Aus der Medizinischen Klinik mit Schwerpunkt
Rheumatologie und Klinische Immunologie
der Medizinischen Fakultät der Charité -
Universitätsmedizin Berlin

Dissertation

Untersuchungen zu Wirkungen einer
eingeschränkten Energiesynthese auf
Funktionen von humanen Immunzellen

zur Erlangung des akademischen Grades
Doctor rerum medicarum (Dr. rer. medic.)

vorgelegt der Medizinischen Fakultät der Charité -
Universitätsmedizin Berlin

von
Robert Tripmacher
aus Berlin

Dekan: Prof. Dr. med. M. Paul

Gutachter:
1. Prof. Dr. med. B. Manger
2. Prof. Dr. med. R. H. Straub
3. Prof. Dr. med. F. Buttgereit

eingereicht am: 22.12.2004

Datum der Promotion: 13.05.2005

Kurzdarstellung

Hintergrund: Die Funktion von Immunzellen hängt von einer konstanten und ausreichenden Energieversorgung ab, die über die OXPHOS in den Mitochondrien und die Glykolyse im Zytosol realisiert wird. Die wichtigsten Substrate dafür sind Sauerstoff und Glukose.

Fragestellung: Bei schweren Erkrankungen oder in Entzündungsgebieten ist die zelluläre Energieversorgung stark beeinträchtigt, weil in der Mikroumgebung der Zelle Sauerstoff und Nährstoffe inadäquat bereitgestellt werden. Ziel war herauszufinden, ob und wie humane Immunzellen ihre Lebensfähigkeit und funktionellen Aktivitäten unter solchen Umständen aufrechterhalten.

Methoden: Humane CD4+ T-Zellen und CD14+ Monozyten wurden durch MACS aus peripherem Blut gesunder Spender isoliert. Die Sauerstoffverbrauchsmessung mittels Clark-Elektrode war Maß der oxidativen Energiebildung, die mit Myxothiazol und Glukoseentzug gehemmt wurde. Die CD3/CD28-stimulierte T-Zell-Proliferation wurde durchflußzytometrisch mittels CFDA SE analysiert. Basierend auf dem Paraformaldehyd-Saponin-Prozedere wurde die Zytokinsynthese ebenfalls am FACS bewertet, nachdem die T-Zellen in Anwesenheit von Brefeldin A mit PMA/Ionomycin stimuliert wurden. Mit einem käuflichen Testsystem (FACS-Technik) wurde die monozytäre Phagozytose untersucht. Die HIF-1α-Expression wurde nach PMA-Ionomycin-Stimulation von Myxothiazol-behandelten T-Zellen auf mRNA- und Proteinebene gemessen.

Ergebnisse: Bei Glukoseanwesenheit waren alle untersuchten Immunfunktionen trotz vollständig gehemmter OXPHOS unbeeinträchtigt. Erst bei gleichzeitigem Glukoseentzug, der per séProliferation und Phagozytose signifikant beeinträchtigte,waren sie signifikant vermindert. Es wird vermutet, daß T-Zellen die Energieverluste mit einem überschießenden Effekt ihres Sauerstoffverbrauchs und stark angetriebener Glykolyse kompensieren. HIF-1α ist dabei nicht entscheidend für die Umschaltung auf anaerobe Energiesynthese.

Schlußfolgerung: Die Daten quantifizieren die Energieanforderungen der funktionellen Aktivität in hochgereinigten humanen Immunzellfraktionen. Es wurde nachgewiesen, daß sich Immunzellen unerwartet lange an eine massiv beeinträchtigte Energetik adaptieren können und ihre spezifischen Funktionen aufrechterhalten.

Abstract

Background: The function of immune cells is dependent upon a constant and adequate supply of energy. Energy is formed via OXPHOS in the mitochondria and via cytosolic glycolysis. Oxygen and glucose are the main substrates for energy synthesis.

Objective: In severe diseases or in inflamed areas cellular energy supply is significantly impaired due to inadequate supply of cellular microenvironment with oxygen and nutrients. The aim of this study was to answer the question, whether and how human immune cells maintain viability and functional activity under these circumstances.

Methods: Human CD4+ T cells and CD14+ monocytes were isolated by MACS from peripheral blood of healthy donors. The extent of oxidative energy formation was determined via measurement of oxygen consumption using a Clark type electrode. Energy production was restricted in glucose-free cell culture medium and by gradually inhibited OXPHOS using myxothiazol. T cell proliferation was flow-cytometrically analysed using CFDA SE after stimulation with CD3 and CD28 antibodies. Cytokine synthesis was assessed by flow-cytometrical immunofluorescence and the paraformaldehyde-saponin procedure after stimulation of T cells with PMA/ionomycin in the presence of brefeldin A. Phagocytosis of monocytes was measured using a commercial test system (FACS technique). HIF-1α expression was assessed by semiquantitative PCR and immunoblot after the stimulation of myxothiazol treated T cells with PMA/ionomycin.

Results: In glucose-containing medium all investigated immune functions were unaffected even under complete suppression of OXPHOS. Only when OXPHOS and glycolysis were simultaneously and almost completely suppressed a significant decrease was found. Glucose deprivation per se caused both a significantly reduced proliferation and phagocytosis. It is supposed, that T cells are able to compensate for an energy deficit by an excess of oxygen consumption and strongly induced glycolysis. However, HIF-1α was found to be not crucial for switching to anaerobic energy synthesis.

Conclusion: These data quantify the energy requirement of functional activity in highly purified human immune cell fractions. An unexpectedly high adaptive potential of immune cells to maintain specific functions even under massively impaired energetic conditions could be demonstrated.

Eigene Schlagworte: CD4+ T-Zellen, CD14+ Monozyten, zellulärer Energiestoffwechsel, simulierter Sauerstoffmangel, Glukoseentzug, intrazelluläre Zytokinsynthese, T-Zell-Proliferation, Phagozytoseaktivität, HIF-1α

Keywords: CD4+ T cells, CD14+ monocytes, cellular energy metabolism, mimicked oxygen deficiency, glucose deprivation, intracellular cytokine synthesis, T cell proliferation, phagocytotic activity, HIF-1α

Inhaltsverzeichnis

• 1  Einleitung
  • 1.1 Energiestoffwechsel von Immunzellen
  • 1.2 Ableitung der Aufgabenstellungen
• 2  Material und Methoden
  • 2.1 Präparation von peripheren mononukleären Zellen des Blutes (PBMC)
  • 2.2 Magnetisch aktivierte Zellsortierung von CD4+ T-Zellen und CD14+ Monozyten
  • 2.3 Zellzählung
  • 2.4 Messung des zellulären Sauerstoffverbrauchs
    • 2.4.1 Stimulanzien und Hemmstoffe des zellulären Sauerstoffverbrauchs
  • 2.5 Zellaktivierung
    • 2.5.1 Unspezifische Zellaktivierung mit Phorbol-12-Myristat-13-Acetat (PMA) und Ionomycin zur Induktion der Zytokinsynthese bei CD4+ T-Zellen
    • 2.5.2 Spezifische Zellaktivierung mit anti-human CD3- und CD28-Antikörpern zur Induktion der Proliferation bei CD4+ T-Zellen
    • 2.5.3 Spezifische Zellaktivierung der CD14+ Monozyten mit Bakterien
  • 2.6  Zellkultivierung
  • 2.7  Fluoreszenzfärbungen
    • 2.7.1 Fixierung von Zellen in Suspension
    • 2.7.2 Intrazelluläre Immunfluoreszenzfärbung von Zytokinen
    • 2.7.3 Extrazelluläre Immunfluoreszenzfärbung von Zelloberflächenmolekülen
    • 2.7.4 Färbung mit Carboxyfluoresceindiacetatsuccinimidylester (CFDA, SE)
    • 2.7.5 Färbung mit Propidiumjodid
  • 2.8 Durchflußzytometrie
  • 2.9 Nachweis von HIF-1α-mRNA mittels semiquantitativer PCR
    • 2.9.1 Isolierung der Gesamt-RNA
    • 2.9.2 Umschreibung der RNA in cDNA
    • 2.9.3 Einstellung der cDNA-Menge
    • 2.9.4 Amplifikation der cDNA
    • 2.9.5 Analyse der Amplifikationsprodukte
  • 2.10 Nachweis des HIF-1α-Proteins mittels Western Blot-Analyse
    • 2.10.1 Tris-Glycin-SDS-Polyacrylamidgel-Elektrophorese
    • 2.10.2 Western-Blot
    • 2.10.3 Zugabe der Antikörper und Detektion
    • 2.10.4 β-Actin-Abgleich
  • 2.11 Verwendete Pufferlösungen
  • 2.12 Statistische Auswertung
• 3  Ergebnisse
  • 3.1 Durchflußzytometrische Bewertung der Zelltrennungen
    • 3.1.1 PBMC-Präparation
    • 3.1.2  Magnetisch separierte CD4+ T-Zellen und CD14+ Monozyten
  • 3.2  Sauerstoffverbrauchsmessungen mit der Clark-Elektrode
    • 3.2.1 Sauerstoffverbrauch von ruhenden und stimulierten PBMC
    • 3.2.2 Sauerstoffverbrauch von ruhenden und stimulierten CD4+ T-Zellen
    • 3.2.3 Titration des Sauerstoffverbrauchs mit Myxothiazol bei ruhenden CD4+ T-Zellen
    • 3.2.4 Sauerstoffverbrauch von ruhenden CD14+ Monozyten
    • 3.2.5 Titration des Sauerstoffverbrauchs mit Myxothiazol bei ruhenden CD14+ Monozyten
  • 3.3 Zytokinproduktion von Myxothiazol-behandelten CD4+ T-Zellen nach unspezifischer Stimulation mit PMA und Ionomycin
  • 3.4  Proliferation von Myxothiazol-behandelten CD4+ T-Zellen nach spezifischer Stimulation mit anti-human CD3- und CD28-Antikörpern
  • 3.5  Phagozytose von Myxothiazol-behandelten CD14+ Monozyten
  • 3.6 Berechnung des minimalen ATP-Bedarfs für das Überleben und die vollständige Funktionalität von CD4+ T-Zellen
  • 3.7 Beeinflussung der HIF-1α-mRNA- und -Proteinexpression bei CD4+ T-Zellen durch Myxothiazol und PMA-Ionomycin-Stimulation
• 4  Diskussion
  • 4.1 Vitalität und Funktionalität von PBMC aus Leukozytenfiltern
  • 4.2 Sauerstoffverbrauchsmessungen bei CD4+ T-Zellen
    • 4.2.1 Sauerstoffverbrauch von ruhenden CD4+ T-Zellen
    • 4.2.2 Sauerstoffverbrauch von Con A-stimulierten CD4+ T-Zellen
  • 4.3 Sauerstoffverbrauchsmessungen bei CD14+ Monozyten
  • 4.4 Titration des Sauerstoffverbrauchs mit Myxothiazol bei CD4+ T-Zellen und CD14+ Monozyten
  • 4.5 Effekte eines beeinträchtigten Energiestoffwechsels auf die PMA-Ionomycin-induzierte Zytokinsynthese bei CD4+ T-Zellen
    • 4.5.1 Aktivierung und Differenzierung von T-Lymphozyten
    • 4.5.2  Wirkungen von Cofaktor- und Vitaminentzug
    • 4.5.3 Wirkungen einer vollständigen Hemmung der OXPHOS unter glukosefreien Bedingungen
    • 4.5.4 Wirkungen einer vollständigen Hemmung der OXPHOS unter glukosehaltigen Bedingungen
  • 4.6 Effekte eines beeinträchtigten Energiestoffwechsels auf die Proliferation bei CD4+ T-Zellen
    • 4.6.1 Wirkungen einer vollständigen Hemmung der OXPHOS unter glukosefreien Bedingungen
    • 4.6.2 Wirkungen einer vollständigen Hemmung der OXPHOS unter glukosehaltigen Bedingungen
  • 4.7  Effekte eines beeinträchtigten Energiestoffwechsels auf die Phagozytoseaktivität von CD14+ Monozyten
    • 4.7.1 Wirkungen einer vollständigen Hemmung der OXPHOS unter glukosefreien Bedingungen
    • 4.7.2 Wirkungen einer vollständigen Hemmung der OXPHOS unter glukosehaltigen Bedingungen
  • 4.8 Hierarchie der Abhängigkeit der untersuchten Immunfunktionen von der glykolytischen und oxidativen Energiegewinnung
  • 4.9 Einfluß des Hypoxie-induzierbaren Faktors-1 auf die ATP-Synthese bei Myxothiazol-gehemmten PMA-Ionomycin-stimulierten CD4+ T-Zellen
  • 4.10 Anstieg des zellulären Sauerstoffverbrauchs zur Sicherstellung des ATP-Bedarfs bei Myxothiazol-gehemmten PMA-Ionomycin-stimulierten CD4+ T-Zellen
• 5  Zusammenfassung
• Literaturverzeichnis
• Abkürzungsverzeichnis
• Danksagung
• Eidesstattliche Erklärung

Tabellen

• Tab. 1: Verwendete Fluoreszenzfarbstoffe
• Tab. 2: Primer zur Amplifikation der HIF-1α- und β-Actin-cDNA
• Tab. 3: Zusammenhang zwischen Zellzahl und Sauerstoffverbrauch von PBMC in verschiedenen Zellkulturmedien
• Tab. 4: Zusammenhang zwischen Zellzahl und basalem Sauerstoffverbrauch von CD4+ T-Zellen in verschiedenen Zellkulturmedien
• Tab. 5: Minimaler Sauerstoffbedarf von 10⁷ CD4+ T-Zellen für 6 h PMA-Ionomycin-Stimulation
• Tab. 6: Minimaler ATP-Bedarf aus der OXPHOS von 10⁷ CD4+ T-Zellen für 6 h PMA-Ionomycin-Stimulation
• Tab. 7: Vergleich des Sauerstoffverbrauchs humaner PBMC
• Tab. 8: Vergleich des Sauerstoffverbrauchs verschiedener ruhender Immunzellpopulationen (nmol O₂/min/10⁷ Zellen)
• Tab. 9: Nach der Methode der kleinsten Quadrate ermittelte Funktionen für die Myxothiazol-Titrationskurven der CD4+ T-Zellen
• Tab. 10: Nach der Methode der kleinsten Quadrate ermittelte Funktionen für die Myxothiazol-Titrationskurven der CD14+ Monozyten
• Tab. 11: Myxothiazoldosis für eine 50%ige Hemmung der Atmung (pmol Myxothiazol/10⁷ Zellen)
• Tab. 12: Anzahl Mitochondrien pro Zelle
• Tab. 13: Relativer Anteil der extramitochondrialen Atmung an der zellulären Gesamtatmung
• Tab. 14: Hierarchie der Abhängigkeit der Immunfunktionen von der Glykolyse
• Tab. 15: Hierarchie der Abhängigkeit der Immunfunktionen von der OXPHOS
• Tab. 16: Sechsstündiger Sauerstoffverbrauch (nmol) von 10⁷ CD4+ T-Zellen unter glukosefreien Bedingungen
• Tab. 17: Sechsstündiger Energieverbrauch (µmol ATP) von 10⁷ CD4+ T-Zellen unter glukosefreien Bedingungen
• Tab. 18: Steigerung des Sauerstoffverbrauchs (fmol) von Mitochondrien in CD4+ T-Zellen, induziert durch PMA und Ionomycin

Bilder

• Abb. 1: Wichtige ATP-verbrauchende Funktionen von Immunzellen (verändert nach Buttgereit et al. 2000). EZ = Endothelzelle, PMN = polymorphnukleäre Zelle, APZ = Antigen-präsentierende Zelle.
• Abb. 2: Schema der prinzipiellen experimentellen Vorgehensweise.
• Abb. 3: Isolierung von PBMC mittels Ficoll-Paque^® Plus-Technik.
• Abb. 4: Magnetisch aktivierte Zellsortierung. N = magnetischer Nordpol, S = magnetischer Südpol.
• Abb. 5: Versuchsaufbau der Sauerstoffverbrauchsmessung. [1] Stopfen mit Clark-Elektrode, [2] Polypropylenmembran, befestigt mit O-Ring, [3] Kanal zur Wirkstoffzugabe, [4] Kabel zum Sauerstoffmeßgerät, [5] Inkubationsgefäß mit Wassermantel, [6] Wasserzu- und [7] -ablauf vom Thermostat, [8] Zellsuspension (rosa) mit Magnetrührstäbchen (weiß), [9] Magnetrührplatte.
• Abb. 6: Originalabbildung eines Sauerstoffverbrauchsexperiments mit PBMC. Durch die Zugabe des Mitogens Con A wird die Atmung angeregt, so daß die gleiche Menge Sauerstoff in kürzerer Zeit verbraucht wird. Die Zugabe des Glucocorticoids bewirkt einen Rückgang der stimulierten Atmung, so daß der Anstieg der Kurve steiler wird. Ab diesem Zeitpunkt nimmt der Sauerstoffverbrauch pro Zeiteinheit wieder ab.
• Abb. 7: Prinzip der Streulicht- und Fluoreszenzmessung am Durchflußzytometer.
• Abb. 8: Durchflußzytometrische Analyse von Vollblut (A) und PBMC (B). R = Region. In A sind durch R1, R2 und R3 jeweils die Lymphozyten, Monozyten und Granulozyten eingegrenzt, in B durch R2, R3 und R4. Ungefärbte Zellen zeigt R5. Die prozentualen Anteile der einzelnen Regionen und damit der Zellpopulationen sind tabellarisch aufgeführt. Bei 27,0 % der PBMC handelte es sich in diesem Beispiel um CD4+ T-Zellen (R7). Monozyten waren mit dem Antikörper markiert, weil sie das CD4-Oberflächenantigen schwach exprimieren (R6).
• Abb. 9: Durchflußzytometrische Erfolgskontrolle einer magnetisch aktivierten Zellsortierung von CD4+ T-Zellen mittels MultiTest-Reagenz^TM. In diesem Beispiel waren 94,1 % der Zellen lebensfähig (R1). Von den lebensfähigen Zellen waren 99,4 % CD4-positiv.
• Abb. 10: Durchflußzytometrische Erfolgskontrolle einer magnetisch aktivierten Zellsortierung von CD4+ T-Zellen mittels anti-human CD4-FITC-Antikörpern. In diesem Beispiel waren 98,6 % der Zellen lebensfähig (R1). Von den lebensfähigen Zellen waren 98,9 % CD4-positiv (R2). In geringem Umfang waren CD4­negative Zellen (R3) und Monozyten (R4) vorhanden.
• Abb. 11: Durchflußzytometrische Erfolgskontrolle einer magnetisch aktivierten Zellsortierung von CD14+ Monozyten mittels anti-human CD14-FITC-Antikörpern. In diesem Beispiel waren 97,9 % der Zellen lebensfähig (R1). Von den lebensfähigen Zellen waren 98,7 % CD14-positiv. PJ = Propidiumjodid.
• Abb. 12: Sauerstoffverbrauch ruhender PBMC in verschiedenen Zellkulturmedien. In BE ohne Glukose wurden insgesamt 28 Messungen durchgeführt (11 Präp.), in BE mit Glukose 8 (4 Präp.), in RPMI 1640 ohne Glukose 46 (15 Präp.) und in RPMI 1640 mit Glukose 43 (16 Präp.). * p = 0,003.
• Abb. 13: Sauerstoffverbrauch Con A-stimulierter PBMC in verschiedenen Zellkulturmedien. In BE ohne Glukose wurden insgesamt 28 Messungen durchgeführt (11 Präp.), in BE mit Glukose 8 (4 Präp.), in RPMI 1640 ohne Glukose 20 (10 Präp.) und in RPMI 1640 mit Glukose 28 (11 Präp.). * p = 0,037.
• Abb. 14: Sauerstoffverbrauch ruhender und Con A-stimulierter PBMC in BE ohne Glukose (n = 8 [4 Präp.]). Das Blut zur PBMC-Gewinnung wurde zum Vergleich mit der Atmung von PBMC aus Leukozytenfiltern durch Punktion einer Vene gewonnen.
• Abb. 15: Sauerstoffverbrauch ruhender und Con A-stimulierter PBMC 5 h nach Präparation in BE ohne (n = 14 [7 Präp.]) und mit Glukose (n = 8 [4 Präp.]). * p = 0,016.
• Abb. 16: Sauerstoffverbrauch von PBMC nach Zugabe von anti-human CD4-MicroBeads^TM  (n = 5 [5 Präp.]) und Con A (n = 2 [bei 2 der 5 Präp.]) in BE ohne Glukose.
• Abb. 17: Sauerstoffverbrauch ruhender und Con A-stimulierter PBMC aus Negativfraktionen magnetisch aktivierter Zellsortierungen in BE ohne Glukose (n = 30 [14 Präp.]). * p < 0,001.
• Abb.18: Sauerstoffverbrauch von CD4+ T-Zellen in RPMI 1640 unter kontinuierlich fallender Sauerstoffsättigung. Beide Kurven wurden durch ununterbrochene Messungen mit Zellen aus jeweils drei unabhängigen Zellpräparationen ermittelt. WB = Wiederbelüftung.
• Abb. 19: Sauerstoffverbrauch ruhender CD4+ T-Zellen in RPMI 1640 ohne (n = 143 [46 Präp.]) und mit Glukose (n = 126 [42 Präp.]). * p = 0,014.
• Abb. 20: Sauerstoffverbrauch Con A-stimulierter CD4+ T-Zellen nach Zugabe von PBMC in bis zu 24 unabhängigen Experimenten in BE ohne Glukose. * p = 0,027 bzw. 0,008.
• Abb. 21: Zeitlicher Verlauf des Sauerstoffverbrauchs von CD4+ T-Zellen nach verschiedenen Myxothiazoldosen bei Glukoseverfügbarkeit (links) und unter glukosefreien Bedingungen (rechts) in Ab- (oben) und Anwesenheit (unten) von PMA und Ionomycin.
• Abb. 22: Zeitlicher Verlauf der Überlebensraten von PMA-Ionomycin-stimulierten CD4+ T-Zellen nach max1- und max2-Myxothiazoldosis bei Glukoseverfügbarkeit (links) und unter glukosefreien Bedingungen (rechts).
• Abb. 23: Sauerstoffverbrauch von CD4+ T-Zellen nach submaximaler Myxothiazoldosis, dreistündiger PMA-Ionomycin-Stimulation und FCCP-Zugabe bei Glukoseverfügbarkeit und unter glukosefreien Bedingungen.
• Abb. 24: Titration des Sauerstoffverbrauchs mit Myxothiazol bei CD4+ T-Zellen in RPMI 1640 ohne Glukose. Jeder Meßpunkt wurde in bis zu 38 unabhängigen Experimenten ermittelt.
• Abb. 25: Titration des Sauerstoffverbrauchs mit Myxothiazol bei CD4+ T-Zellen in RPMI 1640 mit Glukose. Jeder Meßpunkt wurde in bis zu 32 unabhängigen Experimenten ermittelt.
• Abb. 26: Titration des Sauerstoffverbrauchs mit FCCP bei CD4+ T-Zellen in RPMI 1640.
• Abb. 27: Sauerstoffverbrauch von CD4+ T-Zellen nach submax-, max1- und max2-Myxothiazoldosis mit anschließender Zugabe von 0,5 µM FCCP in RPMI 1640 ohne Glukose.
• Abb. 28: Sauerstoffverbrauch von CD4+ T-Zellen nach submax-, max1- und max2-Myxothiazoldosis mit anschließender Zugabe von 1 µM FCCP in RPMI 1640 mit Glukose.
• Abb. 29: Sauerstoffverbrauch ruhender CD14+ Monozyten in RPMI 1640 ohne (n = 22 [7 Präp.]) und mit Glukose (n = 23 [7 Präp.]). * p = 0,017.
• Abb. 30: Titration des Sauerstoffverbrauchs mit Myxothiazol bei CD14+ Monozyten in RPMI 1640 ohne Glukose. Jeder Meßpunkt wurde in bis zu sieben unabhängigen Experimenten ermittelt.
• Abb. 31: Titration des Sauerstoffverbrauchs mit Myxothiazol bei CD4+ T-Zellen in RPMI 1640 mit Glukose. Jeder Meßpunkt wurde in bis zu neun unabhängigen Experimenten ermittelt.
• Abb. 32: Frequenz Zytokin-produzierender CD4+ T-Zellen in verschiedenen Zellkulturmedien aus sechs unabhängigen Zellpräparationen. * p = 0,031 vs. korrespondierenden Wert in Medium A und B.
• Abb. 33: Frequenz Zytokin-produzierender CD4+ T-Zellen in Abhängigkeit vom Sauerstoffverbrauch bei Glukoseverfügbarkeit (A) und unter glukosefreien Bedingungen (B) in jeweils sechs unabhängigen Experimenten.
• Abb. 34: Glukoseentzug und vollständig gehemmter zellulärer Sauerstoffverbrauch reduzieren sehr deutlich den relativen Anteil von IL-2- und IFN-γ-produzierenden CD4+ T-Zellen.
• Abb. 35: Glukoseentzug und vollständig gehemmter zellulärer Sauerstoffverbrauch reduzieren sehr deutlich den relativen Anteil von TNF-α- und IL-4-produzierenden CD4+ T-Zellen.
• Abb. 36: Frequenz proliferierender CD4+ T-Zellen in Abhängigkeit vom Sauerstoffverbrauch bei Glukoseverfügbarkeit und unter glukosefreien Bedingungen.
• Abb. 37: Glukoseentzug und vollständig gehemmter zellulärer Sauerstoffverbrauch vermindern sehr deutlich den relativen Anteil von proliferierenden CD4+ T-Zellen.
• Abb. 38: Frequenz phagozytierender CD14+ Monozyten in Abhängigkeit vom Sauerstoffverbrauch bei Glukoseverfügbarkeit und unter glukosefreien Bedingungen.
• Abb. 39: Glukoseentzug und vollständig gehemmter zellulärer Sauerstoffverbrauch vermindern sehr deutlich den relativen Anteil phagozytierender CD14+ Monozyten.
• Abb. 40: HIF-1α-mRNA-Expressionsnachweis auf cDNA-Ebene mittels semiquantitativer PCR. Dargestellt ist beispielhaft das Ergebnis eines einzelnen Versuchs in Medium D mit PMA-Ionomycin-stimulierten und unstimulierten CD4+ T-Zellen. 1 = 100 % Atmung, 2 = 50 % Restatmung, 3 = vollständige Atmungshemmung mit der submaximalen Myxothiazoldosis, Kontrolle = A. dest.
• Abb. 41: HIF-1α-Protein-Expressionsnachweis mittels Western-Blot-Analyse. Es wurden PMA-Ionomycin-stimulierte und unstimulierte CD4+ T-Zellen eines Experiments unter Glukoseverfügbarkeit (A) und unter glukosefreien Bedingungen (B) verwendet. N = Normoxie, H = Hypoxie, M = submaximale Myxothiazoldosis, (+) = CoCl₂-behandelte HeLa-Zell-Positivkontrolle.