4 Ergebnisse

Ziel dieses Kapitels ist die Darstellung der wichtigsten Ergebnisse dieser Forschungsarbeit. Im Anschluss an den Nachweis der 657del5-Mutation in den verwendeten lymphoblastoiden NBS-Zelllinien durch Sequenzierung (vgl. Abschnitt 4.1) wurde das Wachstum der Zelllinien untersucht. Die Ergebnisse hierzu sind unter 4.2 dargestellt. Unter 4.3 folgt die Darstellung der Ergebnisse zur Wachstumsinhibition der NBS-Zelllinien durch drei verschiedene Mutagene. Abschnitt 4.4 beinhaltet die grafische und tabellarische Darstellung der Ergebnisse zur Induktion der Apoptose in sieben NBS- und zwei AT-Zelllinien. Eine kurze Zusammenfassung der Ergebnisse erfolgt im Abschnitt 4.5. In einer Übersichtstabelle sind die experimentellen Ergebnisse um klinische Daten zu Neoplasien der entsprechenden Patienten ergänzt (vgl. Tab. 4).

4.1  Mutationsnachweis durch Sequenzierung

Vor Beginn der Experimente wurden die verwendeten Zelllinien auf das Vorhandensein der 657del5-Mutation im Nbs1-Gen untersucht. Hierzu wurden zunächst PCR-Produkte der verschiedenen Linien gewonnen und im Anschluss eine Sequenzierungsreaktion durchgeführt (vgl. Abschnitte 3.5 und 3.6).

Bei Zellen gesunder Menschen findet sich auf Chromosom 8q21 an Position 657 im Nbs1-Gen die Basenabfolge ACAAA (rot). Diese fünf Basen fehlen bei NBS-Patienten und führen zur 657del5 Mutation, die auch slawische Mutation genannt wird (vgl. Abb. 9).

	Abb. 9: Nachweis der 657del5-Mutation in Exon 6 des Nbs1-Gens der NBS-Zelllinie JaCe. Die 5 fehlenden Basen sind bei der Kontrollzelllinie vorhanden.

Die Mutation fand sich in allen unter 2.1 aufgeführten NBS-Zelllinien. Die Kontrollzelllinien wiesen keine Mutation auf.

Es wurde das Wachstum lymphoblastoider NBS-Zellen in Kultur untersucht. Dies war zum einen zur Etablierung der Standardbedingungen für die Apoptoseversuche notwendig. Zum anderen interessierten vor dem Hintergrund der klinischen Variabilität des Krankheitsbildes evtl. auftretende Variationen im Wachstumsverhalten der Zellen.

4.2.1  Ermittlung der Ausgangszellzahl für die Apoptoseversuche

Ziel dieses Versuches war es, die optimale Ausgangszelldichte für die Apoptoseversuche zu ermitteln. Wie bereits erwähnt, ist bei Apoptosemessungen eine geringe spontane Apoptoserate (Hintergrundapoptose) von zentraler Bedeutung (vgl. Abschnitt 3.7). Die verwendeten Zellen müssen sich zum Messzeitpunkt in der exponentiellen Wachstumsphase befinden, da Zellen, die bereits das Wachstumsplateau erreicht haben, durch Sauerstoff- und Nährstoffmangel in die Apoptose eintreten und somit das Messergebnis verfälschen können. Andererseits darf die Zelldichte nicht zu gering sein, um ausreichend Zellen für die durchflusszytometrische Analyse zur Verfügung zu haben.

Über einen Zeitraum von acht Tagen wurde die Zunahme der Zellzahl bei drei verschiedenen Ausgangszellzahlen (3ml à 1,7; 3 und 5x10⁵ Zellen/ml) in 6er-Multiwell-Platten verfolgt. Abbildung 10 zeigt beispielhaft das Wachstum einer NBS- und einer Kontrollzelllinie bei einer Ausgangszellzahl von 5x10⁵ Zellen/ml. Es wurden jeweils Doppelwerte ausgezählt und der Mittelwert berechnet. Bei allen drei Ausgangszellzahlen befanden sich die Zellen nach drei Tagen, also zum Zeitpunkt der geplanten Messung der Apoptoseraten, noch in der exponentiellen Wachstumsphase. Auf Grundlage dieses Ergebnisses wurden als Ausgangszellzahl für die Apoptoseversuche 3x10⁵ Zellen/ml verwendet (vgl. Abschnitt 4.4).

	Abb. 10: Wachstum lymphoblastoider NBS-Zellen unter Versuchsbedingungen (Apoptoseversuche). Abgebildet ist das Zellwachstum bei einer Ausgangszelldichte von 5x105 Zellen/ml. Die Fehlerbalken geben die intraexperimentellen Variationen (Doppelwerte) an.

Um das Wachstum mehrerer NBS-Zelllinien in vitro zu beurteilen, wurde die Zunahme der Zellzahl in Abhängigkeit von der Zeit über einen Zeitraum von sieben Tagen beobachtet.

Der Versuchsansatz beinhaltete drei verschiedene Ausgangszellzahlen, 3x10⁴, 7x10⁴ und 1x10⁵ Zellen/ml. Es zeigte sich ein von der Ausgangszelldichte unabhängiges Wachstumsverhalten der Zellen: Wenn sich die Zellzahl einer Linie bei der Dichte von 3x10⁴ Zellen/ml nach 7 Tagen versechsfachte, war dies auch bei 7x10⁴ und 1x10⁵ Zellen/ml der Fall. Beispielhaft ist hier das Ergebnis des Wachstums bei 7x10⁴ Zellen/ml abgebildet. 7 Zelllinien wurden ausgewertet; zwei Kontrollzelllinien und 5 NBS-Linien. Es wurden jeweils Doppelwerte ausgezählt und der Mittelwert berechnet. Zur Beurteilung der Wachstumsgeschwindigkeit der Zelllinien war die Verdopplungszeit in Tagen in der exponentiellen Wachstumsphase Berechnungsgrundlage.

	Abb. 11: Wachstum von fünf NBS- und zwei Kontrollzelllinien über sieben Tage bei einer Ausgangszelldichte von 0,7x105 Zellen/ml. Die Fehlerbalken geben die intraexperimentellen Variationen (Doppelwerte) an.

Insgesamt fallen deutliche Unterschiede im Wachstumsverhalten auf (vgl. Abb. 11). Die Verdopplungszeit der beiden Kontrollzelllinien in der exponentiellen Wachstumsphase liegt bei 1,6 bzw. 2,2 Tagen. Nach 7 Tagen hat sich die absolute Zellzahl vervier- bis versiebenfacht. Bei der Kontrollzelllinie C520 und der NBS-Linie 96P0048 nimmt die Zellzahl von Tag 6 zu Tag 7 leicht ab, was das Erreichen der stationären Phase andeutet.

Drei NBS-Linien (JaCe, RoZd und PeAb) zeigen ein verglichen mit den Kontrollzellen rascheres Wachstum. In der exponentiellen Wachstumsphase verdoppeln sie ihre Zellzahl bereits nach 0,8 (RoZd) bzw. 1,2 (JaCe, PeAb) Tagen. Die NBS-Zelllinien JaCe und RoZd haben ihre Ausgangszellzahl nach 7 Tagen etwa verdreizehnfacht. Auch zu diesem Zeitpunkt befinden sie sich noch nicht in der stationären Phase.

Eine weitere NBS-Linie (95P185) zeigt mit einer Verdopplungszeit von zwei Tagen eine den Kontrollzellen ähnliche Wachstumsgeschwindigkeit. Etwas langsamer als die Kontrollzellen wächst die NBS-Linie 96P0048. Sie verdoppelt ihre Zellzahl erst nach 2,4 Tagen.

In Experimenten zur Wachstumsinhibition sollten NBS-Zellen im Hinblick auf ihre Sensitivität gegenüber drei verschiedenen Zytostatika untersucht werden. Gleichzeitig sollten geeignete Bleomycinkonzentrationen für die Apoptosemessungen am Durchflusszytometer ermittelt werden.

NBS- und Kontrollzellen wurden mit ansteigenden Konzentrationen Bleomycin, Methotrexat und Cyclophosphamid behandelt. Nach fünf Tagen wurde die Zellzahl im Coulter-Counter bestimmt, wobei nur vitale Zellen gezählt wurden. Zur Quantifizierung der Sensitivität gegenüber dem jeweiligen Mutagen wurden Dosen ermittelt, die notwendig waren, um den Anteil überlebender Zellen auf 50% zu reduzieren (LD₅₀).

Die Behandlung der Zellen mit Bleomycin führte bei allen Zelllinien zu einer Abnahme vitaler Zellen bei steigenden Mutagenkonzentrationen (vgl. Abb. 12). Bei den Kontrollzellen lag die LD₅₀ bei etwa 0,52 µg Bleomycin/ml. Die LD₅₀ der drei NBS-Linien lag zwischen 0,19 und 0,34 µg/ml und war damit niedriger als die letale Dosis der Kontrollzellen. Dies bedeutet, dass bereits geringere Dosen Bleomycin bei NBS-Zellen zum Absterben der Zelle führen. Ein statististisch signifikanter Unterschied der zwei Gruppen fand sich bei der Bleomycinkonzentration von 0,5 µg/ml (p = 0,0001).

	Abb. 12: Überlebensraten von drei NBS- und zwei Kontrollzelllinien nach der Inkubation mit ansteigenden Bleomycinkonzentrationen. Die Fehlerbalken geben die intraexperi-mentellen Variationen (Doppelwerte) an.

Die Behandlung mitMethotrexat führte ebenfalls zum konzentrationsabhängigen Absterben der Zellen (vgl. Abb. 13). Kontrollzelllinie C520 war mit einer LD₅₀ von 12 nM Methotrexat dem Mutagen gegenüber am sensitivsten. Die NBS-Linien und die zweite Kontrollzelllinie wiesen keinen signifikanten Unterschied in der Methotrexatsensitivität auf.

Weiterhin zeigt die Grafik einen maximalen Methotrexateffekt bei einer Konzentration von 50 nM. Eine Verdopplung der Konzentration auf 100 nM zeigt keine weitere Zunahme der Anzahl toter Zellen.

	Abb. 13: Überlebensraten von drei NBS- und zwei Kontrollzelllinien bei Inkubation mit ansteigenden Methotrexatkonzentrationen. Die Fehlerbalken geben die intraexperi-mentellen Variationen (Doppelwerte) an.

AuchCyclophosphamid führte in Abhängigkeit von der Konzentration zu einer prozentualen Abnahme überlebender Zellen (vgl. Abb. 14). Zwischen NBS- und Kontrollzelllinien zeigten sich keine signifikanten Unterschiede in der Sensitivität. Die NBS-Linie JaCe hatte mit 0,25 mM Cyclophosphamid die niedrigste LD₅₀.

	Abb. 14: Überlebensraten von zwei NBS- und zwei Kontrollzelllinien bei Inkubation mit ansteigenden Cyclophosphamidkonzentrationen. Die Fehlerbalken geben die intra-experimentellen Variationen (Doppelwerte) an.

4.4.1  Etablierung der Standardbedingungen für die Apoptoseversuche

Vor Beginn der eigentlichen Versuche zur Induktion der Apoptose in NBS-Zellen nach Bleomycinbehandlung (vgl. Abschnitte 4.4.2 und 4.4.3) mussten zunächst Standardbedingungen etabliert werden. Hierzu mussten der zeitliche Verlauf der Apoptose nach DNA-Schädigung sowie die zu verwendenden optimalen Bleomycinkonzentrationen ermittelt werden. Der Apoptosenachweis erfolgte hierbei durch Annexin-V-Färbung (ausführliche Darstellung der Methode unter Abschnitt 3.10.3 und 4.4.3). Zunächst sollten die in den Wachstumsinhibitionsexperimenten getesteten Bleomycinkonzentrationen von 0,1 bis 1 µg/ml für die durchflusszytometrischen Apoptoseversuche übernommen werden (vgl. Abb. 12). Allerdings erwiesen sich diese als nicht ausreichend, um nach Annexin-V-Färbung im Durchflusszytometer nachweisbare apoptotische Effekte zu erzeugen. Konzentrationen wie 1 µg Bleomycin/ml, die im Wachstumsinhibitionsexperiment bereits zum Absterben von 80% der Zellen geführt hatten, zeigten durchflusszytometrisch nach Annexinfärbung Apoptoseraten von nur etwa 4%. Dies erforderte die exakte Bestimmung der Apoptoseraten am Durchflusszytometer bei variierenden Ausgangskonzentrationen und zu verschieden Zeitpunkten nach der Apoptoseinduktion. Hierzu wurden eine Kontroll- und eine NBS-Zelllinie verwendet, die mit ansteigenden Bleomycinkonzentrationen (1, 10 und 30 µg/ml) behandelt wurden. Unbehandelte Zellen beider Linien wurden zur Ermittlung der Hintergrundapoptose mitgeführt (vgl. Abschnitt 3.7). An fünf aufeinanderfolgenden Tagen wurden die Zellen durchflusszytometrisch hinsichtlich eintretender Apoptose untersucht.

Abbildung 15 zeigt die Verteilung vitaler, apoptotischer und spätapoptotischer/ nekrotischer Zellen bei unbehandelten (a) im Vergleich zu mit 30 µg Bleomycin/ml (b) behandelten Zellen im Verlauf von fünf Tagen. Dargestellt sind exemplarisch die Messwerte einer der beiden getesteten Zelllinien.

	Abb. 15: Anteile vitaler (schwarz), apoptotischer (hellgrau) und nekrotischer (dunkelgrau) Zellen bei unbehandelten (a) im Vergleich zu mit 30 µg Bleomycin/ml inkubierten Zellen (b) über fünf Tage (Zelllinie: Kontrollzelllinie C520).

In der Gruppe der unbehandelten Zellen (vgl. Abb. 15a) zeigten sich über den gesamten Versuchszeitraum nahezu konstante Populationsverhältnisse. Die vitalen Zellen bildeten mit ca. 80% die größte Gruppe. Der apoptotische Anteil lag konstant bei etwa 10%, der spätapoptotischer/nekrotischer Zellen bei 7%.

Anders zeigte sich die Verteilung bei den mit 30 µg Bleomycin/ml behandelten Zellen (vgl. Abb. 15b). Hier nahm die Zahl lebender Zellen von anfangs 80% stetig bis auf 10% am fünften Tag ab. Apoptotische Zellen stiegen von 10% zu Anfang auf 67% nach 5 Tagen Bleomycininkubation an. Die Zahl nekrotischer Zellen stieg von 7% auf 24% nach dreitägiger Inkubation. Anschließend fiel der Anteil wieder leicht ab.

Abbildung 16 zeigt die Zunahme früh- und spätapoptotischer/nekrotischer Zellen zusammengefasst über die Zeit bei zwei getesteten Zelllinien (einer Kontrollzelllinie und der NBS-Linie JaCe). Die Zellen wurden mit 1, 10 und 30 µg/ml Bleomycin für fünf Tage inkubiert. Die Ergebnisse der Inkubation mit 1 µg/ml sind nicht dargestellt, da sich keine Apoptose induzieren ließ. Abgebildet ist der Apoptoseverlauf bei den Konzentrationen 10 und 30 µg Bleomycin/ml.

	Abb. 16: Durchflusszytometrisch ermittelte Apoptoseraten einer Kontrollzelllinie und der NBS-Linie JaCe bei fünftägiger Inkubation mit 10 µg (a) und 30 µg (b) Bleomycin/ml. Der schwarze Balken stellt den Anteil apoptotischer Kontrollzellen, der graue Balken den Anteil apoptotischer NBS-Zellen dar. Als apoptotisch gelten alle Annexin-V-positiven Zellen (Ax+/PI- und Ax+/PI+ - Zellen).

Insgesamt zeigte sich eine mit ansteigenden Bleomycinkonzentrationen und längerer Inkubationsdauer zunehmende Apoptoserate. In Abbildung 16a erkennt man bei der Inkubation mit 10 µg Bleomycin/ml bei beiden Zelllinien im Verlauf der Zeit eine stetige Zunahme apoptotischer Zellen. Bei der Kontrollzelllinie stieg die Apoptoserate von anfangs 4,7% auf 49% nach fünf Tagen. Die NBS-Linie JaCe zeigte mit 11,3% am zweiten Tag noch eine der Kontrollzelllinie ähnliche Apoptoserate, blieb dann jedoch mit einer maximalen Rate von 26,3% am 4. Tag unter dem Maximalwert der Kontrollzelllinie (49%) am 5. Tag. Vom 4. auf den 5. Tag fiel die Apoptoserate der NBS-Linie von 26,3% auf 23,5% leicht ab.

Bei der Inkubation mit 30 µg Bleomycin/ml zeigten sich, entsprechend der höheren Mutagenkonzentration, an allen Tagen höhere Apoptoseraten (vgl. Abb. 16b). Bei den Kontrollzellen stieg der Anteil apoptotischer Zellen von initial 8,4% stetig auf 70% nach fünf Tagen. Die Apoptoserate der NBS-Linie blieb erneut hinter der Rate der Kontrollzelllinie zurück und erreichte einen Maximalwert von 47% zu Versuchsende.

Eine spezifische, vielfach verwendete Methode, Apoptose durchflusszytometrisch nachzuweisen, ist die sub-G1-Peak- oder Nicoletti-Methode(vgl. Abschnitt 3.10.2). Sie basiert auf dem geringeren DNA-Gehalt apoptotischer Zellen im Vergleich zu vitalen Zellen. Werden die Zellen mit Propidiumiodid (PI), einem DNA-Farbstoff, gefärbt, fluoreszieren apoptotische weniger intensiv als vitale Zellen.

Ein Beispiel zeigen die folgenden Histogramme. Histogramm 17a zeigt unbehandelte, PI-gefärbte Zellen. Propidiumiodid hat sich in die DNA eingelagert und fluoresziert in zwei schmalen Peaks, die Zellen in der G1-Phase (linker Peak) mit einfachem und Zellen in der G2-Phase (rechter Peak) mit doppeltem DNA-Gehalt repräsentieren. Im darunter liegenden Fluoreszenzbereich, der durch den Marker M1 begrenzt wird, finden sich nur 6,3% der Zellen. Dies bedeutet einen Gesamtanteil apoptotischer Zellen von 6,3% bei unbehandelten Lymphoblasten.

Histogramm 17b zeigt dagegen einen breiten sub-G₁-Peak (Marker M1) von 47,4%. Dies stellt den Anteil apoptotischer Zellkerne nach dreitägiger Bleomycinbehandlung dar.

	Abb. 17: Apoptosenachweis mit der sub-G1-peak-Methode. Unbehandelte Zellen (a) zeigen keinen sub-G1-peak. Bei mit Bleomycin behandelten Zellen (b) findet sich ein breiter sub-G1-peak, der die apoptotischen Zellkerne repräsentiert.

Im folgenden Experiment wurde die Apoptoseinduktion bei sieben NBS-, zwei AT- und zwei Kontrollzelllinien mit Hilfe der sub-G₁-Peak-Methode untersucht. Hierzu wurden die Zellen zunächst für 72 Stunden mit 10 bzw. 30 µg Bleomycin pro ml Zellsuspension inkubiert (vgl. Abschnitt 3.10.1). Für jede Zelllinie wurden pro Bleomycinkonzentration drei Vertiefungen à 3 ml mit 1x10⁶ Zellen angesetzt. Zur Ermittlung der Hintergrundapoptose wurden von jeder Zelllinie unbehandelte Zellen mitgeführt. Nach drei Tagen wurden alle Zelllinien mit PI gefärbt (Nicoletti-Puffer) und durchflusszytometrisch analysiert. Aus den drei Messwerten der mit Bleomycin versetzten Zellen wurde der Mittelwert berechnet und die Rate der Hintergrundapoptose subtrahiert. Anschließend wurden die Apoptoseraten der Patientenzelllinien mit denen der gesunden Kontrollzelllinien verglichen, wobei die Messwerte der Kontrollzellen als Referenz für den t-Test dienten.

Abbildung 18 stellt die Apoptoseraten der Zelllinien graphisch dar. Insgesamt fallen hohe Apoptoseraten von bis zu 80% sowie große Unterschiede zwischen den Raten der einzelnen Zelllinien auf.

	Abb. 18: Hypodiploider DNA-Gehalt (%) nach 72 h Inkubation mit 10 und 30 µg Bleomycin/ml. 7 NBS-, zwei AT- und zwei Kontrollzelllinien wurden untersucht. Die Fehlerbalken geben die intraexperimentellen Variationen (Tripelwerte) an.

Abbildung 18a zeigt die Apoptoseraten nach der Inkubation mit 10 µg Bleomycin/ml. Nach 72 Stunden erreichten die Kontrollzellen eine mittlere Apoptoserate etwa 60%. Im Vergleich dazu zeigten NBS- und AT-Zellen stärker variierende Apoptoseindices – einige Zelllinien wiesen Apoptoseraten ähnlich den Kontrollzellen auf, andere zeigten deutlich niedrigere oder höhere Raten. Zur ersten Gruppe gehören drei NBS-Linien (RoZd, 95P185, 94P247). Sie zeigten Apoptoseraten im Bereich von 57-64%. Ein etwas höherer Apoptoseindex fand sich bei der AT-Linie AT15 mit 69%. Durch Anwendung des t-Tests zeigte sich, dass vier NBS-Linien (96P0048, PeAb, JaCe, 94P307) dagegen signifikant niedrigere Apoptoseindices als die Kontrollzellen aufwiesen. Besonders niedrig waren die Apoptoseindices der NBS-Zelllinien PeAb und JaCe mit 32% bzw. 36%, also nur etwa der Hälfte der Indices der Kontrollzelllinien. Die AT-Zelllinie L15 zeigte eine Tendenz zur niedrigeren Apoptose ohne statistische Signifikanz.

Die Apoptoseraten nach 72stündiger Inkubation mit 30 µg Bleomycin/ml sind in Abbildung 18b dargestellt. Im Vergleich zur Inkubation mit 10 µg Bleomycin/ml haben die Apoptoseindices aller Zelllinien im Durchschnitt um 25,9% zugenommen.

Der Anteil apoptotischer Kontrollzellen hat sich im Vergleich zur niedrigeren Bleomycinkonzentration um 17,5% auf durchschnittlich 70% gesteigert. Die drei NBS-Zelllinien (RoZd, 95P185, 94P247), die bereits bei 10 µg Bleomycin laut t-Test keinen statistisch signifikanten Unterschied zur Apoptoserate der Kontrollzelllinien gezeigt hatten, sind auch hier, wie nun auch die NBS-Zelllinie 96P0048, in diesem Bereich anzusiedeln. Auch beide AT-Zelllinien zeigten eine etwa den Kontrollzellen entsprechende Apoptoserate.

Signifikant geringere Apoptoseraten im Vergleich zu den Kontrollzellen zeigten sich erneut bei den drei NBS-Linien PeAb, JaCe und 94P307.

Tab. 2: Mit der sub-G1-peak-Methode gemessene Apoptoseraten nach Inkubation mit 10 und 30 µg Bleomycin/ml. Angegeben ist der Mittelwert von Tripelwerten inklusive Standardabweichung. Signifikanz bezieht sich auf den Unterschied der Messwerte der NBS- bzw. AT-Zelllinien zum Mittelwert der Kontrollzelllinien. Als Signifikanzniveau wurde p<0,01 angenommen.

Zur Verifizierung der mittels sub-G₁-Peak-Methode gemessenen Apoptoseraten wurden die Zelllinien zusätzlich mit der Annexin-V-Färbung untersucht. Diese Methode ist spezifischer als die sub-G₁-peak-Methode und basiert auf der Anfärbung von in einem frühen Apoptosestadium von der Membraninnen- auf die -außenseite translozierenden Phosphatidylserinen [Vermes, et al., 1995]. Propidiumiodid (PI) wird auch hier verwendet, allerdings dient es lediglich der Gegenfärbung der Zellen. Als DNA-Farbstoff kann es die DNA nur bei spätapoptotischen/nekrotischen Zellen anfärben, deren Zellmembran löchrig und somit für PI durchlässig geworden ist. Demzufolge hat es hier, im Gegensatz zur sub-G₁-peak-Methode, nur qualifizierende und keine quantifizierende Funktion.

Abbildung 19 zeigt beispielhaft drei Dot-Plot-Diagramme einer Zelllinie nach dreitägiger Inkubation mit 0, 10 und 30 µg Bleomycin/ml. Der linke untere Quadrant beinhaltet die vitale Zellpopulation. Die Zellen binden weder Annexin-V noch PI und zeigen deshalb keine Fluoreszenz. Im rechten unteren Quadranten finden sich frühapoptotische (Ax+/PI-), im rechten oberen Quadranten spätapoptotische und nekrotische (Ax+/PI+) Zellen.

Im linken Teil der Abbildung erkennt man die niedrige Apoptoserate unbehandelter Zellen. Die größte Gruppe bilden vitale Zellen mit 89,3%. Frühapoptotisch sind 6,1%, spätapoptotisch 4,2% der Zellen. Unter Bleomycinbehandlung kommt es konzentrationsabhängig zu einer Verschiebung der Populationen. Der prozentuale Anteil vitaler Zellen nimmt ab, während früh- und spätapoptotische Zellen zunehmen. Nach Inkubation mit 30 µg Bleomycin/ml ist die Zahl vitaler Zellen von 89,3% auf 42,4% gefallen. Der Anteil frühapoptotischer ist von 6% auf 37,4%, der spät-apoptotischer/nekrotischer Zellen von 4,2% auf 18,8% gestiegen.

	Abb. 19: Durchflusszytometrische Analyse Annexin-V/PI-gefärbter Zellen nach Inkubation mit 0, 10 und 30 µg Bleomycin/ml für 72 h. Annexin-V ist durch FITC markiert. Der linke untere Quadrant zeigt vitale, der rechte untere apoptotische und der rechte obere Quadrant spätapoptotische/nekrotische Zellen (%).

Im folgenden Experiment wurde die Apoptoseinduktion bei sieben NBS-, zwei AT- und zwei Kontrollzelllinien mit Hilfe der Annexin-V-Methode untersucht. Hierzu wurden die Zellen, analog zum Verfahren bei der sub-G1-peak-Methode (vgl. Abschnitt 4.4.2), für 72 Stunden mit 10 bzw. 30 µg Bleomycin pro ml Zellsuspension inkubiert (vgl. Abschnitt 3.10.1). Für jede Zelllinie wurden pro Bleomycinkonzentration drei Vertiefungen à 3 ml mit 1x10⁶ Zellen angesetzt. Unbehandelte Zellen jeder Zelllinie wurden zur Ermittlung der Hintergrundapoptose mitgeführt. Nach drei Tagen wurden alle Zelllinien mit Annexin-V angefärbt und durchflusszytometrisch analysiert. Aus den drei Messwerten der mit Bleomycin versetzten Zellen wurde der Mittelwert berechnet und die Rate der Hintergrundapoptose subtrahiert. Anschließend wurden die Apoptoseraten der Patientenzelllinien mit denen der gesunden Kontrollzelllinien verglichen, wobei die Messwerte der Kontrollzellen als Referenz für den t-Test dienten.

Abbildung 20 stellt die prozentualen Apoptoseanteile graphisch dar. Auffällig sind zunächst die im Vergleich zur sub-G₁-Peak-Methode bei gleichen Mutagen-konzentrationen insgesamt niedrigeren Apoptoseindices (vgl. Abb. 18). Auch hier zeigten sich, ebenso wie bei den PI-Versuchen, deutliche Unterschiede in den Apoptoseindices der einzelnen Zelllinien.

	Abb. 20: Ax+/PI- und Ax+/PI+ -Zellen nach 72 h Inkubation mit 10 und 30 µg Bleomycin/ml. 7 NBS- zwei AT- und zwei Kontrollzelllinien wurden untersucht. Die Fehlerbalken geben die intraexperimentellen Variationen (Tripelwerte) an.

Bei 10 µg Bleomycin/ml (vgl. Abb. 20a) lag der Anteil apoptotischer Kontrollzellen im Mittel bei etwa 30%.Die Apoptoseraten aller NBS-Zelllinien lagen unter den mittleren Raten der Kontrollzellen. Im Vergleich der jeweiligen Apoptoseraten der NBS- und AT-Zelllinien mit den Kontrollzelllinien mittels t-Test gab es Zelllinien, die Raten im Bereich der Kontrollzellen aufwiesen, und solche, die signifikant nach unten abweichende Apoptoseraten zeigten.

Zur ersten Gruppe gehören drei NBS- (96P0048, RoZd, 95P185) sowie beide AT-Zelllinien, wobei die NBS-Zelllinie 96P0048 eine Tendenz zur niedrigeren Apoptose zeigte. Die vier NBS-Linien der zweiten Gruppe (PeAb, JaCe, 94P247, 94P307) zeigten im t-Test in Relation zu den Kontrollzellen signifikant niedrigere Apoptoseraten (p = 4,5x10^-7). Die niedrigste Rate trat bei der NBS-Linie PeAb mit nur 7% apoptotischen Zellen auf. Die drei NBS-Linien JaCe, 94P247 und 94P307 lagen mit im Durchschnitt 11,7% Apoptose nur bei etwa ¹/₃ der mittleren Apoptoseraten der Kontrollzellen.

Die Inkubation mit 30 µg Bleomycin/ml führte bei allen Zelllinien zu höheren Apoptoseraten (vgl. Abb. 20b). Die mittlere Apoptoserate der Kontrollzellen lag jetzt bei 55% und damit im Vergleich zur Rate bei 10 µg Bleomycin um 45,5% höher. Erneut zeigten alle untersuchten NBS-Zelllinien Apoptoseraten unterhalb des Mittelwerts der Kontrollzellen. Vergleicht man die durchschnittlichen Apoptoseraten der einzelnen NBS- und AT-Zelllinien mit dem Mittelwert der Kontrollzellen, lassen sie sich wieder in die bereits bei 10 µg Bleomycin beobachteten Gruppen einteilen:

Drei NBS-Linien (96P0048, RoZd, 95P185) und beide AT-Linien erreichen erneut Apoptoseraten ähnlich den Kontrollzellen, wobei sich insgesamt eine Tendenz zur niedrigeren Apoptose zeigt.

Vier NBS-Zelllinien (PeAb, JaCe, 94P247, 94P307) zeigen mit durchschnittlich 20% ebenso wie bei der Behandlung mit 10µg Bleomycin/ml signifikant niedrigere Apoptoseraten verglichen mit den durchschnittlichen Raten der Kontrollzelllinien (p = 2x10^-8).

Tab. 3: Mit der Annexin-V-Methode gemessene Apoptoseraten nach Inkubation mit 10 und 30 µg Bleomycin/ml. Angegeben ist der Mittelwert von Tripelwerten inklusive Standardabweichung. Signifikanz bezieht sich auf den Unterschied der Messwerte der NBS- bzw. AT-Zelllinien zum Mittelwert der Kontrollzelllinien. Als Signifikanzniveau wurde p<0,01 angenommen.

+: signifikant verminderte Apoptoserate, -: kein signifikanter Unterschied der Apoptoseraten zu den Kontrollzellen (t-Test). Ax: Annexin-V, PI: Propidiumiodid, pos.: positiv, Sig.: Signifikanz.

Zusammenfassend ergibt sich folgendes Bild: Bei den Untersuchungen zum Zellwachstum zeigte sich eine starke Variabilität der Wachstumsgeschwindigkeiten der Zelllinien untereinander, wobei keine Korrelation zwischen Wachstumsgeschwindigkeit und Apoptoseinduktion erkennbar war. In den Wachstumsinhibitionsexperimenten zeigte sich eine erhöhte Sensitivität von NBS-Zellen auf das Radiomimetikum Bleomycin. Diese Sensitivität bestand bei den auf anderen Wirkmechanismen beruhenden Mutagenen Cyclophosphamid und Methotrexat nicht.

Die durchflusszytometrischen Untersuchungen zur Apoptose wurden mit zwei unabhängigen Färbemethoden – der sub-G1-peak-Methode und der Annexin-V-Färbung – durchgeführt. Bei beiden Methoden zeigten sich Unterschiede in den Apoptoseindices der NBS-Zellen, wobei es Zelllinien mit Apoptoseraten im Bereich der Kontrollzelllinien und solche mit im Vergleich zu den Kontrollzellen signifikant reduzierten Apoptoseraten gab. Bei der Untersuchung mit der Annexin-V-Färbung lagen die Apoptoseraten aller NBS-Zelllinien unter dem Mittelwert der Raten der Kontrollzelllinien.

Drei von sieben untersuchten NBS-Zelllinien zeigten bei beiden Nachweismethoden durchgehend signifikant niedrigere Apoptoseraten als die Kontrollzelllinien. Zwei weitere NBS- sowie beide AT-Zelllinien zeigten dagegen durchgängig den Kontrollzellen ähnliche Apoptoseraten. Die übrigen beiden NBS-Zelllinien (96P0048 und 94P247) ließen sich nicht durchgehend einer der beiden Gruppen zuordnen. In den Annexinversuchen gehörte die NBS-Zelllinie 96P0048 aber stets der Gruppe mit normaler Apoptoserate, die Zelllinie 94P247 dagegen der Gruppe mit niedrigerer Apoptoseinduktion an.

Eine zusammenfassende Darstellung der experimentellen Ergebnisse in Ergänzung der klinischen Daten zur Malignomentstehung zeigt Tabelle 4. Auf Grundlage der bei den Untersuchungen zur Apoptoseinduktion aufgetretenen Verteilung der Apoptoseraten wurden die NBS-Zelllinien in zwei Gruppen eingeteilt - eine Gruppe mit im Normalbereich liegender und eine mit signifikant nach unten abweichender Apoptoserate. Für beide Gruppen wurden die mittleren Apoptoseraten berechnet und mittels t-Test mit dem Durchschnittswert der Kontrollzellen verglichen.

Tab. 4: Zusammenfassung der experimentellen Ergebnisse. Die Daten zur Apoptose wurden aus den spezifischeren Annexin-Versuchen bezogen. Klinische Daten zu Neoplasien sind ergänzt.