Einfluss von all-trans-Retinsäure (ATRA) auf die Expression von Differenzierungsmarkern bei humanen Mastzellen unterschiedlicher ReifegradeFriedrich ThienemannWidmung 11.11.1.1121.1.231.1.341.1.41.1.51.1.651.21.2.161.2.21.2.371.2.41.2.51.2.5.11.2.5.281.31.3.191.3.2101.3.31.41.4.111121.4.2131.4.31.4.4141521516171833.13.1.118193.1.23.1.3203.1.43.1.5213.1.63.1.7223.1.83.23.2.1233.2.23.2.2.13.2.2.2243.2.2.33.2.33.2.3.13.2.3.2253.2.4263.2.5273.33.3.13.3.2283.3.329303.3.4313.43.4.1323.4.233343.4.335363.53.5.13738393.5.23.5.2.1403.5.2.23.5.2.33.5.2.4413.5.3423.5.44344453.5.53.644.1464.1.1474.1.24.1.348494.2504.2.14.2.251524.2.353544.2.4554.3564.3.157584.3.259604.3.361624.3.46364654.3.56667684.3.669704.3.771724.3.8737455.1747576775.2785.3795.480818283845.585SynopsisAbkürzungsverzeichnisLiteraturverzeichnisDanksagungErklärungdeInhaltsverzeichnisHilfeAus der Klinik für Dermatologie, Venerologie und Allergologie
der Medizinischen Fakultät der Charité – Universitätsmedizin BerlinDISSERTATIONEinfluss von all-<em>trans</em>-Retinsäure (ATRA) auf die Expression von Differenzierungsmarkern bei humanen Mastzellen unterschiedlicher Reifegradezur Erlangung des akademischen Grades
Doctor medicinae (Dr. med.)vorgelegt der Medizinischen Fakultät der Charité –
Universitätsmedizin Berlinvon
Friedrich Thienemann
aus Heidenheim an der Brenz Prof. Dr. med. B.M. Henz PD. Dr. med. B. Hermes PD. Dr. med. K. Hartmann Datum der Promotion: 26. Juni 2006 Widmung

Jenny und der Deutschen Elf

 Zusammenfassung

Mastzellen (MZ) reifen zu terminal differenzierten Zellen erst in peripheren Geweben. ATRA ist ein wesentlicher Regulator der Hämatopoese und kann auf positive wie auf negative Weise deren Differenzierung beeinflussen – die Qualität ist dabei häufig abhängig vom Reifegrad. Die Arbeit beschäftigte sich daher mit der Frage, ob die Effekte von ATRA auf MZ ebenfalls abhängig von deren Reifegrad sind. Unreife HMC-1 5C6 Zellen, differenziertere LAD 2 Zellen und reife kutane MZ (KMZ) wurden mit ATRA behandelt und die Effekte auf spezifische Mastzellmarker auf Protein- und mRNA-Ebene untersucht. Die Proteinexpression von c-kit, FceRI, Tryptase und Chymase wurde bei allen drei Zellsystemen herunterreguliert. Änderungen der Proteinexpression wurden qualitativ, wenngleich nicht immer quantitativ auf mRNA-Ebene reflektiert, d.h. es gab Marker, bei denen die Herunterregulation auf der einen oder anderen Ebene überwog. Eine genaue Quantifizierung der ATRA-Effekte auf die Tryptase und Chymase zeigte eine prozentual erheblich stärkere Herunterregulation der mRNA als des Proteins. Invers dazu war der Effekt bei c-kit, ein Effekt, der besonders deutlich bei HMC-1 5C6 auszumachen war. Zur Klärung, welcher Mechanismus der von der mRNA-Ebene unabhängigen Herunterregulation des c-kit-Proteins zugrunde liegt, wurden HMC-1 5C6 zusätzlich zu ATRA mit Inhibitoren fundamentaler Zellfunktionen inkubiert. Cycloheximid allein war dabei in der Lage, die Wirkung von ATRA zu imitieren. Es kann also vermutet werden, dass die starke Herunterregulation des Proteins im Vergleich zur mRNA einem translationellen Mechanismus folgt. Betrachtet man alle Effekte gemeinsam, so zeigte ATRA den stärksten Einfluss auf das am weitesten differenzierte Mastzellsystem, nämlich KMZ. Geringer waren die Effekte bei LAD 2, wohingegen bei HMC-1 5C6 das schwächste Ansprechpotential gegenüber ATRA gefunden wurde. Dies ist von besonderem Interesse, weil ATRA normalerweise wesentlich potenter auf unreif-proliferierende Systeme wirkt. ATRA hat auf humane MZ einen deutlich dedifferenzierenden Effekt, der weitgehend unabhängig vom Reifegrad der Zellen operiert. Die Effekte scheinen dabei in Abhängigkeit vom betrachteten Marker nicht auf die transkriptionelle Ebene beschränkt zu sein, sondern könnten auch einem translationellen Mechanismus unterliegen.

 Mastzelle Dedifferenzierung Vitamin A Retinoide Abstract

Mast cells (MC) are of hematopoietic origin but complete their differentiation exclusively within tissues. A large number of mediators positively or negatively affect the maturation process of MC. ATRA is a potential master regulator of haematopoiesis, where it primarily affects immature and proliferative leukocytes. Here, the effects of ATRA (3-7d) on MC that span different stages of maturation, i. e. immature-leukemic HMC-1 5C6 cells, intermediately matured LAD 2 cells, and terminally differentiated skin MC were analyzed. The expression of the lineage markers c-kit, FceRI, tryptase, chymase und histidindecarboxylase (HDC) was studied in parallel at protein level by flow-cytometric analysis and at mRNA level by RT-PCR. ATRA exposure led to a down-regulation at protein and at mRNA level of c-kit, FceRI, tryptase and chymase by all MC subtypes. Comparing protein and transcript levels, however, substantial differences between c-kit and the proteases were noted. c-kit down-regulation was more pronounced at protein level, whereas the opposite was found with proteases. Further analysis revealed the existence of a second mechanism of c-kit down modulation that proceeded rapidly and independently of mRNA changes. This pathway was restricted to immature MC and could be mimicked by cycloheximide, suggesting that altered translation may account for the phenomenon. Taken together, the study indicates that MC are significant target cells of ATRA throughout their lifespan, but that the molecular events underlying down-regulation of lineage markers may be shifted in the course of MC differentiation. The strongest effects of ATRA were observed in mature MC, while this accounts to a lesser degree for LAD 2 cells. In contrast, the immature and highly proliferating HMC-1 5C6 cells presented even less sensitive to ATRA. Therefore, ATRA has dedifferentiating potential towards human MC that is most pronounced in mature MC. Depending on the specific marker, protein down regulation can underlie various mechanisms. In this regard, c-kit seems to follow a translational rather than transcriptional inhibitory process.

 mast cell dedifferentiation vitamin A retinoic acid Inhaltsverzeichnis

  • 1 EINLEITUNG

    • 1.1  Mastzellen

      • 1.1.1  Die Mastzelle – ein Überblick

      • 1.1.2 Mastzellheterogenität

      • 1.1.3 HMC-1 5C6 Zellen

      • 1.1.4 LAD 2 Zellen

      • 1.1.5 Kutane Mastzellen

      • 1.1.6 Drei unterschiedliche Mastzellsysteme – eine Gegenüberstellung

    • 1.2 Mastzellmarker

      • 1.2.1  Der hochaffine IgE-Rezeptor FcεRI

      • 1.2.2 Der SCF-Rezeptor c-kit

      • 1.2.3 Tryptase

      • 1.2.4 Chymase

      • 1.2.5 Histamin und die Histidindecarboxylase

        • 1.2.5.1  Histamin

        • 1.2.5.2 Histidindecarboxylase

    • 1.3 Zytokine

      • 1.3.1  Interleukin-4

      • 1.3.2 Interleukin-6

      • 1.3.3 Nervenwachstumsfaktor-β

    • 1.4 All-trans-Retinsäure

      • 1.4.1  Überblick

      • 1.4.2 Signaltransduktion

      • 1.4.3 ATRA und die Hämatopoese

      • 1.4.4 ATRA und die Mastzelle

  • 2  FRAGESTELLUNG

  • 3  MATERIAL UND METHODEN

    • 3.1  Material

      • 3.1.1  Technische Geräte

      • 3.1.2 Verbrauchsmaterial

      • 3.1.3 Chemikalien und Reagenzien

      • 3.1.4 Zelllinien

      • 3.1.5 Kits

      • 3.1.6 Agentia

      • 3.1.7 Antikörper

      • 3.1.8 Puffer/Gel

    • 3.2 Zellkultur

      • 3.2.1  Steriltechnik

      • 3.2.2 Zellkultivierung

        • 3.2.2.1  HMC-1 5C6 Zellen in Kultur

        • 3.2.2.2 LAD 2 Zellen in Kultur

        • 3.2.2.3 KMZ in Kultur

      • 3.2.3 Zellzahl, Morphologie, Vitalität und Reinheit

        • 3.2.3.1  Handzählung

        • 3.2.3.2 Automatisierte Zellzählung

      • 3.2.4  Behandlung der Zellen

      • 3.2.5 Erfassung der Apoptose

    • 3.3 Isolierung kutaner Mastzellen

      • 3.3.1  Erster Tag der Vorhautpräparation

      • 3.3.2 Zweiter Tag der Vorhautpräparation

      • 3.3.3 Dritter Tag der Vorhautpräparation

      • 3.3.4 Qualitätskontrolle

    • 3.4 Durchflusszytometrie

      • 3.4.1  Qualitätskontrolle

      • 3.4.2 Coulter Epics XL

      • 3.4.3 Probenvorbereitung, Messung und Datenanalyse

    • 3.5 RT-PCR

      • 3.5.1  Grundlagen

      • 3.5.2 Isolierung von Gesamt-RNA

        • 3.5.2.1  Zelllyse

        • 3.5.2.2 RNA-Extraktion und DNase-Verdau

        • 3.5.2.3 Phenolisierung und Fällung

        • 3.5.2.4 RNA-Reinheitsbestimmung und Quantifizierung

      • 3.5.3 cDNA-Synthese

      • 3.5.4 PCR

      • 3.5.5 Agarosegel-Elektrophorese

    • 3.6 Statistik

  • 4  Ergebnisse

    • 4.1  Charakterisierung der verwendeten Zellen

      • 4.1.1  Charakterisierung von HMC1-5C6 Zellen

      • 4.1.2 Charakterisierung von LAD 2 Zellen

      • 4.1.3 Charakterisierung von KMZ

    • 4.2 Einflüsse von IL-4, IL-6 und NGF-β auf HMC-1 5C6 Zellen

      • 4.2.1  Vorversuche: Einflüsse der Zytokine auf HMC-1 5C6 Zellen

      • 4.2.2 Kinetikstudie: Einflüsse der Zytokine auf HMC-1 5C6 nach 24 Tagen

      • 4.2.3 Quantifizierung der Einflüsse der Zytokine auf HMC-1 5C6 Zellen

      • 4.2.4 Einfluss von IL-4 auf humane Mastzellen unterschiedlicher Reifegrade

    • 4.3 Einfluss von ATRA auf humane Mastzellen unterschiedlicher Reifegrade

      • 4.3.1  Einfluss von ATRA auf Proliferation und Überleben

      • 4.3.2 Einfluss von ATRA auf die Expression von c-kit

      • 4.3.3 Einfluss von ATRA auf die Expression der Tryptase

      • 4.3.4 Einfluss von ATRA auf die Expression der Chymase

      • 4.3.5 Einfluss von ATRA auf die Expression von FcεRI (α, β, γ)

      • 4.3.6 Einfluss von ATRA auf die Expression der Histidindecarboxylase

      • 4.3.7 Zusammenfassender Überblick über die Effekte von ATRA

      • 4.3.8 ATRA beeinflusst auf zweifache Weise die Expression von c-kit

  • 5 DISKUSSION

    • 5.1  IL-4, IL-6, NGF-β ohne differenzierenden Effekt auf HMC-1 5C6 Zellen

    • 5.2 Die intermediär differenzierten LAD 2 Zellen

    • 5.3 IL-4 vermittelte Effekte sind abhängig vom Differenzierungsgrad

    • 5.4 Der dedifferenzierende Einfluss von ATRA auf humane Mastzellen

    • 5.5 Gegenüberstellung der Einflüsse von IL-4 und ATRA auf Mastzellen

  • Synopsis

  • Abkürzungsverzeichnis

  • Literaturverzeichnis

  • Danksagung

  • Erklärung

Tabellen

  • Tabelle 1: Überblick über Mastzellmediatoren.

  • Tabelle 2: Fluoreszenzkanäle (FK) 1 bis 3 im Coulter Epics XL Durchflusszytometer.

  • Tabelle 3: Zusammensetzung des kompletten Reaktionsansatzes für die reverse Transkription (pro Ansatz) mit dem Einzelstrang-Synthesekit 1st Strand cDNA Synthesis Kit für RT-PCR (AMV).

  • Tabelle 4: Nukleotid-Sequenzen der eingesetzten Primer-Paare

  • Tabelle 5: Allgemeine PCR-Bedingungen: Einstellungen der einzelnen Sequenzen des Thermo-Cyclers.

  • Tabelle 6: Spezielle Bedingungen für die PCR-Amplifikation: Annealing-Temperatur und Anzahl der Zyklen für HMC-1 5C6 / LAD 2 / KMZ.

  • Tabelle 7: Gesamtansatz für die spezifische Amplifizierung von DNA-Fragmenten mit der PCR.

  • Tabelle 8: Zusammengefasst sind die Effekte von IL-4 auf die Expression der Mastzellmarker FcεRIα und c-kit sowie auf die Veränderung der Zellzahl.

  • Tabelle 9: Effekte von ATRA auf die Proliferation und Morphologie der drei Mastzellsysteme.

  • Tabelle 10: Quantitative Darstellung der c-kit-Expression nach ATRA-Behandlung.

  • Tabelle 11: Semi-quantitative Erfassung der RT-PCR-Resultate von c-kit.

  • Tabelle 12: Quantitative Darstellung der Tryptase-Expression nach ATRA-Behandlung.

  • Tabelle 13: Semi-quantitative Erfassung der RT-PCR-Resultate von Tryptase.

  • Tabelle 14: Quantitative Darstellung der Chymase-Expression nach ATRA-Behandlung.

  • Tabelle 15: Semi-quantitative Erfassung der RT-PCR-Resultate von Chymase.

  • Tabelle 16: Quantitative Darstellung der FcεRIα-Expression nach ATRA-Behandlung.

  • Tabelle 17: Semi-quantitative Erfassung der RT-PCR-Resultate von FcεRIα.

  • Tabelle 18: Semi-quantitative Erfassung der RT-PCR-Resultate von FcεRIβ.

  • Tabelle 19: Semi-quantitative Erfassung der RT-PCR-Resultate von FcεRIγ.

  • Tabelle 20: Semi-quantitative Erfassung der RT-PCR-Resultate von HDC.

  • Tabelle 21: Humane Mastzellen unterschiedlicher Reifegrade.

  • Tabelle 22: Humane Mastzellen unterschiedlicher Reifegrade.

Bilder

  • Abbildung 1: Synthese der all-trans-Retinsäure (ATRA).

  • Abbildung 2: Metabolismus des Vitamin A.

  • Abbildung 3: Stark vereinfachtes und teils erst hypothetisches Modell der Myelopoese.

  • Abbildung 4: Flowzytometrie-Histogramm: Repräsentative Darstellung der Mastzellmarker FcεRIα, c-kit und Tryptase bei unbehandelten HMC-1 5C6 Zellen.

  • Abbildung 5: Flowzytometrie-Histogramm: Repräsentative Darstellung der Mastzellmarker FcεRIα, c-kit und Tryptase bei unbehandelten LAD 2 Zellen.

  • Abbildung 6: Flowzytometrie-Histogramm: Repräsentative Darstellung der Mastzellmarker FcεRIα, c-kit und Tryptase bei unbehandelten kutanen Mastzellen direkt nach ihrer Isolierung aus Vorhautgewebe.

  • Diagramm 1: Darstellung der c-kit Expression (blau) auf HMC-1 5C6 Zellen im Vergleich zur Isotypkontrolle (grau) während der 24tägigen Inkubation mit IL-4, IL-6 und NGF-β.

  • Diagramm 2: Expression der Mastzellmarker FcεRIα, c-kit und Tryptase (Try) bei HMC-1 5C6 Zellen nach dreitägiger Inkubation mit IL-4, IL-6 und NGF-β, allein oder in Kombination.

  • Diagramm 3: Quantitative Bestimmung der Zellzahl der HMC-1 5C6 Zellen, dargestellt in % zur jeweils eingesäten Zellzahl, gemessen nach dreitägiger Inkubation mit Zytokinen.

  • Abbildung 7: Expression der Mastzellmarker auf der Zelloberfläche: FcεRIα und c-kit gemessen mit Hilfe der Flowzytometrie nach dreitägiger Inkubation mit IL-4.

  • Abbildung 8: Expression des Mastzellmarkers c-kit auf der Zelloberfläche.

  • Abbildung 9: Photo eines RT-PCR-Gels. Darstellung der c-kit-spezifischen mRNA.

  • Abbildung 10: Expression des Mastzellmarkers Tryptase nach Permeabilisierung der Zellmembran.

  • Abbildung 11: Photo eines RT-PCR-Gels.

  • Abbildung 12: Expression des Mastzellmarkers Chymase nach Permeabilisierung der Zellmembran.

  • Abbildung 13: Photo eines RT-PCR Gels.

  • Abbildung 14: Expression von FcεRIα bei intrazellulärer Erfassung nach Permeabilisierung (HMC-1 5C6 Zellen) und auf der Zelloberfläche (LAD 2 Zellen und KMZ).

  • Abbildung 15: Photo von RT-PCR-Gelen.

  • Abbildung 16: Photo eines RT-PCR Gels. Darstellung der HDC-spezifischen mRNA.

  • Diagramm 4: Gegenüberstellung der Effekte von ATRA auf die Proteinexpression humaner Mastzellen.

  • Diagramm 5: Gegenüberstellung der Effekte von ATRA auf die mRNA-Expression humaner Mastzellen.

  • Diagramm 6: Kinetikstudie zur Ermittelung des Zeitpunktes, an dem die Herunterregulation der Proteinexpression von c-kit durch ATRA beginnt.

  • Diagramm 7: Untersuchungen zur Herunterregulation von c-kit während einer 16stündigen Behandlung mit ATRA.

  • Abbildung 17: Ausschnitt von dem Modell der Myelopoese aus der Einleitung (Abbildung 3).