Thiele, Holger: Struktur und Funktion des Gens für das translationell kontrollierte Tumorprotein (TCTP)

Aus dem Institut für Biochemie
der Medizinischen Fakultät Charité
der Humboldt-Universität zu Berlin


DISSERTATION
Struktur und Funktion des Gens für das translationell kontrollierte Tumorprotein (TCTP)

Zur Erlangung des akademischen Grades doctor medicinae (Dr. med.)

vorgelegt der Medizinischen Fakultät Charité
der Humboldt-Universität zu Berlin

von Holger Thiele,
aus Hennigsdorf

Dekan: Prof. Dr. med. Dr. h.c. R. Felix

Gutachter:
Prof. Dr. H. Kühn
PD Dr. P. Nürnberg
Dr. U. Bommer

Datum der Einreichung: Juni 1999

Datum der Promotion: 28. Februar 2000


Seiten: [1] [2] [3] [4] [5] [6] [7] [8] [9] [10] [11] [12] [13] [14] [15] [16] [17] [18] [19] [20] [21] [22] [23] [24] [25] [26] [27] [28] [29] [30] [31] [32] [33] [34] [35] [36] [37] [38] [39] [40] [41] [42] [43] [44] [45] [46] [47] [48] [49] [50] [51] [52] [53] [54] [55] [56] [57] [58] [59] [60] [61] [62] [63] [64] [65] [66] [67] [68] [69] [70] [71] [72] [73] [74] [75] [76] [77] [78] [79] [80] [81] [82] [83] [84] [85] [86] [87] [88] [89] [90] [91] [92] [93] [94] [95] [96] [97] [98] [99] [100-108]

Inhaltsverzeichnis

TitelseiteStruktur und Funktion des Gens für das translationell kontrollierte Tumorprotein (TCTP)
Widmung
Einleitung
Abkürzungsverzeichnis Abkürzungsverzeichnis
1 Aufgabenstellung
2 Einleitung
2.1. Die Funktion des translationell kontrollierten Tumorproteins (TCTP)
2.1.1. TCTP - das wachstums-und translationell regulierte Protein
2.1.2. TCTP - das Strukturprotein
2.1.3.TCTP - der Histamin-Releasing-Factor (HRF)
2.2. Die verschiedenen Ebenen der Expressionskontrolle
2.3. Die Regulation der Transkription
2.3.1. Der Aufbau eukaryontischer Gene
2.3.2. Prinzipien der Transkriptionsregulation
2.3.3. Allgemeine Transkriptionsfaktoren
2.3.4.Spezielle Transkriptionsfaktoren
2.4.Die Entstehung von Pseudogenen
2.4.1. Die Organisation und Evolution des Kern-Genoms
2.4.2. Prozessierte Pseudogene
2.4.3. Nicht prozessierte Pseudogene
3 Material und Methoden
3.1. Materialien
3.1.1. Geräte
3.1.2. Chemikalien
3.1.3. Radiochemikalien
3.1.4. Synthetische Oligonukleotide
3.1.5. Enzyme, Kits und sonstiges
3.1.6. Soft- und Hardware
3.2. Methoden
3.2.1. Polymerase-Kettenreaktion (PCR)
3.2.2. Radioaktiv markierte Sonden
3.2.3. Southernblots
3.2.4. Hybridisierungen mit DNA und RNA Sonden
3.2.5. Sequenzierungen
3.2.6. Screening einer genomischen Lambda DASH® Phagenbank
3.2.7.Screening einer P1-Bank nach genomischen Human-TPT1-Klonen
3.2.8. Subklonierung genomischer Fragmente
3.2.9. CAT-Assays
3.2.10.Dotblots
4 Ergebnisse
4.1. Die Strukturen der TCTP-mRNAs
4.1.1.TCTP-mRNA-Varianten mit alternativen 3’UTRs
4.1.2. Unterschiede in der gewebsspezifischen Transkription der TCTP-mRNAs bei Mensch und Kaninchen
4.2.Aufklärung der Struktur des TPT1-Gens des Kaninchens
4.2.1.Genomische Southernblots
4.2.2. Screening einer Lambda DASHII Phagenbank
4.2.3. Subklonierung und Kartierung des TPT1-Gens
4.2.4. Vollständige Sequenzierung des Gens und Aufklärung der Intron-Exon Übergänge
4.2.5.Genomische Southernblots mit intron- und exonkodierenden Sonden
4.3. Funktionelle Analyse der Promotorregion des TPT1-Gens des Kaninchens
4.3.1. Klonierung von CAT-Reportergenkonstrukten aus Teilen des Promotors
4.3.2. Transfektion von glatten Kaninchenmuskelzellen (SMC) mit TPT1-Promotorgenkonstrukten
4.3.3. Transfektion einer humanen Zellinie mit dem CAT-Konstrukt -918/+80
4.3.4. Analyse der CpG-Inseln des TPT1-Gens
4.3.5. Mögliche TF-Bindungsstellen im TPT1-Promotor des Kaninchens
4.4. Aufklärung der Struktur des humanen TPT1-Gens
4.5. Analyse von 13 TPT1-Pseudogenklonen
4.5.1. Subklonierung von genomischen Fragmenten
4.5.2. Sequenzierung und Analyse der Pseudogene
4.5.3. Untersuchung der flankierenden Bereiche der Pseudogene
4.5.4. Promotoraktivität der 5’-flankierenden Regionen der Pseudogene
5 Diskussion
5.1.Ein Vergleich der TPT1-Gene von Mensch und Kaninchen
5.2.Die Transkriptionsregulation des TPT1-Gens
5.2.1. Auswertung der CAT-Assays und Analyse der Promotorsequenzen
5.2.2.Vergleich der TPT1-Promotoren von Mensch und Kaninchen
5.2.3. TPT1-Induktoren
5.2.4. Beschreibung der potentiell bindenden TF
5.3.Die Strukturen der TCTP-mRNAs
5.4.(Un)sinn der Pseudogene
5.5. Ausblicke
6 Zusammenfassung
Bibliographie Literaturverzeichnis
Danksagung
Selbständigkeitserklärung
Lebenslauf
Anhang A Publikationsliste

Tabellenverzeichnis

Tabelle 1 Alle verwendeten TCTP/TPT1-Primer: Die Positionen der Kaninchenprimer orientieren sich an der Lage im Gen, während sich die Positionen der humanen Primer, wo möglich, an der korrespondierenden cDNA orientiert. Alle Primer sind von 5’ nach 3’ angegeben. (U=UTR, E=Exonnummer, I=Intronnummer, P=Promotor, ?=genaue Positionsangabe derzeit nicht möglich)
Tabelle 2 Kurzübersicht verwendeter Vektoren und Klone, sowie Größen, Orientierungen und Inhalte der Inserts.
Tabelle 3 Aufbau des Multigewebedotblots: mRNA von 50 adulten (Reihe A-F) und fetalen (Reihe G) Geweben des Menschen wurden als Dotblot auf eine Membran aufgetragen. Alle Gewebe wurden durch Hybridisierung mit verschiedenen Haushaltsgensonden so quantitativ kalibriert, daß deren Signalstärke in allen Geweben gleich ist. Reihe H enthält verschiedene Negativkontrollen und erlaubt Aussagen über mögliche Kreuzhybridisierungen.
Tabelle 4 Intron-Exon Übergänge des TPT1-Gens des Kaninchens: Die erste Zeile zeigt die allgemeine Konsensussequenz der Intron/Exonübergänge von vielen Genen ( Alberts et al. 1995 ). Die anderen Zeilen stellen die TCTP Intron/Exonübergänge gegenüber. In allen Fällen beginnen die Introns mit GT und enden mit AG. Diese Positionen sind für den Erkennungsmechanismus der Spleißosomen ausschlaggebend. Alle anderen zum Konsensus gehörenden Positionen sind mehr oder weniger stark konserviert.
Tabelle 5 Zielsequenzduplikationen in den flankierenden Bereichen von vier TPT1-Pseudogenen.
Tabelle 6 Größen der Exons (E) und Introns (I) der TPT1-Gene des Kaninchens und des Menschen (in bp) und ihre Homologien untereinander
Tabelle 7 Gegenüberstellung von Bindungsmotiven für TF im Human- und Kaninchenpromotor: Dargestellt werden die Positionen, Orientierungen (+/-), prozentualen Matrixübereinstimmungen und Bindungsmotive der TF. Der 4 bp und großbuchstabig dargestellte Teil des Bindungsmotives entspricht der Kernsequenz der Bindung und entspricht bei allen TF 100% (Ausnahme STAT-1 beim Kaninchen).
Tabelle 8 Potentielle Bindungsmotive für TF in Introns des Kaninchen TPT1 Gens
Tabelle 9 Die flankierenden Bereiche von zwei humanen TPT1-Pseudogenen vom prozessierten Typ. ZSDs sind unterstrichen.

Abbildungsverzeichnis

Abb. 2-1 Interspezies-Sequenzalignment bisher veröffentlichter TCTP-Proteinsequenzen (Stand 8/98): Von den aufgelisteten 17 Proteinsequenzen sind Vertreter der Primaten, Nager, Vögel, einzelliger Eukaryonten, Nematoden, Protozoen und Pflanzen dargestellt. Konservierte Aminosäuren wurden gelb hervorgehoben. Der blau markierte Abschnitt stellt den für die Bindung des TCTP an Tubulin (Kap. 2.1.2 ) verantwortlichen Bereich dar.
Abb. 2-2: Abstammungsbaum des TCTP in verschiedenen Spezies. Vertebraten und Pflanzen fallen durch ihre hohen Homologien untereinander als Gruppen auf. Größere Abweichungen sind erwartungsgemäß beim Regenwurm, Schistosomen, Filarien und der Hefe sichtbar. Sie repräsentieren evolutionär weiter entfernt liegende Spezies.
Abb. 2-3 IgE-abhängige Arten der Freisetzung von Histamin und anderen Mediatoren aus Mastzellen und basophilen Granulozyten.
Abb. 2-4 Verschiedene Kontroll-Ebenen der Expressionskontrolle in einer schematisierten Zelle: 1. Transkription 2. RNA-Prozessing 3. RNA-Transport 4. Translation 5. mRNA-Stabilität 6. Proteinaktivität ( Alberts et al. 1995 ).
Abb. 2-5 Ansammlung allgemeiner TF am Promotor.
Abb. 2-6 Modell der Gen-Kontrollregion eines eukaryontischen Gens: Modular aufgebaute Regulator-Sequenzen stromaufwärts, stromabwärts oder innerhalb eines Introns binden spezielle TF. Diese wechselwirken mit dem Promotor (TATA-BOX, allgemeine TF und Polymerase) auf direktem Wege oder durch Fernwirkung nach Schleifenbildung der DNA. Die Summe aller inhibierenden und aktivierenden Signale integriert sich zu einer Transkriptionsaktivität, die von dem Vorhandensein, der Aktivierung und der Konzentration der beteiligten TF abhängt.
Abb. 2-7 Vergleich verschiedener Retroelemente: Retroviren und Retrotransposons werden von LTR-Elementen flankiert, die für den Einbau ins Genom verantwortlich sind. Die Gene gag und env kodieren für virale Strukturproteine, und das pol-Gen für eine reverse Trankriptase. SINE und LINE sind nicht-LTR Retroelemente oder Retroposons. Sie besitzten einen poly(A)-Schwanz an ihrem Ende.
Abb. 2-8 Die Organisation des Humangenoms (Brown 1999)
Abb. 2-9 Modell zur Entstehung von prozessierten Pseudogenen (Jeffreys und Harris 1984): Ein Gen wird primär transkribiert (1) und durch Spleißen und Polyadenylierung in die reife mRNA Form überführt (2). Modell A (Bernstein 1983) sieht vor, daß die mRNA unter Benutzung von oligo(dT) als Primer revers transkribiert wird. Eine Topoisomerase I führt zwei Einzelstrangbrüche in die genomische DNA ein, (4) in welche das RNA/DNA-Hybrid kovalent eingebaut wird (5). Entfernung der RNA und Reperaturprozesse (6) generieren das Pseudogen. Modell B (Rogers 1984) beschreibt die Möglichkeit, daß ausgehend von einem Einzelstrangbruch die Aktivität einer terminalen Transferase zu (dT) reichen EInzelstrangüberhängen führt, die ihrerseits als Primer für die cDNA-Synthese dienen (7). Ein weiterer Einzelstrangbruch (8) und Reparaturen (9) generieren das durch Zielsequenzduplikationen (ZSD) flankierte prozessierte Pseudogen.
Abb. 4-1 Vergleich der publizierten TCTP-cDNA Sequenz mit Klonen aus einer cDNA-Bank: Hauptunterschied ist die verlängerte 3’UTR2 des Klones 31/1. Ursache der Punktmutationen in den Klonen 33/34 und 31/1 sind wahrscheinlich Sequenzierfehler der veröffentlichten Datenbanksequenz, die 5’UTR-seitig zudem noch Teile des zur Klonierung benutzten Vektors enthält (MCS).
Abb. 4-2 Vollständige TCTP-cDNA2 Sequenz des Kaninchens: Die beiden alternativ benutzten Polyadenylierungssignale und der Beginn der 3’UTR2 sind unterstrichen dargestellt. Die Sequenz der TCTP-cDNA2 und die daraus hervorgehende TCTP-cDNA1-Sequenz sind unter AJ131951 in der EMBL-Datenbank abgelegt (*=STOP-Signal).
Abb. 4-3 Northernblot von Kaninchen-mRNA aus verschiedenen Geweben: Als Sonde wurde eine kodierende Sonde aus der TCTP-cDNA1 verwendet. Neben den als Marker fungierenden 18S und 28S rRNAs sind die Positionen des kurzen TCTP-Messengers (843 nt) und des langen Messengers (1163 nt) markiert. (Mit freundlicher Genehmigung von M. Berger)
Abb. 4-4 Die zur Dotblot-Hybridisierung benutzten Sonden in Relation zu ihrer Lage innerhalb der humanen TCTP-cDNA2.
Abb. 4-5 Humaner Multigewebedotblot nach Hybridisierung mit verschiedenen Sonden: Abbildung A zeigt den Blot nach Hybridisierung mit der kodierenden TCTP-Sonde und 4 h Expositionsdauer, Abbildung B nach Hybridisierung mit der 3’UTR2 Sonde und 2 d Exposition.
Abb. 4-6 Gewebeverteilung humaner TCTP-mRNA: Poly(A)+RNA aus 50 Humangeweben wurde auf einer Blottingmembran immobilisiert und nacheinander mit je einer TCTP-kodierenden und einer TCTP-3’UTR2 Sonde hybridisiert. Die Auswertung der Signale mit Hilfe eines Phosphorimagers ermöglichte eine Quantifizierung der Signale, die proportional zur mRNA-Menge ist. Die schwarzen Säulen repräsentieren die Summe aus TCTP-mRNA1 und TCTP-mRNA2, die gelben Säulen nur die lange TCTP-mRNA2.
Abb. 4-7 Verhältnis der kurzen zur langen TCTP-mRNA in verschiedenen Geweben des Menschen: Hohe Quotienten wie im Gewebe Hippocampus (A7) signalisieren eine höhere Transkription des kurzen Messengers im Verhältnis zum langen. Die Y-Achse zeigt den relativen Maßstab der Verhältnisse an. Der Fehler beträgt +/- 5%.
Abb. 4-8 Genomischer Southernblot mit TCTP-kodierender Sonde hybridisiert: Die Bahnen 1-6 entsprechen Restriktionsspaltungen mit den Enzymen BamHI (1), EcoRV (2), KpnI (3), XbaI (4), SfiI (5) und NotI (6).
Abb. 4-9 Subklonierung genomischer Fragmente: (A) Lambdaphagen DNA des Klones lambdaH2 wurde mit unterschiedlichen Restrikionsendonukleasen geschnitten und elektrophoretisch aufgetrennt. Das dazugehörige ethidiumbromid-gefärbte Gel ist invers dargestellt. (B) repräsentiert den Molekulargewichtsmarker. (C) Southernblot des selben Gels nach Hybridisierung mit einer TCTP-kodierenden Sonde. Die Pfeile in den Abb. (A) und (C) markieren die subklonierten Fragmente.
Abb. 4-10 Zusammenfassung der Kartierungsexperimente des Klones lambdaH2-EcoRI: Das Fragment enthält das TPT1-Gen vollständig und befindet sich in negativer Orientierung im MCS des Vektors.
Abb. 4-11 Struktur des TPT1-Gens des Kaninchens
Abb. 4-12 TPT1-Gensequenz des Kaninchens (EMBL-Datenbank AJ225898): Im Promotor wurden Bindungsregionen für Transkriptionsfaktoren mit dem Programm “Matinspektor“ vorhergesagt ( Quandt et al. 1995 ) und unterstrichen dargestellt. Introns sind in Kleinbuchstaben angegeben. In der 3’UTR sind zusätzlich das STOP-Kodon, der Beginn der 3’UTR2 und die Polyadenylierungssignale (AATAAA) durch Unterstreichung hervorgehoben.
Abb. 4-13 Vergleich der genomischen Southernblotmuster nach Hybridisierung mit einer exon - und einer intronspezifischen TPT1-Sonde: Die Komplexität der Bandenmuster im exonspezifischen Blot reduziert sich auf einzelne vorhersagbaren Banden im intronspezifischen Blot. Diese Gegenüberstellung legt den zwingenden Schluß nahe, daß die genomische Komplexität der Southernblots allein durch die zahlreichen gefundenen Pseudogene verantwortet wird. Die Pseudogene akkumulieren innerhalb der mit dem Pfeil markierten Bande nach SacI Spaltung.
Abb. 4-14 Gegenüberstellung von TPT1-Gen und TPT1-Pseudogenen hinsichtlich der Lage der verwendeten Sonden und Restriktionsendonukleasen im Southernblot der Abb. 4-13 : Am aussagekräftigsten ist die Spaltung mit SacI. Während im Gen ein Fragment der Größe 3 kb entsteht, liegt die Fragmentgröße bei prozessierten Pseudogenen im Bereich der homologen cDNA, d.h. 0,68 kb. Dieses Fragment akkumuliert bei allen Pseudogenen gleichermaßen und erzeugt die charakteristische starke Bande im kodierend-spezifischen Blot. Alle anderen Schnittorte lassen nur im Falle des Gens bei den Enzymen XbaI, HindIII und KpnI eine Zuordnung erkennen, da Spaltorte in der unbekannten Genumgebung eine Rolle spielen.
Abb. 4-15 Fragmentierung der TPT1-Gen-Kontrollregion: Durch Auswahl verschiedener Restriktionsendonukleasen konnte der Bereich des Promotors in Bereiche unterteilt werden. Alle Fragmente (A-E) beginnen an der Position +80, die sich innerhalb der 5' UTR des Gens befindet. Die 5 stromaufwärts gelegenen Spaltstellen decken den Bereich von -66 bis -918 ab.
Abb. 4-16 PCR-Screening auf Fusions-Konstrukte von TPT1-Promotor-Fragmenten mit dem cat-Gen: Die Bahnen A-E entsprechen den Fragmenten aus Abb. 4-15 . Dargestellt sind die PCR-Produkte, die nach Amplifikation des MCS des Vektors pBLCAT3 inklusive Insert entstanden. Die erste Bahn repräsentiert den MCS ohne Insert.
Abb. 4-17 Dünnschichtchromatographische CAT-Analyse aller untersuchter TPT1-Promotorkonstrukte: Neben einer Positiv- (pBLCAT2) und einer Negativkontrolle (pBLCAT3) sind die Aktivitäten aller Promotorkonstrukte aufgetragen. Die Schwärzungen entsprechen unterschiedlich oft acetyliertem Chloramphenicol. Die Summe aller acetylierten Signale ist der CAT-Aktivität und damit der Promotorstärke äquivalent.
Abb. 4-18 Die Promotor-Stärke verschieden langer TPT1-Gen-Promotorbereiche im Vergleich mit einem starken viralen Promotor (pBLCAT2) ausgedrückt als relative CAT-Aktivitäten: Als Negativkontrolle fungierte das Plasmid pBLCAT3, das den Ausgangsvektor ohne Insert, d.h. ohne Promotor, repräsentiert. Die Zuordnung der Promotorfragmente zu den anderen Konstrukten erschließt sich aus Abb. 4-15
Abb. 4-19 CpG-Insel im Bereich des TPT1-Gens: Alle CG-Sequenzen innerhalb des TPT1-Gens und des flankierenden stromaufwärts gelegenen Bereiches sind als senkrechte Striche dargestellt. Der Transkriptionsstart befindet sich an der Position +1 bp. Man erkennt eine Häufung von CG-Sequenzen in diesem Bereich.
Abb. 4-20 Sequenz des Human-TPT1-Promotors und die Positionen potentieller TF-Bindungsstellen
Abb. 4-21 Subklonierung von genomischen TPT1-Pseudogenfragmenten: Auf dem Bild ist ein EcoRI gespaltener Southernblot von 13 isolierten TPT1 positiven Lambdaklonen zu sehen (lambda1-lambda13). Die mit Pfeil markierten Banden wurden isoliert und in den Vektor pBLSK+ subkloniert.
Abb. 4-22 Vergleichende Betrachtung aller sequenzierten TPT1-Pseudogene: Die Pseudogene lambda2, lambda7 und lambda13 (TPT1-ps1) sind bis auf ein zusätzliches, wahrscheinlich artifizielles A in der Poly(A)-Region von Pseudogen lambda13, identisch. Zusammen mit Klon lambda9 (TPT1-ps2) repräsentieren sie Abkömmlinge der kurzen TCTP-mRNA1. Im Gegensatz dazu haben die Pseudogene lambda1 (TPT1-ps3) und lambda12 (TPT1-ps4) eine verlängerte 3'UTR2 und spiegeln die Verhältnisse der TCTP-mRNA2 wider. Einige identische Mutationen kommen in verschiedenen Pseudogenen vor, was auf evolutionär getrennte Entwicklungen des Gens und der Pseudogene hindeutet. Die Mutationsrate ist in allen Pseudogenen kleiner als 2% und führt in keinem Fall zu einer Zerstörungen des Leserahmens.
Abb. 4-23 Promotoraktivität der 5’ flankierenden Bereiche ausgewählter TPT1-Pseudogene: Der Vektor pBLCAT2 ist die Posivkontrolle und pBLCAT3 die Negativkontrolle. Neben der Promotoraktivität der vier Pseudogene TPT1-ps1/2/3/4 sind die CAT-Aktivitäten des minimalen TPT1-Promotormotivs (Fragment -66/+80) und des Fragments mit maximaler TPT1-Promotoraktivität (Fragment -279/+80) gegenübergestellt.
Abb. 5-1 Vergleich zwischen dem TPT1-Gen des Kaninchens und des Menschen
Abb. 5-2 Position einiger möglicher TF am Kaninchen TPT1-Promotor: Die Positionsmarkierungen (in bp) entsprechen den in den CAT-Experimenten verwendeten Promotorfragmenten.
Abb. 5-3 Vergleich der TPT1-Promotoren des Kaninchens und des Menschen: Übereinstimmende Basen wurden blau markiert. Potentielle TF-Bindungsstellen sind zusätzlich gelb hervorgehoben.
Abb. 5-4 PKC und MAP-Kinase abhängige Signaltransduktionsprozesse (aus Alberts et al. 1995 )
Abb. 5-5 Modell der Wechselwirkung von AP-1 Komponenten mit cis-Elementen (aus Varmus und Weinberg 1994 ). LZ=Leucin-Zipper-Strukturmotiv
Abb. 5-6 Modell PKA abhängiger Signaltransduktionsprozesse: Bestimmte Rezeptoren führen nach Bindung eines Liganden über die dargestellten Signaltransduktionsprozesse zur Aktivierung der PKA. Deren katalytische Untereinheit gelangt in den Zellkern und phosphoryliert Transkriptionsfaktoren wie CREB, wodurch es anderen Transkriptionsfaktoren (CBP) ermöglicht wird am Promotor zu binden und somit die Aktivität des Gens modifiziert wird.

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Mon May 29 13:40:59 2000