Methoden

Dieses Kapitel stellt die zur Durchführung der Experimente verwendeten Methoden dar. Die Abschnitte 3.1 bis 3.6 befassen sich mit allgemeinen Methoden wie der Kultivierung der Zelllinien, der Bestimmung der Zellzahl und der Chromosomenanalyse. Hier werden auch die Methoden der PCR und der DNA-Sequenzierung vorgestellt, die vor Beginn der eigentlichen Versuchsreihen zur Unterscheidung der Zelllinien, zur Testung auf Mycoplasmen und zum Nachweis der 657del5-Mutation in den NBS-Zelllinien verwendet wurden.

Die Abschnitte 3.7 bis 3.9 stellen die Untersuchungen zum Wachstumsverhalten und zur Wachstumsinhibition der NBS-Zelllinien dar. Die Wachstumsinhibition wurde mit drei verschiedenen Mutagenen untersucht, die kurz charakterisiert werden.

In den Abschnitten 3.10 und 3.11 folgt die Beschreibung der Versuche zur Apoptoseinduktion in lymphoblastoiden NBS-Zelllinien. Die verwendeten Apoptose-nachweisverfahren – die sub-G1-peak-Methode und die Annexin-V-Färbung – werden vorgestellt. Darüber hinaus werden kurz die Grundlagen der durchflusszytometrischen Technik beschrieben, die zur Messung der Apoptoseraten verwendet wurde.

Kultivieren und Passagieren von Zellen

Zum Auftauen wurden die Zellen nach der Entnahme aus dem Stickstofftank (-196°C) auf Eis transportiert und in einem 37°C warmen Wasserbad aufgetaut. Die in Einfriermedium gelösten Zellen wurden mit einer Transferpipette in 9 ml RPMI (15% FKS/Pen/Strep) überführt und 10 min bei 800 rpm zentrifugiert. Nach Absaugen des Überstandes wurde das Pellet in 5 ml frischem Medium resuspendiert, in eine kleine Gewebezuchtflasche (50 ml) überführt und in den Brutschrank gestellt.

Die Zellen wurden in Gewebezuchtflaschen (275 ml) im Brutschrank bei 37°C und 5% CO₂ kultiviert. Das verwendete Zellkulturmedium (RPMI) wurde mit 15% fetalem Kälberserum (FKS) und Antibiotika (Penicillin und Streptomycin) versetzt und bei 4°C verwahrt. Im Durchschnitt wurden die Zellen alle 3-4 Tage im Verhältnis von 1:2, 1:4 oder 1:9, je nach Teilungsrate, in eine neue Flasche überführt. Das Umsetzen erfolgte unter sterilen Bedingungen in folgenden Schritten:

Vereinzelung der Zellen durch Auf- und Abpipettieren mit einer sterilen 10 ml Pipette
Überführen des entsprechenden Anteils Zellsuspension in eine neue Flasche
Auffüllen bis auf 50 ml mit frischem Medium

Sollten Zellen über einen längeren Zeitraum konserviert werden, wurden sie nach folgendem Protokoll eingefroren:

Die durch Auf- und Abpipettieren vereinzelten Zellen wurden aus der mittleren Gewebezuchtflasche in ein 50 ml Blue-Cap-Röhrchen überführt und bei 100 rpm für 10 min zentrifugiert.
Das sichtbare Zellpellet wurde mit einer sterilen Transferpipette in 2-3 ml gekühltem Einfriermedium aufgenommen. Zusatz von Dimethylsulfoxid (DMSO) verhinderte die Kristallbildung innerhalb der Zellen sowie die partielle Dehydratation des Zytoplasmas.
Jeweils 1 ml der Zellsuspension wurde in ein verschließbares Kryoröhrchen gegeben und sofort auf Eis gestellt.
Um ein schrittweises Abkühlen zu gewährleisten, wurden die Zellen für mindestens 24 h in einer Einfrierbox aus Styropor bei -80°C aufbewahrt.

Über den Zeitraum von einigen Monaten konnten die Zellen bei -80°C verwahrt werden; bei längerer Verwahrung wurden sie in flüssigem Stickstoff (-196°C) gelagert.

Zellzahlbestimmung

Die Zellzahl wurde automatisch mit Hilfe eines Partikelzählers der Firma Beckman Coulter bestimmt. Das Prinzip der Zählung und Größenbestimmung beruht auf der Messung der Widerstandsänderung, die eine Zelle auslöst, wenn sie in einer elektrisch leitfähigen Flüssigkeit suspendiert wird und durch eine kleine Kapillaröffnung tritt. Die zu messende Partikelgröße wurde auf 7,7-13,4 µm Durchmesser, die durchschnittliche Lymphozytengröße, eingestellt. Da tote Zellen einer Schrumpfung unterliegen, ist ihr Durchmesser kleiner als der lebender Zellen, so dass nur vitale Zellen gezählt werden.

Für die Zellzahlbestimmung mussten die Zellen zunächst vereinzelt werden. 200 µl der Zellsuspension wurden in ein Zählgefäß mit 10 ml isotoner Lösung gegeben, unter die Kapillare in den Partikelzähler gestellt und gemessen. Das Gerät zählt jeweils zweimal 500 µl und mittelt das Ergebnis. Auf einem Display wurden die Zellzahl und die Größenverteilung der Zellen abgelesen. Das Ergebnis wurde mit dem Faktor 100 multipliziert.

Chromosomenanalyse

Um grobe Aberrationen wie z. B. eine Tetraploidie der verwendeten Zelllinien auszuschließen, wurden die Zellen vor Beginn der Versuche einer Chromosomenanalyse unterzogen.

Für die Analyse wurden 1x10⁶ Zellen entnommen, 10 min bei 1000 rpm zentrifugiert und in 3 ml frischem Medium aufgenommen. Die Suspension wurde in 50 ml Gewebezuchtflaschen überführt und zwei Tage im Brutschrank verwahrt.

Zur Fixierung wurden Die Zellen eine Stunde in 30 µl Colcemid inkubiert und anschließend in Röhrchen überführt und 10 min bei 1000 rpm zentrifugiert. Der Überstand wurde verworfen und die Zellen in 5 ml 0,4% KCl resuspendiert und 10 min inkubiert. Die hypotone Lösung bewirkt ein Aufquellen der Zellen. Währenddessen wurden 100 ml Fixierungslösung bestehend aus 25 ml Essigsäure und 75 ml Ethanol angesetzt. Der Überstand wurde bis auf etwa 500 µl abgenommen und die Zellen resuspendiert.

Da die erste Fixierung langsam erfolgen muss, wurden mehrere Tropfen Fixativ langsam nacheinander zugegeben. Anschließend wurden die Röhrchen geschüttelt und weitere 5 ml Fixativ zugegeben. Wieder wurde 10 min/1000 rpm zentrifugiert. Die Zellen wurden zwei weitere Male in 5 ml Fixativ fixiert, resuspendiert und 10 min/1000 rpm zentrifugiert.

Je zwei Tropfen der Zellsuspension wurden auf gekühlte, beschriftete Objektträger aufgetropft und unter einer 65-Watt-Lampe getrocknet.

Für die Färbung wurden die Objektträger für 8 min in Giemsa-Lösung getaucht und mit Wasser abgespült. Die Präparate wurden auf einer Wärmebank bei 42°C getrocknet, etwas Einbettmedium aufgebracht und ein Deckglas aufgedrückt. Für die Auswertung wurden die Präparate unter dem Lichtmikroskop auf grobe Veränderungen im Chromosomensatz untersucht. Pro Zelllinie wurden 20 Metaphasen beurteilt. Bei mehr als einer tetraploiden Metaphase wurde die Zelllinie von den Apoptoseversuchen ausgeschlossen. Pro Präparat wurden zwei digitale Fotos von Metaphasen gemacht und abgespeichert.

DNA-Extraktion aus lymphoblastoiden Zellen

Nach sorgfältiger Resuspension wurde 1 ml Zellsuspension in ein Eppendorfgefäß überführt. Zunächst erfolgte die Zentrifugation für 2 min bei 2000 rpm, anschließend für 30 sec bei 14 000 rpm. Der Überstand wurde verworfen und die Zellen in 30 µl Lysepuffer resuspendiert, 1 h bei 37°C und nochmals für 10 min bei 85°C inkubiert. Die anschließende Zentrifugation von 10 min bei 14 000 rpm bewirkte die Sedimentation von Zelltrümmern am Boden des Gefäßes während die DNA im Überstand gelöst war. Der Überstand wurde in ein neues Eppendorfgefäß überführt. 1,5 µl des Überstandes wurden für die nachfolgend beschriebenen PCR-Reaktionen verwendet.

Polymerase-Kettenreaktion (PCR)

Die PCR ist eine Methode zur enzymatischen Amplifikation spezifischer DNA-Abschnitte. Voraussetzung hierfür ist die Kenntnis der Nukleotidsequenzen, die den gewünschten Genabschnitt flankieren. Zwei synthetisch hergestellte Oligonukleotide (Primer), die komplementär zu den flankierenden Sequenzen sind, binden an die durch Erhitzen denaturierte, einzelsträngig vorliegende DNA und dienen als Startpunkt für die DNA-Synthese. Eine hitzestabile DNA-Polymerase verlängert die Primer entlang der einzelsträngigen Matrize und synthetisiert so den komplementären DNA-Strang. Durch ein in der Regel dreistufiges Temperaturprofil werden die Einzelschritte der Reaktion – Denaturierung des Doppelstrangs, Anlagerung der Primer und Synthetisieren der komplementären DNA – koordiniert. Durch 20-35fache Wiederholung dieses Zyklus lässt sich eine nahezu exponentielle Anreicherung der Zielsequenz erreichen.

Im Rahmen dieser Arbeit wurde die PCR zur Abgrenzung der verwendeten Zelllinien gegeneinander zu Beginn und Ende der Experimente genutzt. Kontaminationen der Zelllinien untereinander sollten dadurch ausgeschlossen werden. Weiterhin wurden alle Linien mittels PCR auf Mycoplasmen getestet. Außerdem wurden PCR-Produkte der sieben verwendeten NBS-Zelllinien zum Nachweis der 657del5 Mutation sequenziert.

Nachweis der Zellgleichheit

Vor Beginn und nach Abschluss der Versuche wurden die verwendeten Zelllinien molekulargenetisch auf Zellgleichheit untersucht. Zu diesem Zweck kam der so genannte Minisatellitentest zum Einsatz. Minisatelliten-DNA besteht aus Kopien von DNA-Abschnitten (Repeats) von 16-64 Basenpaaren, die sich über das gesamte Genom verteilt finden. Überwiegend werden sie weder transkribiert, noch kann ihnen eine funktionelle Bedeutung zugeschrieben werden. Man bezeichnet diese polymorphen Sequenzen auch als VNTR (Variable Number of Tandem Repeats). Da die Anzahl dieser repetitiven Sequenzeinheiten von Mensch zu Mensch variiert, ist es möglich, durch die Bestimmung der Anzahl an Repeats Individuen gegeneinander abzugrenzen.

Der hier verwendete Minisatellit D1S80 besteht aus einer Einheit von 16 Basenpaaren, die im menschlichen Erbgut zwischen 13 und 37mal kopiert vorliegen kann. Mittels PCR läßt sich die genaue Anzahl der Sequenzeinheiten bestimmen.

Für den Versuch wurde humane genomische DNA aus den Zelllinien extrahiert (vgl. Abschnitt 3.4). Ein PCR-Ansatz mit 25 µl Endvolumen enthielt 2 µl genomische DNA und 0,2 µl Taq-DNA-Polymerase (5 U/µl). Die Konzentration der Desoxynukleotid-triphosphate (dNTPs) betrug 0,8 mM, die der Primer jeweils 0,15 µM.Durch Zusatz von ¹/₁₀ Volumen 10xPCR-Puffer wurde die Konzentration der zusätzlichen Komponenten eingestellt.

PCR-Profil:

5 min

94°C

30 sec

94°C

30 sec

65°C

32 Zyklen

1 min

72°C

10 min

72°C

Gelelektrophorese der PCR-Produkte

Die elektrophoretische Auftrennung der PCR-Produkte erfolgte in horizontalen Agarosegelen. Der pH-Wert des TBE-Puffers lag mit 8,3 im basischen Bereich, in dem Protonen von der DNA abdiffundieren und diese somit negativ geladen vorliegt. Durch Anlegen eines elektrischen Feldes bewegt sich die DNA zur positiv geladenen Anode. Abhängig von der Größe der PCR-Produkte wandert die DNA unterschiedlich schnell durch das Agarosegel. Dadurch kommt es zur Auftrennung der Fragmente nach ihrer Größe, wobei die kleinsten Fragmente am schnellsten wandern.

Zur Herstellung des in dieser Arbeit verwendeten 1,5%igen Agarosegels wurden 1,5 g Agarose auf 100 ml mit TE-Puffer aufgefüllt, in einem Mikrowellengerät aufgekocht und gelöst. Zur Detektion der DNA wurden 0,05 µg/ml des Farbstoffes Ethidiumbromid zugegeben. Ethidiumbromid lagert sich in die DNA ein und fluoresziert nach Anregung durch UV-Licht. Die Agaroselösung wurde in eine Gelkammer gegossen und ein Probenkamm eingesetzt. Nach Erkalten und Verfestigung des Gels wurde der Kamm herausgezogen und das Gel mit TBE-Puffer überschichtet.

Die DNA wurde in Ladepuffer aufgenommen (0,3 Vol.) und in die Geltaschen gegeben. Als DNA-Längenvergleichsstandard dienten selbst hergestellte Marker der entsprechenden Repeatzahl, die zusammen mit den PCR-Produkten aufgetragen wurden. Anhand ihrer Größe ließ sich die jeweilige Größe der Produkte in Basenpaaren schätzen.

Die Auftrennung der PCR-Produkte erfolgte bei 120 V für 30 min. Nach Abschluss der Elektrophorese wurde das Gel unter UV-Licht fotografiert und das Bild digital gespeichert.

Mycoplasmentest

Vor Beginn der Experimente wurden alle Zelllinien auf Mycoplasmen getestet. Mycoplasmen sind zellwandlose Bakterien mit einem besonders kleinen Genom. Für die Zellkultur stellen sie eine besondere Gefahr dar, da sie nur schwer nachweisbar sind, den Zellstoffwechsel jedoch nachhaltig beeinflussen können. So können sie z. B. das Zellwachstum hemmen und zu chromosomaler Instabilität führen.

Die Zellen wurden resuspendiert und je 200 µl des Zellsuspensionsüberstandes in Eppendorfgefäße überführt. Diese wurden für 5 min bei 100°C im Wasserbad inkubiert, um evtl. enthaltene Mycoplasmen zu lysieren und DNAsen zu inaktivieren. Durch anschließende Zentrifugation für 5 min bei 13 000 rpm wurden störende Zelltrümmer abgetrennt. Für die PCR-Reaktion wurden 0,5 µl des Überstandes verwendet. Eine Null-Kontrolle (steriles, deionisiertes Wasser) und eine Mycoplasmen-Positivkontrolle (Mycoplasma orale DNA, Minerva Biolabs) wurden mitgeführt.

Das Gesamtvolumen eines PCR-Ansatzes betrug 10 µl. Er enthielt 1 µl 10xPCR Reaktionspuffer (Minerva), 1 µl Primer/Nukleotide (Minerva) und 0,04 µl Taq-DNA-Polymerase (5 U/µl). Mit ddH₂O wurde auf ein Volumen von 9,5 µl aufgefüllt. Nach Zugabe von 0,5 µl DNA wurde die PCR nach folgendem Profil durchgeführt.

2 min

94°C

2 min

55°C

2 min

72°C

30 sec

94°C

34 Zyklen

1 min

55°C

1 min

72°C

Die Auftrennung der PCR-Produkte erfolgte wie unter 3.5.2 beschrieben im 1,5%igen Agarosegel bei einer Spannung von 120 V für ca. 30 min.

Mutationsnachweis durch Sequenzierung

Vor Beginn der Versuche wurden alle verwendeten NBS-Zelllinien auf die Mutation 657del5 getestet, um sicher zu gehen, dass die Linien tatsächlich Träger der Mutation sind. Hierfür wurde das von Sanger et al. beschriebene Verfahren der Sequenzierung durch kontrollierten Kettenabbruch verwendet [Sanger, et al., 1977]. In Abhängigkeit von Primer und Matrizenstrang wird von einer DNA-Polymerase ein farbiges DNA-Produkt synthetisiert. Die Markierung erfolgt mit in vier verschiedenen Farben fluoreszierenden ddNTPs. Jeder Base ist ein spezifisches Fluorophor zugeordnet. Bei der Gelelektrophorese misst ein Detektor die Fluoreszenzsignale der vorbeiwandernden DNA und zeichnet sie auf. Die Ausgabe der Ergebnisse erfolgt in Form von Intensitätsprofilen, aus denen die exakte Basensequenz abgelesen werden kann (vgl. Abb. 9).

Reinigung der PCR-Produkte

Die PCR wurde unter den in 3.5 beschriebenen Bedingungen durchgeführt. Für jede Zelllinie wurde ein PCR-Produkt von Exon 6 des Nbs1-Gens mit Hilfe der Primer NBS Ex6-F und -R (biomers.net GmbH, Ulm) gewonnen. Nach der Agarosegelkontrolle wurden die Produkte von restlichen Primern, dNTPs, Salzen etc. gereinigt. Dies erfolgte mit Hilfe eines Kits der Firma Millipore. Das Kit besteht aus Eppendorf-ähnlichen Probengefäßen und kleinen Säulen mit Filter.

Zunächst wurde für jede Probe eine Filtersäule in ein Probengefäß gesteckt. Die PCR-Produkte wurden in 4 µl ddH₂O gelöst, mit sterilem Wasser auf 500 µl aufgefüllt und auf die Filtersäulen aufgetragen. Die Säulen wurden 15 min bei 5000 rpm zentrifugiert, der Durchlauf verworfen und die DNA-haltige Filtersäule auf ein sauberes Probengefäß gesteckt. Für die Elution der DNA wurden 30 µl H₂O zugegeben und erneut zentrifugiert (2 min/4000 rpm).

Ansatz der Sequenzierreaktion

Die Sequenzierreaktion wurde nach folgendem Ansatz auf Eis pipettiert:

5 µl PCR-Produkt

2 µl Big Dye Terminator Mix

2 µl 1,6 µl/mol Primer

7 µl steriles H₂O

4 µl Puffer

PCR-Profil zur Sequenzierung:

10 sec

96°C

25 Zyklen

5 sec

50°C

4min

60°C

Das Sequenzierprodukt wurde von nicht eingebauten Nukleotiden mit dem Dye-Ex Spin Kit gereinigt. Dieses Kit besteht aus kleinen Säulen mit einer Gelmatrix(Sephadex) und entsprechenden 2 ml Probengefäßen zum Auffangen der eluierten DNA. Zunächst wurden die Deckel der Säulen geöffnet und die Säulen kurz gemischt, um das Sephadex vollständig zu resuspendieren. Dann wurde der Säulenverschluss am Boden entfernt und die Säule in ein Eppendorfgefäß gesetzt. Die Säulen mit Eppendorfgefäß wurden 3 min bei 3000 rpm zentrifugiert und in saubere Eppendorfgefäße gesetzt. Anschließend wurde das gesamte Volumen der Sequenzierreaktion auf die Membran aufgetragen. Es folgte eine weitere Zentrifugation von 3 min bei 3000 rpm, um die DNA von der Säule in das Eppendorfgefäß zu eluieren. Zuletzt wurden 10 µl steriles Wasser zugegeben.

Die Auftrennung der Produkte der Sequenzierreaktion erfolgte im DNA-Sequenzierer ABI 3100. Dabei wurden die DNA-Fragmente in einem Gel der Größe nach getrennt und die Fluoreszenzfarbstoffe mittels Laser angeregt und gemessen. Die erhaltene Sequenz konnte in Form eines vierfarbigen Ausdrucks dokumentiert werden, wobei jede Farbe für eine der vier Basen steht (vgl. Abb. 9).

Wachstumsexperimente

Das Wachstum kultivierter Zellen teilt sich, wie das der Bakterien, in dreiPhasen. Nach der Lag-Phase, in der sich der Stoffwechsel an die Bedingungen des Nährmediums anpasst und die Zellzahl noch nicht zunimmt, folgt die exponentielle Wachstumsphase. Im Anschluss erfolgt eine Verlangsamung des Wachstums und der Übergang in die stationäre Phase durch Erschöpfung der Nährstoffe und Anhäufung toxischer Stoffwechselprodukte. Schließlich sterben die Zellen ab.

Im Rahmen dieser Arbeit wurde das Wachstum lymphoblastoider NBS-Zelllinien untersucht. Zum einen interessierten die Wachstumseigenschaften der Zelllinien, zum anderen mussten zur Etablierung der Standardbedingungen für die Apoptoseversuche die Wachstumsraten aus folgendem Grund bekannt sein.

Für Apoptosemessungen ist wichtig, dass der prozentuale Anteil an spontaner Apoptose, der so genannten Hintergrundapoptose, so gering wie möglich ausfällt. Nur dadurch wird es möglich, die gemessene Apoptoserate auch tatsächlich auf die durchgeführte Behandlung der Zellen zurückzuführen. Hierbei gilt es zu beachten, dass die Zellen sich zum Zeitpunkt der Messung in der exponentiellen Wachstumsphase befinden und nicht etwa unter Nährstoffmangel leiden, welcher ebenfalls Apoptose auslösen kann. Dies würde den prozentualen Anteil der Hintergrundapoptose erhöhen, was wiederum zu Verfälschungen der Messergebnisse führen kann. Ziel war es, eine Hintergrundapoptose von unter 10% zu erreichen. In den hier durchgeführten Versuchen lag sie bei der sub-G₁-peak-Methode im Mittel bei 7,7%, bei der Annexinfärbung bei 6,2% (s. u.).

Um herauszufinden, welche Zelldichte sich für die Versuche eignet, wurden Zellen in ansteigender Dichte in Platten mit 6 bzw. 24 Vertiefungen pipettiert, und ihr Wachstum über einen Zeitraum von bis zu 8 Tagen verfolgt. Die Zählung der Zellen erfolgte täglich mit dem Coulter-Counter. Für jeden Zähltag wurde eine Vertiefung angesetzt, um Verfälschungen der Ergebnisse durch die stetige Abnahme des Volumens zu vermeiden.

Um auch nach der Mutagenbehandlung noch genügend Zellen für die Auswertung am Durchflusszytometer übrig zu haben, wurde zunächst eine relativ hohe Ausgangszellzahl von 5x10⁵ Zellen/ml verwendet. Später erfolgte eine Verringerung auf 3x10⁵ Zellen/ml, da bei dieser Zellzahl sowohl ein exponentielles Wachstum der Kulturen bis zum Tag 4 nach Versuchsbeginn als auch eine ausreichende Zellzahl zur FACS-Messung gewährleistet waren (s. u.).

Mutagene

In den Experimenten zur Wachstumsinhibition (s. u.) wurden die Mutagene Bleomycin, Methotrexat und Cyclophosphamid eingesetzt. Für den Großteil der Versuche zur Apoptoseinduktion wurde Bleomycin verwendet. Alle Mutagene wurden bei -20°C gelagert und vor jedem Versuch frisch aufgetaut.

Bleomycin

Bleomycin ist ein in der Klinik als Zytostatikum eingesetztes Antibiotikum, das aus dem Pilz Streptomyces verticillus isoliert wird. Es wird vorwiegend zur Behandlung von Plattenepithelkarzinomen verwendet.

Bleomycin ist ein Glykopeptidgemisch, das wie eine Nukleosidase wirkt und Thymin aus der DNA abspaltet. Dadurch induziert Bleomycin an isolierter DNA Einzel- und Doppelstrangbrüche. Aufgrund der Ähnlichkeit des Schadensspektrums zu dem ionisierender Strahlung wird Bleomycin auch als Radiomimetikum bezeichnet. Die Mechanismen der zytostatischen Wirksamkeit des Bleomycins sind nicht vollständig bekannt. Vernole et al. konnten eine Apoptoseinduktion in Lymphozyten durch Bleomycin nachweisen [Vernole, et al., 1998].

Das für die Experimente verwendete, wasserlösliche Bleomycin wird von der Firma Mack unter dem Namen Bleomycinum vertrieben. Eine Flasche enthält 7-10 mg lyophylisiertes Bleomycinsulfat, entsprechend einer standardisierten biologischen Aktivität von 15 000 U Bleomycin.

Für die Experimente wurde das Bleomycin in 15 ml sterilfiltriertem Wasser gelöst, in Aliquots von 500 µl à 1 µg/µl abgefüllt und bei -20°C verwahrt.

Cyclophosphamid

Cyclophosphamid gehört zur Gruppe der bifunktionell-alkylierenden Zytostatika. Als Immunsuppressivum wird es bei schwer verlaufenden Autoimmunerkrankungen und nach Organ- und Knochenmarkstransplantationen angewandt. Weiterhin wird es zur Chemotherapie maligner Tumoren verwendet.

Die zytotoxische Wirkung des Cyclophosphamids wird durch eine kovalente Quervernetzung der DNA-Einzelstränge verursacht, wodurch die Replikation und Transkription aller sich teilenden Zellen gehemmt wird. Dies führt zu Funktionsverlust und Zelltod. Cyclophosphamid kann in jede Phase des Zellzyklus eingreifen [Mazur, et al., 2002], wobei sich der zytotoxische Effekt besonders während der DNA-Synthesephase bemerkbar macht.

Das in den Experimenten verwendete Cyclophosphamid wird von der Firma Baxter Oncology unter dem Namen Endoxan vertrieben. Eine Flasche enthält 1g Trockensubstanz, die in 50 ml sterilfiltriertem Wasser gelöst wurde (71,66 mM).

Methotrexat

Methotrexat gehört wie das Cyclophosphamid zu den zytotoxischen Immunsuppressiva, die neben der Immunsuppression auch zur Chemotherapie verwendet werden. Als Antimetabolit der Folsäure hemmt Methotrexat die Dihydrofolatreduktase. In der Folge wird vermindert Tetrahydrofolsäure gebildet, die zur Übertragung von Methylgruppen notwendig ist. Dadurch vermindert sich die Bildung von Thymidin und Purinbasen; die so gestörte DNA- und RNA-Synthese führt zu Funktionsverlust und Zelltod. Dies erklärt, warum Methotrexat seine Wirkung hauptsächlich in der DNA-Synthesephase entfaltet.

Methotrexat wird von der Firma Medac unter dem Namen Methotrexat in Injektionsflaschen mit je 15 mg Methotrexat vertrieben.

Wachstumsinhibitions-Experimente

In Wachstumsinhibitionsexperimenten wurde die Sensitivität lymphoblastoider NBS-Zellen gegenüber den Zytostatika Bleomycin, Cyclophosphamid und Methotrexat (s. o.) bestimmt. Hierzu wurden die Zellen mit ansteigenden Konzentrationen des entsprechenden Mutagens behandelt. 1,5x10⁵Zellen wurden in 1 ml RPMI gelöst, in 24er Mikrotiterplatten ausplattiert und das Mutagen in ansteigenden Konzentrationen zugegeben (0,5 ml, dreifach konzentriert, Endvolumen 1,5 ml). Für jede Mutagenkonzentration wurden Doppelwerte (zwei Vertiefungen) angesetzt. Fünf Tage nach Beginn der Behandlung wurden die lebenden Zellen mit der Coulter-Methode gezählt. Zur Beurteilung der Sensitivität gegenüber dem Mutagen wurde die LD₅₀ (letale Dosis) ermittelt, also die Konzentration, bei der 50% der Zellen abgestorben sind.

Die Ergebnisse wurden mit dem Programm Sigma Plot 8.0 (SPSS Science) anhand von Wachstumskurven graphisch dargestellt (vgl. Abb. 12).

Induktion der Apoptose in NBS-Zellen

In den Apoptoseversuchen wurde die Apoptoseinduktion in lymphoblastoiden NBS-Zellen durch Bleomycin untersucht. Hierzu wurden die Zellen in 6er-Multiwell-Platten gegeben und mit den entsprechenden Bleomycinkonzentrationen versetzt. Zum Apoptosenachweis wurden zwei verschiedene Methoden – die sub-G₁-peak-Methode und die Annexin-V-Färbung (s. u.) – verwendet. Nach der Apoptosefärbung wurden die Zellen durchflusszytometrisch analysiert.

Die ebenfalls verwendete TUNEL-Methode, die auf der Fluoreszenz-Markierung freier 3'-OH-DNA-Enden durch eine terminale Transferase basiert, konnte keine auswertbaren Ergebnisse liefern. Schwierigkeiten bei der Permeabilisierung der Zellen hatten zur unzureichenden Farbstoffaufnahme der Zellen und nachfolgend zur verminderten Anfärbung der Strangbrüche geführt. Dadurch konnten apoptotische Zellen durchflusszytometrisch von vitalen Zellen nicht eindeutig abgegrenzt werden.

Bleomycinbehandlung

Um die gewünschte Anzahl Zellen zu entnehmen, musste zunächst die Zellzahl in den Kulturflaschen mit der Coulter-Methode bestimmt werden. Für die nachfolgenden Messungen der Apoptoseraten war es wichtig, dass sich die Zellen bereits zum Entnahmezeitpunkt im exponentiellen Wachstum befanden. Es zeigte sich, dass die besten Ergebnisse mit der niedrigsten Hintergrundapoptose erzielt werden konnten, wenn die Zellen drei Tage vor Entnahme auf eine Dichte von ca. 1,5x10⁵ Zellen/ml gesplittet wurden. So betrug die Zellzahl zu Versuchsbeginn regelmäßig etwa 3-4x10⁵Zellen/ml.

Das der gewünschten Zellzahl entsprechende Volumen an Zellsuspension wurde aus der Kulturflasche entnommen, in 50 ml Blue-Caps überführt und 10 min bei 1000 rpm zentrifugiert. Der Überstand wurde abgesaugt und die Zellen in frischem Medium resuspendiert. Es wurde entsprechend so viel Medium zugegeben, dass die Zelldichte bei 0,4x10⁶ Zellen/ml lag. Pro Vertiefung wurden nun 1x10⁶ Zellen, resuspendiert in 2,5 ml Medium, ausplattiert. Für jede Zelllinie wurden pro Bleomycinkonzentration jeweils drei Vertiefungen mit Zellen angesetzt.

Die Bleomycinverdünnungen wurden direkt vor Versuchsbeginn hergestellt. Dabei wurde der Wirkstoff so weit verdünnt, dass die pro Vertiefung gewünschte Konzentration in 0,5 ml Verdünnung vorlag. So konnte zu den bereits vorgelegten 2,5 ml die entsprechende Bleomycinkonzentration in 0,5 ml zugegeben werden, um ein Endvolumen von 3 ml pro Vertiefung zu erzielen. Nach Zugabe des Bleomycins wurden die Platten in den Brutschrank gestellt und, je nach Versuchsaufbau, 1-5 Tage darauf zur Apoptosemessung weiterverarbeitet.

Apoptosenachweis mit der sub-G₁-peak-Methode

Ein typisches Apoptosemerkmal ist die Spaltung der DNA durch Endonukleasen in charakteristische, ca. 180 bp-große DNA-Fragmente [Wyllie, 1980]. In apoptotischen Zellen ist daher – verglichen mit vitalen Zellen – der Gehalt an niedermolekularer DNA erhöht, der Anteil hochmolekularer DNA dagegen reduziert. Induziert man nun eine Lyse der Zellmembran, kommt es zum Austreten und nachfolgendem Verlust der niedermolekularen DNA-Fragmente in apoptotischen Zellen, während intakte, hochmolekulare DNA im Zellkern verbleibt. Auf dem Nachweis des somit niedrigeren DNA-Gehalts apoptotischer Zellen beruht die 1991 von Nicoletti et al. (daher auch Nicoletti-Methode genannt) entwickelte sub-G₁-peak-Methode [Nicoletti, et al., 1991]. Hierbei wird der zelluläre DNA-Gehalt nach Permeabilisierung der Zellmembran und Anfärbung der DNA mit Propidiumiodid durchflusszytometrisch bestimmt. Dabei erscheinen apoptotische Zellkerne als breiter, hypodiploider, schwächer-fluoreszierender DNA-Peak (sub-G₁-Peak), der leicht vom schmalen DNA-Doppelpeak gesunder Zellen mit diploidem DNA-Gehalt unterschieden werden kann (vgl. Abb. 17).

Für die Durchführung der sub-G1-peak-Methode wurden 2x10⁵ bleomycinbehandelte Zellen in Eppendorfgefäße überführt und abzentrifugiert. Der Überstand wurde abgesaugt und 200 µl eines hypotonen Propidiumiodid-Puffers (Nicoletti-Puffer) ohne zu resuspendieren zugegeben. Die Inkubation der Zellen im hypotonen Puffer führte zum Platzen der Zellmembranen. Nach einstündiger Inkubation bei 4°C im Dunkeln konnten die Proben am Durchflusszytometer gemessen werden (s. u.).

Bei der Einstellung des FACS-Gerätes (vgl. Abschnitt 3.11) wurden die Kanäle Forward Scatter (Vorwärtsstreulicht, FSC) und Sideward Scatter (Seitwärtsstreulicht, SSC) im linearen Modus, der FL-3 Kanal für die Messung der Propidiumiodid-Fluoreszenz im logarithmischen Modus gemessen. Da bei dieser Methode nur die Fluoreszenz der Zellkerne gemessen wird, musste vor der Messung ein Gate gesetzt werden, um den durch die Lyse entstandenen Zellschutt von der Messung auszuschließen.

Die Auswertung der Messungen erfolgte an einem MacOS 9.2-Computer (Apple Computer Inc., München) mit dem Programm CellQuest Pro (BD Biosciences). Der Prozentsatz apoptotischer Zellen wurde durch Setzen des Markers M1 über den hypodiploiden DNA-peak bestimmt (vgl. Abb. 17).

Apoptosenachweis mittels Annexin-V-Färbung

Die Annexin-V-Färbung ist eine etablierte und vielfach dokumentierte Methode zum Apoptosenachweis, die erstmals 1995 von Vermes et al. beschrieben wurde [Vermes, et al., 1995]. Sie beruht auf charakteristischen Veränderungen der Plasmamembran im Verlauf des Apoptoseprozesses.

Während der Apoptose verliert die Plasmamembran ihre asymmetrische Struktur. Phosphatidylserine, die normalerweise nur auf der Membraninnenseite vorkommen, translozieren auf die Außenseite der Membran. Dies geschieht schon in einer sehr frühen Phase der Apoptose [van Engeland, et al., 1998]. Das 35kDa-Protein Annexin-V besitzt eine hohe Affinität zu Phosphatidylserinen (PS) und bindet kalziumabhängig an PS-exponierende Zellen. Durch Fluoreszenzmarkierung des Annexins mit FITC (Fluoresceinisothiocyanat, grüne Fluoreszenz) wird es nun möglich, apoptotische Zellen mittels Durchflusszytometrie zu erfassen und von nicht-fluoreszierenden, vitalen Zellen abzugrenzen (s. u.).

Die Translokation der Posphatidylserine auf die Membranaußenseite tritt allerdings nicht ausschließlich während der Apoptose auf, sondern auch bei der Nekrose. Im Unterschied zur apoptotischen verlieren nekrotische Zellen jedoch die Integrität der Zellmembran. Färbt man die Zellen nun zusätzlich mit Propidiumiodid (PI, 350 nm), einem DNA-Farbstoff, gelangt dieser nur in durchlässige, nekrotische, nicht aber in apoptotische Zellen. Das Durchflusszytometer ist so in der Lage, apoptotische (FITC+/PI-) von lebenden (FITC-/PI-) und nekrotischen (FITC+/PI+) Zellen zu trennen (vgl. Abb. 19).

Die für die Apoptosemessungen vorgesehenen Zellen wurden, je nach Versuchsaufbau, 1-5 Tage nach der Bleomycinbehandlung geerntet und in 14 ml Zentrifugenröhrchen überführt. Zur Bestimmung der spontanen Apoptoserate (Hintergrundapoptose) der Zelllinien wurden unbehandelte Zellen bei jedem Versuch mitgeführt (vgl. Abschnitt 3.7). Zunächst wurde der Überstand 10 min bei 1000 rpm abzentrifugiert, abgesaugt und die Zellen in 7 ml PBS resuspendiert. Dieser Waschvorgang wurde zwei Mal wiederholt. Für die Färbung wurden die Zellen in 100 µl 1x Bindungspuffer (im Annexin-Kit 10x konzentriert enthalten) aufgenommen und in 5 ml FACS-Röhrchen überführt. Anschließend wurden die Zellen mit 4 µl Annexin-V/FITC und 8 µl Propidiumiodid (50 µg/ml)gefärbt und 30-60 min bei 4°C im Dunkeln inkubiert. Nach Zugabe von 250 µl Bindungspuffer konnten die Proben am Durchflusszytometer gemessen werden. 10 000 Zellen wurden analysiert und ihre Fluoreszenz im Dot-Plot-Diagramm dargestellt. Ein Beispiel findet sich in Abb. 19. Die X-Achse erfasst die Fluoreszenz von FITC-markiertem Annexin-V im FL-1-Kanal, die Y-Achse die PI-Fluoreszenz im FL-3-Kanal.

Die Auswertung der Messungen erfolgte ebenfalls mit dem Programm CellQuest Pro (BD Biosciences). Der Dot-Plot wurde in vier Quadranten unterteilt und den einzelnen Zellfraktionen (vitale, apoptotische und spätapoptotische/nekrotische Zellen) zugeteilt.

Grundlagen der Durchflusszytometrie

Die Durchflusszytometrie ist eine schnelle und effiziente Methode zur Analyse von Einzelzellen in Suspension auf der Grundlage von Streulicht und Fluoreszenz-eigenschaften. Sie erlaubt für mehrere Tausend Einzelzellen innerhalb weniger Sekunden die gleichzeitige Messung der relativen Zellgröße, der Granularität sowie bis zu drei verschiedener Fluoreszenzfarben.

Aufbau und Funktionsweise des Durchflusszytometers

Voraussetzung für die durchflusszytometrische Messung ist das Vorliegen der Zellen in Einzelzellsuspension. Die Probenflüssigkeit wird unter Druck durch eine Kapillare gepreßt. Dabei wird sie durch eine Mantelflüssigkeit beschleunigt, die unter etwas geringerem Druck steht. Dies führt zu einer laminären Strömung, in der die Zellen nach dem Prinzip der hydrodynamischen Fokussierung einzeln nacheinander einen Messpunkt passieren. Auf den Messpunkt ist ein Laserstrahl (Argonlaser, 488 nm) fokussiert. Entsprechend der physikalischen Eigenschaften der Zellen kommt es zur charakteristischen Streuung und Absorption des Lichts. Das absorbierte Vorwärtsstreulicht spiegelt hierbei die Zellgröße, das nach 90° seitwärts gestreute Licht die Granularität ungefärbter Zellen wider. Hierdurch lassen sich z. B. lebende Zellen (groß, weniger granulär) von toten (klein, granulär) trennen. Fluoreszenzen werden, wie das Seitwärtsstreulicht, in 90°-Richtung aufgenommen. Bei fluoreszierenden Zellen absorbieren die Fluorochrome (Fluoreszein, Propidiumiodid) zunächst Licht einer Wellenlänge von 488 nm, welches sie dann langwelliger wieder emittieren. Mit Hilfe eines Filtersystems können die Fluoreszenzfarben unterschieden werden (grün, rot, orange). Das gestreute und emittierte Licht wird durch Photodetektoren aufgenommen, und die digitalisierten Signale durch einen Computer weiterverarbeitet und quantitativ ausgewertet.

Für die Auswertung werden die unterschiedlichen Amplituden der Lichtsignale Kanälen zugeordnet. Alle gemessenen Amplituden beschreiben die jeweilige Zelle. In Histogrammen und Dot-Plots können die Messwerte dargestellt und ausgewertet werden (vgl. Abb. 17 und Abb. 19).

Probenmessung und Datenauswertung

Bei den im Rahmen dieser Arbeit durchgeführten Experimenten erfolgten die Messungen mit einem Durchflusszytometer vom Typ FACS Scan der Firma Becton Dickinson. Zwischenzeitlich musste aufgrund eines Laserdefekts auf ein Gerät vom Typ FACS Calibur der Firma Becton Dickinson ausgewichen werden, wobei alle gespeicherten Einstellungen übernommen werden konnten. Die Geräte wurden in regelmäßigen Abständen durch die Firma Becton Dickinson mit Hilfe fluoreszenzmarkierter Mikropartikel (Mikrobeads) gewartet. Vorwärts- und Seitwärtsstreulicht wurden linear, die Fluoreszenzen logarithmisch erfasst.

Die gemessenen Fluoreszenzsignale werden nicht nur in dem für ihre Erfassung vorgesehenen Kanal registriert, sondern strahlen auch in andere Kanäle aus, was zu Messfehlern führen kann. Deshalb wird ein Anteil des Fluoreszenzsignals in den Kanälen proportional zur Fluoreszenzintensität im eigentlich vorgesehenen Kanal subtrahiert. Dieser Vorgang (Kompensation) wurde bei der Wartung des Geräts regelmäßig mit einfach gefärbten Zellen oder Mikrobeads durchgeführt.

Pro Probe wurden 10 000 Zellen bei einer Messrate von ca. 1000-2000 Zellen/sec. gemessen (je nach Zelldichte). Die Fluorochrome wurden mit einem Argonlaser bei 488 nm angeregt. Die FITC-Fluoreszenz (grün, Emissionsspektrum 515-545 nm) wurde im Kanal 1 (FL1) registriert. Propidiumiodid (rot, Emissionsspektrum 575-620 nm) wurde in Kanal 3 (FL3) gemessen.

Vor Beginn der Messungen am Zytometer mussten die einzelnen Kanalverstärkungen für jede Zelllinie spezifisch eingestellt werden. Hierbei war es wichtig, die Zellen sowohl im FSC/SSC als auch im Fluoreszenzhistogramm gut sichtbar darzustellen. Dies konnte durch die Regelung der einzelnen Kanalverstärkungen, der Kompensation und evtl. durch das Einbringen einer Messschwelle (Threshold) erreicht werden. Die so eingestellten Werte wurden als zelllinienspezifische, so genannte ‘Instrument Settings’ abgespeichert und konnten jederzeit abgerufen werden.

Die Auswertung der Messdaten (setzen der Marker etc.) erfolgte mit dem Programm CellQuest Pro (BD Biosciences). Die weitere Verarbeitung der Daten erfolgte mit dem Programm Microsoft Excel (Microsoft Corp.). Zur graphischen Darstellung wurde das Programm Sigma Plot (SPSS Science) verwendet.

Der Ablauf der Messungen und die Auswertung der Daten wurden bei jeder Messung, einem Standardprotokoll folgend, beibehalten.

Statistik

Statistische Analysen wurden mittels Sigma Plot V. 8.0 der Firma SPSS Science durchgeführt. Zur Prüfung auf signifikante Unterschiede zwischen den untersuchten Zelllinien wurde der zweiseitige Student-t-Test für unabhängige Stichproben verwendet. Als Signifikanzniveau wurde p<0,01 angenommen. Die dargestellten Graphen zeigen den Mittelwert ± Standardabweichung aus Doppel- oder Tripelwerten der Messwerte einer Zelllinie.