Thiele, Holger: Struktur und Funktion des Gens für das translationell kontrollierte Tumorprotein (TCTP)

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Kapitel 2. Einleitung

2.1. Die Funktion des translationell kontrollierten Tumorproteins (TCTP)

2.1.1. TCTP - das wachstums-und translationell regulierte Protein

Stimuliert man eukaryontische Zellkulturen zum Wachstum, so kann man einen Wechsel der exprimierten Proteinmuster beobachten. Verschiedene Arbeitsgruppen widmeten sich dieser Thematik unter der Fragestellung der Identifizierung wachstumsregulierter Proteine und der Ebene ihrer Regulation. Frühe Arbeiten dieser Art konnten einen signifikanten Wechsel von etwa 20 verschiedenen Proteinen in Swiss mouse 3T3 Zellen zeigen, von denen etwa die Hälfte auf der translationellen Ebene kontrolliert wurde. Eines dieser translationell kontrollierten Proteine wurde als Q23 bezeichnet ( Thomas et al. 1981 , Thomas und Thomas 1986 ). Andere Arbeitsgruppen fanden das gleiche Protein als p21 in Maus-Erythroleukämiezellen ( Yenofsky et al. 1983 , Chitpatima et al. 1988 ) und in Ehrlich aszites Tumorzellen mit der Bezeichnung p23 ( Benndorf et al. 1988 , Böhm et al. 1989 , Böhm et al. 1991 ). Die unterschiedlichen Namen gehen auf das geschätzte Molekulargewicht in Elektrophoreseläufen zurück. Das exakte Molekulargewicht des klonierten Säugerproteins (Mensch und Kaninchen) beträgt 19,4 kd.

Die heutige Bezeichnung TCTP ist als Abkürzung für “translationally controlled tumor protein“ zu verstehen und soll zum Ausdruck bringen, daß das Protein in Tumorzellen vorkommt und daß seine Synthese auf der Ebene der Translation kontrolliert wird. Mehrere Veröffentlichungen, unter anderem auch Ergebnisse dieser Arbeit, zeigen indessen, daß es sich keineswegs um ein tumorspezifisches Protein handelt, sondern daß es in zahlreichen Geweben und Spezies exprimiert wird und als ubiquitär vorkommendes, konserviertes Protein betrachtet werden muß. Dies geht auch aus dem Vergleich der Proteinsequenzen verschiedener Spezies hervor ( Abb. 2-1 ). In diesem Kontext ist der Name TCTP etwas irreführend. Da er jedoch überwiegend in Publikationen und Datenbanken benutzt wird, sollte er bis zur endgültigen Aufklärung seiner Funktion beibehalten werden. Der Name des Gens wird heute nach der GDB (genome database) Nomenklatur (Zugangsnummer GDB:1060912) als TPT1 bezeichnet ( Cayanis et al. 1998 ). Entsprechend werden in dieser Arbeit das Protein und die mRNA TCTP genannt, das Gen und die Pseudogene TPT1.


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Abb. 2-1 Interspezies-Sequenzalignment bisher veröffentlichter TCTP-Proteinsequenzen (Stand 8/98): Von den aufgelisteten 17 Proteinsequenzen sind Vertreter der Primaten, Nager, Vögel, einzelliger Eukaryonten, Nematoden, Protozoen und Pflanzen dargestellt. Konservierte Aminosäuren wurden gelb hervorgehoben. Der blau markierte Abschnitt stellt den für die Bindung des TCTP an Tubulin (Kap. 2.1.2 ) verantwortlichen Bereich dar.

Ein näherer Blick auf nah verwandte Spezies offenbart hohe Homologiegrade. Zwischen der Maus- und Rattensequenz beträgt die Übereinstimmung z.B. 100%, zwischen Kaninchen und Mensch 98%. Auch zwischen den verschiedenen Pflanzenarten ist die Homologie ausgeprägt (zwischen 73% und 93% in den verglichenen Pflanzenarten). Einen besseren Überblick über phylogenetische Zusammenhänge liefert Abb. 2-2 .


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Abb. 2-2: Abstammungsbaum des TCTP in verschiedenen Spezies. Vertebraten und Pflanzen fallen durch ihre hohen Homologien untereinander als Gruppen auf. Größere Abweichungen sind erwartungsgemäß beim Regenwurm, Schistosomen, Filarien und der Hefe sichtbar. Sie repräsentieren evolutionär weiter entfernt liegende Spezies.

Beim Vergleich der Proteinsequenzen zeigen sich eine Reihe von gruppenspezifischen Mutationen, etwa die Aminosäuren 42-50, 62-69 und 118-122 als pflanzentypische Domänen. Andere Positionen sind in allen Spezies identisch (Aminosäuren: 12, 15, 16, 51, 53, 55, 78, 93, 138 und 171). Von diesen Aminosäuren kann man erwarten, daß sie unter evolutionärem Erhaltungsdruck standen und wahrscheinlich an den physiologischen Funktionen des Proteins direkt beteiligt sind. Interessanterweise sind zwei der 10 konservierten Aminosäuren Serine. Diese Aminosäure ist wie Threonin und Tyrosin Angriffspunkt spezifischer Proteinkinasen. In der Literatur wurden Isoformen des TCTP beschrieben ( Sanchez et al. 1997a ). Ihre Entstehung ließe sich plausibel mit einer Phosphorylierung erklären.

Die Tatsache, daß TCTP auch als Histaminfreisetzungsfaktor beim Menschen bekannt wurde ( MacDonald et al. 1995 , Schroeder et al. 1996 ), paßt im Hinblick auf die vermutete physiologische Funktion des Proteins nur schlecht in das Bild eines ubiquitär verbreiteten Proteins. Als Bestandteil des Pathomechanismus für Krankheiten aus dem allergischen Formenkreis gewinnt das TCTP jedoch an erheblicher Bedeutung (siehe Kapitel 2.1.3 ).

Die ersten Veröffentlichungen über die Wachstumsabhängigkeit des TCTP zeigten, daß sich das Protein in Abhängigkeit vom Alter des Ehrlich aszites Tumors anreicherte ( Benndorf et al. 1988 ). Viele Tumoren, wie auch der Ehrlich aszites Tumor, zeigen charakteristische Wachstumskurven. Nach einer Phase exponentiellen Wachstums verlangsamt sich die Zellteilung und Tumorexpansion - wahrscheinlich durch autokrine inhibitorische Impulse ( Andersson 1977 , Denhardt et al. 1986 ). TCTP gehörte hierbei zu den Proteinen, die sich bevorzugt in der frühen Phase des Tumorwachstums nachweisen ließen. Zusätzlich ließ sich die


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TCTP-Synthese durch Serum stimulieren ( Benndorf et al. 1988 ). Diese Experimente ließen vermuten, daß TCTP zellzyklusabhängig exprimiert wird. Neue Daten zeigen darüberhinaus eine starke Abhängigkeit der Bindung des TCTP an das Zytoskelett vom Zellzyklus ( Gachet et al. 1999 ).

Die postulierte posttranskriptionelle Regulation des TCTP stützte sich auf folgende Experimente:

  1. Die Tatsache, daß sich die Expression des TCTP durch Serum in sehr kurzer Zeit (10 Minuten) stimulieren ließ. Da die Neusynthese von mRNA eine gewisse Zeit benötigt, mußte von einer Aktivierung schon vorhandener mRNA ausgegangen werden.
  2. Inhibitoren der Transkription wie alpha-Amanitin und Aktinomycin D hatten keinen reduzierenden Effekt auf die Expression. Aktinomycin D erwies sich sogar als sehr effektiver Stimulator der Expression.
  3. Dem zellzyklusabhängigen Wechsel im Proteinniveau stand eine konstante Menge an TCTP-mRNA in den verschiedenen Tumorstadien gegenüber ( Böhm et al. 1989 ).
  4. Die Gruppe von G. Brawerman hatte schon einige Zeit vorher herausgefunden, daß die mRNA von p21 als inaktiver mRNP-Komplex zytosolisch akkumuliert wird, und daß sich die Bildung der mRNP-Partikel durch DMSO induzieren ließen - wahrscheinlich als Folge einer TPT1-Genaktivierung ( Yenofsky et al. 1983 ).

In dem Bestreben die Translationskontrolle des TCTP weiter aufzuklären, wurde der Einfluß der untranslatierten mRNA-Regionen auf den Translationsarrest untersucht. Die Experimente identifizierten eindeutig die UTRs der mRNA als Vermittler der Translationsinaktivierung. Deletionsmutanten der 5’UTR als auch der 3’UTR erwiesen sich in Tumorzellysaten als effizienter translatierbar als die kompletten mRNAs einschließlich ihrer UTRs. Die größte Inhibition ging von der 5’UTR aus. Diese Effekte scheinen jedoch auf tierische Zellen beschränkt zu sein. Zellfreie Translationssysteme aus Weizenkeimlysaten translatierten dagegen auch den unmanipulierten TCTP-Messenger ( Böhm et al. 1991 ). Dies spricht dafür, daß für die Vermittlung der Translationskontrolle zellspezifische Faktoren nötig sind, die in pflanzlichen Zellen fehlen oder nicht kompatibel sind.


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Bommer et al. konnten die Beteiligung des Elongationsfaktors eIF-4E an der Regulation der Translation zeigen ( Bommer et al. 1994 ). Nach diesen Befunden ist die Translatierbarkeit der TCTP-mRNA vom Faktor eIF-4E und der starken räumlichen Faltung der TCTP-mRNA abhängig (Russel und Clemens unpubliziert). Vorstellbar wäre demnach, daß der Faktor eIF-4E als Teil der mRNA-Aufwindungsmaschinerie seine Funktion durch Überwindung der 5’UTR-seitigen Sekundärstrukturen ausübt.

Eine Reihe von zusätzlichen Erkenntnissen steuerten Arbeitsgruppen bei, die sich dem Thema TCTP von sehr unterschiedlichen Richtungen näherten. So fand man TCTP in verschiedenen Spezies darunter Caenorhabditis elegans ( Bini et al. 1997 ), Trypanosoma brucei ( Nasser et al. 1992 ), oder den Pflanzen Alfalfa ( Pay et al. 1992 ) und Pharbitis ( Sage-Ono et al. 1998 ). Man entdeckte TCTP in vielen humanen Geweben darunter Hepatozyten, Makrophagen, Erythrozyten, Thrombozyten, Keratinozyten, Melanomzellen, Hepatoblastomzellen, Erytroleukämiezellen, Lymphomzellen und Gliomzellen. Lediglich in Nierenzellen und Nierenkarzinomzellen war es nicht detektierbar ( Hughes et al. 1993 , Walsh et al. 1995 , Sanchez et al. 1997a ).

Man fand heraus, daß TCTP zu den kalziumbindenden Proteinen zählt ( Nasser et al. 1992 , Sanchez et al. 1997a ), und daß sich TCTP in Makrophagen durch Phorbolester und Lipopolysaccharide induzieren läßt ( Walsh et al. 1995 ). Andere Induktoren der TCTP-Expression, wie die Schwermetalle Cadmium und Kupfer, wurden bei Regenwürmern gefunden, die schwermetallbelasteten Böden ausgesetzt waren ( Sturzenbaum et al. 1998 ). Auch IL-3 brachte man in Verbindung mit der Expressionsstimulation des TCTP ( Nielsen et al. 1998 ). Es konnte gezeigt werden, daß in der Pflanze Pharbitis eine hell/dunkel-abhängige Induktion von TCTP-mRNA als Hinweis auf eine spezifisch pflanzliche Transkriptionsregulation auftritt ( Sage-Ono et al. 1998 ).

Weiterhin existieren Befunde, daß TCTP in den Wirkmechanismus des Antimalariamittels Artesiminin eingreift ( Bhisutthibhan et al. 1998 ). Ob sich hieraus neue Thearapiekonzepte in der Bekämpfung des Erregers der Malaria tropica, Plasmodium falciparum ergeben, bleibt abzuwarten.


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2.1.2. TCTP - das Strukturprotein

Trotz der bis heute ungeklärten physiologischen Funktion des Proteins gibt es neue Daten für eine Beteiligung des TCTP an Strukturen des Zytoskeletts. Mit Hilfe von Immunfluoreszenz-mikroskopischen Untersuchungen konnte gezeigt werden, daß TCTP mit alpha-Tubulin und beta-Tubulin kolokalisiert ist und in vitro an Tubulin bindet (Gachet et al. 1999). In der Zelle liegt das Protein in Komplexen von 100-140 kd vor. In dieser Form läßt es sich mit Anti-Tubulin-Ak immunopräzipitieren. Die Bindung des TCTP an Tubulin ließ sich in der S1, G2 und frühen M-Phase des Zellzyklus nachweisen. Während der Metaphase bis zur Anaphase fanden die Autoren außerdem eine zeitlich limitierte Assoziation mit der Mitosespindel. Die Tubulinbindungsdomäne konnte durch Mutationsanalysen bestimmt werden. Sie hat Ähnlichkeiten mit dem Mikrotubuli-assoziierten Protein MAP-1B ( Abb. 2-1 ). Weitere Hinweise auf die Funktion des TCTP lieferten Experimente, in denen das Protein überexprimiert wurde. Derartige Zellen waren wachstumsgestört, morphologisch verändert und zeigten eine erhöhte Tubulinstabilität.

Zusammengenommen deutet sich an, daß TCTP als ein neues Mitglied der MAPs einzuordnen ist. Tubulin ist neben Actin und Intermediärfilamenten ein Träger des Zytoskeletts der Zelle. Tubulin polymerisiert dabei zu langen Röhren (Mikrotubuli). Entsprechend der vielfältigen Funktionen dieses Strukturproteins existieren dementsprechend eine große Anzahl von Mikrotubuli-assoziierten Proteinen.

Die Tatsache, daß TCTP in der Meta/Anaphase zeitlich begrenzt mit der Mitosespindel wechselwirkt, liefert einen Hinweis auf spezifische Aktivierungsmechanismen. Da TCTP zu den kalziumbindenden Proteinen gehört, und mehrere Isoformen des Proteins existieren ( Sanchez et al. 1997a ), stehen mehrere Modifizierungsmöglichkeiten erklärend zur Diskussion.

2.1.3. TCTP - der Histamin-Releasing-Factor (HRF)

Als 1995 die Gruppe von M. Lichtenstein die molekulare Identifizierung des TCTP als Histaminfreisetzungsfaktor bekanntgab, kam dies überraschend ( MacDonald et al. 1995 ), denn schon damals zeichnete sich ab, daß dieses Protein durch sein Vorkommen in Hefe und Pflanzen schlecht zum Bild eines physiologischen HRF paßte. Als alternative Erklärung bot sich an, daß es sich hierbei um die pathologische Reaktion einer allergisch prädispositionierten


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Subpopulation von Patienten auf ein körpereigenes Protein handeln könnte. Die wesentlichen Ergebnisse der Arbeiten zeigen, daß etwa die Hälfte der Patienten einer Kindergruppe mit atopischer Dermatitis und Nahrungsmittelunverträglichkeiten auf TCTP mit einer Histamin- und IL-4 Sekretion reagierten. Dieser Effekt wurde durch basophile Granulozyten und Mastzellen in Verbindung mit IgE vermittelt.

Die nachfolgenden Abschnitte sollen einen Überblick über IgE-abhängige und IgE-unabhängige Histaminfreisetzungsmechanismen geben.

Histamin gehört zu den mediatorisch wirksamen Substanzen. Seine Freisetzung führt zur Vasodilatation der kleinen Gefäße und zu erhöhter Gefäßpermeabilität. An der Bronchialmuskulatur kommt es Rezeptor-H1-vermittelt zu einer Kontraktion, als dessen Folge asthmatische Beschwerden auftreten.

Mastzellen und basophile Granulozyten sind als spezialisierte Zellen des Immunsystems in der Lage, Histamin auf vielerlei Stimuli hin auszuschütten. Diese lassen sich in zwei Gruppen untergliedern: in IgE abhängige und IgE unabhängige Mechanismen. Zu den IgE unabhängigen Mechanismen gehören unter anderem die Anaphylatoxine C3a und C5a, welche als Spaltprodukte des Komplementsystems bekannt sind, ferner Ca-Ionophore, Mellitin, Leukotriene, Compound 48/80 sowie einige Pharmaka, wie synthetisches ACTH, Codein und Morphin. In der Gruppe der IgE abhängigen Mechanismen kommt es nach Kreuzvernetzung von membranständig gebundenen IgE Molekülen zu einer Degranulation und damit Histaminausschüttung ( Abb. 2-3 ).


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Abb. 2-3 IgE-abhängige Arten der Freisetzung von Histamin und anderen Mediatoren aus Mastzellen und basophilen Granulozyten.

Produktionsstätte der Immunglobuline vom Typ IgE sind Plasmazellen. Damit es zu einer Bildung kommt, muß ein Kontakt mit dem Antigen (z.B. Oberflächenproteine von Parasiten) vorausgegangen sein. Antigenpräsentierende Zellen wie zum Beispiel Makrophagen sind in der Lage, die bei der unspezifischen Abwehr von Mikroorganismen und Parasiten anfallenden Abbauprodukte zu prozessieren und auf ihrer Oberfläche im Komplex mit MHCII zu präsentieren. Dieser Komplex wird von spezifischen T-Helferzellen erkannt und kann zu einer Stimulation von ebenfalls für dieses Antigen Bindungsstellen aufweisende B-Lymhozyten durch Interleukine führen. Erst dann kommt es zur klonalen Differenzierung und Proliferation. Es entstehen sowohl Gedächtniszellen als auch Plasmazellen. In der Anfangsphase der Immunantwort dominieren Ig vom Typ IgM. Später erfolgt eine Umschaltung der Expression der verschiedenen Klassen von Immunglobulinen, die die Bildung von IgG, IgA oder IgE zur Folge hat. Alle Antikörpersubklassen nehmen spezialisierte Aufgaben im Organismus wahr, wobei die Hauptaufgabe des IgE in der Bekämpfung von Wurmparasiten vermutet wird. IgE hat selbst nur eine kurze Halbwertzeit. Auf der Oberfläche von Mastzellen und basophilen Granulozyten vermag es über Fc-Rezeptoren, die in hochaffiner Form praktisch nur dort vorkommen, in gebundener Form lange Zeit zu überdauern. Werden derart gebundene Ak mit Antigen kreuzvernetzt kommt es zur Degranulation. Denselben Effekt haben Anti-IgE Ak oder


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Antiidiotyp-Ak. Die Rezeptoren können auch direkt mit Antirezeptorantikörper kreuzvernetzt werden. Ebenso führt kovalent verbundenes IgE zu einer Überbrückung der Rezeptoren. Eine weitere Möglichkeit der IgE-abhängigen Stimulation bieten Lectine. Diese Stoffe pflanzlicher Herkunft erkennen spezifische Glykosylierungsmuster an Proteinen und binden daran. So läßt sich möglicherweise die Urtikaria nach dem Genuß von Erdbeeren erklären.

Richtet sich die IgE abhängige Immunabwehr nicht gegen Parasiten, sondern gegen harmlose Antigene aus der Umwelt, spricht man von der Überempfindlichkeit vom Typ I bzw. “Allergie“. Praktisch jedes Antigen scheint dafür in Frage zu kommen. Die klinische Symtomatik reicht von Hautrötung, Dermatitis, Urtikaria, Rhinitis, Heufieber, Konjunktivitis, Juckreiz, Asthma, Nahrungsmittelunverträglichkeit bis hin zum anaphylaktischen Schock. Treten mehrere Symtome gleichzeitig auf, spricht man auch von “Atopie“. Dieser Begriff wurde erstmals 1916 geprägt, ( Cooke und Vander-Veer 1916 ) wobei auch eine genetische Disposition der Erkrankten auffiel.

Im Zusammenhang mit der TCTP-gekoppelten Freisetzung von Interleukinen aus Mastzellen und basophilen Granulozyten stellt sich die Frage, worauf die IgE-Abhängigkeit beruhen könnte. Einige der in Abb. 2-3 dargestellten Möglichkeiten sind von MacDonald et al. 1995 kritisch diskutiert bzw. experimentell überprüft worden. Demnach sind spezifisch glykosylierte Immunglobuline nicht die Ursache der Histaminfreisetzung ( Kleine-Tebbe et al. 1996 ). Die Möglichkeit des Auftretens von IgE-Ak, die gegen Epitope des TCTP gerichtet sind (Nr. 1 der Abb. 2-1 ), wurde eingeräumt. Im konkreten Fall käme dies einem Modell einer autoimmun-allergische Reaktion gleich. Von betroffenen Individuen würde man eine ständige Aktivierung des IgE-abhängigen Immunsystems, wie es bei vielen Atopikern vorkommt, erwarten. Über den Zusammenhang zwischen Erkrankungen aus dem autoimmun-rheumatischen Formenkreis und Allergien ist erst wenig bekannt. Bei der Churg Strauß Arteriitis wurden Symtome beschrieben, die auf das Vorhandensein von Auto-Ak verschiedener Subtypen, IgE inklusive hindeuten.

Als andere Erklärung wurden IgE-Varianten ins Feld geführt, die durch alternatives Spleißen entstünden.

Durch die Tatsache, daß TCTP nicht nur intrazellulär sondern auch im Plasma vorkommt und auch extrazellulär als HRF wirkt, stellt sich die Frage, ob es durch spezifische Mechanismen


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sezerniert wird. Proteinchemische Untersuchungen zeigen keinerlei Anhalte für entsprechende Signalsequenzen. Mac Donald et al. gelang die Isolierung des Proteins aus dem Serum ( MacDonald et al. 1995 ). Die Tatsache, daß große Mengen dafür notwendig waren (50 Liter!) lassen auf geringe Serumkonzentrationen schließen. Eine Erklärung wären unspezifische Zelluntergänge. Diese führen immer zum Einschwemmen kleiner Mengen intrazellulärer Proteine in die Blutbahn. Auf diesem Prinzip beruhen die klinischen Diagnosen von Gewebeschäden, wie sie etwa bei Herzinfarkten oder Lebererkrankungen auftreten. Nielsen et al. konnten indes zeigen, daß die Konzentration von TCTP im Plasma selektiv höher als die von anderen intrazellulären Proteinen ist, die zum Vergleich bestimmt wurden. Dies läßt doch auf einen spezifischen bisher nicht erkannten Freisetzungsmechanismus schließen ( Nielsen et al. 1998 ). Unterstellt man dem TCTP eine Funktion im Zytoskelett der Zelle, so muß auch eine Beteiligung dieses Proteins am Zustandekommen des Vesikeltransportes oder der Exozytose als Möglichkeit in Betracht gezogen werden. Diese Vorgänge laufen in Zellen gerichtet an Mikrotubuli und Mikrotubuli-assoziierten Proteinen (MAPs) ab.

2.2. Die verschiedenen Ebenen der Expressionskontrolle

Man kann heute davon ausgehen, daß alle Vorgänge in den Zellen in irgendeiner Art und Weise kontrolliert oder reguliert werden. Die verschiedenen Ebenen der Regulationen getrennt zu beschreiben, geschieht oft aus didaktischen Gründen, da viele Regelkreise ineinander verflochten sind und sich gegenseitig beeinflussen. Die Regulation der Expression der Proteine nimmt diesbezüglich eine Schlüsselstellung ein. So bilden sie den Hauptteil der katalytischen Aktivität der Zellen, sind an vielen strukturellen Funktionen beteiligt und agieren als Hauptakteure molekularer Erkennungsvorgänge. In dieser Funktion sind sie wiederum die Vermittler der Expressionsregulation anderer Proteine. Dabei spielen oft Protein-DNA, Protein-Protein oder Protein-RNA Wechselwirkungen einen Rolle.

Auf welchen Niveaus die Proteinmenge kontrolliert wird, zeigt Abb. 2-4 . Als erstes kann die Zelle festlegen, wann und wie oft ein bestimmtes Gen transkribiert wird (Transkriptionskontrolle). Als nächstes kann Einfluß auf das Spleißen der prä-mRNA sowie sonstiger Modifikationen genommen werden (Prozessing-Kontrolle). Weitere Kontrollmöglichkeiten bietet der Vorgang des Ausschleusens der mRNA aus dem Zellkern


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(Transportkontrolle), die Einflußnahme auf translationelle Vorgänge, etwa durch Aktivierung oder Inaktivierung von mRNPs (Translationskontrolle), die Geschwindigkeit des mRNA-Abbaus durch stabilisierende und destabilisierende Veränderungen der mRNA oder die Möglichkeit, selektiv spezifische Proteinmoleküle nach ihrer Synthese zu aktivieren, inaktivieren oder räumlich abzugrenzen (Proteinaktivitätskontrolle).

Abb. 2-4 Verschiedene Kontroll-Ebenen der Expressionskontrolle in einer schematisierten Zelle: 1. Transkription 2. RNA-Prozessing 3. RNA-Transport 4. Translation 5. mRNA-Stabilität 6. Proteinaktivität ( Alberts et al. 1995 ).

2.3. Die Regulation der Transkription

2.3.1. Der Aufbau eukaryontischer Gene

Typische Eukaryontengene zeigen einen modularen Aufbau. Dabei unterscheidet man zwei Sorten von Modulen. Die eine Sorte besteht aus kodierenden Sequenzen, die man als Exons bezeichnet. Ihre Länge beträgt in der Regel etwa 50 bis 200 bp. Sie stellen die eigentlichen Informationsträger der Proteinsequenzen dar. Oftmals kodieren Exons für funktionell abgrenzbare Proteindomänen bzw. Sekundärstrukturen. Die andere Sorte Module besteht aus kurzen DNA-Sequenzen, die der Transkriptionsregulation dienen. Diese Sequenzen verteilen sich in der Genkotrollregion und sind die Bindungsstellen für Transkriptionsfaktoren (TF).

Die zwischen den Exons liegenden Sequenzen werden als Introns bezeichnet. Ihre Länge kann mehrere kb überschreiten und ist großen Schwankungen unterworfen. In einem als Spleißen


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bezeichneten Prozeß werden diese intronischen Sequenzen aus dem Primärtranskript mit Hilfe eines Multienzymkomplexes (Spleißosom) entfernt. Dabei werden konservierte Bereiche im Intron/Exon-Übergang und innerhalb der Introns als Erkennungsstellen benutzt. Die wahlweise Benutzung des einen oder anderen Spleißortes, auch als alternatives Spleißen bezeichnet, führt durch unterschiedliche Exonzusammensetzungen zu Veränderungen in der Proteinsequenz. Dieses Prinzip wird nur von manchen Genen benutzt ( Mazarakis et al. 1996 ). In den meisten Fällen haben Introns keine weiteren Funktionen, jedoch sind Fälle bekannt, in denen komplette andere Gene in Introns enthalten sind ( Levinson et al. 1990 ), oder Transkriptionsfaktor-bindungsstellen in Introns gefunden wurden ( Sun und Means 1995 ). Als Gegenstück zu Introns läßt sich Spacer-DNA betrachten. Sie verbindet die einzelnen Module der Genkontrollregionen miteinander, ohne eine besondere Funktion inne zu haben.

Der modulare Aufbau der eukaryontischen Gene macht Sinn, wenn man bedenkt, daß durch Insertion oder Deletion von einzelnen Modulen eine schnelle und effiziente Möglichkeit der regulativen und funktionellen Neuorganisation des Genomes realisierbar ist. Damit wären Eukaryonten in der Lage gewesen, sich schnell an veränderte Umweltbedingungen anzupassen. Introns bei Prokaryonten sind außergewöhnlich selten ( Daniels et al. 1985 ). Man vermutet, daß sie unter dem evolutionären Druck ihre Genome klein zu halten, diese Sequenzen verloren haben. Somit stellt das eukaryontische System der Genorganisation das phylogenetisch ältere Modell dar ( Alberts et al. 1995 ).

2.3.2. Prinzipien der Transkriptionsregulation

Der Transkriptionsregulation kommt hinsichtlich der Steuerung der Expression in allen Organismen eine wichtige Rolle zu. Als erster Schritt in der Entstehung von Proteinen kann hier die sinnlose Synthese von Zwischenprodukten verhindert werden. Gerade für Prokaryonten war dies ein starker Selektionsfaktor in der Evolution. Andererseits ist dieses System der Regulation relativ träge. Veränderungen der Transkriptionsrate bewirken erst mit einer gewissen Latenz eine Änderung der Proteinkonzentration. Deshalb eignet sich die Transkriptionsregulation besonders für Grundsatzentscheidungen einer Zelle, den einen oder anderen Satz an Proteinen zu synthetisieren.


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Frühe Erkenntnisse stammten aus der Erforschung von Prokaryonten, die die Erkenntnis brachten, daß Gene durch regulatorische Sequenzen in der Nähe des Transkriptionsstartpunktes kontrolliert werden. Diese relativ kurzen Sequenzen interagieren mit Proteinen, sogenannten Transkriptionsfaktoren (TF) und entscheiden über eine An- oder Abschaltung von Genen sowie der Geschwindigkeit und der Häufigkeit der Transkriptionsinitiation.

Eine Möglichkeit diese Faktoren zu klassifizieren besteht in der Beschreibung ihrer Bindungsmotive, von denen sich bis heute im wesentlichen sechs verschiedene herauskristallisierten. Dies sind das Helix-Turn-Helix-Motiv, das Homöodomänen-Motiv, das Zinkfinger-Motiv, das beta-Faltblatt-Motiv, das Leucin-Zipper-Motiv und das Helix-Loop-Helix-Motiv. Eine charakteristische Eigenschaft vieler TF ist die Bildung von Homo- und Heterodimeren ( Alberts et al. 1995 ).

Nach der Bindung der Faktoren an ihre spezifischen DNA-Sequenzen wechselwirken sie mit dem Transkriptionsinitiationskomplex. Dieser besteht bei Prokaryonten aus der Polymerase in Verbindung mit verschiedenen sigma-Faktoren, bei Eukaryonten aus einem Satz allgemeiner TF inklusive der Polymerase, die an einem spezifischen, sequenzdeterminierten Ort (meistens der TATA-Box) bindet. Dieser Komplex wird als Promotor bezeichnet. Das heutige Modell favorisiert die These, daß spezifische TF die Ansammlung von allgemeinen TF beschleunigen, indem sie zusätzliche Bindungsstellen anbieten (Enhancer) oder verlangsamen, indem sie den Aufbau des Komplexes allgemeiner TF stören (Silencer).

2.3.3. Allgemeine Transkriptionsfaktoren

Als man begann, die Promotoren der eukaryontischen Gene zu analysieren, stieß man auf eine AT-reiche Konsensussequenz um die Position -30, die man nach der Sequenz als TATA-Box bezeichnete. Dieses Element ist eine Komponente der überwiegenden Mehrzahl aller Promotoren, die von der Polymerase II verwendet wird. Ausgehend von der Erkenntnis, daß gereinigte Polymerase II nicht in der Lage war, die Transkription zu initialisieren, isolierte man nach und nach die Faktoren, welche zusätzlich erforderlich waren. Die Abb. 2-5 zeigt, wie der Komplex aus Polymerase und TF vermutlich gebildet wird ( Alberts et al. 1995 ).


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Abb. 2-5 Ansammlung allgemeiner TF am Promotor.

In einer sequenziellen Abfolge binden verschiedene Faktoren nacheinander an der TATA-Box. Zuerst bindet der Faktor TFIID, danach TFIIB, TFIIE, TFIIH und der Komplex aus Polymerase II und TFIIF an dem DNA-Motiv. Durch die Proteinkinaseaktivität des Faktors TFIIH wird eine Untereinheit der Polymerase phosphoryliert und damit für die Transkription aktiviert.

2.3.4. Spezielle Transkriptionsfaktoren

Die Geschwindigkeit mit der diese Prozesse in vivo ablaufen, ist ohne spezielle TF vernachlässigbar. Erst durch sie wird die Ansammlung allgemeiner TF auf meßbare Werte


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gesteigert. Diese speziellen TF binden an Regulator-Sequenzen. Als Genkontrollregion bezeichnet man den Promotor inklusive Regulator-Sequenzen. Diese Region beschränkt sich bei der Mehrzahl der gefundenen Gene auf einen stromaufwärts gelegenen Bereich von etwa -500 bp. Beschrieben wurden jedoch auch Regulator-Sequenzen in großer Distanz zum Promotor ( Tuan et al. 1989 ) innerhalb eines der Introns ( Sun und Means 1995 ) oder stromabwärts des Gens ( Stamatoyannapoulos et al. 1997 ). Abb. 2-6 stellt den Versuch dar, die Fernwirkung der Regulator-Sequenzen und der mit ihnen wechselwirkenden TF durch Schleifenbildung der DNA zu erklären ( Alberts et al. 1995 ).

Abb. 2-6 Modell der Gen-Kontrollregion eines eukaryontischen Gens: Modular aufgebaute Regulator-Sequenzen stromaufwärts, stromabwärts oder innerhalb eines Introns binden spezielle TF. Diese wechselwirken mit dem Promotor (TATA-BOX, allgemeine TF und Polymerase) auf direktem Wege oder durch Fernwirkung nach Schleifenbildung der DNA. Die Summe aller inhibierenden und aktivierenden Signale integriert sich zu einer Transkriptionsaktivität, die von dem Vorhandensein, der Aktivierung und der Konzentration der beteiligten TF abhängt.

Eine heute im Zentrum der Forschung stehende Frage ist, auf welche Weise die Regulatorproteine mit dem Promotor wechselwirken. Wie schon erwähnt, findet der Zusammenbau des Transkriptionskomplexes am Promotor sequenziell statt, und jeder einzelne Schritt kann theoretisch beeinflußt werden. Der Transkriptionsfaktor GAL4 der Hefe überwindet vermutlich die zeitlimitierende Anlagerung des TFIIB an den TFIID durch gleichzeitige Bindung an beide Faktoren. Weil dem TFIIB nun zwei unabhängige Bindungsstellen zur Verfügung stehen, ist die Reaktion kinetisch begünstigt. Der Faktor GAL4 ist auch ein gutes Beispiel für den modularen Aufbau der TF. Zwei Sekundärstrukturen, eine für die Bindung an die Regulator-Sequenzen und eine für die Bindung an die allgemeinen TF (saure


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Aktivierungsdomäne), konnten als wechselwirkende Domänen durch Protein-Hybrid-Experimente eindeutig bestimmt werden ( Alberts et al. 1995 ).

Die Möglichkeiten, die in dem von Eukaryonten verwendeten System der Transkriptionsregulation liegen, sind äußerst vielgestaltig und können die Grundlage für sehr komplexe genetische Schalter liefern. Ein Beispiel dafür ist das even-skipped (eve)-Gen von Drosophila. In einem frühen Embryonalstadium der Fruchtfliege wird das Genprodukt des eve-Gens in sieben Streifen innerhalb des einzellig-mehrkernigen Embryos exprimiert. Erreicht wird dies durch den sieben Streifen entsprechende Genregulator-Module. Diese Module verteilen sich auf einer Länge von 20 kb, binden zusammen etwa 20 TF und arbeiten unabhängig voneinander. Sie integrieren die Konzentration von anderen TF, die sich innerhalb der Zelle gradientenförmig verteilt haben. Das Streifen-2-Modul wird zum Beispiel durch zwei inhibierende Faktoren (biocoid und hunchback) und zwei aktivierende Faktoren (Krüppel und giant) beeinflußt. Nur an einer Stelle im Embryo liegen die TF in den Konzentrationen vor, so daß die Transkription aktiviert wird. Analoges gilt für die anderen Streifenmodule (Alberts et al. 1995).

2.4. Die Entstehung von Pseudogenen

Die Suche nach dem Gen des TCTP gestaltete sich schwierig, da sich zahlreiche TPT1-homologe Sequenzen im Genom des Kaninchens verteilten, wie im Verlauf der Arbeit gezeigt werden wird. In allen untersuchten Fällen handelte es sich hierbei um prozessierte Pseudogene. Die Tatsache, daß sowohl bei der Maus, (Bommer, persönliche Mitteilung) als auch beim Menschen derartige TPT1-Pseudogene vorkommen (Kap. 5.4 ), sprechen für eine generelle Verbreitung bei Säugern.

Prozessierte Pseudogene entstehen, wenn genetische Information von der RNA zum Genom zurückfließt. Die Frage auf welche Weise dies geschieht und woraus die restlichen 90% des Genoms, die nicht für Proteine kodieren bestehen, ist Gegenstand der folgenden Kapitel.

2.4.1. Die Organisation und Evolution des Kern-Genoms

Erste Erkenntnisse über den Aufbau und die Zusammensetzung der Kern-DNA lieferten Experimente über die Geschwindigkeit der Reassoziierung von geschmolzener Maus-DNA


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( Britten und Kohne 1968 ). Sie zeigten, daß etwa 70% des Genoms aus singulären Sequenzen bestanden. In diese Gruppe fallen die kodierenden Sequenzen, Introns, regulatorische Elemente sowie prozessierte und nicht prozessierte Pseudogene. Der Rest reassozierte sehr viel schneller. Dies konnte man sich durch die Annahme von ständigen Wiederholungen der selben Sequenz erklären. Etwa 10% der Sequenzen bestehen aus kurzen Stücken von weniger als 10 bp, die sich millionenfach wiederholen und werden als hochrepetitiv bezeichnet werden. Der Rest, etwa 20%, ist mittelrepetitiv und kommt in Kopienzahlen von mindestens 1000 vor. Einen erheblichen Anteil an der hochrepetitiven DNA macht sogenannte Satelliten DNA aus. Möglicherweise steht sie im Zusammenhang mit Centromeren und Telomeren ( John und Miklos 1979 ).

Bei dem Versuch, die sogenannte mittelrepetitive DNA näher zu charakterisieren, stieß man auf zahlreiche, heute als Retroelemente bezeichnete Sequenzen ( Abb. 2-7 ). Ihre Anwesenheit erklärt man sich durch Retrotransposition, d.h. ihre Bildung und Transposition erfordert neben einem RNA-Intermediat eine reverse Transkriptase-Aktivität. Zu den Retroelementen zählt man Retroviren und Retrotransposons, die über LTR-Elemente verfügen, sowie LINE- und SINE-Elemente, die dieses Merkmal nicht besitzen. All diese Elemente werden aktiv transkribiert und über verschiedene Mechanismen wieder reintegriert. Somit ist also eine Vermehrung möglich, die zu den beobachteten Kopienzahlen führt. Alu-Elemente machen z.B. als Vertreter der SINE 1-3% des Humangenoms aus. Prozessiete Pseudogene sind ebenfalls durch Retrotransposition entstanden, werden aber nicht transkribiert und vermehren sich nicht. Deshalb fallen ihre Kopienzahlen im Genom weitaus niedriger aus.


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Abb. 2-7 Vergleich verschiedener Retroelemente: Retroviren und Retrotransposons werden von LTR-Elementen flankiert, die für den Einbau ins Genom verantwortlich sind. Die Gene gag und env kodieren für virale Strukturproteine, und das pol-Gen für eine reverse Trankriptase. SINE und LINE sind nicht-LTR Retroelemente oder Retroposons. Sie besitzten einen poly(A)-Schwanz an ihrem Ende.

Die Abb. 2-8 stellt die wesentlichen Inhalte des Humangenoms und die ungefähren Größenrelationen der einzelnen Kategorien in schematischer Form dar (Brown 1999).

Abb. 2-8 Die Organisation des Humangenoms (Brown 1999)


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Unter evolotionären Gesichtspunkten scheinen Retrotransposons eine starke Quelle genomischer Neuorganisation darzustellen. So wurde beispielsweise in Maispflanzen ein plötzlicher Transpositionsausbruch mehrerer transponierbarer Elemente beobachtet ( Coen und Carpenter 1986 ). In Drosophila melanogaster beobachtete man ähnliche Ausbrüche bei dem Versuch, unterschiedliche Stämme zu kreuzen ( O'Kane und Gehring 1980 ). Das Phänomen wurde als hybride Dysgenese bekannt. Zumindest bei Pflanzen scheint Umweltstreß ein Auslösemechanismus für Transpositionseruptionen zu sein. Da der Positionswechsel der Transposons ungerichtet geschieht und zu zahlreichen Mutationstypen wie Insertionen, Deletionen usw. führt, ist mit erheblichen Folgen für den Organismus zu rechnen. Beim Menschen sind LINE - Elemente (L1) beispielsweise für Hämophilie A und Brustkrebs verantwortlich gemacht worden ( Kazazian et al. 1988 , Morse et al. 1988 ).

2.4.2. Prozessierte Pseudogene

Im Jahre 1977 entdeckten Jacq und seine Mitarbeiter ( Jacq et al. 1977 ) die Gensequenz einer 5S rRNA mit verkürztem 5'-Ende und zahlreichen weiteren Mutationen. Dieser DNA Bereich konnte unmöglich für ein funktionelles 5S RNA Molekül kodieren und wurde deshalb als “Pseudogen“ bezeichnet. Nachfolgend wurden eine Vielzahl weiterer Pseudogene entdeckt. Schnell erkannte man, daß sich Pseudogene in zwei Gruppen einordnen ließen, prozessierte Pseudogene, die keine Introns enthalten und nicht prozessierte Pseudogene, die ihre Intron/Exon-Architektur behalten haben. Beispiele für nicht prozessierte Pseudogene sind zahlreiche humane Globinpseudogene oder die Sojabohnen Leghämoglobinfamilie (Vanin 1995).

Zur Gruppe der prozessierten Pseudogene gehören z.B.die Gene für das humane ribosomale Protein L7, das Tumorsuppressorprotein p53 oder das menschliche Betatubulin ( Weiner et al. 1986 ). Neueste Beispiele wären der Proteininhibitor der neuronalen Stickstoffoxid-synthase des Kaninchens (Jeong et al. 1998), die gastrointestinale Glutathionperoxidase der Maus (Tsuji et al. 1998) oder die zytosolische Serin-hydroxymethyltransferase (Devor et al. 1998).

Die Liste ließe sich beliebig fortsetzen, da laufend neue Pseudogene entdeckt werden. Prozessierte Pseudogene sind durch mehrere Eigenschaften charakterisierbar, sie zeigen Homologie zur mRNA Sequenz des dazugehörigen funktionellen Gens, haben keine Introns,


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besitzen eine A-reiche Sequenz an ihrem 3' Ende und werden beidseits von kurzen direkten Wiederholungssequenzen flankiert (direct repeats oder ZSDs). Diese 7-17 bp aufweisende Sequenz steht wahrscheinlich in direktem Zusammenhang mit der Insertion der Pseudogene in das Genom der Zelle.

Die folgende Abbildung ( Abb. 2-9 ) zeigt zwei Modelle für die Genese von prozessierten Pseudogenen ( Jeffreys und Harris 1984 , Bernstein et al. 1983 , Rogers 1985 ).

Abb. 2-9 Modell zur Entstehung von prozessierten Pseudogenen (Jeffreys und Harris 1984): Ein Gen wird primär transkribiert (1) und durch Spleißen und Polyadenylierung in die reife mRNA Form überführt (2). Modell A (Bernstein 1983) sieht vor, daß die mRNA unter Benutzung von oligo(dT) als Primer revers transkribiert wird. Eine Topoisomerase I führt zwei Einzelstrangbrüche in die genomische DNA ein, (4) in welche das RNA/DNA-Hybrid kovalent eingebaut wird (5). Entfernung der RNA und Reperaturprozesse (6) generieren das Pseudogen. Modell B (Rogers 1984) beschreibt die Möglichkeit, daß ausgehend von einem Einzelstrangbruch die Aktivität einer terminalen Transferase zu (dT) reichen EInzelstrangüberhängen führt, die ihrerseits als Primer für die cDNA-Synthese dienen (7). Ein weiterer Einzelstrangbruch (8) und Reparaturen (9) generieren das durch Zielsequenzduplikationen (ZSD) flankierte prozessierte Pseudogen.


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Ein strittiger Punkt ist auch heute noch der Ursprung der reversen Transkriptaseaktivität. Wie schon erwähnt, kodieren die pol Gene der Retrovieren und Retrotransposons für eine reverse Transkriptase. Sie könnten demnach für die Enzymaktivität verantwortlich sein.

Andererseits sind Retropseudogene in Drosophila sehr selten ( DiNocera und Dawid 1983 ) und in Hefe unbekannt, obwohl Retrotransposons beschrieben wurden. Endogene und exogene Retroviren sind ebenso für eine Vielzahl von Spezies nachgewiesen worden, unter anderem in Vögeln, für die es nur einen Fall eines beschriebenen prozessierten Pseudogens gibt ( Stein et al. 1983 , Chien und Dawid 1984 ).

Eine Erklärung dafür könnte in den Unterschieden der Gametogenese der verschiedenen Spezies liegen. ( Weiner et al. 1986 ). Diese liegen vor allem in der Oogenese, während die Spermatogenese kaum Unterschiede zeigt. Eine Besonderheit der Oogenese der Säuger ist die bis zu 40 Jahren dauernde Prophase I der Meiose. Bereits embryonal angelegte Oogonien differenzieren zu Oozyten, während die Meiose beginnt. Sie stoppt im Stadium der Prophase I und wird erst mit Erreichen der Geschlechtsreife beendet. Diese Phase dauert einige Monate bei Amphibien und weniger als drei Wochen bei Vögeln. Möglicherweise wird die Bildung von Retrotransposons durch die lange Prophase I der Meiose bei Säugern erst wahrscheinlich gemacht. Eine weitere Schlußfolgerung aus diesem Modell ist das Fehlen oder eine Unterrepräsentation von Pseudogenen in Y-Chromosomen. Auf jeden Fall sollten nur in der Keimbahn generierte Pseudogene vererbt werden. Generell sollte auch gelten, daß die Anzahl der Pseudogene mit der Menge der Transkripte korreliert, und daß nur oozytenspezifische oder in allen Geweben gebildete RNAs (Haushaltsgene) retrograd das Genom infiltrieren.

Für einige dieser Annahmen gibt es Hinweise. So besteht die Liste der bis jetzt gefundenen Pseudogene in der Tat in der Mehrzahl der Fälle aus Haushaltsgenen ( Wagner 1986 ). Bei der Maus fand man von vornehmlich in Oozyten vorkommenden Isoformen des Cytochrom c drei Retropseudogene, dagegen keine hodenspezifischen Isoformen ( Linbach und Wu 1985 ). Leider ist das vorliegende Datenmaterial noch nicht umfangreich genug, um statistisch gesicherte Aussagen machen zu können. In mindestens einem Fall ist z.B. ein Pseudogen auf einem Y-Chromosom beschrieben worden ( Frytag et al. 1984 , Su et al. 1984 ), jedoch ist die genaue chromosomale Kartierung der meisten Pseudogene bisher nicht erfolgt.


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Ein anderer strittiger Punkt betrifft die Herkunft der Primer, die für Modell B der Abb. 2-9 notwendig wären. Verschiedene Vorschläge wurden dazu gemacht. Intrazelluläre rRNA oder tRNA Moleküle könnten als Primer dienen, Haarnadelstrukturen könnten ein “Selbstprimen“ übernehmen, ( Bernstein et al. 1983 ) oder der Einbau der RNA geschieht vor der reversen Transkription in die DNA an Stellen, die komplementär zu dem 3' oder 5' Ende der RNA sind ( Vanin 1985 ). Genau wie Modell B der Abb. 2-9 kommt dieses Modell ohne Primer aus und würde den Einbau von Poly(A+) genauso wie Poly(A-) RNA erklären.

2.4.3. Nicht prozessierte Pseudogene

Nicht prozessierte Pseudogene wurden in der Literatur wesentlich seltener beschrieben als prozessierte. Man kann jedoch noch keine abschließenden Bemerkungen zu diesem Faktum machen, da noch zu wenig Daten vorliegen. Auf jeden Fall folgt die Genese nicht prozessierter Pseudogene anderen Mechanismen als denen der prozessierten Pseudogene. Die übereinstimmende Meinung ist heute, daß nicht prozessierte Pseudogene durch Mutationen funktionslos gewordener Duplikaturen ehemals funktioneller Gene generiert werden. Ihre Existenz ist also nicht an die Bildung von RNA Intermediaten gekoppelt. Genau wie “richtige“ Gene besitzen sie Introns, Exons und Promotorstrukturen. Viele nicht prozessierte Pseudogene sind in Multigenfamilien beschrieben worden. Dies ist wahrscheinlich kein Zufall. Ein plausibles Entstehungsmodell geht von Fehlbasenpaarungen während der Meiose aus. Bekanntlich kommt es während der Meiose zur Paarung homologer Chromosomen mit anschließendem crossing over. Hierbei kommt es an ausgewählten Stellen zur Paarung zweier homologer Chromosomen. Gerade in Bereichen von Multigenfamilien ist die Gefahr der Rasterverschiebung mit ungleichem crossing over gegeben, in deren Endergebnis Genduplikationen resultieren können ( Smith 1976 ). Somit stellen Multigenloci einen Kondensationspunkt in der Entstehung neuer Pseudogene dar.

Die Grenze zwischen Genen und Pseudogenen ist jedoch nur sehr unscharf. Ein Gen kann durch Mutationen inaktiviert und ein Pseudogen durch Mutationen aktiviert werden. Für beide Mechanismen sind Beispiele im Globinlocus gefunden worden ( Jeffreys und Harris 1984 ).


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