3. Ergebnisse.

3.1. Identifikation immunhistochemisch markierter Strukturen in Niere und Leber.

Zur Identifikation wurden immunhistochemisch markierte Strukturen morphologisch und in Doppelmarkierungsexperimenten ausgewertet. Es wurden Desmin für die Markierung des intra- und extraglomerulären Mesangiums, Podosynapsin für die Podozyten, 5´-Ekto-Nukleotidase für die kortikalen Fibroblasten, NADPH-diaphorase-Reaktion und NOS1 Färbung für die Macula densa, THP für die TAL, NCC für den DCT und Na/Ca und Calbindin für den CNT verwendet.

3.2. Lokalisation der Komponenten des L-Arginin-NO-Systems.

NO-Synthese in der Niere findet sich im Endothel von nahezu allen Gefäßen einschließlich der Kapillaren und der Glomerulumgefäße. Hier konnte die endotheliale Isoform NOS3 identifiziert werden. Das kortikale Interstitium war weitgehend frei von NO-Synthasen, während im inner-medullären Interstitium gelegentlich NOS1-positive Fibroblasten detektiert wurden. In den Nephronepithelien wurde ausschließlich NOS1 gefunden. NOS1 Expression beschränkte sich auf die Macula densa und benachbarte Zellen der aufsteigenden Schleife als Teil des juxtaglomerulären Apparats. Dies wurde über eine Kolokalisation von NOS1 mit der NADPH-Diaphorase Reaktion und über In situ Hybridisierung für NOS1 mRNA gezeigt 12. Die Lokalisation des wichtigsten NO-„Rezeptors“, der löslichen Guanylatzyklase (sGC) war Schwerpunkt der vorliegenden Studie. Immunhistochemie mit einem Antikörper gegen die β1 Untereinheit der sGC zeigte eine positive Reaktion im Glomerulus, in Gefäßmuskelzellen sowie in interstitiellen Zellen. Im Glomerulus fand sich die sGC im Mesangium des Kapillarknäuels. Weiterhin waren die Strukturen des JGAs markiert. So fand sich die sGC in der Wand der kleinen Widerstandsgefäße, wie der afferenten Arteriole mit ihren granulierten, renin-enthaltenden Zellen, der efferenten Arteriole sowie des extraglomerulären Mesangiums zwischen den Arteriolen. Das Signal zeigte zellulär eine [Seite 11↓]zytosolische Lokalisation. Diese Befunde wurden über In situ Hybridisierung der α1 und β1 sGC bestätigt. Zusätzlich wurde mit Hilfe von RT-PCR in isolierten Glomeruli die mRNA beider sGC Untereinheiten lokalisiert. In isolierten Mesangialzellen wurde per Western blot die ß1 Untereinheit (UE) des Enzyms identifiziert. Die NO-abhängige cGMP-Produktion wurde ebenfalls in Mesangialzellen über Gabe eines NO-Donors bestätigt. Neben dem JGA zeigten die aus der efferenten Arteriole der juxtamedullären Nephrone entspringenden absteigenden Vasa recta in ihren kontraktilen Abschnitten eine starke sGC-Immunreaktivität. Die Perizyten, welche die Aufgabe der Kontraktion wahrnehmen und sie fassreifenförmig umgeben, waren hierbei stark markiert. Die Fibroblasten des kortikalen Labyrinths sowie die entlang der Gefäßbündel waren positiv gefärbt. Die In situ Hybridisierung für beide UE, welche mRNA Signale in peritubulärer und perivaskulärer Lokalisation mit einem Verteilungsmuster analog der typischen interstitiellen Fibroblasten zeigte, sowie Western blot Analyse und Messung der Enzymreaktivität nach NO-Donor Gabe von medullär isolierten Fibroblasten konnten diese Resultate unterstützen. Die Lokalisation der sGC in der Leber zeigte ein kräftiges immunhistochemisches Signal im Interstitium. Hier waren generell die Ito-Zellen positiv mit schwächer werdender Intensität von periportal zur Zentralvene hin. Positive Wandstrukturen größerer Lebergefäße wie portale Venulen und größere Venen wurden ebenfalls beobachtet. Unterstützend hierfür waren die Western blot Analyse von Leberhomogenat und isolierten Ito-Zellen, die In situ Hybridisierung und RT-PCR beider UE in der Leber sowie die Messung der Enzymreaktivität nach NO-Donor Gabe.

3.3. Lokalisation der Enzyme der Prostaglandinsynthese in der Niere.

Die Aktionen der Prostaglandine betreffen die Modulation der lokalen Hämodynamik, die Reninfreisetzung und die tubuläre Salz- und Wasserresorption. Die Hauptenzyme der Prostaglandinsynthese sind COX-1, COX-2 und für die Umwandlung in das renale Prostaglandin, PGE2, die mPGES. Die Wirkung der Prostaglandine ist zum einen abhängig von deren Produktionsort und zum anderen von der Lokalisation und Dichte der spezifischen Rezeptoren. Am JGA ist die COX-2 abhängige Prostaglandinfreisetzung im Zusammenhang mit einer EP-4-vermittelten Signaltransduktion zur Synthese und Freisetzung von Renin beschrieben worden 19. Wir fanden hier in der Ratte die COX-2 sowie auch die mPGES in Zellen der Macula densa und des umgebenden TAL lokalisiert. Die Maus besaß dagegen COX-2 Immunoreaktivität ausschließlich in der Macula densa. Die COX-1 konnten wir im extraglomerulären Mesangium und schwach im intraglomerulären Mesangium vorfinden. Neben der Beeinflussung der Reninsynthese sind zahlreiche über den EP-1- und EP-3-vermittelte tubuläre Effekte im Rahmen des Salz und -Wassertransports beschrieben worden 11. Entlang des Tubulus war COX-1 in der Ratte im terminalen DCT, im CNT und in den Hauptzellen des CCD und MCD mit einer milden zytoplasmatischen und einer stärkeren Kernmembranfärbung nachweisbar. Es bestand kein Unterschied zwischen der Ratte und der Maus. COX-2 war auf einzeln verteilte, oder in Gruppen auftretende Zellen des TAL mit einer prominenten zytosolischen und einer schwächeren [Seite 12↓]Kernmembranfärbung nachweisbar. mPGES war in beiden Spezies sowohl mit COX-1 als auch mit COX-2 gemeinsam lokalisiert. Diese tubulären Befunde wurden durch In situ Hybridisierung bestätigt. Enzyme der Prostaglandinsynthese waren weiterhin in vaskulären und interstitiellen Strukturen vorhanden. Vaskulär konnten COX-1 deutlich und COX-2 nur gelegentlich im Endothel lokalisiert werden. Die kortikalen Fibroblasten waren in der Maus positiv für COX-1 wie auch für mPGES, während hier in der Ratte kein Signal für diese Enzyme gefunden wurde. Die medullären Lipid-beladenen interstitiellen Zellen sind ein schon früher definierter Produktionsort für Prostaglandine. COX-1, COX-2 und mPGES wurden in starkem Ausmaß sowohl in der Ratte als auch in der Maus in diesen Zellen exprimiert. Hier wurde ebenfalls eine Kolokalisation von PGES mit COX-1 bzw. COX-2 durch Doppelmarkierungen bestätigt.

3.4. Analyse der NOS1 Interaktion mit COX-2.

Sowohl die NOS1 vermittelte NO-Synthese wie auch die COX-2 abhängige Prostaglandinsynthese findet in der Macula densa und dem unmittelbar benachbarten TAL Segment statt. Beide Enzyme werden konstitutiv und teilweise kolokalisiert exprimiert. Diese zeigten analoge Expressionsänderungen unter verschiedenen Stimuli, wie unter renovaskulärer Hypertonie (2K1C Goldblatt-Modell), unter Inhibition des Na-K-2Cl-Kotransporters durch Furosemid oder Salzbeladung und Salzrestriktion 20-23. Da NO COX-2 aktivieren kann 24 und eine Inhibition der NOS1 zu einem Absinken der juxtaglomerulären COX-2 Expresssion 5, 25, 26 führte, nahmen wir an, dass NO ein positiver Regulator der COX-2 ist. So untersuchten wir die Koexpression beider Enzyme durch Auszählung einzelner, für das jeweilige Antigen immunpositiver Zellen des JGA von Ratte und Maus unter veränderten Bedingungen.

COX-2 immunreaktive Zellen wurden nach 3 typischen Lokalisationen unterteilt: die Macula densa selbst, die Macula densa Region und die kortikale dicke aufsteigende Henle-Schleife (cTAL). Doppelmarkierungen von COX-2 und NOS1 ergaben, dass in der NOS1 positiven Macula densa nur eine oder zwei doppelt markierte Zellen, in der Macula densa Region jedoch mehrere solcher Zellen vorkamen. Im benachbarten cTAL wurden COX-2 positive Zellen grundsätzlich allein vorgefunden. Die Anzahl der Zellen, welche COX-2 allein oder zusammen mit NOS1 exprimieren, wurde in den experimentellen Modellen erhoben und mit dem Durchschnitt der entsprechenden Kontrollen verglichen.


[Seite 13↓]

Folgende Resultate wurden im Goldblatt-Modell erhalten:

Gruppe

COX-2 in der Macula densa selbst

COX-2 in der Macula densa Region

COX-2 in der

cTAL

NOS1 gesamt

stenotische Niere

(Kurzzeit)

+ 81 %

+ 71%

+ 73%

+ 35%

nichtstenotische Niere (Kurzzeit)

- 53%

- 41%

-14 %

- 14%

stenotische Niere (Langzeit)

+ 90%

+ 90%

+ 75%

+ 50%

nichtstenotische Niere (Langzeit)

- 70%

- 31%

-16%

- 16%

Die numerischen Veränderungen COX-2 positiver Zellen im Experiment zeigen demnach keinen Bezug zur Koexpression mit NOS1, woraus wir schließen, dass NO – zuminderst in der Zell-autonomen Betrachtungsebene - nicht für die Veränderungen der COX-2 erforderlich ist. Zur Überprüfung unserer Resultate wurden NOS1 defiziente, experimentell gleichfalls stimulierte Mäuse benutzt; diese bestätigten die Beobachtung, dass eine Stimulation von COX-2 auch bei Fehlen von NOS1 erfolgte.


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18.07.2005