In dieser Arbeit repräsentierten HMC-1 5C6 Zellen das am wenigsten reife der drei Mastzellsysteme. Es ist allerdings stärker differenziert als die parentale HMC-1 Zelllinie (Butterfield et al. 1988) und weist deutlichere Mastzellcharakteristika auf, die in der Literatur bereits beschrieben wurden (Weber et al. 1996).

HMC-1 5C6 Zellen exprimierten in den hiesigen Studien die α-Untereinheit des FcεRI-Rezeptors praktisch nur intrazellulär, auf der Zelloberfläche war nur eine sehr schwache Detektion möglich. In starkem Umfang ließen sich der SCF-Rezeptor c-kit und die Tryptase nachweisen (Abbildung 4). Im Rahmen dieser Arbeit wurde die Expression einer Reihe weiterer Marker, die als pan-leukozytär gelten oder für andere Zelltypen spezifisch sind, untersucht. HMC-1 5C6 Zellen exprimierten CD43, CD50 (ICAM-3), CD11a, CD18 und CD35 in absteigender Reihenfolge ihrer Intensität. HMC-1 5C6 Zellen proliferierten stark mit einer Verdopplung der Zellzahl innerhalb von 30-36 Stunden (Ergebnisse nicht dargestellt).

Ein intermediäres Reifestadium stellen LAD 2 Zellen dar. Im Gegensatz zu HMC-1 5C6 Zellen verfügt diese Mastzelllinie über einen funktionellen IgE-Rezeptor FcεRI, und das SCF-Rezeptorgen c-kit ist nicht mutiert (Kirshenbaum et al. 2003).

LAD 2 Zellen exprimierten die α-Untereinheit des FcεRI-Rezeptors ausgesprochen stark, außerdem in ähnlichem Maße wie HMC-1 5C6 Zellen c-kit und Tryptase (Abbildung 5). LAD 2 Zellen besaßen eine schwache Proliferationskapazität, die rhSCF abhängig war. Im Einklang mit der Literatur (Kirshenbaum et al. 2003) verdoppelte sich ihre Population nach etwa zwei Wochen (Ergebnisse nicht dargestellt).

Die aus Vorhautpräparationen stammenden KMZ exprimierten die α-Untereinheit des FcεRI-Rezeptors in ähnlichem Umfang wie die LAD 2 Zellen; zusätzlich exprimierten die KMZ natürlich auch c-kit und die Tryptase (Abbildung 6).

Abbildung 4: Flowzytometrie-Histogramm: Repräsentative Darstellung der Mastzellmarker FcεRIα, c-kit und Tryptase bei unbehandelten HMC-1 5C6 Zellen.

Die Zellen wurden in reinem Medium im Brutschrank kultiviert. Blau: Isotypkontrolle; Rot: Proteine (wie beschriftet). Die α-Kette des IgE-Rezeptors FcεRIα wurde sowohl auf der Zelloberfläche als auch intrazellulär nach Permeabilisierung mit Hilfe der Flowzytometrie gemessen. FcεRIα wird superfiziell praktisch nicht exprimiert.

Abbildung 5: Flowzytometrie-Histogramm: Repräsentative Darstellung der Mastzellmarker FcεRIα, c-kit und Tryptase bei unbehandelten LAD 2 Zellen.

Die Zellen wurden in reinem Medium im Brutschrank kultiviert. Blau: Isotypkontrolle; Rot: Proteine (wie beschriftet).

Abbildung 6: Flowzytometrie-Histogramm: Repräsentative Darstellung der Mastzellmarker FcεRIα, c-kit und Tryptase bei unbehandelten kutanen Mastzellen direkt nach ihrer Isolierung aus Vorhautgewebe.

Blau: Isotypkontrolle; Rot: Proteine (wie beschriftet).

Die Vorversuche umfassten Untersuchungen zu Einflüssen von IL-4, IL-6 und NGF-β auf HMC-1 5C6 Zellen in Medien mit fötalem Kälberserum (Fetal Calf Serum, FCS) bzw. Pferdeserum (Horse Serum, HS). In zehn Testreihen konnte gezeigt werden, dass IL-4 bei HMC-1 5C6 Zellen sowohl eine Herunterregulation der Mastzellmarker verursacht als auch die Zellzahl vermindert. IL-6 und NGF-β wiesen dagegen nur schwache Effekte auf. Außerdem zeigte sich die Kultivierung in HS gegenüber in FCS von Vorteil, da die Effekte deutlicher waren (Ergebnisse nicht dargestellt).

HMC-1 5C6 Zellen wurden 24 Tage mit Zytokinen behandelt und alle drei Tage mit Hilfe der Flowzytometrie gemessen, die verbliebenen Zellen mit frischen Zytokinen restimuliert und weiterkultiviert.

Anhand dieser Kinetikstudie konnte gezeigt werden, dass die Effekte der Zytokine selbst nach 24tägiger Inkubation nicht stärker ausgeprägt waren als schon nach drei Tagen. Am eindruckvollsten wurde das Ergebnis anhand des Mastzellmarkers c-kit sichtbar. Mit drei Ausnahmen waren am dritten Tag der Inkubation, also am Messtag 3, die Effekte am ausgeprägtesten (Diagramm 1: IL-4, IL-6, NGF-β, IL-6+NGF-β). So ergab sich unter IL-4, allein oder in Kombination mit anderen Zytokinen, ein Rückgang der c-kit Expression um mehr als 50% bereits nach dreitägiger Inkubation (Diagramm 1: IL-4, IL-4+IL-6, IL-4+NGF-β, IL-4+IL-6+NGF-β). Im weiteren Verlauf der 24tägigen Kinetik war kein Trend in der c-kit Expression zu erkennen. Das gleiche Ergebnis zeigte sich, jedoch weniger ausgeprägt, auch bei der Tryptase und FcεRIα (Ergebnisse nicht dargestellt).

Aus diesen Resultaten ließ sich ableiten, dass erstens eine dreitägige Inkubationszeit mit Zytokinen ausreicht um Effekte zu erzielen und zweitens IL-4 einen erheblichen Effekt im Sinne einer Herunterregulation der Mastzellmarker c-kit, Tryptase und FcεRIα hat, der durch Kombinationen mit anderen Zytokinen nicht aufgehoben, höchstens abgeschwächt werden kann.

Ein weiterer interessanter Aspekt, der bereits mehrfach in der Literatur beschrieben wurde, war die Verminderung der Zellzahl unter dem Einfluss von IL-4 im Vergleich zur Mediumkontrolle. So wiesen alle IL-4-haltigen Zytokinkombinationen einen stark antiproliferierenden Effekt auf die Zelllinie HMC-1 5C6 auf, was im nachfolgenden Abschnitt (siehe Kapitel 4.2.3) genauer beleuchtet wird.

Diagramm 1: Darstellung der c-kit Expression (blau) auf HMC-1 5C6 Zellen im Vergleich zur Isotypkontrolle (grau) während der 24tägigen Inkubation mit IL-4, IL-6 und NGF-β.

Die Daten der Behandlungen beziehen sich auf die Messwerte der Mediumkontrolle des jeweiligen Messtages (in %). Gezeigt wird jeder zweite Messtag (Messtage 3, 9, 15 und 21). Zur optischen Veranschaulichung sind auf der linken Blatthälfte alle IL-4-haltigen Behandlungen abgebildet.

Nach den Vorversuchen und der 24tägigen Kinetik schließt sich nun die Reproduktion und genauere Quantifizierung der Ergebnisse an. Dazu wurden HMC-1 5C6 Zellen mit allen sieben Zytokinkombinationen (IL-4, IL-6, NGF-β, IL-4+IL-6, IL-4+NGF-β, IL-6+NGF-β und IL-4+IL-6+NGF-β) bzw. mit Kontrollmedium drei Tage lang behandelt und anschließend mit Hilfe der Flowzytometrie die Mastzellmarker c-kit, Tryptase und FcεRIα gemessen, um die in den Vorversuchen angedeuteten Effekte zu bestätigen und statistisch auszuwerten.

Der stärkste Effekt ging wie erwartet von IL-4 aus und wies eine starke Abnahme der Proteinexpression von c-kit, FcεRIα und Tryptase (absteigend nach der Stärke der Suppression) gegenüber der Mediumkontrolle ohne Zytokinzusatz (gesetzt 100%) auf (Diagramm 2: IL-4). Auch in Kombination mit den Zytokinen IL-6 und NGF-β dominierte IL-4 mit seiner inhibitorischen Eigenschaft bezüglich der Expression der Mastzellmarker (Diagramm 2: IL-4+IL-6, IL-4+NGF-β, IL-4+IL-6+NGF-β), während IL-6 allein oder in Kombination mit NGF-β eine Hochregulation des SCF-Rezeptors c-kit verursachte. Die Kombination beider verursachte außerdem eine Hochregulation der Tryptase (Diagramm 2: IL-6, IL-6+NGF-β). Der alleinige Einsatz von NGF-β zeigte keinen Effekt in Bezug auf die Expression der Mastzellmarker (Diagramm 2: NGF-β).

Zusammenfassend induzierte IL-4 eine Herunterregulation aller drei Mastzellmarker und hatte somit scheinbar dedifferenzierende Eigenschaften bezüglich dieser an sich schon unreifen Mastzelllinie HMC-1 5C6. Der stärkste Effekt konnte bei c-kit und der schwächste Effekt bei FcεRIα mit Hilfe der Flowzytometrie gemessen werden. Genau wie bei der parentalen HMC-1 Zelle (Valent et al. 1991) wirkte IL-4 auch bei dessen Subklon hemmend auf die Proliferation, was sich schon bei der 24tägigen Kinetik angedeutet hatte (Diagramm 3). Die anderen Zytokine hingegen zeigten nur minimale (IL-6) oder keine (NGF-β) Effekte auf die Proliferation.

Der angestrebte differenzierende Effekt, um ein intermediär entwickeltes Mastzellstadium zwischen HMC-1 5C6 Zellen und KMZ zu generieren, blieb aus. Beachtlich war aber die deutlich dedifferenzierende Eigenschaft von IL-4. Aufgrund dieser Erkenntnisse wurde zunächst weiter in diesen Themenkomplex investiert und die Fragestellung bearbeitet, ob IL-4-vermittelte Effekte abhängig vom Differenzierungsgrad der Mastzelle sind.

Diagramm 2: Expression der Mastzellmarker FcεRIα, c-kit und Tryptase (Try) bei HMC-1 5C6 Zellen nach dreitägiger Inkubation mit IL-4, IL-6 und NGF-β, allein oder in Kombination.

Die Marker wurden mit Hilfe der Flowzytometrie gemessen. Die Expression der Marker in der Mediumkontrolle wurde gleich 100% gesetzt. Die Antigenexpression der Zytokin-behandelten Zellen bezieht sich auf diese Mediumkontrolle (in %). Die Ergebnisse werden präsentiert als Mittelwert (±SD) von jeweils mindestens vier unabhängigen Messungen. Die mit (*) oder (**) gekennzeichneten Ergebnisse zeigen eine signifikante Herunterregulation der Mastzellmarker (p<0,05 bzw. p<0,01), während (#) auf eine signifikante Hochregulation der Mastzellmarker hinweist (p<0,05).

Diagramm 3: Quantitative Bestimmung der Zellzahl der HMC-1 5C6 Zellen, dargestellt in % zur jeweils eingesäten Zellzahl, gemessen nach dreitägiger Inkubation mit Zytokinen.

Ergebnisse zeigen die Mittelwerte (±SD) von acht unabhängigen Messungen. Alle IL-4-haltigen Messungen zeigen eine signifikante Zellzahlverminderung (p<0,05).

Zu Beginn dieser Arbeit standen der Forschung ausschließlich die Zelllinien HMC-1 und HMC-1 5C6 zur Verfügung (siehe Kapitel 4.2). 2003 etablierte die Arbeitsgruppe von Dr. Metcalfe eine neue Zelllinie von einem Patienten mit Mastzellsarkom, die ein beinahe unerschöpfliches Reservoir einer SCF-abhängigen Mastzelllinie darstellt. Diese LAD 2 genannte Mastzelllinie repräsentiert ein intermediäres Entwicklungsstadium zwischen HMC-1 5C6 und KMZ (Kirshenbaum et al. 2003).

Fortan standen unserem Labor drei Mastzellsysteme unterschiedlichen Reifegrades zur Verfügung: HMC-1 5C6, LAD 2 und KMZ. Mittels dieser drei Systeme konnte nun untersucht werden, ob die IL-4-vermittelten Effekte abhängig vom Differenzierungsgrad (bzw. Proliferationspotential) der Mastzelle sind. Dazu wurden die Zellen drei Tage in IL-4-haltigem Medium kultiviert und anschließend die Mastzellmarker c-kit und FcεRIα mit Hilfe der Flowzytometrie gemessen (Abbildung 7) und statistisch ausgewertet (Tabelle 8). Während sich bei KMZ weder die Expression von FcεRIα noch von c-kit durch IL-4 beeinflussbar zeigt, wiesen LAD 2 Zellen einen klaren Trend in Richtung Herunterregulation des SCF-Rezeptors, nicht aber von FcεRIα auf, ohne jedoch statistisch ein signifikantes Ergebnis zu liefern. Eine Herunterregulation beider Marker war wie schon bei den vorangegangenen Versuchen bei HMC-1 5C6 Zellen zu messen. Es gilt jedoch zu berücksichtigen, dass FcεRIα von vornherein in nur sehr geringem Maße exprimiert wird. Interessant waren auch die Effekte von IL-4 auf die Proliferation (Tabelle 8). So bestätigte sich abermals der antiproliferative (oder proapoptotische) Effekt von IL-4 bei proliferierenden HMC-1 5C6 Zellen. In geringerem Maße galt dies auch für die schwächer proliferierenden LAD 2 Zellen, jedoch nicht für KMZ. Deren Überlebensrate – KMZ proliferieren nicht – wurde signifikant verlängert. Dieser Effekt wurde in der Literatur bereits beschrieben und wird in der Diskussion genauer erörtert.

Zusammenfassend zeigte IL-4 eine starke Herunterregulierung des SCF-Rezeptors c-kit, die mit zunehmender Differenzierung der Mastzelle abnahm und bei KMZ nicht mehr nachweisbar war. Dem Negativeffekt von IL-4 auf die Zellzahlentwicklung der Mastzelllinien stand eine lebensverlängernde Wirkung bei KMZ gegenüber.

Abbildung 7: Expression der Mastzellmarker auf der Zelloberfläche: FcεRIα und c-kit gemessen mit Hilfe der Flowzytometrie nach dreitägiger Inkubation mit IL-4.

FcεRIα

c-kit

Zellzahl

HMC-1 5C6

Medium

100

100

458 ±86

IL-4

75,2 ±14,4*

70,2 ±8,7**

267 ±75**

LAD 2

Medium

100

100

134 ±14

IL-4

102,6 ±5,9

87,8 ±9,0

114 ±11*

KMZ

Medium

100

100

82,7 ±4,5

IL-4

103,4 ±1,5

95,3 ±5,3

90,0 ±6,0#

Tabelle 8: Zusammengefasst sind die Effekte von IL-4 auf die Expression der Mastzellmarker FcεRIα und c-kit sowie auf die Veränderung der Zellzahl.

ATRA hat starken Einfluss auf die Proliferation und Überlebensdauer von Zellen der myeloischen Reihe, wie in zahlreichen in vitro und in vivo Versuchen gezeigt werden konnte.

An dieser Stelle sollen die Einflüsse von ATRA auf die Mastzelle genauer untersucht und dargestellt werden. Wie im vorangegangenen Abschnitt waren auch im zweiten Teil dieser Arbeit drei Mastzellsysteme Gegenstand der Untersuchung. Die stark proliferierenden HMC-1 5C6 Zellen stehen den schwach proliferierenden LAD 2 Zellen gegenüber, während KMZ keine mitotische Aktivität besitzen, sich aber mit rhSCF Zusatz in Medium kultivieren lassen.

Bei HMC-1 5C6 Zellen bewirkte ATRA einen Rückgang der Zellzahl um mehr als 40% im Vergleich zur Mediumkontrolle, während LAD 2 Zellen einen negativen Einfluss von ATRA von knapp 10% aufwiesen. Das Überleben von KMZ hingegen wurde durch ATRA nicht beeinflusst. Eine signifikante Zellgrößenveränderung, gemessen am Zelldurchmesser, konnte nur bei HMC-1 5C6 Zellen unter ATRA-Behandlung im Vergleich zur Mediumkontrolle nachgewiesen werden, obgleich eine ähnliche Tendenz auch bei LAD 2 Zellen und KMZ erkennbar war (Tabelle 9). Bei Untersuchungen der Zellzahl nach einer bestimmten Behandlung, wie in diesem Falle nach Behandlung mit ATRA, kommen zwei Aspekte zum Tragen, die die Zellzahl verändern können. Zum einen kann durch Variation der mitotischen Aktivität der Zellen Einfluss auf die Proliferation ausgeübt werden, zum anderen kann sich die Überlebensdauer der Zellen verändern, was einem frühzeitig induzierten Zelltod gleichkommt. Ob ATRA den Zelltod von HMC-1 5C6 und LAD 2 Zellen beschleunigt, wurde nachfolgend getestet. Dies wurde mit der YoPro-Methode bewerkstelligt, die den Prozentsatz vitaler, nekrotischer und apoptotischer Zellen aufgrund einer unterschiedlichen Penetration der drei Zellstadien mit bestimmten Farbstoffen durchflusszytometrisch ermitteln kann. Das Ergebnis zeigte, dass ATRA keinerlei Zelltod induzierenden Effekt besitzt und die ATRA-vermittelte Reduktion der Zellzahl von HMC-1 5C6 und LAD 2 Zellen daher wahrscheinlich auf antiproliferativen Eigenschaften, nicht aber auf einer beschleunigten Sterberate beruht (Ergebnisse nicht dargestellt).

Zusammenfassend lässt sich feststellen, dass ATRA bei proliferierenden Mastzellen negativ in die Zellzyklusprogression eingreift aber keinen Einfluss auf das Überleben nicht-proliferierender Mastzellen ausübt.

Zellzahl

Durchmesser (μm)

HMC-1 5C6

Medium

480,6 ±68,6

16,6 ±0,1

ATRA

283,0 ±64,5**

15,8 ±0,1**

LAD 2

Medium

148,8 ±9,4

14,1 ±1,2

ATRA

134,4 ±9,3*

13,8 ±1,4

KMZ

Medium

72,1 ±13,3

11,9 ±0,6

ATRA

71,8 ±3,5

11,7 ±0,7

Tabelle 9: Effekte von ATRA auf die Proliferation und Morphologie der drei Mastzellsysteme.

Bei den Untersuchungen der Einflüsse von ATRA auf die Mastzelle zeigte das Retinoid einen starken Effekt auf den SCF-Rezeptor c-kit aller drei Zellsysteme. So ergaben die Untersuchungen eine Herunterregulation des Proteins um mehr als die Hälfte infolge der ATRA-Behandlung (Abbildung 8 und Tabelle 10). Betrachtet man die drei Zellsysteme einzeln, nahm die Stärke der Herunterregulation mit dem Reifegrad zu. So ist der SCF-Rezeptor bei differenzierten KMZ am stärksten herunterreguliert, gefolgt von LAD 2 Zellen und schließlich den HMC-1 5C6 Zellen, bei denen dieser Effekt bereits in der Literatur beschrieben wurde (Nilsson et al. 1994a, Hjertson et al. 2003).

Betrachtet man die Entwicklung dieser Effekte an der Zelloberfläche auf mRNA-Niveau, so sind die Ergebnisse weniger stark ausgeprägt, aber dennoch für LAD 2 Zellen und KMZ deutlich sichtbar (Abbildung 9 und Tabelle 11). Bei HMC-1 5C6 Zellen war jedoch überhaupt kein signifikanter Effekt erkennbar, obgleich das c-kit-Protein – wie oben ausgeführt – stark abnahm.

Zusammenfassend lässt sich sagen, dass der SCF-Rezeptor c-kit mit einer starken Herunterregulation auf die ATRA-Behandlung reagiert und bei differenzierten KMZ am stärksten ist. Dieser Effekt ist auf Proteinebene auffallender als auf mRNA-Niveau.

Abbildung 8: Expression des Mastzellmarkers c-kit auf der Zelloberfläche.

Die Zellen wurden mit ATRA behandelt und nach drei Tagen (HMC-1 5C6 Zellen, oben) bzw. sieben Tagen (LAD 2 Zellen, Mitte und KMZ, unten) mit Hilfe der Durchflusszytometrie gemessen. Schwarz: c-kit-Expression in der Mediumkontrolle. Grau: c-kit-Expression nach ATRA-Behandlung.

Die Expression von c-kit ist angegeben im Verhältnis zur Mediumkontrolle (in %). Die Ergebnisse sind Mittelwerte (±SD) von n=7 (HMC-1 5C6 Zellen), n=4 (LAD 2 Zellen) und n=5 (KMZ) unabhängigen Messungen. Die mit (***) gekennzeichneten Ergebnisse zeigen signifikant niedrigere Werte als die Kontrolle (p<0,001).

HMC-1 5C6

LAD 2

KMZ

Proteinexpression (±SD)

47,2 ±7,2***

41,3 ±4,5***

37,4 ±6,6***

Tabelle 10: Quantitative Darstellung der c-kit-Expression nach ATRA-Behandlung.

Abbildung 9: Photo eines RT-PCR-Gels. Darstellung der c-kit-spezifischen mRNA.

Abgebildet sind die ‚Pärchen’ (Medium [M] vs. ATRA [RA]) der drei untersuchten Mastzellsysteme HMC-1 5C6 Zellen (links), LAD 2 Zellen (Mitte) und KMZ (rechts).

HMC-1 5C6

LAD 2

KMZ

mRNA-Expression (±SD)

84,1 ±8,8

79,8 ±5,5*

61,0 ±8,1***

Tabelle 11: Semi-quantitative Erfassung der RT-PCR-Resultate von c-kit.

Tryptase ist – neben der Chymase – eine von zwei mastzellspezifischen Serinendoproteasen und wird von allen drei Mastzellsystemen, die Gegenstand dieser Arbeit waren, exprimiert. Betrachtet man zunächst die Effekte am Protein selbst, so zeigten alle drei Zellsysteme eine Herunterregulation, die jedoch bei weitem nicht so eindrucksvoll ausgeprägt war wie bei c-kit (Abbildung 10 und Tabelle 12). Die zunehmende Stärke der Herunterregulation hatte jedoch die gleiche Tendenz. Die Effekte waren bei KMZ mit einer fast 30%igen Herunterregulation des Proteins stärker als bei LAD 2 Zellen und am schwächsten bei HMC-1 5C6 Zellen. Setzt man den Grad der Herunterregulation der Tryptase ins Verhältnis zur Stärke der basalen Proteinexpression in den Granula, so fällt auf, dass der Effekt stärker bei Tryptase-hochexprimierenden Mastzellen war also bei KMZ. Auch innerhalb einer Zellpopulation war dies erkennbar. So sieht man sowohl bei HMC-1 5C6 als auch bei LAD 2 Zellen eine Verschiebung der grauen ATRA- gegen die schwarze Medium-Kurve verstärkt im rechten Teil des Histogramms, also im Bereich der hochexprimierenden Zellen.

Verhältnismäßig stark war die Herunterregulation auf transkriptioneller Ebene. So zeigten alle drei Mastzellsysteme eine erhebliche Herunterregulation der mRNA-Konzentration, wobei kein auffälliger Unterschied bei den verschiedenen Reifegraden auszumachen war (Abbildung 11 und Tabelle 13).

Abbildung 10: Expression des Mastzellmarkers Tryptase nach Permeabilisierung der Zellmembran.

Die Zellen wurden mit ATRA behandelt und nach drei Tagen (HMC-1 5C6 Zellen, oben) bzw. sieben Tagen (LAD 2 Zellen, Mitte und KMZ, unten) mit Hilfe der Flowzytometrie gemessen. Schwarz: Tryptase-Expression in der Mediumkontrolle. Grau: Tryptase-Expression nach ATRA-Behandlung.

Die Expression der Tryptase ist angegeben im Verhältnis zur Mediumkontrolle (in %). Die Ergebnisse sind Mittelwerte (±SD) von n=6 (HMC-1 5C6 Zellen), n=4 (LAD 2 Zellen) und n=5 (KMZ) unabhängigen Messungen. Die mit (*), (**) oder (***) gekennzeichneten Ergebnisse zeigen signifikant niedrigere Werte als die Mediumkontrolle (p<0,05, p<0,01 bzw. p<0,001).

HMC-1 5C6

LAD 2

KMZ

Proteinexpression (±SD)

79,7 ±10,2**

77,5 ±10,6*

72,1 ±3,3***

Tabelle 12: Quantitative Darstellung der Tryptase-Expression nach ATRA-Behandlung.

Abbildung 11: Photo eines RT-PCR-Gels.

Darstellung der Tryptase-spezifischen mRNA. Abgebildet sind die ‚Pärchen’ (Medium [M] vs. ATRA [RA]) der drei untersuchten Mastzellsysteme HMC-1 5C6 Zellen (links), LAD 2 Zellen (Mitte) und KMZ (rechts).

HMC-1 5C6

LAD 2

KMZ

mRNA-Expression (±SD)

58,7 ±3,8***

55,9 ±3,6***

51,9 ±3,9***

Tabelle 13: Semi-quantitative Erfassung der RT-PCR-Resultate von Tryptase.

Die zweite wichtige Serinprotease ist die Chymase, ebenfalls ein typisches Charakteristikum für bestimmte Mastzellen. Wie die Tryptase wird auch die Chymase in zytoplasmatischen Granula gespeichert und bei allergischen Prozessen von der Mastzelle freigesetzt. Zur Messung des Proteins müssen die Mastzellen vor der Antikörpermarkierung ebenfalls fixiert und permeabilisiert werden.

Im Gegensatz zur Tryptase wird die zweite Endoprotease nur von KMZ nicht, aber von LAD 2 Zellen und HMC-1 5C6 Zellen gebildet (Abbildung 12 und Tabelle 14). Interessanterweise konnte allerdings neben KMZ auch für LAD 2 Zellen eine transkriptionelle Aktivität festgestellt werden und folglich auch der Effekt von ATRA auf diese untersucht werden (Abbildung 13 und Tabelle 15).

Betrachtet man zunächst die Produktseite, also das Protein, so wiesen KMZ eine leichte Herunterregulation der Chymase auf. Erstaunlicher aber war die extrem starke Herunterregulation der mRNA durch die ATRA-Behandlung. Sowohl LAD 2 Zellen als auch KMZ zeigten – bezogen auf die gesamte Arbeit – die stärkste Abnahme der Chymase-spezifischen mRNA-Konzentration nach ATRA-Behandlung dicht gefolgt von der Tryptase.

Abbildung 12: Expression des Mastzellmarkers Chymase nach Permeabilisierung der Zellmembran.

Nur KMZ verfügen über mit Chymase gefüllte Granula. Die KMZ wurden sieben Tage mit ATRA behandelt und mit Hilfe der Flowzytometrie gemessen. Schwarz: Chymase-Expression in der Mediumkontrolle. Grau: Chymase-Expression nach ATRA-Behandlung.

Die Expression der Chymase ist angegeben im Verhältnis zur Mediumkontrolle (in %). Die Ergebnisse sind Mittelwerte (±SD) von n=3 (HMC-1 5C6 Zellen und LAD 2 Zellen) und n=7 (KMZ) unabhängigen Messungen. Das mit (*) gekennzeichnete Ergebnis zeigt einen signifikant niedrigeren Werte als die Mediumkontrolle (p<0,05).

HMC-1 5C6

LAD 2

KMZ

Proteinexpression (±SD)

nicht detektierbar

81,6 ±11,8*

Tabelle 14: Quantitative Darstellung der Chymase-Expression nach ATRA-Behandlung.

Abbildung 13: Photo eines RT-PCR Gels.

Darstellung der Chymase-spezifischen mRNA. Abgebildet sind die ‚Pärchen’ (Medium [M] vs. ATRA [RA]) der beiden auf mRNA-Ebene Chymase-exprimierenden Mastzellsysteme LAD 2 Zellen (links) und KMZ (rechts). Das weiße Kreuz weist auf eine mangelnde mRNA-Expression hin.

HMC-1 5C6

LAD 2

KMZ

mRNA-Expression (±SD)

nicht detektierbar

52,4 ±5,5***

41,1 ±4,8***

Tabelle 15: Semi-quantitative Erfassung der RT-PCR-Resultate von Chymase.

Der hochaffine IgE-Rezeptor FcεRI ist aus drei verschiedenen Untereinheiten (in der Zusammensetzung αβγγ) aufgebaut und Andockstelle für das Fc-Fragment des Immunglobulins IgE.

Die α-Untereinheit FcεRIα bindet den Fc-Teil des IgE. Die β- und γ-Untereinheiten bilden eine der α-Untereinheit angeschlossene Funktionseinheit und vermitteln ihre Signale in das Zellinnere. Dabei ist die β-Untereinheit für die Zusammensetzung des Komplexes nicht zwingend notwendig und nicht bei allen FcεRI-Rezeptoren nachweisbar.

Wie zu Beginn des Ergebnisteils dieser Arbeit beschrieben, exprimieren alle drei Zellsysteme die α-Untereinheit des FcεRI-Rezeptors. Die Expression der α-Kette wurde entweder direkt auf der Zelloberfläche, also superfiziell (LAD 2 Zellen und KMZ), oder intrazellulär im Zytoplasma (HMC-1 5C6 Zellen) mit Hilfe der Flowzytometrie gemessen. Eine Herunterregulation der α-Untereinheit erfolgte in allen drei Zellsystemen (Abbildung 14 und Tabelle 16). Der stärkste Effekt wurde bei KMZ gemessen, gefolgt von LAD 2 Zellen und HMC-1 5C6 Zellen. Dieser graduelle Effekt konnte auf transkriptioneller Ebene bestätigt werden. So wurde die α-spezifische mRNA nach ATRA-Behandlung im Vergleich zur Mediumkontrolle in allen drei Mastzellsystemen herunterreguliert, und dies mit zunehmendem Effekt bei höherer Mastzelldifferenzierung (Abbildung 15 und Tabelle 17).

Auf transkriptioneller Ebene wurde der Einfluss von ATRA nicht nur auf die α-Untereinheit sondern auch auf die β- und γ-Ketten des FcεRI-Rezeptors untersucht. Im Gegensatz zur α-Untereinheit wird die mRNA der β-Untereinheit nur von LAD 2 Zellen und KMZ exprimiert (Abbildung 15 und Tabelle 18). Dabei konnte kein Effekt von ATRA bei den LAD 2 Zellen festgestellt werden. Bei KMZ wurde eine mäßige, dennoch signifikante Herunterregulation der β-Kette gemessen. Die mRNA der γ-Untereinheit des FcεRI-Rezeptors wurde in allen drei Mastzellsystemen nach ATRA-Behandlung herunterreguliert, ohne nennenswerte Unterschiede zwischen den Mastzellarten (Abbildung 15 und Tabelle 19).

Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die Einflüsse von ATRA auf den hochaffinen IgE-Rezeptor FcεRI den erkennbaren Negativeinfluss auf andere gemessene Proteine bestätigt und im wesentlichen über eine Herunterregulation der α- und γ-Untereinheit vermittelt sein dürfte. Die Ergebnisse auf transkriptioneller Ebene konnten auf Proteinniveau bestätigt werden.

Abbildung 14: Expression von FcεRIα bei intrazellulärer Erfassung nach Permeabilisierung (HMC-1 5C6 Zellen) und auf der Zelloberfläche (LAD 2 Zellen und KMZ).

Die Zellen wurden mit ATRA behandelt und nach drei Tagen (HMC-1 5C6 Zellen, oben) bzw. sieben Tagen (LAD 2 Zellen, Mitte und KMZ, unten) mit Hilfe der Flowzytometrie gemessen. Schwarz: FcεRIα-Expression in der Mediumkontrolle. Grau: FcεRIα-Expression nach ATRA-Behandlung.

Die Expression von FcεRIα ist angegeben im Verhältnis zur Mediumkontrolle (in %). Die Ergebnisse sind Mittelwerte (±SD) von n=6 (HMC-1 5C6 Zellen), n=5 (LAD 2 Zellen) und n=7 (KMZ) unabhängigen Messungen. Die (*) oder (**) gekennzeichneten Ergebnisse zeigen signifikant niedrigere Werte als die Mediumkontrolle (p<0,05 bzw. p<0,01).

HMC-1 5C6

LAD 2

KMZ

Proteinexpression (±SD)

89,0 ±6,4**

74,9 ±8,9**

64,1 ±16,4*

Tabelle 16: Quantitative Darstellung der FcεRIα-Expression nach ATRA-Behandlung.

Abbildung 15: Photo von RT-PCR-Gelen.

Darstellung der FcεRI-spezifischen mRNA: FcεRIα (oben), FcεRIβ (Mitte) und FcεRIγ (unten). Abgebildet sind jeweils die ‚Pärchen’ (Medium [M] vs. ATRA [RA]) der drei untersuchten Mastzellsysteme HMC-1 5C6 Zellen (links), LAD 2 Zellen (Mitte) und KMZ (rechts). Das weiße Kreuz weist auf eine mangelnde mRNA-Expression hin.

Die Konzentration des PCR-Produkts wurde mittels Computersoftware erfasst. Die mRNA-Expression von FcεRIα ist angegeben im Verhältnis zur Mediumkontrolle (in %). Die Ergebnisse sind Mittelwerte (±SD) von n=11 (HMC-1 5C6 Zellen), n=6 (LAD 2 Zellen) und n=7 (KMZ) unabhängigen Messungen. Die mit (**) oder (***) gekennzeichneten Ergebnisse zeigen signifikant niedrigere Werte als die Mediumkontrolle (p<0,01 bzw. p<0,001).

FcεRIα

HMC-1 5C6

LAD 2

KMZ

mRNA-Expression (±SD)

96,3 ±10,5

65,8 ±7,9**

46,5 ±4,2***

Tabelle 17: Semi-quantitative Erfassung der RT-PCR-Resultate von FcεRIα.

Die Konzentration des PCR-Produkts wurde mittels Computersoftware erfasst. Die mRNA-Expression von FcεRIβ ist angegeben im Verhältnis zur Mediumkontrolle (in %). Die Ergebnisse sind Mittelwerte (±SD) von n=3 (HMC-1 5C6 Zellen), n=6 (LAD 2 Zellen) und n=7 (KMZ) unabhängigen Messungen. Das mit (**) gekennzeichnete Ergebnis zeigt einen signifikant niedrigeren Wert als die Mediumkontrolle (p<0,01).

FcεRIβ

HMC-1 5C6

LAD 2

KMZ

mRNA-Expression (±SD)

nicht detektierbar

100,8 ±11,7

74,6 ±7,1**

Tabelle 18: Semi-quantitative Erfassung der RT-PCR-Resultate von FcεRIβ.

FcεRIγ

HMC-1 5C6

LAD 2

KMZ

mRNA-Expression (±SD)

68,0 ±4,9***

72,1 ±3,2***

69,6 ±6,0***

Tabelle 19: Semi-quantitative Erfassung der RT-PCR-Resultate von FcεRIγ.

Die Histidindecarboxylase (HDC) ist ein Schlüsselenzym der Histaminsynthese. Es reguliert den Gehalt an Histamin in den Granula der Mastzelle. Histamin und damit die Histidindecarboxylase ist ein typisches Merkmal der Mastzelle, wobei ersteres ähnlich den Serinendoproteasen nach rezeptorvermittelter Stimulation exozytiert wird. Gemessen wurde der Einfluss von ATRA auf die mRNA-Synthese der HDC. Eine Behandlung mit ATRA zeigte keinen Effekt, weder auf die HDC-spezifische mRNA-Synthese unreifer HMC-1 5C6 Zellen noch auf intermediär differenzierte LAD 2 Zellen noch differenzierte KMZ (Abbildung 16 und Tabelle 20). Die HDC konnte durch ATRA nicht beeinflusst werden.

Abbildung 16: Photo eines RT-PCR Gels. Darstellung der HDC-spezifischen mRNA.

Abgebildet sind die Pärchen (Medium [M] vs. ATRA [RA]) der drei untersuchten Mastzellsysteme HMC-1 5C6 Zellen (links), LAD 2 Zellen (Mitte) und KMZ (rechts).

Die Konzentration des PCR-Produkts wurde mittels Computersoftware erfasst. Die mRNA-Expression von HDC ist angegeben im Verhältnis zur Mediumkontrolle (in %). Die Ergebnisse sind Mittelwerte (±SD) von n=6 (HMC-1 5C6 Zellen), n=6 (LAD 2 Zellen) und n=6 (KMZ) unabhängigen Messungen.

HMC-1 5C6

LAD 2

KMZ

mRNA-Expression (±SD)

104 ±10,3

95,6 ±13,4

104,9 ±15,2

Tabelle 20: Semi-quantitative Erfassung der RT-PCR-Resultate von HDC.

Der Einfluss von ATRA auf den Histamingehalt der drei Mastzellsysteme wurde ebenfalls von unserer Arbeitsgruppe untersucht. Die Ergebnisse entsprechen dem oben beschrieben Nulleffekt. Keines der drei Mastzellsysteme HMC-1 5C6 Zellen, LAD 2 Zellen oder KMZ wies einen veränderten Histamingehalt nach ATRA-Behandlung auf (Babina et al. 2005b).

Dieser zusammenfassende Überblick über die Effekte von ATRA auf die Expression von Differenzierungsmarkern bei den drei Mastzellarten dient sowohl der klaren Gegenüberstellung der unterschiedlichen Effekte von ATRA auf Protein- und mRNA-Ebene als auch der Verdeutlichung der Unterschiede innerhalb der einzelnen Mastzelltypen.

Das Protein c-kit wurde auf allen drei Mastzellsystemen deutlich stärker herunterreguliert als auf mRNA-Ebene (Diagramm 4 und Diagramm 5). Invers zeigten sich die Effekte bei den beiden Serinendoproteasen. In den Zellen, in denen sie exprimiert werden, waren die Einflüsse von ATRA auf die mRNA-Konzentration denen auf Proteinniveau deutlich überlegen und die Herunterregulation somit stärker.

Der Einfluss von ATRA auf die einzelnen Mastzelltypen ist sehr unterschiedlich und in den beiden folgenden Diagrammen dargestellt. So sind die Effekte bei den differenzierten KMZ auf alle Mastzellmarker stärker ausgeprägt als bei LAD 2 und HMC-1 5C6 Zellen. Dies gilt sowohl für die Proteinexpression (Diagramm 4) als auch für die mRNA-Konzentration (Diagramm 5).

Die Ergebnisse der ATRA-Studie sind als Kongressbeitrag vorgestellt (Thienemann et al. 2004b) und als Originalarbeit zur Publikation eingereicht worden (Babina et al. 2005b).

Diagramm 4: Gegenüberstellung der Effekte von ATRA auf die Proteinexpression humaner Mastzellen.

Die Ergebnisse sind Mittelwerte (±SD) von 3-7 unabhängigen Messungen. Die Proteinexpression ist angegeben im Verhältnis zur Mediumkontrolle (in %). Die mit (*), (**) oder (***) gekennzeichneten Ergebnisse zeigen signifikant niedrigere Werte als die Mediumkontrolle (p<0,05, p<0,01 bzw. p<0,001).

Diagramm 5: Gegenüberstellung der Effekte von ATRA auf die mRNA-Expression humaner Mastzellen.

Die Ergebnisse sind Mittelwerte (±SD) von 3-21 unabhängigen Messungen. Die mRNA-Expression ist angegeben im Verhältnis zur Mediumkontrolle (in %). Die mit (*), (**) oder (***) gekennzeichneten Ergebnisse zeigen signifikant niedrigere Werte als die Mediumkontrolle (p<0,05, p<0,01 bzw. p<0,001).

Die obigen Ergebnisse für c-kit (siehe auch Kapitel 4.3.2) zeigen, dass wenigstens bei HMC-1 5C6 Zellen eine verminderte Transkriptkonzentration nicht die Ursache der Proteinabnahme sein kann: Nach 3tägiger Inkubation mit ATRA war (im Unterschied zu den beiden anderen verwendeten Zellarten) keine signifikante Abnahme der c-kit-mRNA in HMC-1 5C6 Zellen feststellbar, sehr wohl aber die des Proteins. Es wurde daher angestrebt den Mechanismus dieses Phänomens einzugrenzen. In Frage kamen dabei unter anderem eine proteolytische Abspaltung des c-kit-Rezeptors (shedding), eine ATRA-induzierte Internalisierung mit nachfolgender Degradation oder eine veränderte Translationsrate. Die beiden erstgenannten Mechanismen sind im Zusammenhang mit der c-kit-Regulation tatsächlich mehrfach beschrieben worden (Yee et al. 1993, Shimizu et al. 1996, Cruz et al. 2004).

Zunächst wurde eine kinetische Studie angefertigt, um zu ermitteln, zu welchem Zeitpunkt die ATRA-vermittelte c-kit-Herunterregulation erstmals detektierbar ist. Wie in Diagramm 6 dargestellt ist dies nach 16 Stunden der Fall. Auch zu diesem Zeitpunkt ließ sich keinerlei Veränderung der c-kit-mRNA feststellen (nicht dargestellt).

Anschließend wurde dieser Zeitpunkt (also 16 h) herangezogen und die Zellen mit einer Reihe von Inhibitoren fundamentaler Zellfunktionen sowie dem c-kit-Liganden SCF inkubiert. Zu den Inhibitoren zählten Cytochalasin B (das die Zytoskelettfunktion unterdrückt), Cycloheximid (das die translationelle Elongation supprimiert) sowie Proteaseinhibitoren, die die Abspaltung von Rezeptoren durch Ausschalten von Proteaseaktivitäten verhindern. Die Ansätze wurden so gewählt, dass die Zellen entweder nur Medium, nur den besagten Inhibitoren (respektive SCF), nur ATRA oder einer Kombination aus ATRA und den Inhibitoren (bzw. SCF) ausgesetzt wurden.

Mit Ausnahme der Proteaseinhibitoren hemmten alle verwendeten Substanzen die c-kit-Expression erwartetermaßen stark (Daten nicht dargestellt). Das Anliegen hier war jedoch zu ermitteln, an welcher Stelle ATRA ansetzt um die c-kit-Zelloberflächendichte zu minimieren. Dies wurde durch die Bestimmung eines zusätzlichen Einflusses der Substanzen bei Anwesenheit von ATRA bewerkstelligt oder anders ausgedrückt, es wurde untersucht, inwiefern der Effekt von ATRA durch einen der Inhibitoren imitiert wird, so dass der ATRA-Effekt in dem System nicht mehr erkennbar ist. Die Resultate sind in Diagramm 7 dargestellt. Hieraus geht klar hervor, dass nur Cycloheximid den ATRA-Effekt nachzuahmen vermag. Im Falle der anderen Inhibitoren oder von SCF war der Negativeinfluss von ATRA dagegen weiterhin klar erkennbar und daher unabhängig von den durch diese beeinflussten Prozessen. Die bisherigen Daten sind als Kongressbeitrag vorgestellt worden (Thienemann et al. 2004b), und die Studien werden im Rahmen einer weiteren Dissertation fortgesetzt.

Diagramm 6: Kinetikstudie zur Ermittelung des Zeitpunktes, an dem die Herunterregulation der Proteinexpression von c-kit durch ATRA beginnt.

Die Untersuchungen wurden an HMC-1 5C6 Zellen durchgeführt, wobei die c-kit-Expression im Verlauf von 16 Stunden mit Hilfe der Durchflusszytometrie gemessen wurde. Die c-kit-Expression ist angegeben im Verhältnis zur Mediumkontrolle (in %). Die Ergebnisse sind Mittelwerte (±SD) von 4 unabhängigen Messungen. Das mit (***) gekennzeichnete Ergebnis zeigt eine signifikante Herunterregulation der c-kit-Expression (p<0,001).

Diagramm 7: Untersuchungen zur Herunterregulation von c-kit während einer 16stündigen Behandlung mit ATRA.

Die Zellen wurden entweder mit Medium oder mit ATRA sowie jeweils zusätzlich mit Cycloheximid (Cyclo), Cytochalasin B, Proteaseinhibitoren und SCF behandelt. Die c-kit-Expression ist angegeben im Verhältnis zur Mediumkontrolle (in %). Die Ergebnisse sind Mittelwerte (±SD) von 4-12 unabhängigen Messungen. Das mit (***) gekennzeichnete Ergebnis konnte der ATRA-bedingten Herunterregulation von c-kit entgegenwirken (p<0,001).