Diskussion

In-vitro Untersuchungen an Patientenzellen

Aus NBS-Patienten gewonnene primäre Lymphozyten und Fibroblasten lassen sich aufgrund ihres langsamen Wachstums erfahrungsgemäß schlecht kultivieren [Ranganathan, et al., 2001]. Deshalb werden Untersuchungen zum NBS wie auch zur AT oft mit viral transformierten Zelllinien durchgeführt. Viele der bisher publizierten Ergebnisse zum zellulären Phänotyp beider Syndrome basieren auf Experimenten mit Epstein-Barr-Virus (EBV)-transformierten lymphoblastoiden Patientenzellen [Bebb, et al., 2001; Gatei, et al., 2000; Meijer, et al., 1999; Shi, et al., 2001]. Häufig findet sich in der Literatur auch die Verwendung von Simian-Virus (SV)40-transformierten Fibroblasten [Duchaud, et al., 1996; Meyn, et al., 1994]. Vorteile transformierter Zellen sind das stabile Wachstum und die unbegrenzte Verfügbarkeit. Auch in dieser Arbeit wurden EBV-transformierte B-Lymphozyten verwendet.

Kritisch zu betrachten sind jedoch Störfaktoren, die sich aus der viralen Transformation der Zellen ergeben. So führt die SV40-Transformation bei Fibroblasten zu einer Aneuploidie [Ramel, et al., 1995]. EBV-transformierte Zellen behalten dagegen ihren diploiden Chromosomensatz, wodurch der Zellstoffwechsel insgesamt weniger beeinträchtigt wird [Tahara, et al., 1997].

Auch die Expression bestimmter Gene kann durch das Einbringen viralen Genoms beeinflusst werden. Dabei kann auch die Apoptoseregulation betroffen sein. Eine gesteigerte Expression von anti-apoptotischem bcl-2in EBV-transformierten Zellen kann so z. B. die Apoptoseinduktion stören [Bebb, et al., 2001; Kawanishi, 1997]. Treten jedoch in Experimenten zur Apoptose Unterschiede zwischen Kontroll- und Patientenzellen mit gleichem Transformationsstatus auf, können diese nicht unmittelbar auf den Transformationsprozess zurückgeführt werden, so dass hier ein Klärungsbedarf besteht.

Weiterhin kann ein Zellmodell zwar Parallelen zur klinischen Situation der Patienten aufzeigen, allerdings nur in begrenztem Umfang. Das komplexe Zusammenspiel einzelner Systeme im Gesamtorganismus wird nicht erfasst. Dies gilt zwar auch für die vorliegende Arbeit, der Vorteil des hier verwendeten Zellmodells liegt jedoch darin, dass es sich bei dem verwendeten Zelltyp – aus NBS-Patienten isolierten B-Lymphozyten – um unmittelbar am Krankheitsbild beteiligte Zellen handelt: Immundefizienz und B-Zell-Lymphome sind Hauptsymptome des NBS.

Insgesamt muss die Verwendung viral transformierter Zelllinien aufgrund der möglichen Beeinflussung des Zellstoffwechsels sowie des selektiven Untersuchungsmaterials kritisch betrachtet werden. Rückschlüsse vom zellulären auf den klinischen NBS-Phänotyp sollten daher zurückhaltend erfolgen. Auf eine mögliche Beeinflussung von EBV auf die in dieser Arbeit untersuchten zellulären Charakteristika wird in den jeweiligen Abschnitten der Ergebnisdiskussion im Einzelnen eingegangen.

Wachstum von NBS-Zellen

In den Wachstumsversuchen zeigten die NBS-Linien unterschiedliche Wachstums-eigenschaften: Drei NBS-Linien wuchsen schneller, eine etwa gleich schnell und eine weitere Linie langsamer als die Kontrollzelllinien (vgl. Abb. 11). Andere Autoren fanden für NBS-Zellen meist ein im Vergleich zu Kontrollzellen reduziertes Wachstum [Girard, et al., 2000; Kang, et al., 2002; Tauchi, et al., 2002], wobei auch variable Wachstumsraten beobachtet wurden [Ranganathan, et al., 2001; Siwicki, et al., 2003]. Zwei zelluläre Mechanismen spielen bei Untersuchungen zum Zellwachstum eine besondere Rolle: die Zellzykluskontrolle und die Telomerlänge.

Störungen der Zellzykluskontrolle in NBS-Zellen sind seit einiger Zeit bekannt [Demuth, et al., 2004; Kang, et al., 2002; Sullivan, et al., 1997]. Im Zusammenhang mit langsamem Zellwachstum sind hier die Ergebnisse von Kang et al. interessant, die bei der Untersuchung des G1/S-Checkpoints in NBS-Mausfibroblasten eine erhöhte basale p21-Expression der Zellen fanden [Kang, et al., 2002]. p21 wird durch p53 aktiviert und spielt eine wichtige Rolle im G1-Phasenarrest [el-Deiry, et al., 1993]. Ein verzögerter Übertritt von Zellen von einer Phase des Zellzyklus in die nächste verlangsamt die Zellproliferation. Entsprechend wuchsen die von Kang et al. untersuchten NBS-Mausfibroblasten 2-5mal langsamer als Kontrollzellen. Dies könnte auch eine Erklärung für die reduzierte Proliferationsrate bei einer der hier untersuchten Zelllinien darstellen.

Bezüglich des Wachstumsverhaltens von NBS-Zellen stellt sich jedoch die Frage nach der in dieser Arbeit beobachteten großen Variabilität der Wachstumsgeschwindigkeiten der einzelnen Zelllinien.

Zum einen können Störungen in der Zellzykluskontrolle sowohl zu verminderten als auch zu gesteigerten Teilungsraten führen. Wiederholt wurden, konträr zu Kang et al., verminderte p53- und p21-Level in NBS-Zellen beschrieben [Antoccia, et al., 1999; Jongmans, et al., 1997; Matsuura, et al., 1998]. Sowohl p53 als auch p21 sind wichtige Initiatoren des G1/S-Checkpoints. Bezüglich des G2-Arrests wurde in NBS-Zellen eine verminderte Phosphorylierung von Chk2, einem Schlüsselenzym im G2/M-Checkpoint, beobachtet [Buscemi, et al., 2001].

Zum anderen spielt neben der Zellzykluskontrolle auch die Telomerlänge eine wichtige Rolle bei der Zellteilung. Telomere bilden die Enden der Chromosomen. Sie bestehen aus sich vielfach wiederholenden Nukleotidsequenzen (Repeats) und dienen dem Schutz der Chromosomenenden. Bei jeder Zellteilung werden Teile der Telomere 'verbraucht', die wieder ersetzt werden müssen. Dafür sorgt ein besonderes Enzym, die Telomerase, die durch reverse Transkription die DNA-Repeats immer wieder ersetzt. Ohne Telomeraseaktivität ist die Teilungsfähigkeit von Zellen begrenzt [Allsopp, et al., 1992].

Neuere Studien sprechen für eine Beteiligung von Nibrin am Telomerstoffwechsel. Zusammen mit Mre11 und Rad50 konnte es in Telomeren humaner Wildtyp-Fibroblasten nachgewiesen werden [Lombard und Guarente, 2000]. Ranganathan et al. fanden verkürzte Telomere in primären NBS-Fibroblasten und brachten dies in Zusammenhang mit der schlechten Teilungsfähigkeit der Zellen. Wiedereinbringen des intakten Nbs1-Gens führte dabei zu einer Verlängerung der Telomere und zu einer Normalisierung des Zellwachstums [Ranganathan, et al., 2001].

Demgegenüber konnten Siwicki et al. keinen Telomerstoffwechsel-Defekt in NBS-Zellen nachweisen: Die untersuchten NBS-T-Lymphozyten zeigten ein kontinuierliches Wachstum, stabile Telomere und normale Telomeraseaktivität. Hieraus schlussfolgerten sie, dass vollständiges, intaktes Nibrin zur Erhaltung der Telomere in den Lymphozyten nicht notwendig sei [Siwicki, et al., 2003]. Die Expression des von Maser et al. beschriebenen 70kDa-Proteinfragmentes [Maser, et al., 2001], das sie in den untersuchten Zellen mittels Immunpräzipitation nachweisen konnten, reiche dabei aus, zusammen mit dem Mre11/Rad50-Komplex die Telomerstabilität zu gewährleisten. Dass das 70kDa-Fragment tatsächlich ausreicht, einige der vitalen Funktionen von Nibrin aufrecht zu erhalten, konnte erst vor kurzem erwiesen werden [Demuth, et al., 2004]. Eine mengenmäßig unterschiedlich starke Expression dieses Fragments könnte somit eine Erklärung für die hier gefundene Variabilität im Wachstumsverhalten darstellen.

Auch das von Kang und Ranganathan et al. gefundene langsame Zellwachstum [Kang, et al., 2002; Ranganathan, et al., 2001] ließe sich mit diesem Modell erklären – ihre Ergebnisse beruhen auf Experimenten mit Fibroblasten: In diesem Zelltyp konnte das 70kDa-Fragment bis heute nicht nachgewiesen werden.

Des Weiteren kommt für die Variabilität im Wachstumsverhalten die unterschiedliche genetische Ausstattung der Zellen mit einem verwobenen Netz verschiedener Genwirkungen in Frage. Zellzyklusanalysen, Untersuchungen zur Telomerstabilität, zur p53-Induktion sowie zur Expression der Proteinfragmente sind hier notwendig, um die Wachstumseigenschaften von NBS-Zellen besser zu verstehen.

Nicht zuletzt spielen Umweltfaktoren wie Kulturbedingungen und Nährstoffversorgung bei Untersuchungen zum Zellwachstum eine bedeutende Rolle. Ebenso beeinflusst der verwendete Zelltyp die Wachstumseigenschaften. Vor diesem Hintergrund bleibt zu berücksichtigen, dass in keiner der oben zitierten Arbeiten EBV-transformierte B-Lymphozyten verwendet wurden. Somit ist ein direkter Vergeich der Ergebnisse anderer Autoren mit den hier ermittelten Wachstumsraten kritisch einzuschätzen.

Wachstumsinhibition von NBS-Zellen

Ein Hauptmerkmal von NBS-Patienten ist die ausgeprägte Strahlenempfindlichkeit. Wie bereits erwähnt, kann die therapeutische Anwendung ionisierender Strahlung für die Patienten lebensbedrohlich sein (vgl. Abschnitt 1.3.1) [Distel, et al., 2003]. Auch aus NBS-Patienten isolierte primäre und transformierte Zellen zeigen, verglichen mit Kontrollzellen, eine erhöhte Sterblichkeit nach Bestrahlung [van der Burgt, et al., 1996]. Ionisierende Strahlen wirken über die Induktion von DNA-Doppelstrangbrüchen (DSB), und die zelluläre Hypersensitivität erstreckt sich auch auf DSB-produzierende Mutagene wie Bleomycin, Camptothecin, Mitomycin C, Etoposid oder Streptonigrin [Kraakman-van der Zwet, et al., 1999; Meyn, et al., 1994; Nakanishi, et al., 2002; Nove, et al., 1986]. Auf zytogenetischer Ebene steigt nach Bestrahlung die Frequenz von Chromosomen-aberrationen in kultivierten NBS-Zellen im Vergleich zu normalen Zellen dramatisch [Antoccia, et al., 1997; Antoccia, et al., 1999; Taalman, et al., 1983].

Ursache der gesteigerten Strahlenempfindlichkeit auf klinischer, zellulärer und zytogenetischer Ebene ist vermutlich eine gestörte Reaktion auf DNA-Doppelstrangbrüche, an deren Erkennung und Reparatur Nibrin beteiligt ist [Kracker, et al., 2005; Tauchi, et al., 2002].

In der vorliegenden Arbeit wurde die Sensitivität von NBS-Zellen gegenüber den unterschiedlich wirkenden Zytostatika Bleomycin, Cyclophosphamid und Methotrexat getestet. Dabei wurden die Zellen mit ansteigenden Konzentrationen des entsprechenden Zytostatikums inkubiert. Nach fünf Tagen wurden die vitalen Zellen mit Hilfe eines automatischen Zählgerätes ausgezählt (vgl. Abschnitt 3.2).

Alle drei Stoffe vermochten in vitro ein Absterben der Zellen zu induzieren (vgl. Abschnitt 4.3). Auf Bleomycin reagierten NBS-Zellen verglichen mit gesunden Kontrollzellen in den Experimenten tendenziell empfindlicher, wobei ein signifikanter Unterschied nur bei einer Konzentration von 0,5 µg/ml nachweisbar war (vgl. Abb. 12). Die erhöhte Sensitivität der Zellen könnte auf den Wirkmechanismus des Bleomycins zurückzuführen sein. Als Radiomimetikum gleicht sein Schadensspektrum dem ionisierender Strahlung, auf die NBS-Zellen besonders empfindlich reagieren [van der Burgt, et al., 1996]. An der DNA induziert Bleomycin Doppelstrangbrüche, deren Erkennung und Reparatur bei NBS-Patienten gestört ist [Kracker, et al., 2005; Tauchi, et al., 2002].

Eine Erklärung für den in den hier durchgeführten Versuchen aufgetretenen verhältnismäßig geringen Unterschied in der Sensitivität zwischen NBS- und Kontrollzellen könnte in der hier verwendeten Methode liegen. Das automatische Zählgerät erfasst nur Zellen ab einer bestimmten, vorher festgelegten Größe. Diese Zellen werden als lebende Zellen gewertet. Allerdings ist die Größe ein relativ unspezifischer Parameter zur Beurteilung der Vitalität der Zelle. Zudem kann infolgedessen der Anteil toter Zellen nur indirekt geschätzt werden, was ein weiterer Nachteil der Methode ist.

Die Inkubation mit Methotrexat und Cyclophosphamid zeigte, im Gegensatz zur Inkubation mit Bleomycin, keinen Unterschied im Überleben von NBS- verglichen mit Kontrollzellen (vgl. Abschnitt 4.3). Dies könnte auf die Wirkmechanismen beider Stoffe zurückzuführen sein, die nicht auf der Induktion von DNA-Doppelstrangbrüchen beruhen. Cyclophosphamid gehört zur Gruppe der bifunktionellen Alkylanzien, die ihre Wirkung über eine Vernetzung von DNA-Strängen entfalten. Nove et al. testeten die Sensitivität von NBS-Zellen gegenüber dem alkylierend wirkenden Agens MNNG(N-methyl-N'nitro-N-nitrosoguanidin) und fanden ebenfalls keinen Unterschied in der Empfindlichkeit [Nove, et al., 1986]. Allerdings handelt es sich bei MNNG um ein monofunktionelles Alkylanz, das nur einen DNA-Strang beschädigt. Die Wirkung von MNNG unterscheidet sich daher von der des Cyclophosphamids. Auch bei Methotrexat zeigte sich in den durchgeführten Versuchen kein Unterschied in der Empfindlichkeit. Als Folsäureantagonist wirkt es über die Hemmung der Dihydrofolatreduktase. Daraus resultiert eine gestörte DNA- und RNA-Synthese mit nachfolgendem Funktionsverlust und Zelltod.

Insgesamt zeigte sich eine erhöhte Empfindlichkeit von NBS-Zellen gegenüber dem Radiomimetikum Bleomycin. Diese Empfindlichkeit war bei Cyclophosphamid und Methotrexat, deren Wirkmechanismen nicht auf der Induktion von DNA-Doppelstrangbrüchen beruhen, nicht nachweisbar.

Apoptoseinduktion in NBS-Zellen

Nachweisverfahren

In den letzten Jahren konnten, ermöglicht durch die charakteristischen Änderungen der Zellmorphologie während des Apoptoseprozesses, immer neue Verfahren zum Apoptosenachweis entwickelt werden.

Neben der konventionellen Mikroskopie und der DNA-Gelelektrophorese haben sich durchflusszytometrische Methoden mehr und mehr durchgesetzt, da sie schnell durchführbar, objektiv und sensitiv sind. In der Literatur finden sich am häufigsten der Apoptosenachweis nach Nicoletti, die Annexin-V-Färbung sowie der TUNEL-Test. In dieser Arbeit wurden die Nicoletti-Methode und die Annexin-V-Färbung angewandt. Die ebenfalls verwendete TUNEL-Methode konnte keine auswertbaren Ergebnisse liefern (vgl. Abschnitt 3.10). Jede der Methoden hat Vor- und Nachteile, die hier kurz aufgezeigt werden sollen.

Die sub-G1-peak-Methode nach Nicoletti ist schnell und einfach durchführbar [Nicoletti, et al., 1991]. Sie beruht auf dem, verglichen mit vitalen Zellkernen, geringeren DNA-Gehalt apoptotischer Zellkerne. Der geringere DNA-Gehalt führt zu einer verminderten Anfärbung apoptotischer Zellen mit Propidiumiodid (PI), was durchflusszytometrisch nachgewiesen werden kann. Da der durch die Fragmentierung der DNA verursachte DNA-Verlust ein im Laufe des Apoptoseprozesses relativ spät auftretendes Ereignis ist, werden frühe Apoptosephasen nicht erfasst. Hiernach müssten mit dieser Methode ermittelte Apoptoseraten geringer sein als bei der Annexinfärbung, da diese auch frühe Apoptosephasen erfasst. Stattdessen fand sich aber bei gleichen Bleomycinkonzentrationen im Nicoletti-Assay eine im Durchschnitt doppelt so hohe Apoptoserate verglichen mit der Annexin-V-Färbung (vgl. Abb. 18, Abb. 20).Die Ursache hierfür liegt in der geringeren Spezifität der Nicoletti-Methode für den Apoptosenachweis. Der hypodiploide sub-G1-peak kann neben apoptotischen Zellkernen auch andere Strukturen wie Mikronuklei und Zellschutt beinhalten, die durch die künstlich induzierte Lyse der Zellmembran frei werden. Diesen Effekt beobachtet man insbesondere bei der Analyse unfixierter, durch Detergenzien lysierter Zellen, wie sie auch in diesem Projekt verwendet wurden. Zudem führt die Verwendung einer logarithmischen Skala zu einer Identifikation kleinster Objekte mit bis zu 0,1% der Fluoreszenz gesunder Zellen. Insgesamt führen die genannten Effekte zu einer Überschätzung der Apoptoserate [Darzynkiewicz, et al., 1997]. Auch Vermes et al., die beide Methoden miteinander verglichen, fanden mit dem Nicoletti-Assay höhere Raten und führten dies auf den Anteil mit erfasster, nicht-apoptosespezifischer Strukturen zurück [Vermes, et al., 1995].

Spezifischer ist der Apoptosenachweis durch Annexin-V-Färbung, erstmals beschrieben von Vermes et al. [Vermes, et al., 1995]. Phosphatidylserine translozieren zu einem frühen Zeitpunkt im Apoptoseprozess auf die Membranaußenseite und lassen sich durch Annexin-V markieren [van Engeland, et al., 1998]. Durch FITC-Markierung des Annexins fluoreszieren Annexin-positive Zellen und können mittels Durchflusszytometrie identifiziert werden. Dadurch werden schon frühe Apoptosestadien erfasst. Die Gegenfärbung mit Propidiumiodid dient bei dieser Methode – im Gegensatz zur sub-G1-peak-Methode – lediglich dem Zweck, frühe von späten Apoptosephasen zu unterscheiden, da die Zellen erst PI einlagern, wenn die Zellmembran im Zuge des Absterbeprozesses löchrig geworden ist. Bei der sub-G₁-peak-Methode wird die Membran dagegen absichtlich in allen Zellen lysiert. Problematisch ist bei der Annexin-Methode allerdings die Abgrenzung spätapoptotischer von nekrotischen Zellen, da beide Prozesse mit einem Verlust der Zellmembranintegrität einhergehen können [Lizard, et al., 1995]. Um keine durch Apoptose zugrunde gegangenen Zellen zu versäumen, wurden bei der Versuchsauswertung PI-positive Zellen (PI+/Ax+) mit berücksichtigt. Dies beinhaltete andererseits die Gefahr zu hoch gemessener Apoptoseraten.

Aufgrund der beschriebenen Fehlermöglichkeiten der verschiedenen Nachweis-methoden ist es ratsam, mehrere Methoden miteinander zu kombinieren, die auf unterschiedlichen Apoptosecharakteristika beruhen. Vergleicht man in unseren Experimenten die mit beiden Methoden ermittelten Apoptoseraten, so sind die absoluten Apoptoseraten bei der sub-G₁-peak-Methode wie bereits erwähnt deutlich höher als bei der Annexin-V-Färbung. Betrachtet man jedoch das relative Verhältnis der einzelnen Zelllinien zueinander erkennt man, dass dieses sich in beiden Versuchen relativ konstant widerspiegelt (vgl. Abb. 18, Abb. 20).

Apoptosefähigkeit von NBS-Zellen

Hauptteil dieser Arbeit war die Charakterisierung von NBS-Zellen hinsichtlich der Apoptosefähigkeit. Untersucht wurde die Apoptoseinduktion in lymphoblastoiden Zellen von sieben NBS-, zwei AT- und zwei Kontrollzelllinien nach Inkubation mit dem Radiomimetikum Bleomycin mit zwei unterschiedlichen Nachweismethoden. Zunächst werden die Ergebnisse der NBS-Zellen erörtert, die Diskussion der AT-Zell-Apoptose findet sich im Anschluss im Abschnitt 5.4.2.3.

Bei der Messung des relativen DNA-Gehalts mit der sub-G₁-peak-Methode zeigten drei der sieben NBS-Zelllinien bei beiden Bleomycinkonzentrationen durchgehend signifikant niedrigere Apoptoseraten als die Kontrollzellen (vgl. Abschnitt 4.4.2). Dieselben NBS-Zelllinien und zusätzlich eine weitere NBS-Linie wiesen auch im Annexin-V-Assay signifikant weniger Apoptose auf (vgl. Abschnitt 4.4.3). Die übrigen Zelllinien, darunter auch die AT-Zellen, zeigten keinen signifikanten Unterschied zu den Apoptoseindices der Kontrollzelllinien.

Die Frage der Apoptoseinduktion in NBS-Zellen wird in der Literatur kontrovers diskutiert. Die in den hier durchgeführten Experimenten aufgetretenen Variationen in der Höhe der Apoptoseindices mit einer Tendenz zur gestörten Apoptoseinduktion bei NBS-Zellen entsprechen den Ergebnissen aktueller Veröffentlichungen zu diesem Thema [Crompton, et al., 2001; Rogoff, et al., 2004]. Zwei Publikationen befassen sich mit virusinduzierter Apoptose in humanen NBS-Fibroblasten. Dabei waren die untersuchten NBS- und AT-Linien unfähig, die Apoptose zu induzieren [Powers, et al., 2004; Rogoff, et al., 2004]. Zwar fanden sich keine Publikationen, die ausschließlich über die Apoptoseinduktion in NBS-B-Lymphozyten berichten, einige Autoren bezogen jedoch NBS-Lymphozyten in Untersuchungen zur AT mit ein. So fanden Crompton et al. analog zu den vorliegenden Ergebnissen eine reduzierte Apoptoserate primärer NBS-Lymphozyten nach Bestrahlung [Crompton, et al., 2001]. Allerdings wurde nur eine Zelllinie untersucht. Meyn et al. fanden dagegen eine gesteigerte Streptonigrin-induzierte Apoptoserate in EBV-transformierten NBS-Zellen, wobei auch hier nur eine Zelllinie untersucht wurde [Meyn, et al., 1994].

Zusammenfassend lassen die zu diesem Thema veröffentlichen Arbeiten in Zusammenhang mit den hier vorgestellten Ergebnissen einer reduzierten Apoptoserate bei vier von sieben NBS-Zelllinien eine Bedeutung von Nbs1 als Gatekeeper bei der Regulation und Induktion der Apoptose vermuten. Auf molekularer Ebene können Störungen der Apoptoseinduktion an der Krebsentstehung beteiligt sein [Igney und Krammer, 2002]. Möglicherweise könnte so ein Zusammenhang zum stark erhöhten Krebsrisiko des NBS hergestellt werden, einem der Hauptmerkmale des NBS-Phänotyps [Seemanova, et al., 1985]. Es stellt sich die Frage, welcher Mechanismus Nbs1 mit der Apoptoseinduktion verknüpfen könnte.

p53 und Apoptose

Die Funktion des Bindeglieds zwischen Nbs1 und Apoptose könnte dem Tumorsuppressorgen p53 zukommen. Es spielt eine wichtige Rolle bei der Erhaltung der genomischen Stabilität und insbesondere bei der Apoptoseinduktion [Vousden und Lu, 2002]. Nach einer DNA-Schädigung induziert p53 über einen G1/S-Phasenarrest eine Wachstumsverzögerung, um die DNA-Reparatur zu ermöglichen [el-Deiry, et al., 1993]. Eine mögliche Störung dieses Mechanismus in NBS-Zellen mit ihren potentiellen Auswirkungen auf das Zellwachstum wurde in Abschnitt 5.2 besprochen.

Ist die DNA-Schädigung jedoch irreparabel, kann p53 die Apoptose einleiten. Es besitzt somit eine klassische Gatekeeper-Funktion (vgl. Abb. 21).

Abb. 21: Das Tumorsuppressorgen p53 induziert nach einer DNA-Schädigung in der Zelle entweder einen Zellzyklusarrest, um eine DNA-Reparatur zu ermöglichen, oder es leitet, wenn der Schaden irreparabel ist, die Apoptose ein [Abb. modifiziert nachHirao, et al., 2002].

Wichtig für die Aktivierung von p53 sind multiple post-translationale Modifikationen, insbesondere Phosphorylierungen [Bode und Dong, 2004]. Unter physiologischen Bedingungen wird p53 im Falle einer DNA-Schädigung mehrfach phosphoryliert und somit stabilisiert und aktiviert [Giaccia und Kastan, 1998].Die Phosphorylierungen modulieren die DNA-Bindekapazität von p53 und schützen es vor dem Abbau durch Proteasen. Aktiviertes p53 wirkt als Transkriptionsfaktor verschiedener Zielgene (u. a. p21, Mdm2, GADD45), die die breite p53-Antwort vermitteln [Zhao, et al., 2000].

Durch Aktivierung einer Vielzahl apoptose-induzierender Gene spielt p53 eine Schlüsselrolle in verschiedenen, teilweise Zelltyp-spezifischen Apoptose-regulationswegen [Vousden und Lu, 2002]. So induziert p53 klassische Apoptosemoleküle wie BAX, FAS, PUMA und Noxa (vgl. Abb. 22) [Owen-Schaub, et al., 1995; Vousden und Lu, 2002], die durch Permeabilisierung der Mitochondrienmembran weitere apoptotische Faktoren freisetzen. Auch durch Proteine der Zellmembran wie PERP, Fas und DR5 kann p53 die Apoptose induzieren [Attardi, et al., 2000]. Außerdem wurde die p53-vermittelte Downregulation antiapoptotischer Gene wie bcl-2 beschrieben [Zhou, et al., 2002]. Neben diesen indirekten Mechanismen gibt es Hinweise auf eine direkte Beteiligung von p53 an der Apoptoseinduktion durch direkte Translokation an die Mitochondrien [Mihara, et al., 2003].

Apaf 1: Apoptotic protease activating factor, BAX: bcl-2-associated X Protein, bcl-2: B-Cell-Lymphoma 2, MDM 2: Mouse double minute 2 homolog, Noxa: Phorbol-12-myristate-13-acetate-induced protein 1, PUMA: p53-upregulated modulator of ApoptosisAbb. 22: Nach einer DNA-Schädigung wird p53 aktiviert. Daraufhin induziert es eine Vielzahl an Genen der Apoptoseregulation. Über p21 bewirkt es zudem einen Zellzyklusarrest [Abb. modifiziert nachNorbury und Zhivotovsky, 2004].

Nbs1 und p53

Intensiver als die Apoptosefähigkeit selbst wurde die p53-Regulation nach DNA-Schädigung in NBS-Zellen untersucht. Dabei liegen zum Anstieg der p53-Gesamtmenge in NBS-Zellen nach Bestrahlung widersprüchliche Ergebnisse vor. Jongmans et al., die fünf NBS-Zelllinien untersuchten, beobachteten eine verzögerte und verminderte p53-Stabilisierung nach Bestrahlung [Jongmans, et al., 1997]. Andere Gruppen bestätigten reduzierte p53-Level in NBS-Zellen, allerdings war der Effekt nicht so ausgeprägt wie bei AT-Zellen [Antoccia, et al., 1999; Matsuura, et al., 1998; Yamazaki, et al., 1998]. Auch völlig normale p53-Level in unbehandelten [Siwicki, et al., 2003] oder bestrahlten NBS-Zellen [Lim, et al., 2000] sind beschrieben worden. Eine Zelllinie zeigte sogar eine stärkere p53-Akkumulation als die Kontrollzellen [Antoccia, et al., 1999].

Aufgrund der vielfältigen Funktionen von p53 nach DNA-Schädigung ist der p53-Gesamtgehalt in der Zelle jedoch ein relativ unspezifischer Parameter zur Beurteilung einzelner p53-Effekte wie der Apoptoseinduktion. Aufschlußreicher sind hier neuere Untersuchungen mit pospho-spezifischen Antikörpern, die zur Aufklärung des genauen Phosphorylierungsmusters am p53-Protein nach DNA-Schädigung beitragen. Besonders bedeutend für die Einleitung der Apoptose scheint dabei die Phosphorylierung der Serinreste 15 und 20 zu sein [She, et al., 2000; She, et al., 2002].

Ein wichtiger Vermittler dieser Reaktionen ist das bei AT-Patienten mutierte ATM (Ataxia teleangiectasia mutated), einer Proteinkinase der Familie der Phosphatidyl-inositol-3-Kinase ähnlichen Kinasen (PI3K). ATM spielt eine zentrale Rolle in der Signaltransduktion nach einer DNA-Schädigung, indem es zahlreiche – vorwiegend an der Zellzykluskontrolle beteiligte – Proteine phosphoryliert und somit aktiviert [Iliakis, et al., 2003; Shiloh, 2003]. Erste Hinweise auf eine Beteiligung von ATM bei der p53-Aktivierung gaben Untersuchungen, die eine verzögerte und verminderte strahlungsinduzierte p53-Stabilisierung in AT-Zellen nachwiesen [Antoccia, et al., 1999; Khanna und Lavin, 1993; Lu und Lane, 1993]. Den biochemischen Zusammenhang lieferten spätere Publikationen, die die Phosphorylierung des Serinrests 15 an p53 durch ATM zeigen konnten [Banin, et al., 1998; Canman, et al., 1998; Khanna, et al., 1998]. Neben der direkten p53-Phosphorylierung aktiviert ATM auch die Checkpoint-Kinase 2 (Chk2), welche über die Phosphorylierung an Serinrest 20 wiederum einer der stärksten Induktoren von p53 ist (vgl. Abb. 23) [Hirao, et al., 2000; Matsuoka, et al., 2000; Melchionna, et al., 2000].

Neben p53 konnte mittlerweile auch Nbs1als wichtiger Reaktionspartner von ATM identifiziert werden: Nach Bestrahlung phosphoryliert ATM Nbs1 an wenigstens vier Serinresten [Gatei, et al., 2000; Lim, et al., 2000; Wu, et al., 2000; Zhao, et al., 2000]. Zudem scheint Nbs1 die ATM-abhängige Phosphorylierung bestimmter Substrate zu erleichtern [Girard, et al., 2002]. So konnten Buscemi et al. nachweisen, dass die durch ATM vermittelte Aktivierung der Chk2 funktionsfähiges Nbs1 benötigt [Buscemi, et al., 2001]. Die Chk2 kann wiederum über Phosphorylierung von Serinrest 20 an p53 Apoptose induzieren [Hirao, et al., 2000].

Für eine Beteiligung von Nbs1 an der Signaltransduktion zur Apoptose sprechen in diesem Zusammenhang auch die Ergebnisse von Rogoff et al. Nach E2F1-Stimulation, einem starken Induktor p53-abhängiger Apoptose [Pan, et al., 1998], fanden sie in primären NBS-Fibroblasten im Vergleich zu Kontrollzellen verminderte Apoptoseraten [Rogoff, et al., 2004]. Bei normal ansteigenden p53-Gesamtmengen zeigten die NBS-Zellen eine unzureichende Phosphorylierung der Serinreste 15 und 20. Insbesondere die phospho-20-Form von p53 war in NBS-Zellen drastisch reduziert. Daraus schlossen Rogoff et al., dass E2F1 zur effektiven Apoptoseinduktion funktionsfähiges Nibrin benötigt. Auch nach HPV-16-Stimulation war die Apoptoseinduktion in NBS-Zellen gestört [Rogoff, et al., 2004]. Powers et al. konnten in ähnlichen Experimenten ebenfalls eine reduzierte virusinduzierte Apoptose in NBS-Zellen nachweisen [Powers, et al., 2004].

Aktuelle Publikationen sprechen dem Nbs1 zusätzlich eine wichtige Funktion in der Aktivierung der ATM-Kinase zu [Horejsi, et al., 2004; Lee und Paull, 2004; Uziel, et al., 2003]. In diesem Zusammenhang konnten Lee und Paull kürzlich zeigen, dass der M/R/N-Komplex direkt an ATM bindet und daraufhin die Bindung von ATM an dessen Substrate Chk2 und p53 erheblich verstärkt wird. Handelte es sich beim eingesetzten Nibrin lediglich um das 70kDa-Fragment, konnte der Komplex nur noch schwach an ATM binden und die Bindung von ATM an Chk2 kaum beeinflussen [Lee und Paull, 2004].

Nbs1 scheint demnach Funktionen sowohl 'upstream' als auch 'downstream' von ATM zu besitzen und damit eine zentrale Rolle bei der Vermittlung ATM-abhängiger Signaltransduktionen zu spielen (vgl. Abb. 24).

Abb. 24: Nbs1 spielt für eine Vielzahl ATM-vermittelter Signaltransduktionen nach DNA-Schädigung eine wichtige Rolle. Es erleichtert die ATM-abhänigige Phosphorylierung von p53 und Chk2. Außerdem scheint es eine Funktion für die Aktivierung von ATM zu haben.

Nach aktuellen Ergebnissen scheint es neben ATM zudem weitere Kinasen zu geben, die Nbs1 mit p53 verknüpfen. ATR (ATM and Rad3-related-Kinase) ist strukturell mit dem ATM verwandt [Cimprich, et al., 1996] und übernimmt ähnliche Funktionen in der Signaltransduktion nach DNA-Schädigung [Shiloh, 2001]. Wie das ATM ist es besonders wichtig für die Zellzykluskontrolle [Brown und Baltimore, 2003; Cliby, et al., 1998]. Viele ATM-typische Substrate wie Chk1, Chk2 und p53 könnnen ebenfalls durch ATR aktiviert werden [Abraham, 2001; Helt, et al., 2005; Shiloh, 2001]. Hierzu gehört u. a. die Phosphorylierung des für die Apoptoseinduktion wichtigen Serinrests 15 an p53 [Lakin, et al., 1999; Stiff, et al., 2005; Tibbetts, et al., 1999]. Auch Nbs1 wird durch ATR phosphoryliert [O'Driscoll, et al., 2003]. Stiff et al. konnten kürzlich zeigen, dass wichtige ATR-vermittelte Phosphorylierungsschritte nach UV-Bestrahlung und Störung der Replikation durch Harnstoffgabe Nbs1-abhängig sind [Stiff, et al., 2005]. Hierzu gehört auch die für die hier dargestellten Zusammenhänge wichtige Phosphorylierung von Serinrest 15 an p53, die in NBS-Zellen reduziert war. Dies könnte wiederum zu einer Störung der p53-abhängigen Apoptose führen.

Insgesamt betrachtet könnte die enge Kooperation von Nbs1 mit für die Apoptoseinduktion wichtigen Regulatoren wie ATM und ATR einen Zusammenhang zwischen Nbs1 und p53-vermittelter Apoptose herstellen. Die unzureichende Stabilisierung der p53-15- und 20-Phosphoformen wäre demnach eine mögliche Erklärung für die in den hier durchgeführten Versuchen festgestellte, signifikant verminderte Apoptoseinduktion in vier von sieben untersuchten NBS-Zelllinien.

Allerdings zeigten nicht alle untersuchten NBS-Zelllinien Störungen in der Apoptose-induktion. Drei der untersuchten Zelllinien zeigten im Annexin-V-Assay keinen signifikanten Unterschied zu den mittleren Apoptoseraten der Kontrollzellen (vgl. Abb. 20). Betrachtet man NBS-Zelllinien mit im Normalbereich liegender Apoptoseinduktion und solche mit im Vergleich zu den Kontrollzellen signifikant verminderten Apoptoseraten als zwei getrennte Populationen und berechnet den jeweiligen Mittelwert ergibt sich folgendes Bild:

Abb. 25: Einteilung der NBS-Zelllinien nach ihren Apoptoseeigenschaften in zwei Gruppen: eine Gruppe mit tendenziell erniedrigter aber noch im Normalbereich liegender (n = 3), die zweite Gruppe mit signifikant verminderter Apoptoseinduktion (n = 4) nach Bleomycinbehandlung.

Zellen der Gruppe mit im Bereich der Kontrollzellen liegender Apoptoseinduktion (blau) zeigten zwar tendenziell verminderte Apoptoseraten, der Unterschied war jedoch statistisch nicht signifikant. NBS-Zelllinien der zweiten Gruppe (rot) zeigten dagegen bei beiden Bleomycinkonzentrationen signifikant verminderte Apoptoseraten.

Nach der Erörterung möglicher Gründe für eine verminderte Apoptoseinduktion in NBS-Zellen (s. o.) bleibt damit zunächst die Frage offen, welche Ursachen es für die im Normalbereich liegenden Apoptoseraten bei drei der sieben untersuchten NBS-Zelllinien geben könnte.

Eine Erklärungsmöglichkeit hierfür wären die z. T. erheblichen Abweichungen, die einige Autoren bezüglich der p53-Induktion in NBS-Zellen untereinander fanden [Antoccia, et al., 1999; Girard, et al., 2000; Matsuura, et al., 1998; Yamazaki, et al., 1998]. Ebenso zeigen NBS-Patienten auf klinischer Ebene beträchtliche Variationen in der Ausprägung des Krankheitsbildes [The International Nijmegen-Breakage-Syndrome Study Group,The_International_Nijmegen-Breakage-Syndrome_Study_Group, 2000]. Möglicherweise reflektiert diese Variabilität verschiedene basale Expressionsmuster im großen Netzwerk pro- und antiapoptotischer Gene. Vor diesem Hintergrund ist es denkbar, dass in den drei Zelllinien mit normaler Apoptosefähigkeit andere Proteine stärker exprimiert werden, die die gestörte Nbs1-Funktion kompensieren. Betrachtet man die Abbildungen 5 und 23 unter diesem Gesichtspunkt, wird deutlich, dass es sich bei der Regulation der Apoptose um ein komplexes Netzwerk ineinandergreifender Genwirkungen handelt. So könnte eine gesteigerte Expression pro-apoptotischer Faktoren wie BAX, Noxa oder PUMA einer mangelnden p53-Aktivierung entgegenwirken. Auch von p53 gänzlich unabhängige Apoptoseregulationswege sind beschrieben worden (vgl. Abb. 5) [Li, et al., 2000; Yang, et al., 2002].

NBS-Patienten mit solchen Veränderungen im zellulären Expressionsmuster wären so in der Lage, trotz fehlender Nibrinfunktion auf eine DNA-Schädigung adäquat zu reagieren und das Apoptoseprogramm auszulösen. Demzufolge bestünde bei diesen Patienten auch ein geringeres Risiko zur Anhäufung von Mutationen und nachfolgender maligner Entartung.

Ein solcher Zusammenhang könnte sich unter Miteinbeziehung der klinischen Daten zur Krebsentstehung in Korrelation mit den hier gefundenen Apoptoseraten andeuten: Zwei von drei Patienten aus der Gruppe mit im Normalbereich liegender Apoptosefähigkeit haben bisher noch kein Malignom entwickelt. Beim Malignom der dritten Patientin handelt es sich mit einem Meningeom um einen benignen, NBS-untypischen Hirntumor. Alle vier Patienten, deren Lymphoblasten verminderte Apoptoseraten aufwiesen, haben dagegen bereits Lymphome entwickelt (vgl. Tab. 4).

Es wäre also möglich, dass es generell zwei Gruppen von NBS-Patienten gibt – Patienten mit höherem und mit niedrigerem Entartungsrisiko, wobei eine verminderte Apoptoseinduktion als Risikofaktor für Krebs angesehen werden könnte. Aufgrund der niedrigen hier untersuchten Gesamtfallzahl sollten sich jedoch in jedem Fall Studien mit größeren Patientenzahlen anschließen, um genauere Erkenntnisse über den Zusammenhang von Apoptosefähigkeit und Krebsentstehung bei NBS-Patienten zu gewinnen.

Einen weiteren Erklärungsansatz für die Variationen auf klinischer und zellulärer Ebene könnte die variable Expression eines Proteinfragments mit teilweise erhaltener Restfunktion liefern, das Maser et al. vor kurzem nachweisen konnten [Maser, et al., 2001]. Auch Girard et al. schlugen eine variable Restfunktion als Erklärung für interzelluläre Schwankungen vor; zu diesem Zeitpunkt war das Proteinfragment allerdings noch nicht entdeckt worden [Girard, et al., 2000]. Vorstellbar ist ein Zusammenhang der Restfunktion mit p53-abhängiger Apoptose. Das 70kDa-Fragment könnte, unterschiedlich stark exprimiert, indirekt z. B. über ATM, die Phosphorylierung von p53 an den Serinresten 15 und 20 erleichtern und dadurch Apoptose ermöglichen. Dass das 70kDa-Fragment tatsächlich ausreicht, um einige Nibrinfunktionen aufrecht zu erhalten, konnte kürzlich bewiesen werden [Demuth, et al., 2004].

AT und Apoptose

Das Nijmegen-Breakage-Syndrom zeigt auf klinischer und zellulärer Ebene vielfach Überschneidungen mit der Ataxia teleangiectasia (vgl.Tab. 1). Beide Syndrome gehen mit erhöhter Sensitivität gegenüber ionisierender Strahlung, Immundefizienz, radioresistenter DNA-Synthese, Zellzyklusdefekten und erhöhtem Krebsrisiko einher [Crawford, 1998; Seemanova, et al., 1985; Taalman, et al., 1983]. Ergänzend zu den sieben NBS-Zelllinien wurden aufgrund der Überschneidungen im zellulären Phänotyp zusätzlich zwei AT-Zelllinien in Bezug auf die Apoptoseinduktion nach Bleomycinbehandlung untersucht. Dabei zeigte sich mit beiden Nachweismethoden eine im Bereich der Kontrollzellen liegende Apoptoserate der AT-Lymphoblasten (vgl. Abb. 18, Abb. 20).

Die große Bedeutung von ATM in der Zellantwort auf DNA-Schädigungen sowie seine enge Kooperation mit p53 und Nbs1 (vgl Abschnitt 5.4.2.2) lässt zunächst eine mangelnde Apoptoseinduktion in AT-Zellen vermuten. Die Literatur liefert hier widersprüchliche Daten. Zwar gibt es zahlreiche Berichte, die tatsächlich eine gestörte Apoptoseregulation im Sinne einer verminderten Apoptoserate nach Bestrahlung von AT-Zellen dokumentieren [Bebb, et al., 2001; Crompton, et al., 2001; Duchaud, et al., 1996; Meijer, et al., 1999; Shigeta, et al., 1999]. Andere Arbeitsgruppen berichten dagegen von gesteigerten Apoptoseindices [Humar, et al., 1997; Meyn, et al., 1994; Shi, et al., 2001; Zhang, et al., 2001]. Auch eine normale, im Bereich gesunder Kontrollzellen liegende Apoptoseinduktion nach Bestrahlung lymphoblastoider AT-Zellen wurde beobachtet [Fernet, et al., 2003; Meijer, et al., 2001].

Welche Erklärung könnte es – trotz der engen Verknüpfung von ATM zu Proteinen der Apoptoseregulation – für die dennoch immer wieder dokumentierte normale oder gar verstärkte Apoptoseinduktion in AT-Zellen geben?

Eine Möglichkeit ist die Existenz alternativer Regulationswege in der Signaltransduktion zu p53. Andere Mitglieder der PI3K-Familie könnten den ATM-Ausfall kompensieren. Potenzieller Kandidat für diese Rolle ist das bereits erwähnte ATR(ATM and Rad3-related-Protein) (vgl. Abschnitt 5.4.2.2), dessen Funktionen sich vielfach mit denen des ATM überschneiden [Abraham, 2001; Helt, et al., 2005; O'Driscoll, et al., 2003; Shiloh, 2001]. Hierzu gehört auch die Phosphorylierung des für die Apoptoseinduktion essentiellen Serinrests 15 an p53 [Lakin, et al., 1999; Stiff, et al., 2005; Tibbetts, et al., 1999]. Auch Nbs1 wird von ATR phosphoryliert [O'Driscoll, et al., 2003]. Denkbar ist demnach, dass der Ausfall einer der beiden Kinasen durch den Ersatz der anderen kompensiert werden kann. Abraham schlägt hierzu folgendes Modell vor: Beim Fehlen von intaktem ATM (AT-Patienten) oder in normalen Zellen mit hohen Leveln bestrahlungsinduzierter DNA-Schäden könnte ATR – evtl. mit einiger Verzögerung – als 'Ersatz'-Kinase einspringen [Abraham, 2001]. Es wäre also denkbar, dass ATR Defizite der AT-Zellen zur Induktion der Apoptose ausgleichen und so eine normale Apoptoseinduktion, wie sie auch in den hier durchgeführten Experimenten zu beobachten war (vgl. Abschnitte 4.4.2 und 4.4.3), aufrechterhalten könnte. Der Ausfall von Nibrin würde also zwei Wege der Apoptoseinduktion betreffen, der Ausfall von ATM dagegen nur einen. Dies stellt eine mögliche Erklärung für die höhere Tumorinzidenz bei NBS- verglichen mit AT-Patienten dar [Seemanova, et al., 1985; Taylor, et al., 1996].

Eine weitere Ursache einer normalen Apoptoseregulation in AT-Zellen könnte wiederum die p53-unabhängige Apoptose sein, die durch Proteine wie Nur77 oder p73 vermittelt wird (vgl. Abb. 5). Ein solches Modell wurde bereits bei den Überlegungen zur normalen Apoptoseinduktion in NBS-Zellen diskutiert (vgl. Abschnitt 5.4.2.2). Auch bei der AT könnten unterschiedlich stark exprimierte Apoptoseregulations-Proteine den ATM-Verlust kompensieren.

Zur Erhärtung dieser Thesen sind, besonders im Hinblick auf die kleine Zahl von zwei untersuchten AT-Zelllinien, sicherlich weiterführende Untersuchungen notwendig. Sind jedoch in den letzten Jahren mehr und mehr Überschneidungen von NBS und AT auf molekularer Ebene gefunden worden, bleibt doch festzuhalten, dass es sich um unterschiedliche Krankheitsbilder handelt. Bei der AT fehlen Mikrozephalie, charakteristische Facies und Entwicklungsverzögerung, beim NBS hingegen die Ataxie. Möglicherweise handelt es sich also bei der Apoptosefähigkeit um ein weiteres Merkmal, in dem sich beide Syndrome voneinander unterscheiden.

Methodik bei Untersuchungen zur Apoptose

Unabhängig vom zugrunde liegenden Syndrom sollte bei der Diskussion der vorliegenden Ergebnisse weiterhin berücksichtigt werden, dass bei Untersuchungen zur Apoptose die Methodik eine wichtige Rolle spielt. Induktions- und Nachweismethode, Erfassungszeitraum und Zelltyp variieren in den Veröffentlichungen beträchtlich [z. B.Bebb, et al., 2001; Meyn, et al., 1994; Rogoff, et al., 2004; Shi, et al., 2001].

Beim Vergleich mit den hier vorliegenden Ergebnissen liegt ein Unterschied darin, dass in der Literatur vornehmlich ionisierende Strahlung, hier dagegen chemische Mutagene verwendet wurden. Allerdings gibt es Untersuchungen, in denen NBS-Zellen genauso empfindlich auf das hier verwendete Radiomimetikum Bleomycin wie auf ionisierende Strahlung reagieren [Perez-Vera, et al., 1997].

Ein weiterer wichtiger Aspekt ist das Zeitintervall zwischen Induktion der Apoptose und Messung der Apoptoseraten. Diese Zeiträume reichen in der Literatur von einigen wenigen Stunden bis zu mehreren Wochen. Shi et al. berücksichtigten das langsamere Wachstum von AT-Zellen und erfassten die Apoptose noch bis zu 30 Tage nach Bestrahlung. Dabei fanden sie im Vergleich zu Kontrollzellen gesteigerte Apoptoseraten [Shi, et al., 2001]. Außerdem kann der Zeitpunkt der Apoptose leicht verpasst werden, da der Prozess, sobald er einmal ausgelöst wurde, sehr schnell durchlaufen wird. So kann die gemessene Rate trotz ausgedehnter Apoptose gering sein [Wyllie, et al., 1980]. Um diese Fehlerquellen zu vermeiden wurden in dieser Arbeit Versuche zum genauen zeitlichen Verlauf der Apoptose nach DNA-Schädigung durchgeführt (vgl. Abschnitt 4.4.1).

Weiterhin können die verschiedenen Nachweismethoden zum Teil stark divergierende Apoptoseindices liefern (vgl. Abschnitt 5.4.1). Bebb et al. fanden z. B. mit der TUNEL-Methode zwei- bis dreifach höhere Apoptoseraten als mit der sub-G₁-peak-Methode [Bebb, et al., 2001]. Auch in den hier durchgeführten Versuchen variierten die Raten zwischen beiden Nachweismethoden zum Teil erheblich (vgl. Abschnitte 4.4.2 und 4.4.3).

Auch der verwendete Zelltyp kann Messungen der Apoptoseraten beeinflussen. In der Literatur wird die Verwendung humaner Fibroblasten und Lymphozyten, Maus- oder Hühnerzellen beschrieben, die sich in ihrer Apoptoseregulation erheblich unterscheiden können. So ist die Apoptose in Lymphozyten generell leichter zu induzieren als in Fibroblasten. Zudem ist bekannt, dass periphere Lymphozyten ohne jeglichen Stimulus eine spontane Apoptoserate von bis zu 20% besitzen können [Genzlinger, 1997]. Einige Forschungsgruppen arbeiteten mit transformierten, andere mit primären Zelllinien. Dabei muss eine mögliche Beeinflussung der Apoptose durch den Prozess der Virustransformation berücksichtigt werden (vgl. Abschnitt 5.1). So kann die EBV-Transformation zur Heraufregulation des antiapoptotischen bcl-2 führen und dadurch die Apoptose unterdrücken (vgl. Abschnitt 5.1) [Kawanishi, 1997]. Vidair et al. führten die gesteigerte Apoptoseneigung SV40-transformierter AT-Fibroblasten auf eine erhöhte c-myc-Expression zurück [Vidair, et al., 1996]. Es existieren aber auch Veröffentlichungen, die die Unabhängigkeit der Apoptoserate von der Virustransformation herausstellen. Duchaud et al. verglichen die Apoptoserate EBV-transformierter mit der nicht-transformierter AT-Zellen nach Bestrahlung und konnten keinen Unterschied feststellen. Auch die spontane Apoptoserate war unabhängig vom Transformationsstatus [Duchaud, et al., 1996]. Auch Shi et al. konnten keinen Unterschied in der Apoptoserate zwischen transformierten und nativen AT-Lymphozyten feststellen [Shi, et al., 2001].

Zusammenfassend liefern die in dieser Arbeit erhobenen Daten keinen Hinweis darauf, dass der erhöhten Radio- und Zytostatikasensitivität von NBS-Zellen eine durch genomische Instabilität ausgelöste gesteigerte Apoptose zugrunde liegt. Viemehr scheint die komplexe Induktion, zumindest in einigen dieser Zelllinien, gestört zu sein. Um ein differenzierteres Bild der Apoptoseregulation in NBS-Zellen zu gewinnen, sind hier weiterführende Untersuchungen erforderlich, insbesondere zur p53-Expression und seinem genauen Phosphorylierungsmuster sowie zur Expression anderer, apoptoseregulierender Gene.

Die Rolle von Nbs1

Nach dem bereits in der Einleitung beschriebenen Modell von Kinzler und Vogelstein spielen zwei Gruppen von Genen eine wichtige Rolle bei der Krebsentstehung [Kinzler und Vogelstein, 1997]. Die Caretaker sind für die Instandhaltung des Genoms durch Reparatur entstandener DNA-Läsionen zuständig. Die Gatekeeper kontrollieren dagegen den Zellzyklus und die Apoptose und verhindern so die Weitergabe fehlerhafter Informationen an Tochterzellen. Mutationen in Genen beider Gruppen können zu genetischer Instabilität und verminderter Apoptosefähigkeit führen, in deren Folge es zur Entartung der Zelle kommen kann.

Unternimmt man den Versuch, Nbs1 im komplexen Netzwerk der Reaktionen der Zelle auf eine DNA-Schädigung einzuordnen, ergibt sich folgendes Bild: Als Caretaker spielt es bei der Reparatur von DNA-Doppelstrangbrüchen eine Rolle. Dabei kann eine Funktion des Nibrins beim Reparaturmechanismus des NHEJ als gesichert, bei der homologen Rekombination als wahrscheinlich angesehen werden [Kracker, et al., 2005; Tauchi, et al., 2002]. In der Zellzykluskontrolle übernimmt Nbs1 zudem Gatekeeper-Funktionen. Eine Beteiligung am intra-S-Phase-Checkpoint ist mehrfach belegt worden [Gatei, et al., 2000; Lim, et al., 2000]. Auch der G2/M-Checkpoint zeigte sich in vielen Veröffentlichungen in NBS-Zellen gestört [Demuth, et al., 2004; Stiff, et al., 2004].

Mit der Apoptoseregulation wurde in dieser Arbeit ein weiterer, wichtiger Gatekeeper-Mechanismus untersucht. Dabei zeigten vier von sieben NBS-Zelllinien Störungen in der Apoptosefähigkeit, was eine Funktion von Nbs1 bei der Apoptoseregulation wahrscheinlich macht. Nbs1 scheint also sowohl Caretaker- als auch Gatekeeper-Funktionen zu übernehmen.

Insgesamt scheint eine strikte Trennung von Caretakers und Gatekeepers nicht immer möglich. Vielmehr muss bisweilen von einem komplexen Zusammenspiel der Regulatoren und Effektoren beider 'pathways' ausgegangen werden. Einige Proteine, die sowohl an der Erkennung von DNA-Schäden und deren Reparatur als auch an der Apoptoseregulation beteiligt sind, wurden bereits beschrieben [Cregan, et al., 2002]. Mutationen in solchen Genen, die Caretaker und Gatekeeper in einem sind, müssten folglich besonders schwere klinische Konsequenzen in Gestalt eines stark erhöhten Krebsrisikos mit sich bringen. Vergleicht man das klinische Bild des NBS mit Krankheiten wie der Xeroderma pigmentosum [Stary und Sarasin, 2002] oder dem Li-Fraumeni-Syndrom [Li und Fraumeni, 1969], bei denen nur entweder Caretaker- oder Gatekeeper-Gen betroffen sind, fällt das schon besonders früh stark erhöhte Krebsrisiko auf [Seemanova, et al., 1985]. Auf dieser Grundlage erscheint eine Doppelfunktion des Gens ebenfalls plausibel. Besonders interessant ist in diesem Zusammenhang auch das hier gefundene gemeinsame Auftreten reduzierter Apoptoseindices zusammen mit Lymphomen. Patienten mit einer gestörten Apoptoseinduktion erkrankten dabei bisher sämtlich an malignen Lymphomen, während Patienten mit im Normalbereich liegender Apoptosefähigkeit bislang keine Lymphome entwickelten (vgl. Tab. 4).

Möglicherweise führt also die DNA-Reparatur-Störung der NBS-Zellen erst bei gleichzeitig herabgesetzter Apoptoseinduktion zu einem erhöhten Krebsrisiko. Patienten, die trotz Nbs1-Mutation und dank kompensierender Veränderungen in der Expression anderer Gene eine effektive Apoptose aufrechterhalten können, wären weniger gefährdet. Hieraus folgt auch, dass die Gemeinsamkeiten beider Patientengruppen – Immundefizienz und Zellzyklusstörungen – vermutlich allein durch die Störungen in der DNA-Reparatur bedingt werden. Tatsächlich konnte eine direkte Beteiligung von Nibrin am Immunglobulin-Klassenwechsel in B-Lymphozyten, einem NHEJ-Mechanismus, erst vor kurzem gezeigt werden [Kracker, et al., 2005]. Hierdurch wird, durch die Funktion von Nibrin im NHEJ, zum ersten Mal eine molekulare Erklärung für die Immundefizienz der NBS-Patienten gegeben.