5 DISKUSSION

5.1  IL-4, IL-6, NGF-β ohne differenzierenden Effekt auf HMC-1 5C6 Zellen

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Ursprünglich standen der Arbeitsgruppe nur zwei Mastzelltypen für Studienzwecke zur Verfügung – wenn man von den Differenzen zwischen dem HMC-1 Subklon 5C6 und der parentalen HMC-1 Zelllinie absieht – um die Effekte von ATRA auf Mastzellen zu untersuchen, nämlich HMC-1 5C6 Zellen und KMZ. Für die Beantwortung der Frage, ob ATRA differenzierende (oder dedifferenzierende) Eigenschaften auf Mastzellen besitzt, und ob diese abhängig von deren Reifegrad sind, war es erforderlich, ein intermediär differenziertes System zu generieren. Um dies zu bewerkstelligen, wurde der Versuch unternommen, neben den unreifen HMC-1 5C6 Zellen und den vollständig differenzierten KMZ, mit Hilfe der Zytokine IL-4 und IL-6 sowie dem Nervenwachstumsfaktor NGF-β ein reiferes System zu schaffen (Tabelle 21). Die zwei Zytokine und der Nervenwachstumsfaktor sind an entscheidenden Prozessen der Myelopoese und auch speziell an der Mastzelldifferenzierung beteiligt wie in der Einleitung ausgeführt (siehe Kapitel 1.3). Der entscheidende Wachstumsfaktor der Mastzelldifferenzierung SCF musste als Differenzierungsfaktor außen vor bleiben, da HMC-1 5C6 Zellen zwei Punktmutationen des SCF-Rezeptors c-kit innehaben, und somit SCF-unabhängig proliferieren (Furitsu et al. 1993).

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Tabelle 21: Humane Mastzellen unterschiedlicher Reifegrade.

HMC-1 5C6 < ‚Zytokin-behandelte HMC-1 5C6’ (angestrebt) < KMZ

Das Ziel einer Zytokinbehandlung wäre eine intermediäre Mastzelllinie zwischen HMC-1 5C6 und KMZ gewesen.

Um eine mögliche Differenzierung zu identifizieren, wurden die drei charakteristischen Mastzellmarker c-kit, Tryptase und FcεRIα herangezogen. c-kit ist im allgemeinen wohl einer der weniger spezifischen Rezeptoren für Mastzellen, obgleich von allen – auch unreiferen – Mastzellen exprimiert und auf fast allen pluripotenten Zellen zu finden, eine Eigenschaft, die mit fortschreitender Reifung verloren geht, nicht aber bei Melanozyten und Mastzellen (Ashman 1999); auch auf unreifen Mastzellen wie den HMC-1 5C6 Zellen sind hohe Level von c-kit nachweisbar. FcεRIα weist die höchsten Expressionsgrade bei Mastzellen und basophilen Granulozyten auf (Hasegawa et al. 1999). Hinsichtlich der Mastzellen wird angenommen, dass sich die Expression mit fortschreitendem Reifegrad verstärkt. Die Tryptase ist eine klassische Serinendoprotease der Mastzelle, wird kaum von anderen Zellen exprimiert und ist somit ein typisches wenn nicht sogar das typischste Mastzellmerkmal (Schwartz 2001).

Dies wird zusätzlich durch neue Daten der Arbeitsgruppe belegt, die zeigen, dass die Transkriptspiegel der Tryptase 20fach erhöht sind gegenüber den – ebenfalls recht weit differenzierten – LAD 2 Zellen (Babina et al. 2005b). Die Unterschiede auf der Proteinebene sind noch drastischer (Guhl, Babina, unveröffentlicht).

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Die zwei eingesetzten Zytokine IL-4 und IL-6 und der Nervenwachstumsfaktor NGF-β zeigten bezüglich der drei gewählten Mastzellmarker teils eben zwar messbare teils auch deutliche Effekte auf die unreife HMC-1 5C6 Zelllinie. Ein intermediär differenziertes Mastzellsystem entstand jedoch nicht, womit sich die Zelllinie unter diesen Bedingungen als weitgehend differenzierungsresistent erwies.

Während IL-6 und NGF-β nur geringe bzw. gar keine Effekte auf HMC-1 5C6 Zellen hatten, induzierte IL-4 eine einheitliche Herunterregulation aller drei untersuchten Marker verbunden mit einer deutlich antiproliferativen Wirkung, die bereits bei der parentalen HMC-1 Zelllinie aufgefallen war (Valent et al. 1991). Obwohl die Effekte von IL-6 und NGF-β nicht so sehr ins Gewicht fielen wie die von IL-4, so ist doch hervorzuheben, dass die Kombination beider zu einer Hochregulation von c-kit und FcεRIα führte und die Effekte von IL-4 leicht dämpfte, nicht aber umkehren konnte. Alle Daten gemeinsam betrachtet legen nahe, dass die Mechanismen, denen die Expression der verschiedenen Marker unterliegt, weitgehend unabhängig voneinander operieren. So wurde von IL-6 ein Marker herunter (Tryptase), ein anderer hoch reguliert (c-kit), während die Kombination mit NGF-β nur zu der oben besagten Hochregulation führte.

Ein weiterer Aspekt geht aus der 24tägigen Kinetikstudie mit HMC-1 5C6 Zellen hervor, bei der sich die maximalen Effekte bereits nach dreitägiger Inkubation mit den Mediatoren einstellten. Dies zeigte zum einen, dass der Weg der Signaltransduktion bis zur Wirkung an den Effektorproteinen zeitlich kürzer ist als bei vielen typischen Differenzierungsagentien, deren Anwesenheit oft mehrere Wochen über gewährleistet sein muss, um die angestrebten Effekte zu erzielen. Zum anderen geht daraus hervor, dass der Effekt keinen kumulativen Aspekt birgt und auch nach 24 Tagen nicht sehr stark an Intensität verliert. Dies wird wahrscheinlich dadurch mitbedingt, dass aufgrund der stetigen Proliferation der Zelllinie die individuelle Zelle einem wesentlich kürzeren Einfluss der Mediatoren unterliegt als aus der Kinetik ableitbar wäre. Andererseits lässt sich die kleine Abschwächung der Effekte (c-kit nach 24 Tagen, Diagramm 1) am ehesten mit einer gewissen Desensibilisierung der Zellen nach langfristiger Inkubation mit den Mediatoren erklären. Da die Kinetikstudie jedoch nur einmal durchgeführt wurde, bleiben die Erklärungen spekulativ, und es lassen sich daraus keine allgemein gültigen Schlüsse ziehen.

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Der IgE-Rezeptorteil FcεRIα war bei HMC-1 5C6 Zellen superfiziell nur sehr schwach exprimiert, während die Expression intrazellulär deutlich höher war. Erklären ließe sich dies in Anlehnung an vorangegangene Publikationen, bei denen FcεRIα intrazellulär gespeichert wurde (Hasegawa et al. 1999, Smith et al. 2000). Dies würde eine weitere Möglichkeit der Zelle darstellen, die Expression des IgE-Rezeptors und die damit verbundene IgE-Quervernetzung zu regulieren und zwar durch Präformation und zytoplasmatische Speicherung des Rezeptorkomplexes gefolgt von dessen Transport zur Plasmamembran auf einen Stimulus hin. Alternativ könnte man aber auch einen HMC-1 5C6-spezifischen Defekt im FcεRI-Transport zur Zellmembran oder ein Fusionsproblem der α-Kette mit den anderen beiden Untereinheiten annehmen. In der Tat werden die β- und γ-Ketten gar nicht oder nur geringfügig von HMC-1 5C6 Zellen exprimiert, was sich durch quantitative RT-PCR am LightCycler im Vergleich mit den anderen Mastzellarten demonstrieren ließ (Babina et al. 2005b).

Blickt man auf andere Studien zu diesem Thema, kommen weitere interessante Aspekte zum Vorschein. Bei Mastzellen, die aus Nabelschnurblut gezüchtet wurden, waren die dedifferenzierenden Effekte von IL-4 durch IL-6 aufhebbar, und IL-6 konnte seine differenzierende Wirkung auf unreife Mastzellen vor allem durch eine Hemmung der Mastzellapoptose entfalten (Oskeritzian et al. 1999). Tatsächlich gilt IL-6 als einer der entscheidenden Wachtumsfaktoren neben rhSCF in der in vitro Mastzellgenerierung (Nakahata et al. 1995, Kirshenbaum et al. 1999). Kinoshita et al. berichteten dagegen über eine Herunterregulation von c-kit durch IL-6 plus rhSCF versus rhSCF allein (1999); wie dies im Zusammenhang mit den anderen zitierten Studien zu bewerten ist, bleibt abzuwarten. Weitere Publikationen (Saito et al. 1995, Kirshenbaum et al. 1999, siehe auch Kapitel 1.3.2) zeigen einen stark differenzierenden und gleichzeitig antiapoptotischen Effekt von IL-6 bei sehr unreifen ‚Prä-Pro-Mastzellen’ – Mastzellen die sicherlich unreifer als HMC-1 5C6 Zellen und gleichzeitig nicht leukämisch entartet sind. Bei HMC-1 5C6 Zellen ist, wie hier gezeigt, dieser Effekt praktisch nicht mehr nachvollziehbar obwohl sie einen IL-6-Rezeptor aufweisen (Schoeler et al. 2003). Gleiches gilt auch für den Nervenwachstumsfaktor NGF-β, was außerdem den schwachen, dennoch nachweisbaren Synergismus mit IL-6 erklären könnte (Kanbe et al. 2000).

5.2 Die intermediär differenzierten LAD 2 Zellen

In der Zeit, in der diese Arbeit entstand, extrahierte die Arbeitsgruppe unter Dr. Metcalfe von einem Patienten mit Mastzellsarkom die Mastzelllinie LAD 2 (Kirshenbaum et al. 2003). Sie stellt im Verhältnis zu HMC-1 5C6 Zellen und KMZ ein intermediäres Reifestadium dar, das dabei näher bei der KMZ als bei der HMC-1 5C6 Zelle liegt (Tabelle 22). Damit stand der Arbeitsgruppe trotz des nicht geglückten Versuchs ein intermediäres Mastzellsystem zu generieren (vgl. 5.1), eine dritte Mastzellart zur Verfügung.

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Tabelle 22: Humane Mastzellen unterschiedlicher Reifegrade.

HMC-1 5C6 << LAD 2 < KMZ

Nachdem die Arbeitsgruppe unter Dr. Metcalfe die Mastzelllinie LAD 2 zur Verfügung gestellt hatte, standen dem Labor drei Mastzellmodelle zur Verfügung.

5.3 IL-4 vermittelte Effekte sind abhängig vom Differenzierungsgrad

Bevor sich die Arbeit dem Hauptteil, also dem Einfluss von ATRA auf Mastzellen unterschiedlicher Reifegrade, widmete, sollte zunächst untersucht werden, ob die IL-4-vermittelten Effekte auf HMC-1 5C6 Zellen auch für die beiden anderen Mastzelltypen LAD 2 Zellen und KMZ Gültigkeit besitzen, oder ob die Effekte etwa abhängig vom Reifegrad bzw. Proliferationspotential der Zellen sind. Die beiden Mastzellmarker c-kit und FcεRIα wurden betrachtet und brachten ein klares Ergebnis: Nur bei HMC-1 5C6 Zellen konnte IL-4 einen signifikanten Effekt erzielen und die beiden Marker herunterregulieren, während bei LAD 2 Zellen höchstens ein Trend, bei c-kit und bei KMZ gar kein Effekt mehr zu erkennen war. Zusätzlich zu den HMC-1 5C6 Zellen konnte auch bei den schwächer proliferieren LAD 2 Zellen eine antiproliferative Komponente festgestellt werden, wenngleich deutlich vermindert. Dem gegenüber stehen KMZ, bei denen IL-4 das Überlebenspotential der Zellen erhöht, ein Effekt, der bereits in der Literatur beschrieben wurde (Babina et al. 2004).

Die Effekte von IL-4 auf humane Mastzellen waren bereits vielfach Thema in Publikationen. So beschrieben Nilsson et al. in zwei Publikationen einen negativen Effekt auf die Expression der Proteine c-kit und Tryptase (Nilsson et al. 1994b, Nilsson & Nilsson 1995). In anderen Arbeiten wurde die Expression von FcεRIα durch IL-4 hochreguliert (Toru et al. 1996, Xia et al. 1997). Setzt man die Ergebnisse der Arbeit in diesen Kontext, so scheint sich die Vermutung zu bestätigen, dass bei proliferierenden, (sehr) unreifen Mastzellen – Mastzellen, die noch nicht den Weg ins Gewebe gefunden haben – IL-4 sowohl einen dedifferenzierenden Einfluss im Sinne einer Herunterregulation einiger Mastzellmarker hat als auch die Proliferation und das Größenwachstum bremst. Ein negativer Einfluss von IL-4 ist auch bei Monozyten gut dokumentiert (Sonoda 1994, Hart et al. 1999), und die ähnlichen Effekte könnten deren angenommene ontogenetische Verwandtschaft mit Mastzellen weiter untermauern (Kirshenbaum et al. 1999, Babina et al. 2004).

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Die Ergebnisse dieses Teils der Arbeit zeigen, dass der Einfluss von IL-4 auf Mastzellen nicht nur Spezies-spezifisch (Mensch vs. Nager) und abhängig vom Mastzelltyp/Lokalisation (mukosale Mastzellen vs. Bindegewebsmastzellen) ist, wie in der Literatur angedeutet, sondern, dass bei humanen Mastzellen der Reifegrad die entscheidende Rolle bezüglich ihrer Sensitivität gegenüber IL-4 spielt.

In ihrer Systematik durch die parallele Einbeziehung verschiedener Mastzellarten stellt die Arbeit ein gewisses Novum dar: Es wurde demonstriert, dass die scheinbaren Widersprüchlichkeiten der Literatur hinsichtlich der Einflüsse von IL-4 auf Mastzellen in Wirklichkeit gar keine Widersprüche darstellen, sondern dass Mastzellen in jedem Fenster ihrer Entwicklung ein anderes Ansprechpotential aufweisen (Thienemann et al. 2004a).

5.4 Der dedifferenzierende Einfluss von ATRA auf humane Mastzellen

Der Hauptteil der Arbeit beschäftigt sich mit den Effekten von ATRA auf humane Mastzellen unterschiedlicher Reifegrade. ATRA ist ein wichtiger Regulator zellulärer Transkriptionsprogramme und beeinflusst ganz wesentlich die Entwicklung fötaler und embryonaler Zellen (Kastner et al. 1995). Zudem nimmt der Einfluss von ATRA nach der Geburt nicht ab und moduliert weiterhin viele Prozesse. Dabei wirkt ATRA besonders potent auf solche Zellen des adulten Organismus, die weiterhin ein proliferatives Potential aufweisen und regeneriert werden. Dies gilt besonders für Zellen der Hämatopoese und ephithelialen Entwicklung.

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Blickt man auf die Hämatopoese, so sind die Effekte vielseitig und erscheinen häufig kontrovers. So kann ATRA je nach Zelltyp und Reifegrad die Differenzierung fördern oder hemmen, die Zellzahlentwicklung positiv wie negativ beeinflussen und Zellfunktionen aktivieren oder eliminieren. Wie in der Einleitung ausführlich dargestellt sind die Regulationsprozesse in der myeloischen Reihe abhängig vom Typ und Differenzierungsgrad der einzelnen Zellen. Humane Mastzellen als hämatopoetisch-myeloische Zellen sind ebenso wie Granulozyten und Monozyten offenbar Ziel des Retinoids. Bislang gibt es aber nur einige wenige Arbeitsgruppen, die sich mit Retinoiden und deren Effekte auf Mastzellen befasst haben. Im Konsens sind die Effekte von ATRA auf Mastzellen bislang ein negativer Einfluss auf die Entwicklung der Zellzahl und auf die Differenzierung im Sinne einer verminderten Expression spezifischer Oberflächenmoleküle, Mastzellproteasen sowie von Histamin. Die Expression anderer pan-leukozytärer Moleküle wie der Adhäsionsmoleküle ICAM-1 und ICAM-3 sowie von CD43 wurde hingegen verstärkt (Babina et al. 1997a, 1997b, 2001). Die bislang vorliegenden Daten beziehen sich dabei fast ausschließlich auf proliferative Systeme. Um weitere Einblicke in die Wirkungsweise von ATRA auf Mastzellen zu gewinnen und zu klären, ob die Effekte des Retinoids sich in Abhängigkeit des Reifegrades bzw. der Teilungsfähigkeit von Mastzellen unterscheiden, wurden drei Mastzellsysteme mit ATRA behandelt.

Die Untersuchungen zeigten einen direkten ATRA-Einfluss auf HMC-1 5C6, LAD 2 und KMZ in Form einer Herunterregulation all jener Mastzellmarker, die Gegenstand der Untersuchung waren (ausgenommen HDC). Daher lässt sich feststellen, dass humane Mastzellen in Anwesenheit des Retinoids offenbar dedifferenzieren. Zudem scheint, dass Mastzellen während ihrer gesamten Lebensdauer effektives Ziel des Retinoids sind, da der Effekt unabhängig von ihrem Reifestadium und bei allen drei untersuchten Mastzellsystemen nachweisbar war. So reduzierte in allen drei Mastzellarten ATRA die Expression von c-kit, Tryptase, FcεRIα und FcεRIγ. Die andere Serinendoprotease Chymase – auf Proteinebene nur in KMZ, auf mRNA-Ebene bei LAD 2 und KMZ nachweisbar – wurde ebenfalls herunterreguliert, während FcεRIβ durch ATRA nur in KMZ negativ beeinflusst wurde, nicht aber bei LAD 2 Zellen. FcεRIβ war bei HMC-1 5C6 Zellen nicht detektierbar. Das Enzym HDC war der einzige Mastzellmarker, der nicht die geringste Beeinflussbarkeit durch ATRA aufwies. Es ist beachtenswert, dass keiner der untersuchten Mastzellmarker hochreguliert wurde.

Auf den ersten Blick waren die Effekte von ATRA unabhängig vom Reifegrad des untersuchten Mastzelltyps. Bei genauerer Betrachtung der einzelnen Ergebnisse fällt jedoch eine Tendenz der Zunahme des Effekts von ATRA mit zunehmendem Reifegrad auf. So ist auf Proteinebene bei c-kit, Trypase und FcεRIα die Herunterregulation der Expression bei KMZ stärker ausgeprägt als bei LAD 2 Zellen und am schwächsten bei HMC-1 5C6 Zellen. Die Chymase ist bei LAD 2 und HMC-1 5C6 Zellen in der Durchflusszytometrie nicht nachweisbar und somit kein Trend beschreibbar. Auch der ATRA-Einfluss auf die mRNA-Konzentration von c-kit, Tryptase, Chymase, FcεRIα und FCεRIβ ist bei KMZ stärker als bei den beiden unreiferen Mastzelltypen HMC-1 5C6 und LAD 2. Allerdings war bei HMC-1 5C6 Zellen die Chymase-spezifische mRNA nicht detektierbar. Zielzellen des Retinoids sind im allgemeinen weniger differenzierte Zellen vor allem in der Embryogenese und frühen Hämatopoese (Gudas et al. 1994). Bei Mastzellen scheint dies nicht der Fall zu sein, da differenzierte KMZ die stärksten Effekte nach ATRA-Behandlung aufwiesen und somit auch in diesem Reifestadium ihre Empfindlichkeit gegenüber dem Retinoid beibehielten – ein interessanter Gesichtspunkt im Kontext der Wirkungsweise von Vitamin A und seinen Derivaten.

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Es lässt sich daher vermuten, dass die Einflüsse von ATRA auf Mastzellen über Mechanismen operieren, die in ähnlicher Weise in jedem Mastzelltyp und unabhängig vom Reifegrad induzierbar sind.

HMC-1 5C6 und LAD 2 Zellen proliferieren in vitro praktisch unendlich (allerdings mit sehr unterschiedlichen Raten) – HMC-1 5C6 sogar unabhängig von rhSCF. KMZ besitzen keine mitotische Aktivität. ATRA hat einen stark antiproliferativen Effekt u.a. auf leukämische Zellen in vitro (Breitman et al. 1980, Benthin et al. 2001), auf Tumorzellen in vivo wie bei der APL (Chomienne et al. 1996) und auf myeloische Vorläuferzellen (Douer et al. 2000). Auch bei HMC-1 Zellen verursacht ATRA eine Reduktion der Zellzahl (Nilsson et al. 1994a, Alexandrakis et al. 2003). Zelluläre Differenzierung geht regelmäßig mit einem Stillstand mitotischer Aktivität einher (Breitman et al. 1980, Olsson & Breitman 1982, Matikainen & Hurme 1994, James et al. 1997, Kreutz et al. 1998, Babina & Henz 2003). Dies macht man sich in der Therapie der APL mit ATRA zunutze, wobei eine Differenzierung der unreifen Blasten in Richtung Granulozyten erreicht wird (Chomienne et al. 1996). Die Mechanismen könnten dabei über eine rein RARE-vermittelte Gentranskription hinausgehen, da sich feststellen ließ, dass auch andere Signalwege, die über STAT-Proteine, Tyrosinkinasen und MAPKs (siehe Kapitel 1.2.2) verlaufen, ebenfalls durch ATRA rekrutiert werden, wobei noch nicht klar ist, was dies beispielsweise für die Therapie der APL bedeutet (Kambhampati et al. 2004). Setzt man nun die Ergebnisse der Effekte von ATRA auf die Proliferation von HMC-1 5C6 und LAD 2 Zellen dieser Arbeit in wissenschaftlichen Kontext, so bestätigt sich zwar die antiproliferative Eigenschaft von ATRA (Tabelle 9), die interessanterweise jedoch nicht, wie für andere Zellarten beschrieben, mit einer Differenzierung sondern einer Dedifferenzierung der Zelllinien einherging. Zusätzlich konnte mit der YO-PRO-1-Methode gezeigt werden, dass ATRA keinerlei Zelltod-induzierenden Effekt besitzt, und die Reduktion der Zellzahl proliferierender HMC-1 5C6 Zellen und LAD 2 Zellen daher auf antiproliferativen Eigenschaften von ATRA, nicht aber auf einer beschleunigten Sterberate beruht. Dies steht im Einklang mit der zahlreichen hierzu vorliegenden Literatur (Alexandrakis et al. 2003, Otsuki et al. 2003).

Es kann also vermutet werden, dass der antiproliferative Effekt von ATRA auf beide Zelllinien von den ansonsten dedifferenzierenden Effekten unabhängig und ihnen schlichtweg übergestülpt ist. Dass diese beiden Prozesse – d. h. Antiproliferation und Dedifferenzierung – zeitgleich auftreten können, lässt sich versuchsweise damit erklären, dass die typisch antiproliferative Wirkung von ATRA, die in fast allen Zellsystemen beobachtet wird, auch bei den Mastzelllinien auftritt, hier aber gekoppelt ist mit Negativeinflüssen auf typische Linienmarker. Letztere scheinen wiederum während der gesamten Lebensdauer einer Mastzelle zu bestehen, wenn man die vorliegende Literatur (Kinoshita et al. 2000, Alexandrakis et al. 2003, Hjertson et al. 2003) mit den Daten der eigenen Studie kombiniert. Der mechanistische Unterbau, der den antiproliferativen Effekten von ATRA bei einigen leukämischen Zellen zugrunde liegt, besteht in einer starken Abnahme der c-Myc und Cyclin-E-Konzentration, gefolgt von einer posttranskriptionellen Hochregulation der Expression der Proteine p21WAF1/CIP1 und p27Kip1, wodurch der Eingriff in die Zellzyklusprogression bewerkstelligt wird (Dimberg et al. 2002). Cycline modulieren den Eintritt einer Zelle in die Mitose, indem sie andere Enzyme (Cyclin-abhängige Kinasen) anschalten und so den Übergang von der G0- in die G1-Phase und dann weiter in die S-Phase bewirken (Berg et al. 2002). Es kann vermutet werden, dass ähnliche Mechanismen auch bei HMC-1 5C6 und möglicherweise auch bei LAD 2 Zellen greifen. Das Konzept der höchsten ATRA-Effekte bei proliferativen Stadien einer Zellart kann in Bezug auf ATRA und humane Mastzellen nicht aufrechterhalten werden, da die Dedifferenzierung mit zunehmendem Reifegrad der Mastzellen quantitativ zunahm und bei KMZ am höchsten war. Auch wurde die Überlebenswahrscheinlichkeit von KMZ durch ATRA nicht beeinflusst (Tabelle 9). Diese Ergebnisse spiegeln die anderer Untersuchungen wider (Hjertson et al. 2003). In Bezug auf Mastzellen und ATRA müssen Differenzierung und Proliferation in Zukunft gesondert betrachtet werden.

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Im Unterschied zu den eigenen Daten beschrieben Kinoshita et al. unter Verwendung von aus Nabelschnurblut gezüchteten Mastzellen eine starke Abnahme von Histamin durch Retinoide (2000). Dabei wurde die HDC-Expression nicht untersucht. Da es in dieser Studie zu einer massiven Abnahme der Zellgröße durch ATRA kam, sagt die Zunahme von Histamin auf einer Pro-Zell-Basis wenig darüber aus, ob die Histaminkonzentration in der Zelle – bezogen auf die Zellmasse bzw. auf andere als konstant angenommene Referenzproteine – tatsächlich ansteigt. Desweiteren berichteten Hjertson et al., dass in der Retinoid-behandelten Haut keine Effekte auf die Mastzelldichte erkennbar sind (2003). Während die nur Tryptase-positiven Mastzellen geringfügig anstiegen, ließ sich keinerlei Einfluss auf die typischen Tryptase+/Chymase+ doppelt positiven Mastzellen feststellen. Obgleich die Gruppe diese Befunde dahingehend interpretiert hat, dass Retinoide lediglich auf Mastzellvorläufer wirken und reife Mastzellen weniger suszeptibel sind, lassen sich die Befunde durchaus in Einklang mit der eigenen Studie bringen und dabei alternativ interpretieren: Abgesehen davon, dass die Effekte auf Mastzellen in komplexen in vivo Situationen durch die Effekte weiterer Zellen indirekt moduliert werden können, findet auch die vorliegende Arbeit keinen Einfluss von ATRA auf das Überleben der KMZ. Desweiteren ist die hier aufgedeckte Herunterregulation von Tryptase und Chymase auf Proteinebene relativ gering, viel zu gering jedenfalls, um mittels Immunhistochemie, die allenfalls semi-quantitative Aussagen gestattet, detektierbar zu sein. Die hier vorgenommenen Studien zur Quantifizierung der mRNA-Ebene, die eine deutliche Abnahme beider Proteasen demonstriert haben, sind von Hjertson et al. dagegen nicht durchgeführt worden.

Mastzellen verfügen über diverse Retinoidrezeptoren (Babina et al. 2001 und weitere unveröffentlichte Daten der Arbeitsgruppe) und sind daher zu einem RAR- und/oder RXR-vermittelten Einfluss auf die Genexpression in der Lage. Wie jedoch dieser erste Schritt, d.h. die Bindung von ATRA an Retinoidrezeptoren und deren Aktivierung, in die komplexe Erscheinung der Dedifferenzierung übersetzt wird, ist unklar. Aufgrund der relativ langen Zeiten, die nötig sind, um die Effekte zu beobachten, kann jedoch angenommen werden, dass es sich in den meisten Fällen um indirekte Einflüsse handelt. Das heißt, dass ATRA nicht direkt in die Regulation der Mastzellmarker eingreift (ohnehin eher unwahrscheinlich, weil RAREs i.d.R. positiv-regulatorische Elemente sind, die die Transkriptionsrate eines Gens verstärken und nicht abschwächen [Chambon 1996]), sondern die Produktion weiterer regulatorischer Proteine steuert, die anschließend (ggf. über weitere Zwischenstufen) die Linienmarker herabregulieren. In der Tat liegen der Arbeitsgruppe bereits Ergebnisse vor, die aufzeigen, dass ATRA massiv in das Transkriptionsfaktor-Repertoire von Mastzellen eingreift (Babina, bislang unveröffentlichte Daten). Die detaillierte Aufklärung aller molekularen Mechanismen wird allerdings noch große Forschungsanstrengungen erfordern und könnte viele Jahre dauern.

Wie bereits beschrieben wird die Mehrheit der Mastzellmarker sowohl auf Protein- als auch auf mRNA-Ebene herunterreguliert. Die Wege, die zu dieser veränderten Expression führen, sind aber vermutlich je nach Marker unterschiedlich. Ein Hinweis darauf ist die mal stärkere Herunterregulation auf Proteinebene (Diagramm 4) und mal auf mRNA-Ebene (Diagramm 5). Zwei Extreme sind der SCF-Rezeptor c-kit, der auf Proteinebene durch ATRA sehr stark herunterreguliert wurde, während die mRNA-Konzentration schwächer oder gar nicht betroffen war. Das andere Extrem ist die Chymase. Bei dieser war die mRNA-Konzentration am stärksten negativ beeinträchtigt. Die Unterschiede zwischen Protein- und mRNA-Expression könnten unter anderem auch von der Proteinstabilität abhängen. Während die Tryptase und Chymase in Granula gespeicherte Proteasen sind – bei beiden ist die mRNA deutlich herunterreguliert –, sind c-kit und FcεRIα in die Zellmembran integriert und unterliegen gegebenenfalls anderen Auf- und Abbaumechanismen.

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Die höhere Stabilität der Serinendoproteasen könnte z. B. durch den protektiven Einfluss von Proteoglykanen gewährleistet sein (Humphries et al. 1999). Eine sehr hohe Stabilität der Proteasen in ihrer natürlichen Umgebung kann daher angenommen werden. Als alternative, wenngleich weniger wahrscheinliche Erklärung, kommt auch in Betracht, dass die die Proteasen kodierende mRNA keinen limitierenden Faktor bei der Determination der Proteinmenge darstellt.

Während sich die Ergebnisse der Proteasen probeweise erklären lassen, war zunächst völlig unklar, welchen Weg die ATRA-vermittelte Herunterregulation von c-kit beschreitet, ohne dass seine mRNA in den HMC-1 5C6 Zellen einem Einfluss unterliegt. Es muss daher weitere Mechanismen geben, die die Zelloberflächendichte von c-kit beeinflussen. Gut dokumentiert sind z. B. die Liganden-(d. h. SCF-)vermittelte Internalisierung mit anschließender Degradation sowie eine proteolytische Abspaltung nach Zellaktivierung (shedding), so dass der c-kit Metabolismus nicht mit einer veränderten Genaktivität einhergehen muss (Brizzi et al. 1993, Yee et al. 1993, Shimizu et al. 1996, Cruz et al. 2004).

In den hier durchgeführten Studien ließ sich tatsächlich zeigen, dass ATRA die c-kit-Expression auf zweifache Weise beeinflusst: Zum einen über einen transkriptionellen Mechanismus, der besonders stark bei den KMZ gefolgt von LAD 2 Zellen auftritt, zum anderen durch einen posttranskriptionellen Weg, der bei HMC-1 5C6 Zellen besonders ausgeprägt ist. In der Tat geht die gesamte Abnahme von c-kit bei letzteren offenbar auf diesen zweiten regulatorischen Mechanismus zurück, denn die Transkriptkonzentration ist zu keinem Zeitpunkt signifikant betroffen. Es deutet sich dabei an, dass der Einfluss von ATRA auf translationellem Weg erfolgen könnte. Dies wird einerseits durch die kinetischen Daten gestützt: Der Effekt ist bereits nach 16 h maximal (Diagramm 6), d.h. nach einem wesentlich längeren Zeitraum als z. B. die Liganden-induzierte c-kit-Internalisierung, die bereits nach 20 min erkennbar ist, aber doch nach einem kürzeren Zeitabschnitt, den in der Regel eine transkriptionelle Regulation erfordert, um ihr Maximum zu erreichen. Andererseits wird aus den Kombinationbehandlungen mit ATRA + Inhibitoren (versus Inhibitoren alleine) deutlich, dass der Effekt von ATRA bei Anwesenheit von Cycloheximid verschwindet, nicht aber bei Anwesenheit anderer Inhibitoren (Diagramm 7). Dies deutet darauf hin, dass Cycloheximid und ATRA gleichartig operieren. Ein translationeller Mechanismus ist in der Literatur bislang im Zusammenhang mit der c-kit-Regulation noch nicht beschrieben worden, seine Existenz wäre jedoch von hohem Interesse. Deswegen werden die Studien, die endgültig zu seiner Identifizierung führen sollen, in dem Labor intensiv weitergeführt.

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Im Zusammenhang mit der Regulation von c-kit ist erwähnenswert, dass die hier gefundene starke Abnahme der Proteinexpression auf Mastzellen beschränkt zu sein scheint, da sie bei c-kit+-Stammzellen nicht auftritt (Hayashi et al. 1995, Herault et al. 1998).

Zusammenfassend lässt sich feststellen, dass ATRA einen deutlich dedifferenzierenden Einfluss auf Mastzellen ausübt (Abbildung 17), der durch die Herunterregulation aller untersuchten Mastzellmarker (mit Ausnahme von HDC) veranschaulicht wird, und dass diese Effekte bei allen drei Mastzelltypen detektierbar sind. Es gibt nur wenige Studien, die ATRA mit Negativeffekten auf Linienmarker in Zusammenhang bringen, am ehesten wohl noch bei Mastzellen. Dies hatte sich in der Literatur bereits angedeutet, konnte aber in dieser Arbeit nunmehr – auch unter Zuhilfenahme terminal differenzierter Mastzellen – endgültig demonstriert werden. ATRA bestätigt sich daher abermals als ein wichtiger Akteur der Hämatopoese im allgemeinen und der Myelopoese im besonderen (Abbildung 3 und Abbildung 17). In dem komplexen Zusammenspiel von Wachstum und Entwicklung koordinieren ATRA und andere Retinoide nicht nur einen einzigen Mechanismus wie beispielsweise die Differenzierung oder Dedifferenzierung einer einzelnen Zellart. Sie koordinieren auch im eigentlichen Sinne des Wortes viele Prozesse gleichzeitig und beeinflussen dabei vermutlich Aspekte wie beispielsweise Alter, Gesundheitszustand oder Homöostase unter Berücksichtigung der jeweiligen Erfordernisse und entsprechender Anpassung ihrer Wirkung. So kann es sein, dass ATRA bei dem einen Zelltyp differenzierende Eigenschaften aufweist, während der andere Zelltyp zur Dedifferenzierung gebracht wird. Der dedifferenzierende Einfluss von ATRA auf Mastzellen ist hiermit systematisch aufgearbeitet worden und ermöglicht eine neue Betrachtungsweise von ATRA in Bezug auf Wachstum und Differenzierung von Leukozyten.

Abbildung 17: Ausschnitt von dem Modell der Myelopoese aus der Einleitung (Abbildung 3).

Die Grafik ist um die neuen Erkenntnisse aus dieser Arbeit probeweise erweitert und der dedifferenzierende Einfluss von ATRA auf humane Mastzellen in Rot ergänzt worden.

5.5 Gegenüberstellung der Einflüsse von IL-4 und ATRA auf Mastzellen

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Nachdem der Versuch gescheitert war, ein reiferes Zellsystem als die HMC-1 5C6 Zellen mit Hilfe der ausgewählten Zytokine zu generieren, wurde dennoch weiter in die deutlich negativen Effekte von IL-4 auf Mastzellen investiert. Wie bei den Versuchen mit ATRA wurden auch die Effekte von IL-4 auf alle drei Mastzellsysteme im Vergleich getestet. Der Grund dafür war, dass zwar bereits viele Publikationen zum IL-4-Effekt auf Mastzellen verfügbar waren, die Daten aber deutlich divergierten. Somit sind die Mastzellsysteme HMC-1 5C6, LAD 2 und KMZ sowohl mit IL-4 als auch mit ATRA behandelt worden.

Im Gegensatz zu IL-4 waren die Effekte von ATRA auf Mastzellen weitgehend unabhängig vom Reifegrad, die Qualität der Effekte bei allen untersuchten Mastzelltypen ähnlich. Damit präsentiert sich IL-4 als ein Zytokin, das nur in einem sehr kurzen Zeitfenster auf Mastzellen zu wirken scheint, da selbst bei den intermediär differenzierten LAD 2 Zellen nur noch ein Trend aber kein signifikanter Effekt auf die c-kit- und FcεRIα-Expression nachweisbar war. Dies liegt nicht an einer abnehmenden Expression des IL-4-Rezeptors (Babina, Guhl, unveröffentlicht) oder des in die Signaltransduktion involvierten STAT6 (Babina et al. 2005a) in den verschiedenen Mastzellen. Es gibt also Substanzen, die Mastzellen während ihrer gesamten Genese ansprechen können, wohingegen die Wirkung anderer auf ein spezielles Stadium beschränkt bleibt oder gar revertiert werden kann.

Interessant ist dieser Gesichtspunkt natürlich im Hinblick auf die Mastzellheterogenität und bietet eine Erklärung für die großen Unterschiede und starke Schwankungsbreite in den publizierten Untersuchungen zu Mastzellen. Die Ergebnisse dieser Arbeit machen deutlich, wie wichtig bei der konsequenten Untersuchung von Mastzellen der parallele Einsatz verschiedener Mastzellsysteme ist, um Veränderungen von Prozessen wie der Ansprechbarkeit gegenüber Mediatoren zu erfassen, um allgemein gültige und nicht auf eine einzige Zelllinie beschränkte Erkenntnisse zu erzielen. Erst dann lassen sich klare Schlussfolgerungen ziehen. Die Bedeutung eines Metaboliten, der nur in einem sehr kurzen Zeitfenster seine Wirkung zeigt, ist nichtsdestotrotz genauso wichtig wie die eines Metaboliten, der unabhängig vom Reifegrad auf eine Zellart lebenslang seine Wirkung entfalten kann. Im Falle des Retinoids ist der vom Reifegrad unabhängige Einfluss von wesentlicher physiologischer Bedeutung und Interesse, da sich endgültig differenzierte Zellen im humanen System im Regelfall wenig oder gar nicht durch ATRA beeinflussen lassen.


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25.08.2006