5 Ergebnisse und Diskussion

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Eine Vielzahl an Erkrankungen, insbesondere die atherosklerotische Gefäßerkrankungen, basieren auf einer signifikanten Veränderung der physiologischen Umgebung oder der morphologischen Schädigung der Einzelzellschicht. Es ist eine große Anzahl an proatherogenen Faktoren bekannt (Nikotinkonsum, Diabetes mellitus, Adipositas, Hyperlipidämie, Hyperhomozysteinämie oder genetischer Hintergrund)[4, 5, 6]. Genauso sind heute atheroprotektive Faktoren bekannt. Einer der bedeutendsten Faktoren sind HDL-Moleküle[23]. Aus einer langen Zeit der epidemiologischen Beobachtung heraus, haben sich die gegen Atherosklerose schützenden Eigenschaften von HDL-Molekülen immer deutlicher statistisch herausarbeiten lassen[24]. In den 60iger Jahren des letzten Jahrhunderts wurde von Glomset die antiatherogene Funktion der HDL auf die Fähigkeit des Cholesterintransportes von peripheren Zellen zur Leber, dem reversen Cholesterintransport, verstanden[7]. Diese These hielt sich über Jahrzehnte und konnte auch gut untermauert werden. Die komplex strukturierten HDL-Moleküle scheinen aber weit mehr zu sein als reine Cholesterintransporter. HDL-Moleküle sind Trägermoleküle für eine große Anzahl an Proteinen und Lipiden. Eine große Anzahl an Studien konnte eine positive Korrelation zwischen der Höhe des Plasmaspiegels von HDL und der endothelabhängigen Gefäßdilatation nachweisen[25]. Kürzlich konnte durch die Verabreichung von rekombinant hergestelltem HDL die eingeschränkte endotheliale Kapazität bei Männern mit Hypercholesterinämie signifikant verbessert werden[26]. Der Einfluss von HDL Molekülen auf die endotheliale Funktion ist durch eine Reihe von verschiedenen Mechanismen begründet worden. Darunter sind die Synthese von vasorelaxierenden Prostanoiden, wie Prostaglandin E2 oder I2 [27]. 2001 konnte die Arbeitsgruppe um Yuhanna erfolgreich zeigen, dass HDL-Moleküle zu einer direkten Stimulation eines der unter physiologischen Bedingungen bedeutendsten gefäßprotektiven Enzymsysteme, der endothelialen NO-Synthase, führt[8]. Über die Aktivierung der eNOS mit anschließender NO-Sekretion reguliert das Endothel eine Reihe von physiologischen Prozessen. NO bewirkt eine direkte Relaxation glatter Gefäßmuskelzellen mit einer einhergehenden Vasodilatation der Gefäße, eine Hemmung der Leukozytenadhäsion an das Endothel, eine Stabilisierung der Endothelpermeabilität mit einer Verhinderung des Übertritts von Leukozyten oder gefäßschädlicher Moleküle in die glatte Gefäßmuskelschicht und wirkt antiapoptotisch auf Endothelzellen[28]. Für die HDL induzierte eNOS Aktivierung ist die Bindung des HDL-assoziierten ApoA1-Lipoproteins an den „Scavenger receptor BI“ (SR-BI-Rezeptor) notwendig[8]. Interessanterweise konnte gezeigt werden, dass isoliertes ApoA1-Protein keine Aktivierung der eNOS über die Aktivierung des SR-BI bewirkt[8]. In dem ersten Teilprojekt dieser Publikationspromotion wurden die einzelnen Bestandteile der HDL-Fraktion systematisch auf die Fähigkeit, eNOS zu aktivieren, untersucht. Übereinstimmend zu der 2001 von Yuhanna veröffentlichten Ergebnissen konnte erfolgreich die Aktivierung der eNOS durch isoliertes HDL nachgewiesen werden. Die in der vorliegenden Studie eingesetzte HDL-Konzentration ist äquivalent zu der physiologische vorliegenden Konzentration (0.8 – 1.2 mg/ml HDL Protein entsprechen ungefähr 40-70 mg HDL Cholesterol/dl). In vorkontrahierten Aortenringen von C57BL/6 Mäusen mit intaktem Endothel bewirken HDL eine dosisabhängige Vasodilatation (Abbildung 1a und Abbildung 1c). Diese Vasodilatation kann durch chemische Hemmung der eNOS durch den spezifischen Inhibitor L-NAME und durch mechanische Endothelentfernung vollständig unterdrückt werden. In vorkontrahierten Aortenringen von eNOS defizienten Mäusen konnte ebenfalls keine signifikante Vasodilatation durch HDL induziert werden. Die chemische Hemmung der Cyclooxygenase oder der Cytochrom-P450-Oxidoreduktase, beides Enzymsysteme, die ihrerseits vasorelaxierende Moleküle (Prostazyklin, Eicosanoide) synthetisieren, konnte die HDL induzierte Vasodilatation nicht signifikant verändern, ein weiterer Beweis der eNOS abhängigen Vasodilatation. Die direkte HDL induzierte NO-Liberation aus kultivierten HUVECs konnte mittels des NO sensitiven Fluorophors DAF-2DA visualisiert werden. Durch pharmakologische Hemmung der eNOS durch L-NAME konnte der NO-abhängige Fluoreszenzanstieg unterbunden werden (Abbildung 1b). In Parafinschnitte konnte die HDL-induzierte Phosphorylierung der eNOS immunhistochemisch dargestellt werden (Abbildung 1d). Die direkte systemische arterielle Applikation von isolierten HDL-Molekülen in Wistar-Kyoto-Ratten bewirkte eine schnell einsetzende und kurz anhaltende Verminderung des systemischen mittleren arteriellen Mitteldruckes (Abbildung 1e). 1999 konnte Dimmeler und Mitarbeiter erfolgreich nachweisen, dass die Aktivierung der AKT-Kinase durch vermehrte Phosphorylierung ein entscheidender Schritt in der Aktivierung der eNOS darstellt[29]. Die Inkubation von humanen umbilikalen Venenendothelzellen mit isolierten HDL-Molekülen bewirkte eine vermehrte zeitabhängige Phosphorylierung der AKT-Kinase und der eNOS (Abbildung 1f und 1g). Die Liberation von NO durch den Einfluss verschiedener bekannter Stimulatoren (VEGF, Östrogene, IGF-1) wird über die Aktivierung dieses Enzyms durch die Phosphorylierung am Serin1177 bewirkt[30, 31, 32]. In einer kürzlich veröffentlichten Arbeit konnte darüber hinaus nachgewiesen werden, dass eine protektive Wirkung von HDL Molekülen auf Endothelzellen gegenüber Apoptose über diese Aktivierung der AKT-Kinase vermittelt wird[33]. In der vorliegenden Publikationspromotion konnte nachgewiesen werden, dass die HDL induzierte eNOS Aktivierung das Serin1177 innerhalb der eNOS eine Phosphorylierungsstelle der AKT-Kinase in HUVECs ist, wie es für andere Endothelzellen bereits gezeigt werden konnte[34]. Die Aktivierung der eNOS durch HDL konnte durch die Inhibition der der Phosphatidyl-Inositol-3-Kinase (PI3-Kinase) durch den spezifischen Inhibitor Ly294002 unterdrückt werden. Diese Befund legen die Vermutung nahe, dass die Aktivierung der eNOS durch HDL über die Aktivierung der PI3-Kinase mit einhergehender Aktivierung der AKT-Kinase teilweise verläuft, denn durch die Inhibition der PI3-Kinase konnte lediglich ca. 50 % der HDL induzierten Vasorelaxation inhibiert werden. Diese Befunde lassen auf das Vorhandensein alternativer Signaltransdutktionswege (AKT-unabghängig) bis zur Aktivierung der eNOS schließen. In der vorliegenden Untersuchung konnte die von Gong aufgestellte These[9], dass nur weibliches HDL-Moleküle zu einer Aktivierung der eNOS führen nicht bestätigen. Mehrere unabhängige Isolationen von HDL-Molekülen von unterschiedlichen weiblichen Probanden zeigten sowohl in physiologischen, als auch in zellbiologischen Versuchen eine signifikante Aktivierung eNOS (Abbildung h). Die HDL-induzierte Aktivierung der eNOS und die damit einhergehende Vasorelaxation war an thorakalen Aortenringen von S1P3-Rezeptor defizienten Mausen signifikant schwächer ausgeprägt im Vergleich zu den Verhältnissen an thorakalen Aortenringen von C57Bl/6 Mäusen. Dieser Befund zeigt, dass ein Teil der HDL induzierten eNOS Aktivierung über die Stimulation des S1P3-Rezeptors verläuft (Abbildung 1h). Im nächsten Schritt wurden die HDL-Moleküle in die beiden großen Teilkomponenten, die Protein- und Lipidfraktion, aufgetrennt. In physiologischen Versuchen an isolierten Aortenringen von C57Bl/6 Mäusen wurde die eNOS von der isolierten HDL-Lipidfraktion in einer im HDL vorliegenden Konzentration stimuliert. Übereinstimmend mit den Vorbefunden wurde durch die Proteinfraktion, insbesondere durch das quantitativ wichtigste Protein ApoA1-Lipoprotein, keine signifikante Veränderung des Vasotonus der vorkontrahierten Aortenringe ausgelöst. Aus der Lipidfraktion wurden die quantitativ wichtigsten Komponenten isoliert weiter untersucht. Cholesterin und Sphingomyelin führten zu keiner signifikanten Veränderung des Vasotonus, wohingegen Lysophosphatidylcholin (LPC) eine signifikante Vasokonstriktion bewirkte. Eine weitere quantitativ bedeutsame Gruppe an Lipide, die der LPL, insbesondere S1P, SPC und LSF, zeigten potente eNOS aktivierende Eigenschaften. In physiologischen Versuchen an vorkontrahierten Aortenringen von C57Bl/6 Mäusen bewirkten diese LPL eine konzentrationsabhängige Vasodilatation, die durch Hemmung der eNOS mittels L-NAME und durch mechanische Endothelentfernung vollständig unterbunden werden konnte (Abbildung 2a). In vorkontrahierten Aortenringen von eNOS defizienten Tieren wurde durch S1P eine Vasokonstriktion festgestellt, wobei SPC und LSF den Gefäßtonus nicht signifikant veränderten (Abbildung 2b). In HUVEC konnte in Übereinstimmung mit den physiologischen Versuchen mit Hilfe des NO sensitiven Fluorophors DAF-2DA die LPL induzierte NO-Produktion fluoreszenzmikroskopisch visualisiert werden (Abbildung 2d). Die Wirkung von S1P auf den Gefäßtonus verschiedener Gefäßabschnitte variiert sehr in Abhängigkeit der exprimierten Rezeptoren. In zerebralen, mesenterialen und renalen Gefäßabschnitten ist S1P beispielsweise ein Vasokonstriktor[35]. In Western Blot Analysen konnte im Rahmen dieser Arbeit nachgewiesen werden, dass S1P, SPC und LSF, übereinstimmend zu den Befunden durch HDL, die Akt-Kinase und die eNOS durch Phosphorylierung aktivieren (Abbildung 2e). Innerhalb der Gefäßphysiologie besitzen zwei der bekannten S1P-Rezeptoren, der S1P1- und S1P3-Rezeptor, eine Bedeutung insbesondere auf die Endothelfunktion[36]. Auf der Zelloberfläche einer Reihe von kultivierten Endothelzellen (HUVECs, HMECs) werden diese Rezeptoren stark exprimiert (eigene unveröffentlichte Ergebnisse). In Dilatationsversuchen an thorakalen Aortenringen von S1P3 defizienten Mäusen und in Western Blot Analysen aus isolierten Endothelzellen aus S1P3 defizienten Mäusen konnte herausgearbeitet werden, dass die Aktivierung des S1P3 Rezeptor durch S1P, SPC und LSF in den Signaltransduktionsweg eingeschaltet ist (Abbildung 2f). Im Gegensatz zu der in Aortenringen von C57Bl6 Mäusen durch S1P, SPC und LSF induzierten Vasodilatation, konnte in Aortenringen von S1P3 Rezeptor defizienten Mäusen keine Vasodilatation detektiert werden (Abbildung 2f). Dabei bestehen keine signifikanten Unterschiede in der endothelialen Kapazität zwischen C57Bl6 und S1P3 defizienten Mäusen in Bezug auf die endothelabhängige Vasodilatation auf Acetylcholin und der endothelunabhängigen Vasodilatation auf Natriumnitroprussid. In Western Blot Untersuchungen an S1P3 Rezeptor defizienten Endothelzellen wurde die AKT und eNOS im Vergleich zu Endothelzellen aus C57Bl/6 Mäusen signifikant schlechter durch den Einfluss von HDL phosphoryliert (Abbildung 2 g). Durch die Inkubation dieser S1P3-Rezeptor defizienten Endothelzellen mit S1P, SPC oder LSF wurde keine signifikante Phosphorylierung der AKT oder eNOS induziert (Abbildung 2g). Um die Frage nach einer physiologischen Relevanz dieser Befunde zu beantworten, wurde isoliertes S1P, SPC und LSF intraarteriell in eine Wistar-Ratte appliziert und gleichzeitig der Blutdruck invasiv gemessen kontinuierlich aufgezeichnet. Die Applikation von S1P, SPC und LSF verursachte eine unmittelbare kurzzeitig signifikante Verminderung des mittlere systemischen arteriellen Blutdrucks (Abbildung 1d, Abbildung 2c). 2003 wurde die HDL induzierte eNOS Aktivierung von Gong mit den HDL-assoziierten Östrogene zu erklären versucht[9]. Die Autoren konnten interessanterweise zeigen, dass die isolierten HDL-Moleküle aus weiblichem Plasma eine sehr potente eNOS Aktivierung verursachen, wohingegen das aus männlichem Plasma isolierte HDL keine Aktivierung der eNOS zeigt. Die Autoren konnten korrespondierend zu diesem Befund eine Östrogenkonzentration im pikomolaren Bereich im weiblichen HDL und keine Östrogene im männlichen HDL nachweisen. Kritisch diskutiert ist zu erwähnen, dass die innerhalb der weiblichen HDL-Moleküle nachgewiesenen Östrogenkonzentrationen um den Faktor 104 bis 105 geringer sind als diejenigen, die eine Aktivierung der eNOS bewirken. Um diesen Befund näher zu untersuchen, wurden geschlechterspezifische HDL-Fraktionen isoliert und auf Vasoaktivität untersucht. Es konnte im Rahmen dieser Arbeit eindeutig nachgewiesen werden, dass sowohl HDL-Isolationen aus weiblichem Plasma, als auch HDL-Isolationen aus männlichem Plasma eine signifikante Vasodilatation an vorkontrahierten Aortenringen von C57Bl6 Mäusen bewirkt (Abbildung 1h). Dabei konnten keine signifikanten Unterschiede in der durch die einzelnen HDL-Isolate induzierte Vasodilatationen nachgewiesen werden, wobei die HDL Isolate aus dem Plasma von weiblichen Probanden tendenziell eine stärkere Vasodilatation bewirkten. Interessanterweise hatten männlichen Probanden weniger S1P im HDL als weibliche Probanden, wobei der Unterschied in der kleinen Probeanzahl (jeweils n=7) nicht signifikant war. Zusammenfassend konnten im ersten Teilabschnitt dieser Publikationspromotion zum ersten Mal spezielle HDL-Komponenten, die Lysophospholipide, als biologisch wirksame Moleküle mit potenziell antiatherogener Wirkung und derer Signaltransduktionskaskade beschrieben werden.
HDL sind sehr komplex aufgebaute Moleküle, die eine Reihe von verschiedenen intrazellulären Signaltransduktionsmechanismen aktivieren können, wofür spezifische Komponenten der HDL-Moleküle jeweils identifiziert werden konnten. Im Rahmen dieser Publikationspromotion konnten durch die Auftrennung der HDL-Moleküle in die Lipid- und Proteinfraktion eindeutig nachgewiesen werden, dass die eNOS aktivierenden Komponenten Bestandteile der Lipidfraktion sind. Die Proteinfraktion, insbesondere das Apo-Lipoprotein AI, verursachten keine signifikanten Veränderungen des Vasotonus von vorkontrahierten Aortenringen. Dieser Befund steht in Übereinstimmung mit den Befunden einervorangegangenen Studie[8]. Innerhalb der Lipidfraktion wurden die quantitativ bedeutendsten Komponenten auf die eNOS aktivierende Eigenschaft untersucht. Durch systematische Untersuchungen konnten 3 Lysophospholipide, alle Bestandteil der HDL-Moleküle, identifiziert werden, die eine Aktivierung der eNOS bewirkten. Diese Lysophosholipide bewirkten eine eNOS Aktivierung in Konzentrationen, die ebenfalls in HDL-Molekülen vorliegen. In einem mg HDL sind im Durchschnitt 287±17 pmol S1P[37] und 290±20 pmol SPC[37] enthalten. Die systemische Applikation von 1 mg HDL, sowie 200 nmol S1P oder SPC in eine WKY-Ratte verursacht eine direkte signifikante kurzfristige Verminderung des MAD. In vivo sind aber im Vergleich zu den in vitro Daten eine Bemerkungen zu machen. Die innerhalb des HDL-Moleküls enthaltenen Lysophospholipide könnten synergistisch an den entsprechenden Rezeptoren wirken. Die Bindung von HDL-Molekülen an den SRBI-Rezeptor könnte zu einer räumlichen Anordnung der im HDL enthaltenen Lysophospholipide am vermittelnden Rezeptor führen, so dass die lokale Konzentration deutlicher höher ist, als bei den Lysophospholipiden in Lösung.

Die biologisch aktiven Lyspophospholipide wirken über spezifische plasmamembranständige G-Protein gekoppelte Rezeptoren. Diese Rezeptoren werden nach dem stärken Agonisten, S1P, auch S1P-Rezeptoren genannt [13, 38,39, 40]. Zur Zeit sind 5 unterschiedliche S1P-Rezeptoren bekannt (S1P1-5). Über die Aktivierung dieser Rezeptoren bewirken Lysophospholipide ein Reihe von biologischen Wirkungen, wie z.B. Angiogenese und Verlängerung des Überlebens von Endothelzellen[41]. Sowohl die Lysophospholipide aktivieren verschiedene spezifische S1P-Rezeptoren, wovon der S1P1-, S1P2- und der S1P3-Rezeptor auf Endothelzellen exprimiert werden[42, 43, 44]. SPC aktiviert darüber hinaus weitere spezifische SPC-Rezeptoren (OGR-1, GPR4, G2A)[45]. Die in dieser Publikatoinspromotion beobachteten Effekte von HDL und den Lysophospholipiden auf die AKT-Aktiverung und eNOS-Aktivierung mit einhergehender NO-Liberaion konnten durch die Wirkung von Pertussistoxin unterbunden werden. Dieser Befund lässt auf den Einfluss eines PTX-sensitiven Gi-Proteins schließen. In isolierten thorakalen Aortenringen von S1P3-Rezeptor defizienten Mäusen konnte durch den Einfluss von S1P. SPC und LSF keine signifikante Veränderung der durch PE induzierten Vorkontraktion beobachtet werden. Dieser Befund lässt darauf schließen, dass über die Aktivierung dieser Rezeptor die eNOS Aktivierung gesteuert wird. In Western Blot Untersuchungen an isolierten glatten Gefäßmuskelzellen aus S1P3 defizienten Mäusen konnten durch S1P, SPC und LSF keine Aktivierung der AKT und keine Phosphorylierung der eNOS bewirkt werden. Damit konnte zum ersten Mal gezeigt werden, dass ein Teil der durch HDL induzierten eNOS Aktivierung (ca. 50 %) über die assoziierten Lysophospholipide über die Aktivierung des S1P3-Rezeptors mediiert wird. Dabei hängt die Wirkung der Lysophospholipide vom jeweiligen Gefäßtonus ab. Die vasodilatierende Wirkung der LPL konnte in den Versuchen an den isolierten Aortenringen nach Vorkontraktion beobachtet werden. Unter basalen, nicht vorkontrahierten Bedingungen verursachten S1P und SPC eine gering gradige, aber signifikante Vasokontraktion. Ein Befund der durch mehrere Studien gezeigt werden konnte[46]. Dabei konnten keine signifikanten Unterschiede in dieser Vasokonstriktion zwischen C57Bl/6 Mäusen und S1P3-Rezeptor defizienten Mäusen beobachtet werden, so dass diese vasokonstiktive Komponente nicht über den S1P3-Rezeptor vermittelt zu sein scheint. Die auch unter Vorkontraktion zu beobachtende vasokonstriktive Wirkung von S1P und SPC an isolierten thorakalen Aortenringen von eNOS- und S1P3-Rezeptor defizienten Mäusen unterstreicht die duale Wirkung der LPL auf den Vasotonus. Die Lysophosholipide innerhalb der getesteten HDL-Moleküle sind für ca. 50 % der HDL induzierten eNOS Aktivierung verantwortlich
Im zweiten Teil der Publikationspromotion wurde die Wirkung des Immunmodulators FTY720 auf die endotheliale Funktion untersucht. FTY720 ist ein Derivat einer aus dem Pilz Isaria sinclarii isolierten Substanz Myriocin[47]. Myriocin vermittelt sehr potente immunmodulatorische Wirkungen, besitzt aber starke Nebenwirkungen[48]. Daher musste die Struktur von Myriocin so verändert werden, dass die immunmodulatorischen Eigenschaften erhalten blieben, die Nebenwirkungen jedoch deutlich schwächer ausgeprägt waren. Dieses oral verfügbare Medikament ist FTY720. FTY720 ist ein strukturelles Homolog eines endogenen LPL, dem Sphingosin[16]. Die Lysophospholipide FTY720 und Sphingosin sind beides Vorläufermoleküle, die durch eine endogene Sphingosinkinase ( SpK) zu den aktiven Metaboliten, S1P und FTY720-Phosphat phosphoryliert werden müssen[49]. FTY720 ist ein sehr potenter Agonist an 4 der 5 heutzutage bekannten S1P-Rezeptoren (S1P1, S1P3, S1P4, S1P5)[16]. Die immunmodulatorische Wirkung von FTY720 ist auf eine irreversible Internalisierung des S1P1 Rezeptor nach Bindung zurückzuführen. Neben der immunmodulatorischen Wirkung von LPL sind ebenfalls direkte Effekte auf die Gefäßregulation bekannt[37]. Aufgrund der strukturellen Homologie zu S1P und der agonistischen Wirkung von FTY720 am S1P3 Rezeptor wurde die Bedeutung von FTY720 auf die Gefäßphysiologie untersucht. In Dilatationsstudien an vorkontrahierten Aortenringen von C57Bl/6 Mäusen konnte eine potente vasodilatatorische Wirkung von FTY720 und von FTY720-P in einer Konzentrationsabhängigkeit nachgewiesen werden (Abbildung 3a, Abbildung 3b, Abbildung 3c). Durch mechanische Endothelentfernung und Inhibition der eNOS durch L-NAME (Abbildung 3d) konnte die FTY720 und FTY720-P induzierte Vasodilatation vollständig aufgehoben werden. Es konnte ebenfalls keine signifikante Vasodilatation in vorkontrahierten thorakalen Aortenringen von eNOS defizienten Mäusen durch FTY720 und FTY720-P beobachtet werden (Abbildung 3e). In Western Blot Untersuchungen konnte konzentrations- und zeitabhängig nachgewiesen werden, dass FTY720 und FTY720-P eine Phosphorylierung der AKT und eNOS bewirken. Die Inhibition der Phosphoinositol-3-Kinase, ein für die Phosphorylierung der AKT essentielles Enzym[29], durch den spezifischen Inhibitor Ly294004 verhinderte die FTY720 und FTY720-P induzierte Phosphorylierung der AKT und eNOS. FTY720 und FTY720-P induzierten beide einen Fluoreszenzsignalintensitätsanstieg des NO-sensitiven Fluorophors DAF-2DA, der durch die pharmakologische Inhibition des eNOS durch L-NAME unterbunden wurde (Abbildung 3f). Im nächsten Schritt wurde untersucht, ob der Phosphorylierungsschritt von FTY720 zu FTY720-P für die FTY720 Wirkung ist, weil FTY720 und FTY720-P in den jeweiligen Untersuchungen vergleichbare Wirkung zeigten. Es wurden Dilatationsstudien an thorakalen Aortenringen von C57Bl6 Mäusen unter Inhibition der Sphingosinkinase (SpK) durch den spezifischen Inhibitor Dimethylsphingosin (DMS) durchgeführt. Unter diesen Bedingungen wurde ausschließlich durch FTY720-P eine signifikante Vasodilatation verursacht, wohingegen FTY720 keine signifikante Veränderung der Vorkontraktion bewirkte (Abbildung 3g). In Western Blot Untersuchungen konnte unter Inhibition der SpK eine FTY720-P induzierte Phosphorylierung der AKT und eNOS beobachtet werden, wohingegen die nicht phosphorylierte Form von FTY720 keine Wirkung auf die Phosphorylierung von AKT und eNOS zeigte. Damit ist eindeutig gezeigt worden, dass FTY720 ein inaktives Vorläufermolekül ist, welches durch Phosphorylierung durch die SpK aktiviert wird. Diese Befunde stehen in Übereinstimmung mit einer Vielzahl von Studien, in denen FTY720-P als aktiver Metabolit identifiziert worden ist[49, 50]. Um diesen Befund zu konfirmieren wurden Experimente mit strukturellen Analoga von FTY720 durchgeführt. AAL151 ist ein durch die SpK phosphorylierbares Isomer von FTY720, wohingegen AAL149 ein nicht phosphorylierbares, somit inaktives, Isomer ist. AFD298 ist die phosphorylierte biologisch aktive Form von AAL151. Übereinstimmend mit den Vorbefunden konnte gezeigt werden, das AAL151 und AFD298 eine konzentrationsabhängige eNOS Aktivierung bewirken, wohingegen das inaktive Isomer AAL149 keine Einfluss auf die eNOS Aktivierung besitzt (Abbildung 3h). Übereinstimmend mit den S1P-Vorbefunden konnte weder durch FTY720, noch durch FTY720-P eine signifikante Veränderung der Vorkontraktion in Aortenringen von S1P3 Rezeptor defizienten Tieren induziert werden (Abbildung 3i). Zusammenfassend zeigt sich, dass der LPL-basierte Immunmodulator FTY720 zu einer HDL- und S1P vergleichbarer eNOS Aktivierung über Aktivierung des S1P3-Rezeptors und der AKT-Kinase führt. Die Bedeutung dieses Befundes liegt in erster Linie im Bereich der Transplantationsmedizin. Zum ersten Mal konnte gezeigt werden, dass eine immunmodulatorische Substanz durch Aktivierung einer rezeptorabhängigen Signaltransduktionskaskade eine direkte Wirkung auf das Endothel besitzt. Die notwendige Langzeitbehandlung der organtransplantierten Patienten mit den heute üblichen Immunsuppressiva (Cyclosporin, Tacrolimus, Sirolimus) führt zu einer progredient entwickelnden Transplantationsvaskulopathie, die ein führender Grund der Transplantatfunktionsverschlechterung bis hin zum Transplantatversagen ist [51]. Es konnte bereits gezeigt werden, dass die sich unter der Behandlung mit Cyclosporin entwickelnde Vaskulopathie signifikant durch die Kombinationstherapie mit Cyclosporin A und FTY720 reduziert werden kann[52]. Somit stellt die FTY720 induzierte eNOS Aktivierung einen Hinweis auf einen möglichen, neben der immunmodulatorischen Funktion, zugrunde liegenden Mechanismus dar.
Im dritten Teil dieser Publikationspromotion wurde versucht, aus stimulierten humanen mikrovaskulären Endothelzellen (HMEC) einen neuartigen vasoaktiven Faktor zu isolieren. Dabei wurden die HMEC auf verschiedene Weise stimuliert, wobei zum einen mechanische Belastung, zum anderen chemische Stimulatoren (Endothelin, ATP, UTP, Acetylcholin, A23187) eingesetzt wurden. Die jeweiligen Endothelzellüberstände (EZÜ) wurden abgenommen und mit Hilfe der isoliert perfundierten Rattenniere (IPN) auf Vasoaktivität überprüft. Dabei zeigte sich, dass die EZÜ der verschiedenen Stimulationsreihen in der IPN zu einem signifikanten Anstieg des Perfusionsdrucks führten (Abbildung 4a). Durch pharmakologische Inhibition wurde die gesuchte Substanzklasse weiter eingeschränkt. Es ist bekannt, dass das Endothel eine Reihe von vasoaktiven Substanzen produziert und liberiert. Zwei bedeutende Hauptgruppen sind Endothelin und Nukleotide[19, 53]. In Versuchen unter Inhibition des Endothelin-Rezeptors A (ETa) mit dem spezifischen Inhibitor BQ123 konnte gezeigt werden, dass nur ein geringer, aber signifikanter Anteil (ca. 10 %) des durch die EZÜ ausgelösten Perfusionsdruckanstiegs gehemmt werden konnte. Im nächsten Schritt wurde der Einfluss von Mononukleotiden auf den EZÜ induzierten Perfusionsdruckanstieg untersucht. Dazu wurden die im EZÜ enthaltenen Mononukleotide durch die Anwesenheit von alkalischer Phosphatase degradiert. Dadurch wurde die Vasoaktivität um weitere ca. 40 % reduziert (Abbildung 4a und 4b). Durch die Inhibition von P2X-Rezeptoren mit den unspezifischen Inhibitoren Suramin und PPADS wurde der restliche Anteil an der Perfusionsdruckerhöhung um weitere ca. 30 % gehemmt (Abbildung 4a und 4b). Da ein großer Anteil der Vasoaktivität des EZÜ nach Degradierung der Mononukleotide durch unselektive Hemmung von P2X-Rezeptoren vermindert werden konnte, kamen als mögliche auslösende Faktoren Dinukleotsidpolyphosphate in Betracht. Durch chromatographische Auftrennung und MALDI Experimente (durchgeführt von Herrn PD Dr. rer. nat. Joachim Jankowski und Mitarbeitern) konnte in mehreren Schritten ein Dinukleosidpolyphsophat, Uridin Adenosin Tetraphosphat (Up4A) isoliert werden. Bei Up4A handelt es sich um ein zum ersten Mal beschriebenes Molekül, das sich aus einem Pyrimidin (Uridin) und einem Purin (Adenosin) zusammensetzt. Während der einzelnen Aufreinigungsschritte wurden ca. 850 - 900 Fraktionen mit Hilfe der IPN auf Vasoaktivität untersucht. Auf diesem Wege konnte man die interessierenden Fraktionen immer weiter einengen. In den nach der Aufreinigung von Up4A mit der Reinsubstanz durchgeführten physiologischen Versuchen wurde die pharmakologische Charakterisierung von Up4A an der IPN durchgeführt (Abbildung 4c). Durch die Dauerperfusion des intrarenalen Gefäßsystems mit α,β-methylen-ATP, einer Substanz, die die P2X1- und P2X3-Rezeptoren vollständig desensitisiert, wurde die durch Up4A ausgelöste Erhöhung des Perfusionsdruckes signifikant um ca. 75 % vermindert. Die starke Verminderung der Vasoaktivität durch α,β-methylen-ATP deutet auf die Bedeutung des P2X1- und P2X3-Rezeptors hin, wobei in der glatten Gefäßmuskelzelle der P2X1-Rezeptor die dominierende Untergruppe an P2X-Rezeptoren ist. Um zwischen dem P2X1- und dem P2X3-Rezeptor pharmakologisch diskriminieren zu können, wurden Versuche mit NFO23, TNP-ATP und Diinosin-Pentaphosphat (Ip5I) durchgeführt (Abbildung 4d). Diese beiden Substanzen sind P2X1- und P2X3-Antagonisten, wobei eine P2X1:P2X3 Rezeptoraffinität von 1 (TNP-ATP), 20 (NFO23), bzw. 1000 (Ip5I) besteht. Diese Antagonisten wurden in einer Konzentration eingesetzt, die bekanntermaßen P2X1-Rezeptoren zu einem überwiegenden Teil blockt (≥ EC75), wohingegen eine schwache Wirkung auf P2X3-Rezeptoren besteht (≤ EC25). Unter Dauerperfusion mit diesen Konzentrationen von NFO23 und Ip5I wurde die Wirkung von Up4A stark vermindert, ein Befund, der den Einfluss des P2X1-Rezeptors weiter unterstützt. Die unter α,β-methylen-ATP beobachtete Restaktivität von Up4A macht die Wirkung von Up4A an der zweiten Unterklasse von Purinrezeptoren, den P2Y-Rezeptoren, wahrscheinlich. Alle heute bekannten Uridin-enthaltenden Nukleotide besitzen eine Affinität zu P2Y-Rezeptoren. Für den P2Y2- und P2Y4-Rezeptor ist eine direkte Bedeutung auf den Gefäßtonus beschrieben[54]. Ein weiterer Grund für die beobachtete restlich Vasoaktivität von Up4A könnte in der Bildung der Abbauprodukten ATP und UTP liegen. Sowohl für ATP, als auch für UTP ist eine eigene Vasoaktivität auf das renale Gefäßsystem bekannt. Im Vergleich der jeweiligen Dosis-Wirkungs-Kurven zeigte jedoch sich, dass sowohl ATP, als auch UTP eine signifikant geringere Vasoaktivität besitzen als Up4A. Somit kann die durch die Degradationsprodukte ausgelöste Vasoaktivität als eher gering eingeschätzt werden. Im Rahmen des Projektes wurde die Plasmakonzentration von Up4A im humanen Plasma (durchgeführt von Herrn PD Dr. rer. nat. Joachim Jankowski und Mitarbeitern) mit 55 nmol/l bestimmt. Es konnte gezeigt werden, dass Up4A in dieser Konzentration signifikante Veränderungen des renalen Perfusionsdruckes bewirkt. Um die Bedeutung von Up4A auf den systemischen mittleren Blutdruck einer Ratte zu überprüfen, wurde Up4A intraaortal appliziert und der Blutdruck kontinuierlich intraarteriell gemessen. Die Wirkung von Up4A wurde mit der von Noradrenalin (NE) verglichen. Die Applikation von NE bewirkte einen starken, aber lediglich kurzen Anstieg des MAD, wohingegen die Applikation von der gleichen Dosis Up4A zu einer schwächeren, aber signifikant länger anhaltenden Erhöhung des MAD führte (Abbildung 4e). Ein Befund der auf eine längere Halbwertszeit von Up4A beruhen könnte. Dinukleosidpolyphosphate sind durch die chemische Zusammensetzung gegen eine rasche Degradierung geschützt [55]. Die Stimulation von Endothelzellen mit Endothelin führte zu einer signifikanten Zunahme der Up4A Sekretion in den Überstand, so dass man eine Bedeutung von Up4A an der Endothelin induzierten Vasoaktivität postulieren kann. Zusammenfassend kann man sagen, dass Endothelzellen autokrin und parakrin aktive Zellen darstellen. Durch eine Reihe von Einflussfaktoren von mechanischem Reiz bis hin zu unterschiedlichen chemischen Reizen werden Endothelzellen zur Sekretion von vasoaktiven Hormonen angeregt. Im Rahmen dieser Publikationspromotion konnte zum ersten Mal ein neues vasoaktives Hormon, das gemischte Dinukleosidpolyphosphat Up4A, identifiziert, aufgereinigt und pharmakologisch charakterisiert werden. Dieses neuartige Dinukleosidpolyphosphat ist ein potenter Vasokonstriktor im renalen Perfusionsgebiet und vermag nach intraarterieller Applikation den MAD über einen signifikant langen Zeitraum zu erhöhen. Damit könnte Up4A als eines der „endothelium-derived contraction factors“ einen Einfluss auf unterschiedliche Formen der Hypertonie besitzen.


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13.11.2006