MATERIAL UND METHODEN

3.1  Material

3.1.1  Technische Geräte

↓18

Gerät

Bezugsquelle

Abzug

Köttermann

Autoklav (Typ 17)

Melag

Brutschrank

Heraeus

Casy 1 Zellzähler

Schärfe System

Coulter Elite Workstation Software XI2

Beckmann Coulter Electronics

Durchflusszytometer Epics XL

Beckmann Coulter Electronics

Gelelektrophoresekammer SUB-Cell GT mit Zubehör

Bio-Rad

Heizblock (Thermomixer 5436)

Eppendorf

Magnet Mini Macs

Miltenyi Biotec

Magnetrührer (IKAMAG Reo)

IKAMAG

Metallfilter (300, 150, 70, 40 µm)

Sigma

Microplate Reader, Software: Revelation MRX Vers. 3.22

Life Science Tech. Dynatech Lab.

Mikroskop (45 1485)

Zeiss

Mikroskop (92 499)

Zeiss

Mikroskop (ID 03)

Zeiss

Mikrowelle Mikromat

AEG

Neubauer Zählkammer

Neolab

Pipetten (verstellbar)

Eppendorf

Pipettierhilfen (Pipetus)

Hirschmann

Power Supply (Modell 1000/500)

Bio-Rad

Power Supply (ST 504)

Gibco

Schüttler (IKA-Vibrax-VXR)

Janke und Kunkel

Sterilbank (flow-bench)

Karl Bleymehl Reinraum-technik

Thermocycler Primus oder Primus 96 plus

MWG-Biotech

UV-Transilluminator

LKB

Vortex (Heidolph Reax 2000)

Heidolph Reax

Waage (Sartorius Universal)

Sartorius

Wasserbad (MS Lauda)

Lauda

Wasserbad (Thermo-Cycler 60)

Bio-Med

Wasserstrahlpumpe

Bio-Med

Zellzentrifuge (Minifuge RF)

Heraeus

Zentrifuge (5402)

Eppendorf

↓19

(Fortsetzung Technische Geräte)

3.1.2 Verbrauchsmaterial

Material

Bezugsquelle

6 -/24 -/96 - well Platten

Greiner

6-, 24- und 96-well-Platten (steril, für Suspensionskultur und Gewebekultur)

Greiner

FACS-Röhrchen (5 ml)

Sarstedt

Falcon-Röhrchen (steril, 50 ml, 15 ml)

Greiner

Kanülen (Standardkanüle Nr. 1 gelb)

B. Braun

Kryoröhrchen

Greiner

Kunststoffauslaufpipetten (steril, 25 ml, 10 ml, 5 ml, 2 ml)

Sarstedt

Kunststoffflaschen (steril, 600 ml, 250 ml, 50 ml)

Greiner

Einmalhandschuhe

Hartmann

MACS Prä-Separationsfilter (30 µm)

Miltenyi Biotec

MACS Separation Columns LCC

Miltenyi Biotec

Nylongasefilter (30 µm)

Miltenyi Biotec

Petrischalen (verschiedene Größen)

Greiner

Phase Lock Gel

Eppendorf

Reaktionsgefäße (0,5/1,5/2,0 ml, z. T. safe lock)

Eppendorf

Röhrchen (steril), (15 ml / 50 ml)

Greiner

Skalpelle

Bard-Parker

Spritzen (steril, 50 ml, 10 ml)

B. Braun

Sterilfilter (mit und ohne Vorfilter, 0,2 µm)

Sarstedt

Zellkulturflasche Tissue Culture

Greiner

3.1.3 Chemikalien und Reagenzien

Substanz

Bezugsquelle

β-Monothioglycerol (3-Mercapto-1,2-propandiol)

Sigma

100 bp DNA Ladder Plus

MBI Fermentas

6x Loading Dye (Gelladepuffer)

MBI Fermentas

Accutase

PAA Laboratories

Aceton

Merck

Agarose

Boehringer Mannheim

Aqua Ad Iniectabilia

B. Braun

Basal Iscove Medium 1x

Seromed

Bromphenolblau

Merck

BSA (Bovine Serum Albumin)

Boehringer Mannheim

Diethylcarbonat-(DEPC-)Wasser

Baack GmbH

Dimethylsulfoxid (DMSO)

Sigma

Dispase I

Boehringer Mannheim

Ehidiumbromid

Sigma

Ethanol absolut

Merck

Ethylendiamin-tetra-Essigsäure (EDTA)

Serva

FCS (Fetal Calf Serum)

Seromed

HS (Horse Serum)

Seromed

Humanes AB-Serum (dialysiert)

Biotest

Kollagenase Typ 4

Worthington Biochemical Corp.

L-Glutamin

Seromed

Monothioglycerol

Sigma

Natriumacetat

Novagen, Merck Biosciences

PBS (Phosphate Buffered Saline) (ohne Ca2+/Mg2+) 1x

PAA Laboratories

PCR-Primer

TIB Molbiol

Pellet Paint Co-Precipitant

Novagen, Merck Biosciences

Penicillin/Streptomycin

Seromed

Phenylisoamylalkohol

Gibco

Toluidinblau

Seromed

Tris-Acetat

Sigma

Trypanblau

Seromed

↓20

3.1.4 Zelllinien

Zelllinie/Zelltyp

Bezugsquelle

HMC-1 Zellen

Dr. Butterfield

KMZ aus Vorhaut

Berliner Praxen und Kliniken

LAD 2 Zellen

Dr. Metcalfe

HMC-1 und LAD 2 Zellen wurden freundlicherweise von Dr. Butterfield aus Rochester, MN, USA bzw. Dr. Metcalfe aus Bethesda, MD, USA zur Verfügung gestellt.

3.1.5 Kits

↓21

Kit

Bezugsquelle

1st Strand cDNA Synthesis Kit

Boehringer Mannheim

Alexa Fluor TM 488 Labeling Kit

Molecular Probes

Mycoplasma Detection Kit

Roche Diagnostics

PCR Master Mix Kit

Boehringer Mannheim

QIAshredder

Qiagen

RiboGreen RNA Quantitation Kit

Molecular Probes

RNase-Free DNase Set

Qiagen

RNeasy Total RNA Kit

Qiagen

Vybrant Apoptosis Assay Kit no. 4

Molecular Probes

3.1.6 Agentia

Agens

Bezugsquelle

ATRA

Sigma

IL-4

R&D Systems

IL-6

R&D Systems

NGF-β

R&D Systems

rhSCF

R&D Systems

Cycloheximid

Calbiochem-Novabiochen

Cytochalasin B

Calbiochem-Novabiochen

Proteaseinhibitorcocktail

Roche

PMSF (Phenyl-Methyl-Sulphonyp-Fluorid)

Sigma

(Fortsetzung Agentia)

3.1.7 Antikörper

↓22

Antikörper (Spezifität)

Bezugsquelle

Anti-CD117 (c-kit) (YB5.B8)

Dr. Ashman

Anti-CD117-FITC (c-kit) (95C6)

Dianova

Anti-CD11a (25.3.1)

Immunotech

Anti-CD13 (MY7)

Immunotech

Anti-CD18 (3E8)

Immunotech

Anti-CD35 (J3D3)

Immunotech

Anti-CD43 (DF-T1)

Dakopatts

Anti-CD50 (ICAM-3) (CAL3.10)

R&D Systems

Anti-Chymase (3D5)

Biotrend

Anti-FcεRIα (29C6)

Dr. Hakimi

Anti-FcεRIα- FITC (29C6)

Dr. Hakimi, mit FITC Labeling Kit

Anti-Tryptase (AA1)

Serotec

Anti-Tryptase-FITC (AA1)

Serotec, mit FITC Labeling Kit

GAM-FITC

Jackson Immuno Research Lab

Isotypkontrolle Anti-IgG1 (11711.11)

R&D Systems

Isotypkontrolle Anti-IgG1-FITC (11711.11)

R&D Systems

MACS Goat Anti-Mouse IgG Micro Beads

Miltenyi Biotec

Maus-γ-Globulin

Dianova

Die direkte Immunfluoreszenz kam bei KMZ, die indirekte Immunfluoreszenz bei HMC-1 5C6 und LAD 2 Zellen zum Einsatz. Anti-FcεRIα (29C6) und anti-CD117 (c-kit) (YB5.B8) wurden freundlicherweise von Dr. Hakimi aus Nutley, NJ, USA bzw. von Dr. Ashman aus Adelaide, Australien zu Verfügung gestellt. Dipl. Ing. S. Guhl übernahm freundlicherweise das FITC-Labeling der Antiköper anti-FcεRIα und anti-Tryptase mit dem Alexa Fluor Labeling Kit nach Herstelleranweisungen.

3.1.8 Puffer/Gel

Agarose-Gel 1,5%

- 0,75 g Agarose

- 50 ml TAE (1x)

(Agarose und TAE in der Mikrowelle erhitzen)

- 5 μl Ethidiumbromidlösung

FACS-Puffer

- 0,05 % Na- Azid

- 2 % FCS

MACS-Puffer

- PBS (ohne Ca2+/Mg2+)

- 0,5 % BSA

- 2mM EDTA

TAE-Puffer (50x)

- 40 mM Tris-Acetat

- 2 mM EDTA

(Die Lösung wurde mit konz. Essigsäure auf einen pH von 8,0 eingestellt)

3.2 Zellkultur

3.2.1  Steriltechnik

↓23

Um einer Kontamination mit Bakterien und Pilzen vorzubeugen, wurden Zellarbeiten stets in steriler Umgebung einer Arbeitsbank mit laminarem Luftabzug (flow-bench) durchgeführt, die vor Arbeitsbeginn immer mit alkoholischer Lösung gereinigt wurde. Einmalhandschuhe waren für die Arbeit obligatorisch. Alle benutzten Kunststoffmaterialien waren mit γ-Strahlung sterilisierte Einmalgeräte (Pipetten, Spritzen, Flaschen, Platten, Zentrifugenröhrchen). Pipettenspitzen und Eppendorfgefäße wurden für 30 min bei 134°C und 2 bar autoklaviert. Basal Iscove Medium und PBS wurden steril eingekauft. Zusätze wie fötales Kälberserum (Fetal Calf Serum, FCS), Pferdeserum (Horse Serum, HS), Streptomycin und Penicillin wurden durch Filter mit 0,2 µm Porendurchmesser direkt in das Medium filtriert.

3.2.2 Zellkultivierung

Die Zellen wurden in einem Brutschrank bei einer Temperatur von 37°C, 100%iger Luftfeuchtigkeit und CO2-Begasung von 5% kultiviert. Der Brutschrank war mit einem Alarmsystem ausgestattet, das aktiviert wurde, wenn die Richtwerte und damit die Standardisierung der Testreihen verletzt wurde.

3.2.2.1  HMC-1 5C6 Zellen in Kultur

Die Kultivierung dieser Zelllinie erfolgte in Basal Iscove Medium unter Zusatz von entweder 10% hitzeinaktiviertem (30 min bei 56°C) FCS oder 20% hitzeinaktiviertem HS, außerdem 4 mM L-Glutamin, Penicillin (1000 IU/ml), Streptomycin (1 mg/ml) und 10 µM Monothioglycerol. Alle drei Tage wurde das Medium gewechselt. Die Kultivierung von HMC-1 5C6 Zellen erfolgte in Gewebekulturflaschen bzw. -platten (Butterfield et al. 1988, Weber et al. 1996).

3.2.2.2 LAD 2 Zellen in Kultur

↓24

Die Kultivierung dieser Zelllinie erfolgte in Basal Iscove Medium unter Zusatz von 10% hitzeinaktiviertem FCS, 4 mM L-Glutamin, Penicillin (1000 IU/ml), Streptomycin (1 mg/ml) und 10 µM Monothioglycerol. Zur Proliferation benötigten diese Zellen außerdem den rekombinanten Stammzellfaktor rhSCF (100 ng/ml). Alle vier Tage wurde das Medium gewechselt. Die Kultivierung der LAD 2 Zellen erfolgte entweder in Gewebekulturflaschen oder -platten (Kirshenbaum et al. 2003).

3.2.2.3 KMZ in Kultur

Die Kultivierung dieser Zellen erfolgte in Basal Iscove Medium unter Zusatz von 10% hitzeinaktiviertem FCS, 4 mM L-Glutamin, Penicillin (1000 IU/ml), Streptomycin (1 mg/ml) und 10 µM Monothioglycerol. Um in vitro eine siebentägige Inkubation mit Zytokinen/Wachstumsfaktoren oder ATRA bzw. Medium zu gewährleisten, benötigten die Zellen außerdem rhSCF (100 ng/ml). Die Kultivierung der KMZ erfolgte entweder in Gewebekulturflaschen oder -platten (Babina et al. 2004).

3.2.3 Zellzahl, Morphologie, Vitalität und Reinheit

3.2.3.1  Handzählung

Die Zellzählung und die Bestimmung der Vitalität wurden mit Hilfe der Neubauer Zählkammer nach Färbung mit Trypanblau (0,5% [w/v] in PBS) durchgeführt und die Vitalität (in %) angegeben. Mit einer sauren Toluidinblaufärbung (0,1% [w/v] in 0,5 N HCl) konnte der Reinheitsgrad isolierter humaner Mastzellen bestimmt werden.

3.2.3.2 Automatisierte Zellzählung

↓25

Alternativ, zum Vergleich bzw. zur Korrektur der Handzellzählung, wurde die Zellzahl quantitativ mit dem CASY-Zellzähler als Dreifachmessung bestimmt. Zum Vereinzeln der Zellen mussten LAD 2 Zellen mit Accutase vorbehandelt werden, da sie im Gegensatz zu HMC-1 5C6 Zellen und KMZ stark adhärierende Eigenschaften besitzen und in Zellklumpen in Kultur zu finden sind. Der durchschnittliche Zelldurchmesser wurde von demselben Gerät bestimmt.

3.2.4  Behandlung der Zellen

Die Zellen wurden mit folgenden Substanzen behandelt:

Substanz

Konzentration

ATRA

1 μM

IL-4

20 ng/ml

IL-6

50 ng/ml

NGF-β

10 ng/ml

↓26

Bei der Verwendung des Retinoids ist besonders auf seine Photosensibilität zu achten. ATRA isomerisiert infolge von Lichteinwirkung in die deutlich toxischere 13-cis-Retinsäure, teilweise auch in 9-cis-Retinsäure. Obwohl die Isomerisierung ihr Maximum erst nach über 90 Stunden erreicht, wurden sämtliche Untersuchungen, bei denen ATRA eingesetzt wurde, in abgedunkelter Umgebung durchgeführt (Goli & Brown 2004). Der ATRA-Bestand wurde bei -20°C, bei einer Konzentration der Stammlösung von 100 mM, im Antioxidant DMSO im Dunkeln aufbewahrt. DMSO (erst recht in der hier verwendeten enormen Verdünnung von 1:100.000) selbst hat keinerlei differenzierenden Effekt auf die parentale HMC-1 Zelllinie und wurde in einer Vergleichsstudie mit ATRA bereits in der Vergangenheit getestet (Nilsson et al. 1994a).

In den Versuchen zur Klärung der Mechanismen der kurzzeitigen Herunterregulation von c-kit wurden die Substanzen in den in Klammern angegeben Konzentrationen eingesetzt: Cycloheximid (10 μg/ml), Cytochalasin B (100 μM) und Proteaseinhibitorcocktail (eine Tablette wurde in 10 ml Medium gelöst und 1/10 des Volumens machte den Endansatz aus) + PMSF (100 μM).

Bei allen Versuchsreihen wurde zeitgleich unter Standardbedingungen eine Kontrollkultur mit Medium unterhalten, die bei der statistischen Auswertung als Negativkontrolle diente.

3.2.5 Erfassung der Apoptose

↓27

Die Messung apoptotischer und toter Zellen erfolgte nach der YO-PRO-1-Methode mit Hilfe des Vybrant Apoptosis Assay Kits. Das Prinzip beruht auf einer Veränderung der Permeabilität der Zellmembran während der Apoptose und dem Zelltod. Die beiden Fluoreszenzfarbstoffe YO-PRO-1 und Propidium-Iodid werden von intakten, lebenden Zellen weder passiv noch aktiv aufgenommen. Bei apoptotischen Zellen hingegen kann nur YO-PRO-1, nicht aber Propidium-Iodid, aufgrund der veränderten Permeabilität der Zellmembran in die Zelle eindringen. Bei toten Zellen passieren beide Farbstoffe die Zellmembran. Die YO-PRO-1- und Propidium-Iodid-Fluoreszenzfärbung kann anschließend mit Hilfe der Durchflusszytometrie gemessen und so der Zustand der Zellen dargestellt werden (Guhl et al. 2003).

3.3 Isolierung kutaner Mastzellen

Die in dieser Arbeit verwendeten Mastzellen sind aus Vorhautgewebe nach Zirkumzision isoliert worden, die von kinderchirurgischen Praxen und urologischen Kliniken in Berlin in physiologischem Transportmedium geliefert wurden. Die Gewinnung der Mastzellen folgte mit kleinen Modifikationen einem etablierten Protokoll (Babina et al. 2004).

3.3.1  Erster Tag der Vorhautpräparation

Zuerst wurde die Vorhaut in zwei Waschgängen mit PBS (ohne Ca2+/Mg2+) gereinigt, makroskopisch sichtbares Fettgewebe und Blutgefäße entfernt und in ca. 4 mm2 große Quadrate zerschnitten, anschließend wurde sie über Nacht in Dispase (0,5 mg/g Vorhaut) eingelegt und unter Vibration bei 4°C inkubiert. Während dieser Zeit löst die Dispase die Bindung zwischen Epidermis und Dermis, und beide Hautschichten können dann mit einer Pinzette voneinander getrennt werden.

3.3.2 Zweiter Tag der Vorhautpräparation

↓28

Nach zwei Waschgängen folgte mit einer Pinzette die Trennung der Epidermis von der mastzellhaltigen Dermis, die mit einer Schere zu einer breiigen Konsistenz zerkleinert wurde, um dann nach einstündiger Inkubation bei 37°C im Bewegungsbad (f=190/s) mit Kollagenase (10 mg/g Vorhaut) das Kollagengerüst aufzulösen. Die Epidermis wurde verworfen. Mit einem Metallfilter (150 µm Porengröße) wurde nun verdautes von unverdautem Gewebe getrennt, das Filtrat mit PBS zentrifugiert (1500 U/min, 10 min bei 4°C) und die Pellets resuspendiert, nach zwei weiteren Filtrationen (100 µm und 40 µm Porengröße) erneut zentrifugiert und mit PBS gewaschen. Diese Pellets – nun einzelne Zellen – wurden erstmals in Medium (10 ml) aufgenommen, wie oben beschrieben gezählt, und anschließend bei einer Zelldichte von 1x106/ml eine weitere Nacht im Brutschrank inkubiert.

3.3.3 Dritter Tag der Vorhautpräparation

Im Mittelpunkt des dritten Tages stand die gezielte Isolierung der c-kit-positiven Zellen an der MACS-Trennsäule. Vor einer erneuten Zellzählung wurden die Zellen zunächst einmal in PBS gewaschen, der Überstand entfernt und das Pellet resuspendiert, um dann den primären Antikörper c-kit (YB5.B8, Endkonzentration 0,1 μg/ml) zu binden. Für je 1x107/ml Gesamtzellen wurde 100 µl Ansatzvolumen wie folgt berechnet:

20 µl inaktiviertes AB-Serum

20% des Ansatz-Volumens

2 µl YB5.B8

2% des Ansatz-Volumens

78 µl Zellen in MACS-Puffer

78% des Ansatz-Volumens

↓29

Zellpellet und obiger Antikörperansatz wurden in vorgekühlte 2ml-Kryo-Röhrchen überführt und 15 min auf einem Rotator (15-20 U/min, 4°C) inkubiert. Anschließend wurde dann das Inkubat in 15ml-Greiner-Röhrchen zurückgeführt, um es zweimal mit MACS-Puffer (2 mM EDTA und 0,5% BSA in PBS ohne Ca2+/Mg2+) zu waschen. Es ist zu beachten, dass sowohl die Puffertemperatur als auch die der Röhrchen stets bei 4°C gehalten wurde, um unspezifische Bindungen und Reaktionen zu vermeiden. Dann erfolgte die Kopplung des sekundären Antikörpers an den primären Antikörper, also an die magnetischen Partikel, anhand derer die c-kit-positiven Zellen mit Hilfe eines Magneten selektiert wurden. Für je 1x107 Gesamtzellen wurde 100 µl Ansatzvolumen wie folgt berechnet:

20 µl inaktiviertes AB-Serum

20% des Ansatz-Volumens

20 µl magnetische Micro-Beads

20% des Ansatz-Volumens

60 µl Zellen in MACS-Puffer

60% des Ansatz-Volumens

Zellpellet und obiger Antikörperansatz wurden ebenfalls in vorgekühlte 2ml-Kryo-Röhrchen überführt und 15 min auf einem Rotator (15-20 U/min, 4°C) inkubiert. Auch jetzt wurde das Inkubat anschließend in 15ml-Greiner-Röhrchen zurückgeführt, dann aber nur einmal in MACS-Puffer gewaschen und die Zellen in 5 ml MACS-Puffer aufgenommen.

↓30

Nach einer weiteren Filtrierung mit einem MACS-Prä-Separationsfilter und einem Waschschritt in MACS-Puffer wurden die Zellen in 500 µl MACS-Puffer resuspendiert. Die folgenden Arbeitsschritte wurden mit einer magnetischen Trennsäule, der MACS-Zell-Separationssäule, ebenfalls unter der Flow-bench durchgeführt. Die am Magneten positionierten Säulen wurden mit je 500 µl MACS-Puffer vorgespült, die 500 μl Zellsuspension auf die Säulen (bis zu 1x108 Zellen pro Säule) pipettiert und dann dreimal mit der gleichen Menge MACS-Puffer nachgespült – einmal mit und zweimal ohne angebrachter Kanüle.

Die Säule, an der sich nun ausschließlich c-kit-positive Zellen magnetisch hielten, wurde von dem Magneten getrennt. Mit 500 μl MACS-Puffer konnten diese Zellen in 5ml-Röhrchen eluiert werden.

Zuletzt wurden die Zellen gezählt und deren Reinheit mit einer Toluidinblaufärbung bestimmt. Bei allen Präparationen waren ausschließlich über 90% der Zellen Toluidinblau gefärbt. Nun wurden die Mastzellen in Medium aufgenommen (1x106/ml) und in verschiedenen Versuchen verwendet.

3.3.4 Qualitätskontrolle

↓31

Zur Qualitätskontrolle wurden die Mastzellen nach Aufreinigung und Toluidinblaufärbung anhand ihrer Oberflächenmoleküle in der Durchflusszytometrie in regelmäßigen Abständen charakterisiert. Dazu wurden FITC-markierte Antikörper gegen c-kit und FcεRIα (1 μg) eingesetzt (siehe Kapitel 3.4.3).

3.4 Durchflusszytometrie

Seit über dreißig Jahren ist es möglich mit Hilfe der Durchflusszytometrie (Flow cytometry) eine Phänotypisierung von Zellen vorzunehmen und deren Morphologie und Funktion zu beschreiben.

Hinter der Durchflusszytometrie steht ein fluoreszenzoptischer Mechanismus, der Oberflächenmoleküle einzelner Zellen, die mit fluoreszierenden, monoklonalen Antikörpern markiert sind, nach Anregung durch Laserlicht (488 nm Argonlaser) identifizieren kann. Die durch das Laserlicht emittierten Fluoreszenzsignale können von dem Gerät verstärkt und gelesen werden, um anschließend von dem integrierten Rechner in eine verständliche Passform transponiert und dargestellt zu werden. Diese Methode bietet die Möglichkeit, einzelne Zellen quantitativ, schnell und exakt zu charakterisieren und deren Antigenstruktur zu erfassen (Scheffold & Kern 2000). So erlangte sie neben dem Einsatz in der Grundlagenforschung auch ein hohes Maß an klinischer Bedeutung, angefangen mit der Diagnostik hämatologisch-onkologischer Erkrankungen bis hin zur Ermittlung des Therapiebeginns bei der HIV-Erkrankung, der die Durchflusszytometrie auch den hohen Bekanntheitsgrad verdankt (Fritsch & Vanscheidt 1996).

3.4.1  Qualitätskontrolle

↓32

Die Gewährleistung der Qualität erfolgt erstens durch standardisierte Protokolle für die Probenvorbereitung, zweitens durch den Einsatz einer Isotypkontrolle bei jeder Messung, auf die sich die Proben beziehen, drittens durch das Gating der Zellen in der FSC-SSC-Bildanalyse, also einer Identifizierung der Zellen anhand ihrer Größe und Granularität auf Grundlage des Wissens über die zu bearbeitende Probe und viertens durch die Möglichkeit einer Zweitmessung, also einer Reproduzierbarkeit der Messung.

3.4.2 Coulter Epics XL

Die Messung der Proteinexpression auf der Zelloberfläche und intrazellulär wurde mit dem Epics XL Durchflusszytometer durchgeführt. Für die Markierung der zu untersuchenden Moleküle wurden monoklonale Maus-Primärantikörper verwendet, die entweder mit grün fluoreszierendem Fluoreszeinisothiocyanat (FITC) oder rot fluoreszierendem Phycoerythrin (PE) konjugiert waren. Die Messung kann sowohl den Anteil fluoreszenzmarkierter Zellen (in %) und die Fluoreszenzintensität pro Zelle darstellen als auch die Morphologie und Granularität aller Zellen, also auch die der nicht markierten, ermitteln.

Epics XL saugt die antikörpermarkierte Zellsuspension durch eine feine Stahlkapillare ins Innere des Geräts, wo die Zellen durch hydrodynamische Fokussierung einzeln in einer Kapillare von einem Laserstrahl erfasst werden.

↓33

Dazu wird die Zellprobe aus der Kapillare in das Zentrum eines mit Flüssigkeit (sheath fluid) durchflossenen Raumes gespritzt. Durch die konische Form dieses Teilstücks wird der Durchmesser verkleinert und durch die konstante Strömung die Zellen im Zentrum einzeln aufgereiht. Auf diese Weise passieren die Zellen alle einzeln den Laserstrahl, und es kommt erstens zur Lichtstreuung aufgrund des Hindernisses ‚Zelle’ aller Zellen und zweitens zur Photonenemission der FITC- oder PE-markierten Zellen.

Durch die Streusignale lassen sich Größe und Granularität der Zellen bestimmen. Die Größe (Volumen) der Zellen kann man anhand ihrer Vorwärtsstreuung (Forward Scatter, FS) entsprechend einer Lichtablenkung in spitzem Winkel zur Laserachse und die Granularität anhand ihrer Seitwärtsstreuung (Side Scatter, SS) entsprechend einer Lichtablenkung in stumpfem Winkel ermitteln. Das emittierte Fluoreszenzlicht (FL) kann natürlich auch in all diese Winkel ausstrahlen. Die Fluoreszenzsignale werden vom Gerät an dichromatischen Filtern registriert und die Information an Photodioden weitergeleitet. Die Lichtsignale finden sich in drei Fluoreszenzkanälen (FK) wieder, deren Filter unterschiedliche Wellenlängen detektieren können (Tabelle 2) und somit auch in der Lage sind, Zellen mit drei unterschiedlich markierten Antigenen gleichzeitig zu erfassen.

Tabelle 2: Fluoreszenzkanäle (FK) 1 bis 3 im Coulter Epics XL Durchflusszytometer.

  

FITC

PE

FK 1

505-545 nm

520 nm

 

FK 2

555-595 nm

 

575 nm

FK 3

605-635 nm

  

Die Emissionsmaxima der Fluoreszenzfarbstoffe FITC und PE werden von zwei unterschiedlichen Fluoreszenzkanälen wahrgenommen.

↓34

Die Abbildung der Messung in Form eines Histogramms zeigt die Fluoreszenzintensität der Zellen im Verhältnis zur Anzahl der Zellen als statistische Verteilung und wird logarithmisch aufgetragen. Dabei wird jede einzelne Zelle, die den Laser passiert, einem Kanal entsprechend ihrer Emissionsintensität zugeordnet und ist somit das Maß für die an einer Zelle gebundenen FITC- oder PE-Antikörper. Diese Einteilung erfolgt entweder in 512 oder 1024 Kanälen.

Zur Beurteilung einer fluoreszenzmarkierten Zellpopulation in der Durchflusszytometrie sind zwei Messgrößen wichtig: Zum einen der prozentuale Anteil an positiven Zellen – Zellen, die das entsprechende Antigen tragen – und zum anderen der Mittelwert der Kanalfluoreszenz (Mean Channel Fluoresence, MCF). Für den auch als Mean bezeichneten Wert gilt:

3.4.3 Probenvorbereitung, Messung und Datenanalyse

↓35

Für die Auswertung am Durchflusszytometer mussten die Zellen mit einem Fluoreszenzfarbstoff (FITC oder PE) markiert werden. Dafür stehen generell zwei Methoden zur Verfügung, die auch bei dieser Arbeit Anwendung fanden.

Bei der direkten Immunfluoreszenz ist der primäre Antikörper mit einem Fluoreszenzfarbstoff kovalent verbunden. Die indirekte Immunfluoreszenz hingegen benötigt zwei Antikörper um im Durchflusszytometer messbar zu sein. Der primäre Antikörper bindet an das spezifische Epitop auf der Zelloberfläche. Zur Sichtbarmachung wird ein zweiter Antikörper eingesetzt, der den primären Antikörper bindet und ihn durch seinen Fluoreszenzfarbstoff sichtbar macht. Die indirekte Immunfluoreszenzmethode ist zwar zeitaufwendiger, birgt aber den Vorteil einer leichten Signalverstärkung gegenüber der direkten Immunfluoreszenzmethode. Außerdem könne bei diese Methode auch solche Primärantikörper zum Einsatz gelangen, die in konjugierter Form nicht erhältlich sind.

Bei der zytometrischen Messung wurden jeweils 5x105 behandelte und unbehandelte HMC-1 5C6 Zellen, LAD 2 Zellen und 1x105 KMZ eingesetzt. Alle Arbeitsschritte wurden stets auf Eis durchgeführt. In FACS-Röhrchen mussten die Zellen zunächst von Medium in zweimaligem Waschgang mit PBS (ohne Ca2+/Mg2+) gereinigt und die Zellpellets mit autologem AB-Serum (10 μl) behandelt werden, um unspezifische Bindungen und Bindungsstellen an Fc-Rezeptoren zu blockieren. Der Primärantikörper (10 µg/ml) sollte dann mindestens 30 min inkubieren. Kam die direkte Immunfluoreszenz zum Einsatz, so schloss sich zu diesem Zeitpunkt lediglich ein weiterer Waschgang mit PBS an, um dann die markierten Zellen im Durchflusszytometer zu messen. Außerdem musste im Falle KMZ zusammen mit dem AB-Serum noch 2 μl γ-Globulin zugesetzt werden, um verbliebene Bindungsstellen der anti-Maus-gekoppelten magnetischen Partikel abzusättigen. Bei der indirekten Immunfluoreszenz hingegen wurde nach einem weiteren Waschgang der sekundäre Antikörper mit Fluoreszenzfarbstoff hinzupipettiert. Eingesetzt wurden entweder 2 μl eines FITC-Ziege-anti-Maus Immunglobulins (Goat-Anti-Mouse, GAM-FITC) oder GAM-PE. Nach weiteren 30 min Inkubation auf Eis folgten zwei Waschgänge. Zuletzt wurden die Zellen in 500 µl PBS aufgenommen, am Durchflusszytometer analysiert und statistisch mit Coulter Elite Workstation Software Xl2 ausgewertet. Die als Negativkontrolle eingesetzte Isotypkontrolle wurde erfahrungsgemäß auf 2% positive Zellen eingestellt. Dieser Wert stellt ungefähr den Anteil unspezifischer Bindungen und der Eigenfluoreszenz der Zellen dar, die gerade bei Zellen mit großem Durchmesser erheblich ist.

↓36

Bei der Auswertung gilt, dass der Mean direkt proportional zur durchschnittlichen Rezeptordichte des untersuchten Antigens ist und somit quantitativ dargestellt werden kann. Der Mean unterliegt tagesabhängigen Schwankungen und wird deshalb bei der Auswertung ins Verhältnis zur Isotypkontrolle gesetzt

Zur quantitativen Darstellung der Antigenexpression wurde der Mean der unbehandelten Zellen gleich 100% gesetzt und die Veränderung der Antigenexpression darauf bezogen. Für die Antigenexpression [in %] gilt demzufolge:

3.5 RT-PCR

3.5.1  Grundlagen

↓37

Die reverse Transkriptase-Polymerase-Kettenreaktion (Reverse Transcriptase-Polymerase Chain Reaction, RT-PCR) ist die sensitivste Methode, um mRNA zu detektieren und qualitativ wie quantitativ zu beschreiben. Zwei weitere Methoden (Northern Blot und RNase Protection Assay) stehen der Wissenschaft zur Verfügung, um die mRNA-Konzentration in Zellen zu bestimmen. Diese benötigen jedoch eine deutlich höhere absolute mRNA-Menge, was bei aufwendigen Einzelzellpräparationen wie der Aufreinigung von KMZ aus Vorhautgewebe nicht gewährleistet werden kann.

Neben der Messung der Proteinexpression, sei es superfiziell (auf der Zellmembran) oder intrazellulär (im Zytoplasma), ist die Bestimmung der mRNA für das Verständnis regulatorischer Prozesse in der Zelle von entscheidender Bedeutung. Die mRNA-Synthese und damit die Konzentration an mRNA im Zytoplasma ist ein wichtiger regulatorischer Schritt auf dem Weg vom Gen zum Protein. Sowohl die transkriptionelle Kontrolle als auch die Processing-Kontrolle bestimmen neben zusätzlichen Stabilitätskriterien die tatsächliche mRNA-Konzentration. Ist die mRNA einmal synthetisiert, so ist die Proteinsynthese meist nur ein angeschlossener Produktionsschritt und es besteht oft, wenngleich nicht immer, ein linearer Zusammenhang zwischen mRNA-Konzentration und Proteinsynthese.

In der vorliegenden Arbeit diente die RT-PCR dem quantitativen Nachweis der Transkripte der untersuchten Mastzellmarker (c-kit, Tryptase, Chymase, FcεRIα, FcεRIβ, FcεRIγ und HDC) und deren Beeinflussbarkeit durch ATRA.

↓38

Von der Zelle bis zur amplifizierten DNA sind viele Einzelschritte notwendig, die sich im Überblick aus Zelllyse, RNA-Extraktion und DNase-Verdau, Phenolisierung und Fällung, RNA-Reinheitsbestimmung und Quantifizierung, cDNA-Synthese und PCR zusammensetzen. Der RNeasy Total RNA Kit wurde zur Präparation der Gesamt-RNA aus Zellen genutzt.

Für die reverse Transkription der mRNA in cDNA wurde ein Einzelstrang-Synthesekit unter Verwendung arbiträrer Sechsernukleotide ( Random Primer)nach Herstelleranweisungen benutzt. Die somit neu synthetisierte Einzelstrang cDNA wurde in der sich anschließenden PCR-Amplifizierung als Vorlage (Template) verwendet und war somit Arbeitsbasis für die anschließende Identifikation der Mastzellmarker auf mRNA-Ebene. Die eingesetzten Primer sind in Tabelle 4 aufgeführt.

Masterkit und Primer stellten die nötigen Einzelkomponenten für die PCR-Amplifizierung dar. Die PCR-Amplifizierung ist ein Zyklus aus DNA-Denaturierung, Primer-Hybridisierung und Polymerisation, der sich bis zu fünfzig Mal wiederholen kann und durch Temperaturvariation in einem sog. Thermo-Cycler, bestehend aus einem Erhitzungs- und Abkühlungsprozess, unterhalten wird.

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An der jeweiligen Startsequenz des Primers beginnend, synthetisiert das thermostabile Enzym Tag-Polymerase an der cDNA einen komplementären Strang. Die entstandene Doppelstrang-DNA wird im anschließenden Zyklus wieder durch Denaturierung geteilt und die beiden resultierenden Einzelstränge dienen erneut als Template für den nächsten Zyklus.

Sämtliche Arbeiten mit RNA wurden mit Einmalhandschuhen durchgeführt, um eine Kontamination mit RNasen oder DNA zu vermeiden. Benutzte Glasware und Plastikreaktionsgefäße waren steril, Lösungen autoklaviert. Wasser wurde mit 0,1% Diethylcarbonat versetzt, kräftig geschüttelt, über Nacht stehen gelassen und am nächsten Tag vier Stunden bei 121°C autoklaviert (DEPC-Wasser).

3.5.2 Isolierung von Gesamt-RNA

Für die Isolierung von Gesamt-RNA aus Zellen wurde der RNeasy Total RNA Kit nach Angaben des Herstellers verwendet. Wenn nicht anders beschrieben wurden alle folgenden Arbeitsschritte bei Raumtemperatur durchgeführt.

3.5.2.1  Zelllyse

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Die behandelten Zellen wurden aus Gewebekulturflaschen oder -platten in Greiner-Röhrchen überführt, zentrifugiert (1400 U/min, 4°C, 10 min) und das Zellpellet im Anschluss zweimal mit eiskaltem, sterilem PBS (ohne Ca2+/Mg2+) gewaschen, um dann auf eine Zellkonzentration von 1x106/ml Puffer eingestellt zu werden. 2 ml dieser Zellsuspension wurden in RNase-freie Eppendorfgefäße überführt, zentrifugiert (2000 U/min, 4°C, 10 min) und das entstandene Zellpellet mit einer Wasserstrahlpumpe trocken gesaugt, auf Eis gelagert und sofort mit 350 μl RTL Lysis Puffer versetzt. Nach einminütigem Vortexen wurden die lysierten Zellen zügig tiefgefroren (-80°C).

3.5.2.2 RNA-Extraktion und DNase-Verdau

Der zweite Schritt konzentrierte sich auf die RNA-Extraktion aus lysierten HMC-1 5C6 Zellen, LAD 2 Zellen oder KMZ. Das aufgetaute Lysat musste zunächst zur Homogenisierung auf eine QIAshredder-Säule aufgetragen und 1 min zentrifugiert (10.000 U/min) werden. Anschließend wurde das Lysat mit 350 μl Ethanol (70%) gemischt, auf eine RNeasy-Spin-Säule pipettiert und für 15 s zentrifugiert (10.000 U/min). Die RNA-Fraktion wurde somit an die Spin-Säule gebunden. Um kontaminierende Biomoleküle zu entfernen, wurde die Spin-Säule mit 700 μl RW1 Puffer gespült, wie im vorherigen Schritt zentrifugiert, anschließend mit DNase (10 μl DNase (entsprechen 30 U)und 70 μl RDD Puffer) behandelt und 20 min inkubiert. Nach zweimaligem Waschen und Zentrifugieren der nun gänzlich DNA-freien Gesamt-RNA mit je 500 μl RPE Puffer (10.000 U/min, 15 s und 2 min) konnte sie in 50 μl DEPC-Wasser gelöst werden.

3.5.2.3 Phenolisierung und Fällung

Die extrahierte Gesamt-RNA musste einem Phenolisierungs- und Fällungsprozess unterzogen werden, um von der DNase befreit und aufkonzentriert zu werden. Die in Wasser gelöste RNA wurde dazu mit 100 μl Phenylisoamylalkohol (Luftabzug!) in Gel enthaltende Eppendorfgefäße (Phase Lock Gel) zur Trennung von organischer und wässriger Phase pipettiert, zentrifugiert (10.000 U/min, 5 min) und die entstandene wässrige obere Phase in sterile Eppendorfgefäße überführt. Die gewonnene RNA-Lösung wurde mit Natriumacetat (3 M, 1:10) und 2 μl des Farbstoffs Pellet Paint (im Dunkeln!) versetzt und ein Volumen Ethanol absolut ergänzt. Nach zweiminütiger Inkubation bildete sich nach anschließendem Zentrifugieren (10.000 U/min, 5 min) ein dem Farbstoff entsprechendes rot angefärbtes RNA-Pellet, das mit der Wasserstrahlpumpe trocken gesaugt wurde. Zum Abschluss musste dieses zweimal mit Ethanol (200 μl, 70% und 100 μl, absolut) gewaschen, zentrifugiert (10.000 U/min, 5 min) und abgesaugt werden. Am Ende wurde das saubere Pellet in 20 μl DEPC-Wasser gelöst.

3.5.2.4 RNA-Reinheitsbestimmung und Quantifizierung

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Die Reinheit der RNA wurde mittels Elektrophorese bestimmt. Hierbei wurde RNA auf einem Agarose-Gel (1,5%), das sich in einer Elektrophoresekammer in Gelladepuffer befindet, in die charakteristischen 18S- und 28S-Banden ribosomaler RNA aufgetrennt (70 Volt, 30 min). Bandenunschärfe oder Schlieren im niedermolekularen Bereich sprächen für degradierte RNA. Eine DNA-Kontamination wäre an zusätzlichen Banden im höhermolekularen Bereich erkennbar gewesen. Quantifiziert wurde die RNA mittels des Fluoreszenzfarbstoffs Ribogreen in 96-Well-Platten.

3.5.3 cDNA-Synthese

Für die cDNA-Synthese wurde der Einzelstrang-Synthesekit 1st Strand cDNA Synthesis Kit verwendet. Die RNA-abhängige DNA-Polymerase (reverse Transkriptase) synthetisiert DNA-Kopien eines RNA-Moleküls. Es entsteht eine sog. komplementäre DNA (complementary DNA, cDNA). Für die Synthese von cDNA-Molekülen wurden Random Primer verwendet. Sie hybridisieren mit Nukleotiden auf der mRNA und fungieren so als Startpunkt für die reverse Transkriptase.

Standardmäßig wurde für die reverse Transkription pro Ansatz 1 μg Gesamt-RNA eingesetzt und zu einem Endvolumen von 8,2 μl mit RNase/DNase freiem Wasser verdünnt. Wie in Tabelle 3 aufgelistet betrug das Gesamtvolumen für den Reaktionsansatz für die reverse Transkription 20 μl.

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RNA-H2O-Ansatz und Mastermix wurden durch Vortexen gemischt und 10 min bei Raumtemperatur inkubiert. Bei diesem Schritt hybridisieren die Random Primer mit der mRNA. Während der sich anschließenden einstündigen Inkubation im Wasserbad (42°C) synthetisiert die reverse Transkriptase die cDNA. Der letzte Schritt, zehnminütiges Kochen (95°C), denaturiert die reverse Transkriptase, um bei der Amplifizierung spezifischer cDNA-Fragmente durch die PCR nicht zu interferieren. Die Proben wurden sofort auf Eis gelegt, mit H2O verdünnt (1:3) und dann bei -80°C bis zur Amplifizierung konserviert.

Tabelle 3: Zusammensetzung des kompletten Reaktionsansatzes für die reverse Transkription (pro Ansatz) mit dem Einzelstrang-Synthesekit 1st Strand cDNA Synthesis Kit für RT-PCR (AMV).

Reagenz

Volumen/Ansatz
(in μl)

10x Puffer

2,0

MgCl2 (25 mM)

4,0

Desoxynukleotide

2,0

Random Primer

2,0

RNase-Inhibitor

1,0

reverse Transkriptase

0,8

Volumen Mastermix

11,8

RNA-H2O-Ansatz

8,2

Gesamtvolumen

20,0

3.5.4 PCR

Die spezifische Amplifizierung von DNA-Fragmenten erfolgte mit der Polymerase-Kettenreaktion (Polymerase Chain Reaction, PCR). Für die Amplifizierung wurden Puffer und Reagenzien des PCR Master-Kits eingesetzt, der viele der für die PCR benötigten Komponenten bereitstellt (wie reverse Transkriptase, Desoxyribonukleotide, MgCl2 etc.) und 5 μl cDNA-Lösung verwendet, wobei die bereits verdünnte cDNA (1:3) bei allen Amplifizierungen bis auf FcεRIβ auf 1:30 weiterverdünnt wurde. Für die einzelnen Primer (Tabelle 4) wurden in Vorversuchen für die Amplifizierung der spezifischen DNA-Fragmente ideale Bedingungen getestet. Die allgemeinen PCR-Bedingungen und im besonderen die Annealing-Temperaturen sind in Tabelle 5 und Tabelle 6zusammengefasst. Der Gesamtansatz betrug für alle PCR-Amplifizierungen 25 μl und ist übersichtlich in Tabelle 7dargestellt.

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Tabelle 4: Nukleotid-Sequenzen der eingesetzten Primer-Paare

Oligonukleotid

Sequenz

β-Aktin

Forward: 5'-AAT CTC ATC TTG TTT TCT GCG-3'

Reverse: 5'-CCT TCC TGG GCA TGG AGT CCT-3'

c-kit

Forward: 5'-CTA GGA ATG TGT AAG TGC CTC C-3’

Reverse: 5'-CGT TGA CTA TCA GTT CAG CGA G-3’

Chymase

Forward: 5’-TCCGACCGTCCATAGGATACG-3’

Reverse: 5’-CCCTTATTCCATCCACGGGTCTC-3’

FcεRIα

Forward: 5'-CTG TTC TTC GCT CCA GAT GGC GT-3’

Reverse: 5'-TAC AGT AAT GTT GAG GGG CTC AG-3’

FcεRIβ

Forward: 5'-GAT CAG GAT GGT AAT TCC CGT T-3’

Reverse: 5'-GGA CAC AGA AAG TAA TAG GAG AG-3’

FcεRIγ

Forward: 5'-CCA GCA GTG GTC TTG CTC TTA C-3’

Reverse: 5'-GCA TGC AGG CAT ATG TGA TGC C-3’

HDC

Forward: 5’-AGC TGC CTG AGA GTG CTC CTG A-3’

Reverse: 5’-GCA TTT TTG CCA ACC AGT CCA T-3’

Tryptase

Forward: 5'-GGA GCT GGA GGA GCC CGT GA-3’

Reverse: 5'-ACC TGG GTA GGA AGC AGT GGT G-3’

Tabelle 5: Allgemeine PCR-Bedingungen: Einstellungen der einzelnen Sequenzen des Thermo-Cyclers.

Sequenz

Temperatur/sonstiges

Dauer

Initiale Denaturierung

94°C

5 min

Primerannealing

Tabelle 6

1 min

Elongation

72°C

1 min

Denaturierung

94°C

45 s

Letzte Elongation

72°C

5 min

Zyklen-Anzahl

Tabelle 6

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Tabelle 6: Spezielle Bedingungen für die PCR-Amplifikation: Annealing-Temperatur und Anzahl der Zyklen für HMC-1 5C6 / LAD 2 / KMZ.

Oligonukleotid

Annealing-Temperatur

(in °C)

Anzahl der Zyklen

β-Aktin

58

23/25/25

c-kit

60

30/29/29

Chymase

60

40*/32/30

FcεRIα

50

35/30/30

FcεRIβ

50

40*/30/30

FcεRIγ

65

32/28/28

HDC

62

28/28/28

Tryptase

60

27/27/25

*Chymase und FcεRIβ sind bei HMC-1 5C6 Zellen auf mRNA-Ebene nicht detektierbar.

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Tabelle 7: Gesamtansatz für die spezifische Amplifizierung von DNA-Fragmenten mit der PCR.

Reagenz

Volumen/Ansatz

(in μl)

Master-Mix

12,5

5’Primer

2,5

3’Primer

2,5

H2O

2,5

Volumen Master-Ansatz

20,0

cDNA (i.d.R. 1:30)

5,0

Gesamtvolumen

25,0

Verwendet wurde der PCR Master-Kit nach Herstellerangaben. Die Primer lagen je in einer Konzentration von 500 µM vor.

3.5.5 Agarosegel-Elektrophorese

Die elektrophoretische Auftrennung der amplifizierten DNA-Fragmente erfolgte in Agarose-Elektrophorese. Die Agarosekonzentration betrug 1,5% und wurde in TAE-Puffer aufgekocht, mit Ethidiumbromidlösung (1:10.000) versetzt und 20 min in der Gelapparatur gehärtet. In der Elektrophoresekammer wurde das Gel mit TAE (50x) überschichtet, dann die DNA-Fragmente (10 μl) mit Gelladepuffer (2 μl) gemischt, in die Geltaschen hineinpipettiert und durch Anlegen elektrischer Spannung (6 Volt/cm) aufgetrennt. Zur Bestimmung der Fragmentlänge wurde außerdem ein DNA-Standard mit 100 Basenpaaren auf das Gel aufgetragen (100 bp Leiter). Nach der Elektrophorese (45-60 min) wurden die DNA-Fragmente auf einem UV-Schirm sichtbar gemacht und digital photographiert.

3.6 Statistik

Um die Ergebnisse auf statistische Signifikanz zu untersuchen und die Standardabweichungen (Standard Deviation, SD) zu berechnen, wurden die Microsoft-Excel Dateien, in die alle Ergebnisse dieser Arbeit eingetragen wurden, in das Statistikprogramm STATA 8.0 importiert. Die einzelnen Messungen sind als unabhängige Ereignisse zu betrachten. Die Teststatistik wurde mit dem Student’schen t-Test ermittelt. Es wurde definiert, dass ein p-Wert ≤0,05 als signifikant, ein p-Wert ≤0,01 als hoch signifikant und ein p-Wert ≤0,001 als sehr hoch signifikant bezeichnet werden kann.


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25.08.2006