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Kapitel 3. Material und Methoden

3.1. Materialien

3.1.1. Geräte

Thermocycler	Biometra TRIO-Thermoblock
Hybridisierungsofen	MWG BIOTECH
Geigerzähler	Series 900 mini-monitor
Stromversorgungsgeräte	GIBCO, Consort, LKB
Zentrifugen	Sigma, Sorvall, Heraeus
Flüssigszintillationszähler	Wallac, LKB
Phosphorimager	Biorad
Transiluminator	AGS
Elektrophoresekammern	BRL, Pharmacia
Kamera	Polaroid
Laminarboxen	Antair
Speed-vac	Savant
Brutschränke	Heraeus
Wasserbäder	MGW-Biotech
Elektroporationsgeräte	Life Technologies, LKB
Photometer	Shimadzu
DNA-Sequencer	MGW Biotech, ABI Prism

3.1.2. Chemikalien

Alle verwendeten Chemikalien besaßen den Reinheitsgrad pro analysi.

Acetyl-Coenzym A	Boehringer Mannheim
Agarose	Serva
Ampicillin	Roth
Bacto Agar	Difco
BactoTrypton	Difco
Bacto Hefe	Difco
Borsäure	Roth
Bromphenolblau	Merck
BSA	Boehringer Mannheim
Chloroform	Baker
dATP, dCTP, dGTP, dTTP	Biolabs
DMEM	Gibco
DMSO	Merck
DTT	Sigma
EDTA	Serva
Ethanol	Baker
Ethidiumbromid	Ferak

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FKS	Gibco
Glucose	Merck
Glycerin	Merck
HCl	Merck
Heringssperma-DNA	Boehringer Mannheim
KCl	Roth
KH2PO4	VEB Laborchemie Apolda
Maltose	BDH
Methanol	Baker
MgCl2	Sigma
MgSO4	VEB Laborchemie Apolda
2-Mercaptoethanol	Serva
NaAc	Roth
NaCl	Roth
NaCitrat	Roth
NaOH	Roth
PEG 6000	Roth
Phenol	Roth
SDS	Serva
Streptomycin	Serva
TRIS	Roth
X-Gal	AGS

3.1.3. Radiochemikalien

[32P] dCTP (3000-6000Ci/mmol)	Amersham
[32P] UTP (800 Ci/mmol)	ICN
[1,2 C14] Chloramphenicol (103 mCi/mmol)	ICN

3.1.4. Synthetische Oligonukleotide

Tabelle 1 Alle verwendeten TCTP/TPT1-Primer: Die Positionen der Kaninchenprimer orientieren sich an der Lage im Gen, während sich die Positionen der humanen Primer, wo möglich, an der korrespondierenden cDNA orientiert. Alle Primer sind von 5’ nach 3’ angegeben. (U=UTR, E=Exonnummer, I=Intronnummer, P=Promotor, ?=genaue Positionsangabe derzeit nicht möglich)

Name	5’ Sequenz 3’	Position	Name	5’ Sequenz 3’	Position
TPT1- Gen Hinprimer Kaninchen	TPT1- Gen RückprimerKaninchen
P2301H	cttttccgcccgctcccc	1 U	P23R10	tgctctccgagaacttcccg	-531 P
P23H9	tccgggctcctgcaagcta	63 U	P23R11	tctgggtgcttgtctaactc	-508 P
P23H5	tctcctaccagccgccat	98 U	P23R9	tagcttggcaggagcccgga	63 U
P23Nco5'	taccagccgccaccatggtt	103 UE	HMO-TAPR2	tcttgtagatgtcggagaac	375 E2
P23H8	tccgacatctacaagatccg	379 E2	LX2R4	gatgagcgaatcatcaatgt	964 E3
LX2H4b	acattgatgattcgctcatc	964 E3	LX2R3	caatatcaacaccagtgatc	1037 E3
P23H7	caagcacatccttgctaa	1536 E4	P23I1R	gtatgctcacattgctcag	1267 I3
P23H6	ggtgaaaacatgaatccaga	2325 E5	HMO-TAPR1	ccatctggattcatgttttc	2328 E5
P23I3H	gggcttagaatcttgattc	2628 I5	LX2R1	catctctaaaccatcctta	2405 E5
P23648H	tggatctatcactgctcatc	3306 U	P23-635R	ttaacatttttccatctctaa	2415 E5
P23H10	acttcaagtggaggcattgt	3422 U	P23I3R	caatctgggctgccacaa	3197 I5
P23H4	gagagaatgcctattagt	3504 U	LX2R0	agacaacctacatgacaatg	3457 U
P23H11	cctacaacggaagtagctaac	3756 U	P23R1	tgtagaagttatctgaag	3613 U
			P23R3	caactcaatcagtctctc	3802 U

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Name	5’ Sequenz 3’	Position	Name	5’ Sequenz 3’	Position
TPT1-Gen/cDNA Hinprimer Mensch	TPT1-Gen/cDNA Rückprimer Mensch
hP23PromH	atgcaccgggaatacaactg	?	P23-37R	ccaacctcatatagagggca	-37 P
P23-37H	tgccctctatatgaggttgg	-37 P	hP23-1R	aggggggagcgggcggaaaag	1 E
hP23-293H	gaaggtaccgaaagcacagt	292 E	hP23-333R	ctgcaggtgatggttcatga	332 E
hP23-I4H	tccggaagtatcttatggcc	? I4	hP23-654R	tgatgacaggtgatagatcc	653 E
hP23-I4H2	gtggtctaaaccttcccttg	? I4	hP23-U2R	ccactgaatgagtctcttttt	1135 U
hP23-635H	caaatgtggcaattattttg	634 E
hP23-U2H	atttgagagaatgccttttag	851 U

Zum Screening von Rekombinanten wurden folgende Primer verwendet:

CAT3-H2 5’ AGTCACGACGTTGTAAAACG 3’ Position 367 bp im Vektor pBLCAT3

CAT3-R2 5’ CCTTAGCTCCTGAAAATCTC 3’ Position 479 bp im Vektor pBLCAT3

Alle Oligonukleotide wurden von der Firma TIB Mol-Biol (Berlin) im Synthesemaßstab 0,2 µmol bezogen.

3.1.5. Enzyme, Kits und sonstiges

Restriktionsendonukleasen, Ligasen, Polymerasen,	Boehringer, AGS, Biolabs, Fermentas
CIP, RNAsin, Proteinase K, Nukleasen	Clontech, Invitrogen, MBI, Biolabs
PCR-Script™Amp Cloning Kit	Stratagene
Human monocyte cDNA library	Clontech
Human RNA Master Blot™	Clontech
P1-Bank gene discovery array	Genome Systems
QIAquick PCR Purification Kit	QIAGEN
QIAEX II Gel Extraction Kit	QIAGEN
QIAGEN Plasmid Mini/Maxi Kits	QIAGEN
QIAquick Nucleotide Removal Kit	QIAGEN
Random Primed DNA Labeling Kit	Boehringer
Hybond - N	Amersham
Immobilon™ - N	Millipore
Kodak BioMax MR film	Kodak
Polaroid Polapan PRO 100 film	Polaroid
DC-Plastikfolien 20 x 20 cm Kieselgel 60	Merck
Micro BCA™ Protein Assay Reagent Kit	Pierce

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3.1.6. Soft- und Hardware

Diese Arbeit wurde auf einem Macintosh Computer (Power Macintosh G3) realisiert. Als Textverarbeitung kam Microsoft Office 98 zum Einsatz. Als Werkzeuge zum Bearbeiten und Analysieren von DNA-, RNA- und Proteinsequenzen wurden DNA-Strider 1.2, das DNAStar-Programm und GCG benutzt. Graphiken wurden mit Canvas und Adobe Photoshop erstellt und bearbeitet. Auf folgende Internetresourcen wurde zurückgegriffen:

http://www.ebi.ac.uk	Sequenzvergleiche, Zugriff auf EMBL-, GenBank-, Swissprot Datenbanken
http://transfac.gbf.de	Zugriff auf TransFac-Datenbank und MatInspector® Programm

3.2. Methoden

3.2.1. Polymerase-Kettenreaktion (PCR)

Ein Standart-PCR Ansatz setzte sich wie folgt zusammen: 18,75 µl H20, 0,75 µl 50mM MgCl2, 2,5 µl 10x PCR-Puffer, 1 µl 10 µM Hinprimer, 1 µl 10 µM Rückprimer, 0,5 µg Template-DNA und 0,25 µl Taq-Polymerase von InViTek 1 U/µl. Die Annealing-Temperaturen wurden unter Verwendung der Formel Tm=69,3 °C + 0,41 x (GC%) - 650/Primerlänge + 3°C abgeschätzt. Die weiteren PCR Bedingungen wurden angelehnt an das Protokoll von Kramer und Coen ( Kramer und Coen 1995 ).

3.2.2. Radioaktiv markierte Sonden

“random primed DNA labeling“

100 ng gereinigte PCR-Fragmente (Protokoll von QIAgen) wurden mit 5 µl [³²P]-dCTP (3000-6000 Ci/mMol) und 2 µl Hexanukleotid-Primer-Mix nach dem Protokoll von Boehringer Mannheim radioaktiv markiert, von restlichen radioaktiven Nukleotiden mit Affinitätssäulen nach dem Protokoll von QIAgen befreit und nach 5 min Kochen zur Hybridisierungslösung gegeben.

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1 µg linearisierte Plasmid-DNA wurde unter Verwendung von 2,5µl [³²P]-UTP (800 Ci/mmol) und T3 oder T7 Polymerase nach dem Protokoll von Promega (Promega Riboprobe^® in vitro system) generiert. Die Entfernung überschüssiger Nukleotide erfolgte durch Fällung der RNA-Sonde mit 2,5Vol Äthanol und 1/10Vol. 3M NaAc für 30 min. bei -80°C und 2 maliger Waschung mit -20°C kaltem 70%igem Äthanol. Nach Aufnahme in 100µl 1xTE-Puffer wurde die Sonde der Hybridisierungslösung zugegeben.

3.2.3. Southernblots

40 µg Kaninchen-DNA aus der Leber wurden 8 h mit Restriktionsenzymen gespalten. Die Reaktionen wurden mit dem vom Enzymhersteller empfohlenen Puffersystem und 3 U Enzym/µg DNA in einem Endvolumen von 400 µl durchgeführt. Die Anreicherung der DNA geschah nach Phenol/Chloroformextraktion und Fällung in 70% Äthanol bei -80 °C in 20 µl 1xTE. Die Auftrennung der Proben erfolgte in einem 1% Agarosegel über Nacht. Nach Photographie des Gels erfolgte dessen Übertragung auf eine Nylonmembran mittels Kapillartransfer in 20xSSC. Die Keuzvernetzung der DNA mit dem Filter wurde bei 80°C für 2h im Heißluftofen durchgeführt ( Southern 1975 ).

3.2.4. Hybridisierungen mit DNA und RNA Sonden

Die Prähybridisierung des Blots erfolgte 2h bei 68°C im Hybridisierungsofen. Die Hybridisierung wurde über Nacht in Hybridisierungslösung ebenfalls bei 68°C durchgeführt. Der Blot wurde anschließend mehrmals (4-6 mal) in Waschpuffern mit absteigender Salzkonzentration (2x SSC/0,1%SDS, 1x SSC/0,1% SDS, 0,5x SSC/0,1% SDS, 0,1x SSC/0,1% SDS) von unspezifisch gebundener Radioaktivität befreit. Die Temperaturen (45°C - 65°C) und Waschzeiten (1h-8h) richteten sich nach der detektierbaren Hintergrundaktivität ( Maniatis et al. 1989 ). Die Exposition erfolgte mit Röntgenfilmen bei -80°C für 1h -2d je nach Signalstärke.

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3.2.5. Sequenzierungen

Die Sequenzierungen erfolgten per Auftrag durch die Firma InViTek Berlin nach der Methode von Sanger (Didesoxy-Methode) mit fluoreszensmarkierten Nukleotiden auf dem ABM Prism Sequencer Model 2.1.1., oder selbst von Hand mit ³⁵S markiertem dATP und dem Sequenzierungskit der Firma USB ( Maniatis et al. 1989 ).

3.2.6. Screening einer genomischen Lambda DASH^® Phagenbank

Das Screening der genomischen Kaninchenphagenbank Lamda DASH^® II orientierte sich am Firmenprotokoll von Stratagene. Die Plaquedichte wurde so gewählt, daß auf 16 Platten (_ 13 cm) mit je etwa 30 000 pfu das Kaninchengenom statistisch 2-3 mal vertreten war. Nach partieller Spaltung der DNA mit Sau3AI erfolgte der Einbau von 9-22 kb großen Fragmenten in den Lamda DASH^® II Phagenvektor. Als Sonde fand ein markiertes PCR Fragment Verwendung, das ein Teilamplifikat aus dem kodierenden Teil des TCTP-cDNA-Klones 31/1 darstellte (Primer LX2H4/LX2R1). Nach Primär-, Sekundär- und Tertiärscreening gelang die Isolierung von 13 Pseudogenklonen (1-13) und einem TPT1-Gen-Klon (H1). Die Präparation von -DNA wurde Maniatis et al. 1989 entnommen. Durch erneutes Screening der Bank mit Hilfe einer radioaktiv markierten Intronsonde wurden zwei weitere genomische TPT1-Klone gewonnen (H2, H3), wobei geeignete Restriktionsfragmente des Klon H2 weiter subkloniert und analysiert wurden.

3.2.7. Screening einer P1-Bank nach genomischen Human-TPT1-Klonen

Die Vorgehensweise der Klonsuche ist dem Kap. 4.3.5 zu entnehmen. Die weitere Subklonierung von Restriktionsfragmenten des P1 Klones 231/E12 wurde wie folgt gestaltet. Klon 18: Der Klon E12 wurde XbaI/NotI gespalten und das Gemisch aller Fragmente in einen XbaI/NotI linearisierten pBLSK+ Vektor ligiert. Mit einem radioaktiv markierten PCR-Fragment aus Klon E12 (Primer: P23-37H/HMO-TAP-R2) wurden per Koloniehybridisierung positive Bakterienklone selektiert. Die Analyse des Inserts von Klon 18 ergab eine Größe von 6,6 kb. Der NotI Ort lag im Intron 1 während sich der XbaI Ort stromaufwärts des Gens befand. Klon 18/BglII/XbaI: Klon 18 wurde mit BglII/XbaI geschnitten und unter Deletion eines 6,1 kb Fragmentes religiert. Dieser Klon enthält 501 bp des humanen TPT1-Promotors.

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3.2.8. Subklonierung genomischer Fragmente

H2-EcoRI: Der das Kaninchen-TPT1-Gen enthaltene -Klon H2 wurde mit EcoRI gespalten und das durch Southernblots identifizierte 6,8 kb Fragment aus dem Gel eluiert. Dieses wurde in einen EcoRI geschnittenen und Phosphatase behandelten pBLSK + Vektor ligiert. H7: Der Klon H2-EcoRI wurde mit NheI gespalten und das 0,9 kb große NheI/NheI Fragment aus dem Gel eluiert. Dieses Fragment wurde in einen XbaI geschnittenen und Phosphatase behandelten pBLCAT3 Vektor ligiert. Die Orientierung des Fragmentes wurde durch HindIII-Spaltung überprüft. H12: Der Klon H2-EcoRI wurde mit NheI und HindIII gespalten und das 460 bp große Fragment aus dem Gel eluiert. Dieses wurde in einen HindIII/XbaI geschnittenen pBLCAT3 Vektor ligiert. H33: Der Klon H12 wurde mit EcoNI und HindIII gespalten, das 4 kb große pBLCAT3 Vektorfragment isoliert, die Enden mit der Klenow-Polymerase aufgefüllt und anschließend religiert. H27/H31: Das einklonierte Fragment des Klones H12 wurde mit Hilfe flankierender Primer (CAT3H2/CAT3R2) unter Einschluß von Teilen des Polylinkers per PCR in quantitativen Mengen amplifiziert, isoliert und anschließend mit RsaI bzw. MspAI nachgespalten. Diese Fragmente wurden in den HindIII gespaltenen, mit Hilfe von Klenow-Polymerase glattendig gemachten und anschließend BamHI gespaltenen pBLCAT3 Vektor einkloniert (H27=BspMI, H31=RsaI). TPT1-ps1/2/3/4: Southernblots mit EcoRI gespaltener DNA der Klone 1-13 wurden mit einer TCTP-kodierenden Sonde hybridisiert und autoradiographisch dargestellt. Die in Abb. 4-21 markierten Banden wurden aus Agarosegelen extrahiert, in den mit EcoRI linearisierten und Phosphatase behandelten Vektor pBLSK+ ligiert und die TPT1-Pseudogen enthaltenen Bereiche anschließend sequenziert. H21, H14, H25: 1 (TPT1-ps3), 7 (TPT1-ps1) und 9 (TPT1-ps2) DNA wurde mit NheI und XbaI gespalten und die 700, 800 und 2000 bp großen Banden in einen XbaI linearisierten und Phosphatase behandelten pBLSK+ Vektor ligiert. Die positiven Klone wurden durch Spaltung mit BamHI auf die richtige Orientierung überprüft. H35: Das 1,2 kb große HindIII/NheI Fragment aus dem Klon 12 (TPT1-ps4) wurde in HindIII/NheI linearisierten pBLSK+ ligiert.

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Tabelle 2 Kurzübersicht verwendeter Vektoren und Klone, sowie Größen, Orientierungen und Inhalte der Inserts.

Klon	Insert Größe	Insert Orient.	Insert enthält ...	Vektor
H2	15 kb	?	Kan. TPT1-Gen komplett	l-DASHII
H2-EcoRI	7 kb	-	Kan. TPT1-Gen komplett	pBLSK +
H2-SmaI	4 kb	+	Kan. TPT1-Gen ab Intron 1	pBLSK +
H7	0,9 kb	+	Kan. TPT1-Promotor	pBLCAT3
H12	0,49	+	Kan. TPT1-Promotor	pBLCAT3
H33	0,37	+	Kan. TPT1-Promotor	pBLCAT3
H27	0,25	+	Kan. TPT1-Promotor	pBLCAT3
H31	0,15	+	Kan. TPT1-Promotor	pBLCAT3
231/E12	100 kb	?	Human TPT1-Gen komplett	P1
Klon18	6,6 kb	?	Human TPT1-Gen bis Intron1	pBLSK+
Klon18/BglII/XbaI	0,5 kb	?	Human TPT1-Gen bis Intron1	pBLSK+
H14	0,8	+	TPT1-ps1-Promotor	pBLCAT3
H25	2,0	+	TPT1-ps2-Promotor	pBLCAT3
H21	0,7	+	TPT1-ps3-Promotor	pBLCAT3
H35	1,2 kb	+	TPT1-ps4-Promotor	pBLCAT3
1-13	15 kb	?	TPT1-Pseudogene	l-DASHII
2-EcoRI7-EcoRI13-EcoRI	1,8 kb	?	TPT1-ps1	pBLSK+
9-EcoRI	2,5 kb	?	TPT1-ps2	pBLSK+
1-EcoRI	2,5 kb	?	TPT1-ps3	pBLSK+
12-EcoRI	3,0 kb	?	TPT1-ps4	pBLSK+
H40	0,39 kb	-	Kaninchen kodierend aus TCTP-mRNA	pCRScript SK+
hP23/3’UTR2	0,69 kb	+	Human, komplette TCTP-3’UTR2	pCRScript SK+

3.2.9. CAT-Assays

Glatte Aorta-Muskelzellen vom Kaninchen (S. Ylä-Herttuala, Kuopio, Finnland) wurden in DMEM unter Zusatz von 10% FKS, 50 µg/ml Penicillin und 50 µg/ml Streptomycin kultiviert. 5 x 10⁶ Zellen wurden pro Ansatz mit 30 µg CAT-Konstrukt-Plasmid und 8 µg beta-Gal-Plasmid nach der Elektroporatiosmethode kotransfiziert ( Bergot et al. 1992 ). Die Bestimmung der CAT Enzymaktivität wurde entsprechend der Vorschrift von Gorman et al. ( Gorman et al. 1982 ) durchgeführt. Dazu wurden die Zellen nach 48h in Zellkultur abzentrifugiert, ein Proteinextrakt präpariert und die Proteinkonzentration nach einer modifizierten Biuret-Methode (Micro BCA Protein Assay Kit, Pierce, USA) bestimmt. Aus 90 µg Proteinextrakt wurden die 14C-markierten acetylierten Chloramphenicol-Produkte angereichert und dünnschichtchromatographisch aufgetrennt. Nach Exposition der Kieselgelplatten gegen einen Röntgenfilm wurden die Acetylierungsprodukte auf den Platten markiert, ausgeschnitten und die Stärke der Aktivität im Szintillationszähler quantifiziert. Zur Kalibrierung der Unterschiede in der Transfektionseffizienz wurde die gemessene Aktivität durch Bestimmung der

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3.2.10. Dotblots

Aus einer humanen Monozyten-cDNA-Bank wurden per PCR ein 388 bp großes kodierendes Fragment (Primerkombination P23-H8/HMO-TAP-R1) und ein 690 bp großes Fragment aus der humanen 3’UTR2 der TCTP-cDNA (Primerkombination hP23-U2H/hP23-U2R) amplifiziert und mit dem pCR-Script™ Amp.SK+ Kloniersystem von Stratagene subkloniert. Nach Verifizierung der PCR-Produkte durch Sequenzierung und enzymatischer Linearisierung der Vektoren wurden mit dem Promega Riboprobe^® in vitro System radioaktiv markierte Transkripte generiert. Mit diesen Sonden wurde ein kommerziell erhältlicher RNA-Dotblot mit Poly(A)+RNA aus 50 verschiedenen menschlichen Geweben (Human Master Blot, Clontech) nacheinander im Abstand von 3 Monaten nach Abklingen der Aktivität hybridisiert. Nach der Anfertigung autoradiographischer Aufnahmen (die Expositionszeit für den mit der kodierenden Sonde hybridisierten Blot betrug 4 h und für die 3‘UTR2-spezifische Sonde 2 Tage) wurden mit zwei verschiedenen Phosphorimagersystemen von Biorad (Modell GS-525 und Modell FX) die Signale jeweils quantitativ ausgewertet.

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