4. Diskussion

Die hier in Kurzform dargelegten Resultate zeigen die Lokalisation von Schlüsselprodukten des L-Arginin-NO-Systems und des Prostaglandinsynthese-Systems sowie funktionelle Implikationen und Aspekte ihrer Interaktion.

4.1. Juxtaglomerulärer Apparat.

Der JGA besteht grundsätzlich aus den Glomerulumgefäßen, dem extraglomerulärem Mesangium und der Macula densa. NOS1 und NOS3 fanden wir in der Macula densa bzw. im Endothel 27-29, COX-2 jedoch nur im Epithel der Macula densa und benachbarter aufsteigender Schleife; wir bestätigten z. T. hiermit bestehende Vorarbeiten 22. Für bedeutsam halten wir die Lokalisation der sGC in den glattmuskulären Elementen des JGA (Extraglomeruläres Mesangium und arterioläre Wandzellen) und die mPGES in der Macula densa, da diese Befunde Hypothesen stützen, die im Rahmen der tubulo-vaskulären Signaltransduktion aufgestellt worden sind 2. Hierbei stand im Vordergrund, dass eine Hemmung des NKCC2-abhängigen Salztransports der aufsteigenden Schleife NOS1 und COX-2 stimuliert, und dass parallel sich Antworten in der gesteigerten Reninfreisetzung und in einer Dämpfung der konstriktiven TGF-Antwort der afferenten Arteriole messen ließen 2. In vitro-Messungen ergaben einen Hinweis auf die permissive Rolle von cGMP bei der Reninfreisetzung 30. Unsere Resultate bestätigen diesen Befund in situ, indem die cGMP-[Seite 14↓]freisetzende sGC in den Zielzellen, den granulierten Zellen des JGA nachweisbar war. Der Nachweis von sGC in den benachbarten Gefäßwandzellen und dem extraglomeurlären Mesangium weist ferner auf die Rolle von cGMP beim TGF hin und bestätigt damit Befunde an isolierten Präparationen 25, 26. Unsere Befunde liefern somit das zellbezogene Substrat zur Bestätigung funktioneller vorausgegangener physiologischer Experimente. Dass hiermit die funktionelle Bedeutung der lokalen NO Freisetzung erschöpfend geklärt wäre, kann aufgrund neuester Befunde allerdings nicht ohne Einschränkung behauptet werden 31. In ähnlicher Weise stützt unser Nachweis von mPGES in der Macula densa funktionelle Beobachtung der Rolle von Prostaglandin E2 und -I2 bei der Stimulation der Reninfreisetzung 32-35. In einer vorausgegangenen Arbeit war hingegen das Fehlen dieses Enzyms auf mRNA-Ebene in Diskrepanz zu unseren Befunden 36. Neuere Ergebnisse konnten unsere Arbeit zur Lokalisation der mPGES in der Macula densa bestätigen 37. Unsere Befunde sind im Einklang mit der heraushebenden Rolle Macula densa-lokalisierter COX-2 bei verringertem Transport und bei Hemmung des RAS durch Angiotensin II-Rezeptorblocker 22, 23, 38 über das Effektorsystem von PGE2 und deren spezifische Rezeptoren 19.Für die andere COX-Isoform, COX-1, welche wir ebenfalls innerhalb des JGA im EGM lokalisierten, konnte durch spezifische Hemmversuche keine Wirkung auf das RAAS nachwiesen werden 35.

4.2. Glomerulus.

Hier konnten wir sGC in den intraglomerulären Mesangialzellen vorfinden. Diese verankern die glomerulären Kapillarschlingen an ihrem Befestigungsapparat und sind an der mechanischen Integrität des glomerulären Hilus beteiligt. Rezeptoren für konstriktiv wirkende Hormone konnten durch andere Gruppen an den Mesangialzellen nachgewiesen werden 39. Von den konstitutiven NOS parakrin freigesetztes NO könnte zum Ort seines Rezeptors diffundieren und über die zelluläre cGMP Produktion in den Mesangialzellen antagonistisch wirken. Auch die lokale Prostaglandinsynthese ist im Glomerulum von Bedeutung 40. Hier konnten wir die COX-1 gleichfalls im intraglomerulären Mesangium lokalisieren und damit Interpretationen von Soler at.al 41, welche PGH2 als Prostaglandinvorstufe in Mesangialzellen vorfanden, unterstützen. Obwohl wir mittels RT-PCR COX-2 mRNA in Glomerulumextrakt amplifizierten, konnten wir COX-2 Immunreaktivität nicht verlässlich detektieren. Dies wurde von einer anderen Arbeitsgruppe auf Proteinebene immunchemisch bestätigt 42, 43.

4.3. Vaskuläre Aspekte.

Für die Regulation der renalen Durchblutung sind die Widerstandsarteriolen des Kortex sowie die aus den Vasa efferentia der juxtamedullären Glomeruli entspringenden absteigenden Vasa recta relevant. Größere kortikale Widerstandsgefäße, mit Ausnahme der Glomerulumarteriolen, waren im Gegensatz zu den medullären absteigenden Vasa recta weniger stark für sGC-positiv. Die sGC-Immunreaktivität der Vasa recta lässt auf eine NO Abhängikeit in Zusammenhang mit der medullären Durchblutung schließen und ist somit das morphologische Korrelat zu den etablierten Effekten von NO auf die medulläre Durchblutung 12, 44. Die Enzyme der Prostaglandinsynthese [Seite 15↓]ließen sich in der Ratte und Maus unter Kontrollbedingungen nicht sicher nachweisen. Hier konnte lediglich im Endothel größerer Gefäße die COX-1 gefunden werden. Dies steht im Widersrpuch zur Expression der Enzyme der Prostaglandinsythese in der menschlichen Niere 45. Beide COX Isoformen sind human im renalen Gefäßbett weit verbreitet und spielen in der Pathophysiologie des Bluthochdrucks eine entscheidende Rolle.

4.4. Renales Interstitium.

Kortikale interstitielle Fibroblasten sind perikapillär angeordnet und nehmen Aufgaben der mechanischen Festigung sowie der funktionellen Integration tubulärer und vaskulärer Parameter wahr. Es bestehen Hinweise auf ihre Funktion, indem sie die Produktionsorte für Adenosin als Mediator des TGF 1 sowie für Erythropoetin 46 und NADPH Oxidase 47 in der Niere sind. Die sGC war in diesen kortikalen Zellen stark exprimiert. Dies kann den hohen cGMP Gehalt interstitieller Flüssikeit 48 in der Niere erklären und Hinweise auf die Signalvermittlung geben. Mit einer Diffusionslänge von 220μm und einer Lebenszeit von 60 Sekunden könnte man sich vorstellen, dass interstitiell gebildetes cGMP basolateral vom proximalen Tubulus aufgenommen wird, wie gezeigt in 48, und dort die Natriumresorption beeinflusst 49. Dies könnte ein Teilaspekt der NO Wirkung auf den tubulären Transport sein. Im Gegensatz zur Ratte konnten wir in der Maus COX-1 und mPGES in den kortikalen interstitiellen Fibroblasten lokalisieren, während in beiden Spezies COX-1 und -2 und mPGES im Nierenmark in den medullären Fibroblasten vorkamen. Das Nierenmark wird oft auch als Prostaglandindrüse bezeichnet, welches die hohe Konzentration dieser widerspiegelt. Funktionell bieten sie ein Apoptoseschutz und verhindern eine Schädigung, wenn das Nierenmark osmotischen Veränderungen, wie zum Beispiel der Wasserrestriktion, ausgesetzt ist 50.

4.5. Epitheliale Aspekte.

Entgegen den früher publizierten PCR und immunhistochemischen Daten, welche sGC mRNA in den verschiedenen tubulären Epithelien und α2 sGC Immunreaktivität im Sammelrohr detektierten 51-53, gelang es uns nicht die sGC im Epithel zu markieren. Die Diskrepanz zwischen diesen Resultaten mag an einem Sensitivitäts- oder Spezifitätsproblem liegen. Wir konnten sGC mRNA und Protein in einer Reihe verschiedener Zelltypen nachweisen, so dass es tubulär zumindest in einer niedrigeren Konzentration vorkommen müsste.

4.5.1. Dicke aufsteigende Henle’sche Schleife.

Entlang des Nephrons war der cTAL der erste positive Lokalisationsort für die Prostaglandinsynthese. Hier konnten wir COX-2, in einzeln verteilten Zellen, und mPGES in der Nähe der Macula densa vorfinden. Die Anzahl COX-2 positiver TAL Zellen beläuft sich auf 2% 54, welche den physiologischen Status reflektiert und die Möglichkeit einer Expressionssteigerung der COX-2 unter experimentellen Bedingungen zulässt. Dies reflektiert die induzierbare Natur des COX-2 im TAL wie auch in anderen Lokalisationen. Erwähnenswert beim Menschen ist, dass das COX-2 Protein in der MD nur im Alter und während pathologischer Veränderungen sichtbar [Seite 16↓]gemacht werden kann 55-57. Über COX-2 gebildete Prostaglandine sind relevant für die epitheliale Funktion. So erlauben sie die Wirkung der Schleifendiuretika 21 und üben damit einen inhibitorischen Effekt auf den Na-K-2Cl-Kotransport in mTAL Zellen aus 58. Auch in in vitro perfundierten mTAL konnte für PGE2 eine inhibitorische Wirkung auf die Salzresorption nachgewiesen werden 11. Die lokale Verteilung der PGE2 Rezeptoren wird derzeit noch kontrovers diskutiert 11, 19. Hervorzuheben ist die besondere Bedeutung des COX-2 während der perinatalen Entwicklung der Niere. Die deutlich stärkere neonatale Expression 59 konnte durch die Beobachtung unterstützt werden, dass COX-2 defiziente Mäuse einen Nephronschaden während der Entwicklung erleiden 60. Die intrazelluläre Signalkaskade, hervorgerufen durch die über COX-2 und mPGES gebildeten Prostaglandine, ist zum Teil erfasst und beinhaltet eine schnelle Phosphorylierung von p38 und ERK1/2 Kinasen sowie die Stimulation von MAP Kinasen 61.

4.5.2. Distales Konvolut und Sammelrohr

. Die Lokalisation von COX-1 und mPGES begann mit der 2. Hälfte des DCT und erstreckte sich weiter über den CNT, CCD und das gesamt medulläre Sammelrohr, ausgenommen die Schaltzellen dieser Segmente. Dies traf sowohl für die Ratte wie für die Maus zu. Diese Beobachtungen sind teilweise in Einklang mit einer früheren Beschreibung der COX-1 im Sammelrohr 56, 62., jedoch entgegengesetzt zu Befunden von Ferguson et.al 63 welcher sowohl COX-1 und wie auch COX-2 nur in den Schaltzellen des CCD vorfand. Probleme der Antikörper-Spezifität könnten hierfür die Grundlage sein. Die Wirkung der Prostaglandine ist in diesem Segment über die Prostaglandin E-Rezeptoren EP-1 und EP-3 vermittelt, welche durch pharmakologische Hemmstudien hier lokalisiert worden sind 11. Die Funktionen der hier gebildeten Prostaglandine betreffen die Feinregulation der Salz- und Wasserhomöostase. So konnte gezeigt werden, dass endogen gebildetes ebenso wie exogen zugeführtes PGE2 die bekannten Effekte von Vasopressin auf die Wasserausscheidung des Sammelrohres inhibieren 64. PGE2 kann weiterhin die Salzresorption im CCD über einen Kalzium-gekoppelten Mechanismus vermindern 65. Eine streng basolateral gerichtete Gabe von PGE2 führte zu einer vermehrten Wasserausscheidung, so dass hier vermutlich die Lokalisation des Rezeptors im Epithel von Bedeutung ist 65. Unsere Untersuchungen zeigten ebenfalls sehr starke Signale für COX-1 und mPGES im DCT und CNT. Hier könnten lokale Wirkungen über den EP-4 Rezeptor vermittelt werden 19 oder mit dem lokalen Kallikrein-Bradykininsystem 66, der Aldosteronwirkung oder dem Amilorid-sensitiven epithelialen Natriumkanal interagieren 67.

4.6. Ito-Zellen der Leber.

Die Lokalisation der sGC und lokale cGMP Freisetzung steht mit funktionellen Daten über diesen Zelltyp im Einklang. Ito-Zellen wurden als leberspezifische Perizyten beschrieben, welche sich im Disse-Raum befinden und hier lange Ausläufer zwischen Sinusendothel und Parenchymzellen besitzen 68. Sie sind mit den renalen kortikalen interstitiellen Zellen verwandt, indem sie Eigenschaften wie die Erythropoetinproduktion 69 und die Expression der neutrophilen NADPH [Seite 17↓]Oxidase und 5´Ektonukleotidase 47 mit diesen teilen. Die Lokalisation der sGC in Ito-Zellen weist auf die Funktion des NO und CO in Hinblick auf die Einstellung des kontraktilen Tonus der Ito-Zellen hin. So kommt der sGC hier auch eine Bedeutung bei der Regulation der sinusoidalen Mikrozirkulation und damit auch des portalen Blutdrucks. In Übereinstimmung mit unseren Resultaten sind die Beobachtungen von Kawada et al, die cGMP Freisetzung aus Ito-Zellen nach NO-Gabe berichten70.

4.7. Zusammenhang zwischen NOS1 und COX-2.

Die räumliche Nähe der Expression von COX-2 und NOS1 im Bereich der MD und ihre bei einigen Versuchsbedingungen gleichsinnige Expressionsänderung führten im Verein mit funktionellen Studien zu der Interpretation, dass zwischen beiden Enzymen ein funktioneller Zusammenhang besteht. Die Einflussnahme von in der Macula densa gebildetem NO auf die COX-2 der Macula densa und ihrer Nachbarzellen ist dadurch gegeben, dass NO mit Häm-Proteinen interagieren kann 71 und COX-2 ein Enzym mit einer Häm-Domäne ist 72. In kultivierten Zellen verschiedener Herkunft konnte nachgewiesen werden, dass NO in der Lage ist die Prostaglandinproduktion zu stimulieren 73-75. Dies wurde auch in cTAL Zellen gezeigt, in denen sich die Expression von COX-2 unter Zugabe von NO-Donor oder cGMP signifikant erhöhte bzw. sich durch Gabe eines selektiven NOS1 Inhibitors erniedrigen ließ 76, während in anderen Modellen gegensätzliche Reaktionen beobachtet wurden 77. Unsere Untersuchungen an verschieden stimulierten Rattenmodellen ergaben für die COX-2 der Macula densa und Nachbarzellen, die auch NOS1 exprimieren, gleiche Expressionsänderungen wie in entfernter liegenden, NOS1-negativen Zellen des TAL. Summarisch zeigte die Auswertung dieser Zellen ähnliche Änderungen für NOS1 und COX-2 wie in früher beschriebenen Studien 14, 20-23, 63. Auch NOS1 defiziente Mäuse zeigten unter normalen und stimulierten Konditionen keinen Unterschied der Expressionsänderungen von COX-2 im Vergleich zu den entsprechenden Wildtyptieren. Wir schließen hieraus, dass intrazelluläres NO für die COX-2 Synthese nicht notwendig ist. Damit spiegeln unsere in vivo Daten nicht die in Zellkultur erhobenen Ergebnisse wider. Es ist denkbar, dass NO in denjenigen Zellen, die beide Enzyme exprimieren, die Expression von COX-2 dennoch bestimmt, dass jedoch in den lediglich COX-2 exprimierenden Zellen auch andere Signalwege wirksam sind. So ist ein generell gültiger Mechanismus der COX-2 Stimulation über eine Chlorid-bezogene Verringerung der Na-K-2Cl-Tranportleistung durch die Freisetzung von PGE2 gut belegt 78.

4.8. Zusammenfassend

haben wir mit der Lokalisation der sGC in der Niere vaskuläre und interstitielle Strukturen gekennzeichnet, die sich mit zuvor aufgestellten Konzepten NO-stimulierbarer Signalwege für Nierenkortex und Mark in Übereinstimmung bringen lassen und diese im Detail verdeutlichen. Dies gilt auch für die hepatischen Ito-Zellen. Die Analyse der Verteilung der Enzyme der Prostaglandinsynthese in der Niere konnte ebenso die funktionellen Interpretationen von ortsspezifischer PGE2 Wirkung auf die Regulation des Blutflusses und der Salz- und [Seite 18↓]Wasserhomöostase präzisieren. Eine zuvor postulierte Abhängigkeit der COX-2 von lokaler NO-Freisetzung durch ko-exprimierte NOS1 ließ sich nicht erhärten.


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18.07.2005