1 Einleitung

• 1.1  Entstehung von DNA-Schäden

• 1.2 Konsequenzen von DNA-Schäden und Störungen in deren Reparatur

  • 1.2.1  DNA-Doppelstrangbruch-Reparatur

  • 1.2.2 Zellzykluskontrolle und Apoptose

• 1.3 Das Nijmegen-Breakage-Syndrom

  • 1.3.1  Klinisches Bild des Nijmegen-Breakage-Syndroms

  • 1.3.2 Zellulärer NBS-Phänotyp

  • 1.3.3 Molekulare Grundlagen

    • 1.3.3.1 Das Nbs1-Gen

    • 1.3.3.2 Nbs1 und DNA-Reparatur

    • 1.3.3.3 Funktionen von Nbs1 bei der Zellzykluskontrolle und Apoptose

• 1.4 Zielsetzung der Arbeit

2 Material

• 2.1  Zelllinien

• 2.2 Zellkulturmedien

• 2.3 Chemikalien

• 2.4 Enzyme

• 2.5 Lösungen und Puffer

• 2.6 Geräte

• 2.7 Fertige Kits

• 2.8 Verbrauchsmaterialien

• 2.9 Computeranwendungen

3 Methoden

• 3.1  Kultivieren und Passagieren von Zellen

• 3.2 Zellzahlbestimmung

• 3.3 Chromosomenanalyse

• 3.4 DNA-Extraktion aus lymphoblastoiden Zellen

• 3.5 Polymerase-Kettenreaktion (PCR)

  • 3.5.1  Nachweis der Zellgleichheit

  • 3.5.2 Gelelektrophorese der PCR-Produkte

  • 3.5.3 Mycoplasmentest

• 3.6 Mutationsnachweis durch Sequenzierung

  • 3.6.1  Reinigung der PCR-Produkte

  • 3.6.2 Ansatz der Sequenzierreaktion

• 3.7 Wachstumsexperimente

• 3.8 Mutagene

  • 3.8.1  Bleomycin

  • 3.8.2 Cyclophosphamid

  • 3.8.3 Methotrexat

• 3.9 Wachstumsinhibitions-Experimente

• 3.10 Induktion der Apoptose in NBS-Zellen

  • 3.10.1  Bleomycinbehandlung

  • 3.10.2 Apoptosenachweis mit der sub-G₁-peak-Methode

  • 3.10.3 Apoptosenachweis mittels Annexin-V-Färbung

• 3.11 Grundlagen der Durchflusszytometrie

  • 3.11.1  Aufbau und Funktionsweise des Durchflusszytometers

  • 3.11.2 Probenmessung und Datenauswertung

• 3.12 Statistik

4 Ergebnisse

• 4.1  Mutationsnachweis durch Sequenzierung

• 4.2 Wachstumscharakteristika von NBS-Zellen

  • 4.2.1  Ermittlung der Ausgangszellzahl für die Apoptoseversuche

  • 4.2.2 Wachstum von NBS-Zellen

• 4.3 Wachstumsinhibition von NBS-Zellen

• 4.4 Induktion der Apoptose in NBS-Zellen

  • 4.4.1  Etablierung der Standardbedingungen für die Apoptoseversuche

  • 4.4.2 Apoptosenachweis mit der sub-G1-Peak-Methode

  • 4.4.3 Apoptosenachweis mit der Annexin-V-Färbung

• 4.5 Zusammenfassung der Ergebnisse

5 Diskussion

• 5.1  In-vitro Untersuchungen an Patientenzellen

• 5.2 Wachstum von NBS-Zellen

• 5.3 Wachstumsinhibition von NBS-Zellen

• 5.4 Apoptoseinduktion in NBS-Zellen

  • 5.4.1  Nachweisverfahren

  • 5.4.2 Apoptosefähigkeit von NBS-Zellen

    • 5.4.2.1 p53 und Apoptose

    • 5.4.2.2 Nbs1 und p53

    • 5.4.2.3 AT und Apoptose

    • 5.4.2.4 Methodik bei Untersuchungen zur Apoptose

• 5.5 Die Rolle von Nbs1

6 Zusammenfassung

Abkürzungsverzeichnis

Literaturverzeichnis

Erklärung an Eides Statt

Danksagung

Tab. 1: Klinische und zelluläre Merkmale von Nijmegen-Breakage-Syndrom (NBS) und Ataxia teleangiectasia (AT).

Tab. 2: Mit der sub-G1-peak-Methode gemessene Apoptoseraten nach Inkubation mit 10 und 30 µg Bleomycin/ml. Angegeben ist der Mittelwert von Tripelwerten inklusive Standardabweichung. Signifikanz bezieht sich auf den Unterschied der Messwerte der NBS- bzw. AT-Zelllinien zum Mittelwert der Kontrollzelllinien. Als Signifikanzniveau wurde p<0,01 angenommen.

Tab. 3: Mit der Annexin-V-Methode gemessene Apoptoseraten nach Inkubation mit 10 und 30 µg Bleomycin/ml. Angegeben ist der Mittelwert von Tripelwerten inklusive Standardabweichung. Signifikanz bezieht sich auf den Unterschied der Messwerte der NBS- bzw. AT-Zelllinien zum Mittelwert der Kontrollzelllinien. Als Signifikanzniveau wurde p<0,01 angenommen.

Tab. 4: Zusammenfassung der experimentellen Ergebnisse. Die Daten zur Apoptose wurden aus den spezifischeren Annexin-Versuchen bezogen. Klinische Daten zu Neoplasien sind ergänzt.

Abb. 1: DNA-Reparatur, Apoptose und Krebsentstehung. Defekte Caretakers führen zur Anhäufung von Mutationen. Solange die Gatekeeper-Gene noch intakt sind, können die Mutationen erkannt und die mutierte Zelle unschädlich gemacht werden. Sind jedoch auch die Gatekeepers defekt, kann sich die veränderte Zelle ungesteuert teilen [Abb. modifiziert nachKinzler und Vogelstein, 1997].

Abb. 2: Die Phasen des Zellzyklus. Der Übergang von einer Phase in die folgende wird an mindestens drei Checkpoints kontrolliert.

Abb. 3: Morphologischer Verlauf der Apoptose [Abb. modifiziert nacho.V., 2004, Roche Applied Science].

Abb. 4: Morphologischer Verlauf der Nekrose [Abb. modifiziert nacho.V., 2004, Roche Applied Science].

Apaf 1: Apoptotic protease activating factor, Chk2: Checkpoint-Kinase 2, CytC: Cytochrom C, FADD: Fas-associated death domain protein, FasL: Fas-Ligand, Nur77: Nuclear Hormone Receptor TR53. Abb. 5: Zwei Wege der Apoptoseinduktion sind bekannt: Beim Todesrezeptorweg (extrazellulär) wird der Oberflächenrezeptor Fas durch Bindung entsprechender Liganden (FasL) aktiviert. Dies führt zur Ausbildung eines membrangebundenen Death Inducing Signalling Complex (DISC), bestehend aus FADD, Fas und Procaspase 8. Der DISC aktiviert 'Downstream'-Caspasen, die die Zelle zerlegen. Der mitochondriale Weg wird durch intrazelluläre Stimuli wie z. B. DNA-Schädigung ausgelöst und p53-abhängig oder -unabhängig an die Mitochondrien übermittelt. Über Freisetzung von CytC kommt es zur Ausbildung des Apoptosoms, das wiederum die Procaspase 3, das gemeinsame Endmolekül beider Apoptosewege, aktiviert [Abb. modifiziert nachHengartner, 2000].

Abb. 6: Geschwisterpaar mit Nijmegen-Breakage-Syndrom. Das Bild wurde freundlicherweise von Prof. Dr. E. Seemanova (Prag) zur Verfügung gestellt.

Abb. 7: Kopfumfang und Längenwachstum zweier männlicher NBS-Patienten. Abbildung der Daten mit freundlicher Genehmigung von Prof. Dr. E. Seemanova (Prag).

AS: Aminosäuren, BP: Basenpaare, BRCT: breast cancer carboxy terminal, FHA: fork-head-associated, Ser: Serinrest Abb. 8: Das Nbs1-Gen und sein Genprodukt, das Nibrin. Mutationen im Nbs1-Gen führen zum klinischen Bild des Nijmegen-Breakage-Syndroms. Bisher sind 9 verschiedene Mutationen bekannt. Die 657del5-Mutation ist mit über 90% bei NBS-Patienten am häufigsten.

Abb. 9: Nachweis der 657del5-Mutation in Exon 6 des Nbs1-Gens der NBS-Zelllinie JaCe. Die 5 fehlenden Basen sind bei der Kontrollzelllinie vorhanden.

Abb. 10: Wachstum lymphoblastoider NBS-Zellen unter Versuchsbedingungen (Apoptoseversuche). Abgebildet ist das Zellwachstum bei einer Ausgangszelldichte von 5x10⁵ Zellen/ml. Die Fehlerbalken geben die intraexperimentellen Variationen (Doppelwerte) an.

Abb. 11: Wachstum von fünf NBS- und zwei Kontrollzelllinien über sieben Tage bei einer Ausgangszelldichte von 0,7x10⁵ Zellen/ml. Die Fehlerbalken geben die intraexperimentellen Variationen (Doppelwerte) an.

Abb. 12: Überlebensraten von drei NBS- und zwei Kontrollzelllinien nach der Inkubation mit ansteigenden Bleomycinkonzentrationen. Die Fehlerbalken geben die intraexperi-mentellen Variationen (Doppelwerte) an.

Abb. 13: Überlebensraten von drei NBS- und zwei Kontrollzelllinien bei Inkubation mit ansteigenden Methotrexatkonzentrationen. Die Fehlerbalken geben die intraexperi-mentellen Variationen (Doppelwerte) an.

Abb. 14: Überlebensraten von zwei NBS- und zwei Kontrollzelllinien bei Inkubation mit ansteigenden Cyclophosphamidkonzentrationen. Die Fehlerbalken geben die intra-experimentellen Variationen (Doppelwerte) an.

Abb. 15: Anteile vitaler (schwarz), apoptotischer (hellgrau) und nekrotischer (dunkelgrau) Zellen bei unbehandelten (a) im Vergleich zu mit 30 µg Bleomycin/ml inkubierten Zellen (b) über fünf Tage (Zelllinie: Kontrollzelllinie C520).

Abb. 16: Durchflusszytometrisch ermittelte Apoptoseraten einer Kontrollzelllinie und der NBS-Linie JaCe bei fünftägiger Inkubation mit 10 µg (a) und 30 µg (b) Bleomycin/ml. Der schwarze Balken stellt den Anteil apoptotischer Kontrollzellen, der graue Balken den Anteil apoptotischer NBS-Zellen dar. Als apoptotisch gelten alle Annexin-V-positiven Zellen (Ax+/PI- und Ax+/PI+ - Zellen).

Abb. 17: Apoptosenachweis mit der sub-G₁-peak-Methode. Unbehandelte Zellen (a) zeigen keinen sub-G₁-peak. Bei mit Bleomycin behandelten Zellen (b) findet sich ein breiter sub-G₁-peak, der die apoptotischen Zellkerne repräsentiert.

Abb. 18: Hypodiploider DNA-Gehalt (%) nach 72 h Inkubation mit 10 und 30 µg Bleomycin/ml. 7 NBS-, zwei AT- und zwei Kontrollzelllinien wurden untersucht. Die Fehlerbalken geben die intraexperimentellen Variationen (Tripelwerte) an.

Abb. 19: Durchflusszytometrische Analyse Annexin-V/PI-gefärbter Zellen nach Inkubation mit 0, 10 und 30 µg Bleomycin/ml für 72 h. Annexin-V ist durch FITC markiert. Der linke untere Quadrant zeigt vitale, der rechte untere apoptotische und der rechte obere Quadrant spätapoptotische/nekrotische Zellen (%).

Abb. 20: Ax+/PI- und Ax+/PI+ -Zellen nach 72 h Inkubation mit 10 und 30 µg Bleomycin/ml. 7 NBS- zwei AT- und zwei Kontrollzelllinien wurden untersucht. Die Fehlerbalken geben die intraexperimentellen Variationen (Tripelwerte) an.

Abb. 21: Das Tumorsuppressorgen p53 induziert nach einer DNA-Schädigung in der Zelle entweder einen Zellzyklusarrest, um eine DNA-Reparatur zu ermöglichen, oder es leitet, wenn der Schaden irreparabel ist, die Apoptose ein [Abb. modifiziert nachHirao, et al., 2002].

Apaf 1: Apoptotic protease activating factor, BAX: bcl-2-associated X Protein, bcl-2: B-Cell-Lymphoma 2, MDM 2: Mouse double minute 2 homolog, Noxa: Phorbol-12-myristate-13-acetate-induced protein 1, PUMA: p53-upregulated modulator of ApoptosisAbb. 22: Nach einer DNA-Schädigung wird p53 aktiviert. Daraufhin induziert es eine Vielzahl an Genen der Apoptoseregulation. Über p21 bewirkt es zudem einen Zellzyklusarrest [Abb. modifiziert nachNorbury und Zhivotovsky, 2004].

Abb. 24: Nbs1 spielt für eine Vielzahl ATM-vermittelter Signaltransduktionen nach DNA-Schädigung eine wichtige Rolle. Es erleichtert die ATM-abhänigige Phosphorylierung von p53 und Chk2. Außerdem scheint es eine Funktion für die Aktivierung von ATM zu haben.

Abb. 25: Einteilung der NBS-Zelllinien nach ihren Apoptoseeigenschaften in zwei Gruppen: eine Gruppe mit tendenziell erniedrigter aber noch im Normalbereich liegender (n = 3), die zweite Gruppe mit signifikant verminderter Apoptoseinduktion (n = 4) nach Bleomycinbehandlung.