4 Methoden

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Physiologische Versuche an isolierten Aortenringpräparaten
Es wurden die thorakalen Aorten von Wistar-Kyoto-Ratten (WKY), vom C57Bl6-, eNOS defizienten und S1P3-Rezeptor defizienten Mäusen vorsichtig frei präpariert und entnommen. Es wurde eine unverzügliche Lagerung in kalter, Carbogen-begaster physiologischer Tyrode-Lösung vorgenommen. Nachdem die Adventitia vorsichtig vollständig abpräpariert worden ist, wurden die Gefäße unter einem Dissektionsmikroskop in 2 mm lange Ringpräparate geschnitten. Diese Ringe wurden auf 2 Drähten in den Kleingefäßmyographen (Kleingefäß-Myograph Modell 410A, Danish Myotechnology, Aarhus/DK) eingespannt. Danach lässt man die Gefäße für 60 Minuten in der 37°C warmen und Carbogen-begasten Tyrodelösung äquilibrieren. Nach Normalisierung des Gefäßinnendruckes wurden die Gefäße während einer Vorkaskade auf ihre Funktionalität überprüft. Nur Gefäße, die festgelegte Bedingungen erfüllten, wurden für die Versuche genutzt. Unter Vorkontraktionsbedingungen wurde der Einfluss von HDL und der assoziierten Lysophospholipide auf den Gefäßtonus von mit Phenylephrin (PE) vorkontrahierten Aortenringen ermittelt. Um den Einfluss von FTY720, der phosphorylierten Form von FTY720, den FTY-Derivaten AAL149, AAL151 und AFD298 auf den Gefäßtonus zu ermitteln, wurden Versuche am Kleingefäßmyographen wie beschrieben durchgeführt. Die Versuche wurden ebenfalls an Aortenringen von Wistar-Kyoto-Ratten (WKY-Ratten), C57BL/6-, eNOS defizienten und S1P3-Rezeptor defizienten Mäusen durchgeführt.
Intraarterielle Blutdruckmessung
An WKY-Ratten wurde die intraarterielle Blutdruckmessung durchgeführt. Die Ratten wurden durch eine intramuskuläre Injektion von Ketamin/Xylazin (80 bzw. 10 mg/kg) anästhesiert und die Betäubung bedarfgerecht durch wiederholte Injektion aufrechterhalten. Während des operativen Eingriffes wurde die Körpertemperatur der anästhesierten Ratten von 37 °C durch die Nutzung eines beheizten Operationstisches aufrechterhalten. Die Körpertemperatur wurde durch einen Rektalthermistor kontinuierlich gemessen, der mit dem Beheizungssystem des OP-Tisches rückgekoppelt ist. Die Tiere werden tracheotomiert und ein Tubus in die Trachea eingeführt, um Auswirkungen der anästhesiebedingte Hypersekretion zu verhindern. Es wurden unter einem Präparationsmikroskop ein venöser Zugang in die V. jugularis interna sinistra und ein arterieller Katheter in die A. carotis communis dextra gelegt. Über den arteriellen Schenkel wurde kontinuierlich blutig der MAD gemessen. Nach der operativen Positionierung des venösen und des arteriellen Katheters wurde der Blutdruck über eine Äquilibrierungszeit von 60 Minuten kontinuierlich aufgezeichnet und erst nach Stabilisierung der Versuch begonnen. Nach der Äquilibrierungsphase wurde der MAD erhöht. Dazu wurde nach einer einmaligen intravenösen Endothelin-Bolusapplikation von 500 ng / 0,2 ml kontinuierlich Endothelin in einer Konzentration von 1000 ng/h mittels einer Infusionspumpe verabreicht, wobei ein maximal infundiertes Volumen von 1 ml/h nicht überschritten wurde. Die Endothelin induzierte Erhöhung des MAD wurde solange abgewartet, bis sich der MAD konstant auf einen im Vergleich zum Ausgangsniveau mindestens 20 mmHg erhöhten Werten gehalten hat. Bei konstant erhöhtem MAD wurden die durch die Applikation von HDL (1 mg/0,2 ml), S1P (200 nM/0,2 ml), SPC (200 nM/0,2 ml) und LSF (200 nM/0,2 ml) Veränderungen des MAD ermittelt. Nach Applikation der Testsubstanz und Stabilisierung des MAD auf das Ausgangsniveau wurde die endothelabhängige Vasodilatation durch intraarterielle Applikation von Acetylcholin (200 nM/0,2 ml) überprüft.
Um die Wirkung von Up4A auf den systemischen Blutdruck zu untersuchen wurden intraarterielle Blutdruckmessungen an WKY-Ratten wie oben beschrieben durchgeführt. Bei konstantem Ruhe-MAD wurde durch die Applikation von Norepinephrin (NE) und Up4A über den arteriellen Schenkel Veränderungen des MAD ermittelt.
Fluoreszenzmikroskopische Darstellung von NO
Um die intrazelluläre Produktion von NO nachzuweisen, wurden Experimente an humanen umbilikalen Venenendothelzellen (HUVEC) mit Hilfe des NO-sensitiven zellpermeablen Fluorophores 4,5-Di-Amino-Fluorescein-Diacetat (DAF-2DA) durchgeführt. Zur Detektion der NO-Bildung wurden die HUVECs (1,2 x 105 Zellen) auf Gelatine beschichteten Objektträger ausplattiert und für 120 Minuten in RPMI 1640 inkubiert, welchem 1 % FCS (v/v) und 100 IU/ml Penicillin/Streptomycin zugesetzt wurden. Die Zellen wurden für einen Zeitraum von 30 Minuten in einem Inkubationsschrank bei 37 °C mit DAF-2DA inkubiert. In Anschluss wurden die Zellen insgesamt vierfach gewaschen und anschließend für 10 Minuten mit HDL (0,5 mg/ml), S1P (10 µM), SPC (10 µM) und LSF (10 µM) stimuliert. In einigen Versuchen wurde die eNOS zuvor mit dem spezifischen Inhibitor L-NAME (100 µM) gehemmt. Die jeweiligen Reaktionen wurden durch die Fixierung der Zellen mit 2 % Paraformaldehydlösung (v/v) für 3 Minuten bei 4 °C gestoppt. Es wurden ausschließlich HUVEC bis maximal zur 4. Passage eingesetzt. Die Betrachtung der Zellen erfolgt unter einem invertierten Fluoreszenzmikroskop. Die ermittelten Bilder wurden mittels des speziell für dieses Mikroskop entwickelten Auswerteprogrammes Axiovision 4.1 (Firma Carl Zeiss) analysiert.
Isoliert perfundierte Rattenniere
Männliche drei bis vier Monate alte Wistar-Kyoto-Ratten mit einem Körpergewicht zwischen 150 und 200 Gramm wurden mittels einer intraperitonealen Urethan-Injektion anästhesiert. Die Bauchhöhle wurde durch einen Y-Schnitt vom Unterbauch bis zum Zwerchfellansatz eröffnet. Die linke Niere mit der zugehörigen Arteria renalis und die infrarenale Aorta wurde durch stumpfe Dissektion vom umliegenden Bindegewebe frei präpariert, abgeklemmt, ligiert und inzisiert. Ein Polyethylenkatheter wird über die infrarenale Aorta in die A. renalis eingeführt. Die Niere wurde mit 250 IE Heparin perfundiert und direkt an das Perfusionssystem angeschlossen. Die Niere wird über eine peristaltische Pumpe mit einem permanenten Fluss von 8 ml pro Minute perfundiert. Als Perfusat wird mit Carbogen (95% O2, 5% CO2) begaste und auf 37°C erhitzte Krebs-Henseleit-Lösung genutzt. Über einen Infusionsschenkel konnten die Testsubstanzen in den Perfusionsfluss hinzu gegeben werden. Die durch die getesteten Substanzen renalen Gefäße hervorgerufenen Effekte wurden als Änderung des Perfusionsdrucks über einen Druckaufnehmer an einem parallel geschalteten Arm des Systems gemessen und über einen Brückenverstärker verstärkt und digital aufgezeichnet. Nach dem Anschluss der Niere an das Perfusionssystem wurde eine Äquilibrierungszeit von 60 Minuten abgewartet. Zur Überprüfung der Funktionstüchtigkeit der Niere wurden zu Beginn und am Ende eines jeden Versuchs standardmäßig Bolusinjektionen folgender Substanzen appliziert: Ang II (1 nmol), α,β-methyl-ATP (1 nmol) und Ap4A (1 nmol). Wurde im Versuchsverlauf mit Dauerperfusionen von Antagonisten oder α,β−meATP gearbeitet, so wurden diese Kontrollsubstanzen vor, während und nach der Antagonisierung ein weiteres Mal appliziert.
Proteinnachweis mittels Western Blot-Analyse
Um die Expression der in der Signaltransduktion der eNOS Aktivierung eingeschalteten Moleküle auf Proteinebene zu detektieren, wurden Western Blot Analysen nach etablierter Methodik durchgeführt. Dabei wurden Proteine aus HUVECs mittels Phosphoprotein-Lysepuffer (Fa. Bio-Rad) nach Angaben des Herstellers isoliert, die DNA bei 100 °C über 12 Minuten denaturiert und sedimentiert. Der Proteingehalt im Überstand wurde mittels BCA-Protein-Detektions-Assay (Fa. Pierce) nach Angaben des Herstellers bestimmt. Durch vertikale Plattenelektrophorese wurden die Proteine nach der Methode von Laemmli in 10%igen diskontinuierlichen SDS-Polyacrylamidgelen analysiert. Im Anschluss daran wurden die Gele mit Coomassie-Blau-Lösung gefärbt und die Proteine fixiert. Zur Entfärbung unspezifischer Anfärbungen wurden die Gele über 4 Stunden mit Coomassie-Entfärber-Lösung behandelt. Danach die aufgetrennten Proteine durch Elektrotransfer auf eine Nitrocellulose-Membran (0,45 µm) übertragen und für die Immundetektion immobilisiert. Dabei wurde die „semi-dry“ Methode verwendet (Trans-Blot SD Semi-Dry Transfer Cell, Firma Bio-Rad). Zur Kontrolle eines erfolgreichen Western Blots wurden die Proteine auf der Membran mit Ponceaurot reversibel gefärbt. Durch Immundetektion der jeweiligen Proteine mittels eines spezifischen Primär-Antikörpers (in diesem Fall gegen Rabbit anti-total-eNOS, Rabbit anti-Ser1177-phosho-eNOS, Rabbit anti-total-AKT, Rabbit anti-Ser473-phosho-AKT). Das zu messende Protein wird semiquantitativ darstellbar durch Bindung eines Meerrettichperoxidase-gekoppelten anti-Rabbit-IgG-Sekundärantikörper an den Primär-Antikörpers mit anschließender chemiluminometrischer Visualisierung mittels ECL-Chemilumineszenz-Reagenz (Fa. Amersham) nach Angaben des Herstellers. Die Membran wurde in einer Röntgenkassette mit einem Hyperfilm ECL gelegt und entwickelt.


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13.11.2006