Thiele, Holger: Struktur und Funktion des Gens für das translationell kontrollierte Tumorprotein (TCTP)

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Kapitel 6. Zusammenfassung

Die vorliegende Arbeit beschreibt die bisher unbekannte, vollständige Struktur des Gens für das translationell kontrollierte Tumorprotein (TCTP) bei Mensch und Kaninchen und legt erstmals funktionelle Daten zur Kontrolle seiner Transkription vor.

Der Name des Proteins geht auf seine erstmalige Beschreibung in Tumorzellen zurück, sowie auf Besonderheiten seiner spezifisch auf der Translationsebene kontrollierten Synthese. Entsprechend der „human genome database“ Nomenklatur wird das Gen, das für TCTP kodiert, mit TPT1 bezeichnet.

TCTP ist ein ubiquitär im Tier- und Pflanzenreich verbreitetes Protein mit bisher nicht genau bekannter physiologischer und molekularer Funktion. Bindungsstudien sowie Untersuchungen zu seiner intrazellulären Lokalisation haben gezeigt, daß es im Bereich des Zytoskeletts stark vom Zellzyklus abhängig an Tubulin bindet, sowie eine hohe Affinität zu Kalzium-Ionen hat. Von besonderem medizinischen Interesse ist die Eigenschaft des TCTP, als Histamin freisetzender Faktor (histamine releasing factor=HFR) wirken zu können. Die basophilen Leukozyten vieler atopischer Kinder mit Hautekzemen und Nahrungsmittelunverträglichkeiten reagierten auf TCTP mit einer IgE-abhängigen Histaminausschüttung. Damit könnte sich das Protein als ein Schlüssel zum Verständnis der in Industriestaaten zunehmend wichtiger werdenden allergischen Erkrankungen erweisen.

Grundlage für das Verständnis der Synthese eines Proteins sind Kenntnisse über Struktur und Regulation der Expression seines Gens. Die Expression eines Gens wird hauptsächlich auf der Transkriptionsebene determiniert. Aber auch posttranskriptionelle Regulationsprozesse auf der mRNA- und Proteinebene können von Bedeutung sein. Es war bekannt, daß Stimulatoren der Genexpression wie Phorbolester (TPA), Lipopolysaccharide (LPS), Interleukine (IL-3), Dimethylsulfoxid (DMSO) oder Schwermetalle zu einer Induktion der TCTP-Synthese führen. Dies sprach für eine starke Beteiligung der Kontrollebene der Transkription.

Da die Promotor- und Genstrukturen bisher von keiner Spezies bekannt waren, mußten diese zunächst aufgeklärt werden. Dazu wurde das Human- und ein Tiermodell (Kaninchen) gewählt. Am Beginn wurden genomische Rekombinanten des Kaninchen-Gens isoliert und sequenziert.


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Vergleiche mit cDNA-Sequenzen ergaben die vollständige Genstruktur. Das relativ kleine Gen von 3819 Nukleotiden Länge erwies sich als typisch für Eukaryonten. Es umfaßt sechs Exons (144 bp, 74 bp, 191 bp, 106 bp, 117 bp, 531 bp), die von fünf Introns unterbrochen werden (220 bp, 503 bp, 331 bp, 746 bp, 856 bp). Das Gen kodiert für zwei verschiedene mRNAs von 843 nt und 1163 Nukleotiden Länge, die sich durch Verwendung alternativer Polyadenylierungssignale nur in der Länge der 3’-untranslatierten Sequenzen (3’UTR) unterscheiden. Beide mRNAs konnten aus einer cDNA Bank isoliert und ihre Struktur vollständig aufgeklärt werden. Weiterhin wurden 1,2 kb der 5’-flankierenden Region des Gens sequenziert, die die wesentlichen Promotorstrukturen enthält.

Nach der Analyse des Kaninchen TPT1-Gens wurde auch die Struktur des Human-Gens vollständig aufgeklärt. Während der Arbeiten am Kaninchen-Gen wurde eine 3’-terminale Teilsequenz des Human-Gens publiziert, die jedoch nur etwa einem Drittel seiner Gesamtlänge entsprach und auch keine Promotorstrukturen enthielt. Deshalb wurde der Versuch unternommen, die Struktur des Human-Gens zu vervollständigen. Es wurde eine genomische Rekombinante aus einer Human-Bank isoliert, die das komplette Gen enthielt. Es wurde vollständig sequenziert, einschließlich 0,5 kb seiner Promotorregion. Das Human-Gen ist 4259 Nukleotide lang, besitzt eine identische Intron/Exon Architektur wie das Kaninchen-Gen und wird ebenfalls in zwei mRNAs transkribiert, die sich in der Struktur ihrer 3’-UTR unterscheiden.

Die Transkriptionskontrolle vieler Gene spiegelt sich häufig in unterschiedlicher Genaktivität in verschieden Geweben wider. Dies läßt sich durch Quantifizierung der gebildeten mRNA-Menge untersuchen. Das Ausmaß der Transkription des TPT1-Gens in den verschiedenen Geweben von Mensch und Kaninchen wurde mittels Northern- und RNA Dotblot-Analysen untersucht. Die Ergebnisse zeigen, daß beide mRNAs in allen untersuchten Geweben von Mensch (50) und Kaninchen (10) transkribiert werden, aber mit großen quantitativen Unterschieden. Die Expressionsstärke unterschied sich bis zum Faktor 100 zwischen stark exprimierenden Geweben, wie glatten Muskelzellen, und schwach exprimierenden, wie Geweben des ZNS. Dies spricht für eine ausgeprägte Transkriptionskontrolle unter der Mitwirkung gewebsspezifischer Faktoren.

Die Verfügbarkeit der Sequenzen der Promotorregionen des Kaninchen- als auch des Human-Gens machte es möglich, eine Computeranalyse von möglichen Bindungsorten


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für Transkriptionsfaktoren zu erstellen und diese mit einer vergleichenden Betrachtung konservierter Sequenzregionen zu verbinden. Denn häufig sind bedeutsame Bindungsregionen zwischen den Spezies evolutionär konserviert und der Wert der Vorhersage erhöht sich damit beträchtlich. Die ersten 160 bp beider Promotoren erwiesen sich als zu 89% homolog, und alle Bindungsstellen für Transkriptionsfaktoren (TF) sind in diesem Bereich konserviert. Dazu gehören zwei TF aus den Familien CREB/AP-1, zwei ETS-1 Faktoren, ein SP-1 Faktor und ein MZF-1 Faktor. Die in ihrer Homologie stark nachlassenden stromaufwärtsliegenden Promotorsequenzen haben noch konservierte Bindungsstellen für die Faktoren NF-1, MZF-1 und STAT-1.

Um funktionelle Aussagen über die Transkriptionseffizienz des Kaninchenpromotors zu erhalten, wurden CAT-Assays durchgeführt. Dazu wurde der Promotor fragmentiert, an ein cat-Reportergen gekoppelt und nach transienter Transfektion in glatte Muskelzellen die Promotorstärke der einzelnen Teile durch Messung der CAT-Enzymaktivität ermittelt. Ein minimales Promotormotiv läßt sich auf 66 bp eingrenzen. Hier befinden sich eine TATA-Box und die Bindungsorte für einen CREB/AP-1 und einen MZF-1 Faktor. Innerhalb von 166 bp konnte kein weiterer Anstieg der Aktivität gemessen werden. Die Faktoren, die in diesem Bereich binden könnten sind zwei ETS-1, ein CREB/AP-1 und ein SP-1. Einen sprunghaften Anstieg der Aktivität bis 90% gegenüber dem zur Kontrolle verwendeten starken Thymidinkinasepromotor des HSV1-Virus verzeichnet das nächst größere Fragment von 291 bp. Im Kaninchengen kommen hier zwei NF-1 und eine MZF-1 Bindungsstelle, im Human-Gen ein NF-1-Ort in entgegengesetzter Orientierung, ein SP-1 und ein MZF-1 Ort vor. Alle größeren Promotorfragmente fallen in ihrer Aktivität wieder leicht (70-80%) ab, was auf die Anwesenheit eines Transkriptions-Silencers hindeutet. Hier ist vor allem eine konservierte Bindungsstelle für STAT-1 zu erwähnen.

Das gemeinsame Merkmal beider Promotoren ist die Häufung von Bindungsstellen für TF im Bereich der stark konservierten 160 bp proximal zum Transkriptionsinitiationsort, die man als Protooncogene in vielen wachstumsregulierten Genen findet. Dazu gehören ETS-1 und CREB/AP-1. Eine besondere Eigenschaft der CREB/AP-1 Familien, zu denen z.B. CREB1, CRE-BP1, c-Jun und c-Fos gehören, ist die Fähigkeit, als einer der Kreuzungspunkte der intrazellulären Signalwege (Proteinkinase A und Proteinkinase C) auf extrazelluläre Stimuli zu reagieren. Die Bindungsstelle für AP-1 wird auch Phorbolester (TPA)-responsibles Element


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(TRE) genannt, da Phorbolester bekanntermaßen zur Aktivierung der TF c-Jun und c-Fos führen. Auch Lipopolysaccharide greifen in diese Signaltransduktionsprozesse ein. Dies würde erklären, wie es zur Aktivierung des TPT1-Gens durch diese Substanzen kommt.

Southernblot-Analysen konnten eine Vielzahl von Sequenzelementen in genomischer Kaninchen DNA nachweisen, die neben dem aktiven TPT1-Gen mit TPT1-Sonden hybridisieren. Als Ursache für diese komplexe Verteilung TPT1-homologer Elemente im Kaninchengenom konnten intronlose prozessierte TPT1-Pseudogene identifiziert werden. Da dieses Phänomen sowohl bei der Maus als auch beim Menschen nachweisbar ist, kann man hier von einer speziesübergreifenden Besonderheit des TPT1-Gens ausgehen. Aus einer genomischen Bank wurden Rekombinanten der Pseudogene isoliert. Von insgesamt über 30 Primärklonen wurden 13 näher charakterisiert und sechs Pseudogene vollständig sequenziert. Von diesen sechs Klonen enthielten vier unterschiedliche Pseudogene mit unterschiedlicher Struktur und unterschiedlichen flankierenden genomischen Integrationssequenzen. Die Pseudogene TPT1-ps1 und TPT1-ps2 sind Abkömmlinge der kurzen TCTP-mRNA1, während die Klone TPT1-ps3 und TPT1-ps4 die lange TCTP-mRNA2 repräsentieren. Alle Pseudogene sind zu über 98% homolog zur korrespondierenden mRNA, haben keine, bzw. keine gravierenden Aminosäureaustausche und besitzen alle einen offenen Leserahmen. Um eine mögliche Promotor-Aktivität und damit Exprimierbarkeit der Pseudogene zu untersuchen, wurden analog zum aktiven TPT1-Gen CAT-Assays mit klonierten 5’-flankierenden Fragmenten der Pseudogene durchgeführt. Das Pseudogen TPT1-ps4 zeigte hierbei eine Aktivität, die mit der basalen Promotorstärke des TPT1-Gens vergleichbar war. Das Pseudogen TPT1-ps2 hatte eine etwa halb so große Aktivität. Ob diese Pseudogene eine biologische Relevanz besitzen und sie in vivo exprimiert werden ist jedoch ungeklärt.


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Mon May 29 13:40:59 2000