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1  Einleitung

1.1 Energiestoffwechsel von Immunzellen

Immunzellen benötigen für allgemeine und spezifische Funktionen beträchtliche Mengen an Energie in Form von ATP (Buttgereit et al. 2000). Die Energie wird verbraucht für den transmembranen Ionentransport, die Makromolekülsynthese und für wichtige Prozesse, die an der Auseinandersetzung mit Antigenen beteiligt sind (Abb. 1). Ein ungestörtes Funktionieren des Immunsystems ist ohne eine adäquate Energieversorgung nicht möglich.

Abb. 1: Wichtige ATP-verbrauchende Funktionen von Immunzellen (verändert nach Buttgereit et al. 2000). EZ = Endothelzelle, PMN = polymorphnukleäre Zelle, APZ = Antigen-präsentierende Zelle.

Der Energiestoffwechsel von Immunzellen ist während der Zellaktivierung durch Antigene und Mitogene drastischen Veränderungen ausgesetzt und spielt bei der Regulation der zellulären Antwort in der angeborenen und erworbenen Immunität eine zentrale Rolle (Buttgereit et al. 2000, Krauss et al. 2001, Plas und Thompson 2002). Eine schnelle und anhaltende Steigerung der Energiebereitstellung ist für die Absicherung von Proliferation, Differenzierung und Effektorfunktionen wie die Synthese von Zytokinen, Chemokinen und Adhäsionsmolekülen [Seite 12↓]erforderlich.

Die von Zellen verwendete freie Energie wird über die oxidative Phosphorylierung (OXPHOS) in der Atmungskette der Mitochondrien und die zytosolische Glykolyse produziert. Beide Systeme stehen über den Zitratzyklus miteinander in Verbindung. In aeroben Organismen ist aber die OXPHOS die Hauptenergiequelle (Saraste 1999). Die freie Energie steht den Zellen hauptsächlich in Form von endogen gebildetem ATP zur Verfügung. Extrazelluläres ATP wird von aktivierten Thrombozyten und Zellen unter Hypoxie, Stress oder bei Gewebszerstörung freigesetzt. Die immunologischen Aktivitäten von extrazellulärem ATP beinhalten eine mitogene Stimulation, die Freisetzung von Zytokinen, die Induktion von Zelltod über die Stimulation spezifischer purinerger Rezeptoren und Effekte auf die Signaltransduktion (Ferrari et al. 1997, Langston et al. 2003).

Lymphozyten gewinnen unter aeroben Bedingungen den größten Teil oder ihre gesamte Energie über die OXPHOS (Seitz 1965). Roos und Loos (1973) konnten ermitteln, daß auf diese Weise 85 % gewonnen werden. Der Rest wird über die Glykolyse bereitgestellt. Das Hauptsubstrat ihres Energiestoffwechsels ist Glukose (Kirschner et al. 1972). Trotzdem können Lymphozyten und Monozyten unter anaeroben Bedingungen ihre ATP-Konzentration problemlos durch eine gesteigerte anaerobe Glykolyse aufrechterhalten (Levene und Meyer 1912a, 1912b, Fleischmann und Kubowitz 1927, Kempner 1939, Seitz 1965, Laszlo 1967, Lewis et al. 1999, Kato und Walz 2000, Kawaguchi et al. 2001). Aber auch unter aeroben Bedingungen werden in Lymphozyten die ATP-Konzentrationen weitestgehend sichergestellt, wenn keine Glukose verfügbar ist (Seitz 1965, Laszlo 1967). Ein Grund liegt darin, daß die Glykolyse in diesen Zellen ohnehin durch die Anwesenheit von Sauerstoff gehemmt wird (Baierlein und Foster 1968, Kirschner et al. 1972, Newsholme et al. 1985a, Merlo-Pich et al. 2004). Dieser an Hefen entdeckte Effekt wurde nach seinem Entdecker als Pasteur-Effekt bezeichnet (Pasteur 1876). Darüber hinaus wird bei Glukosemangel der zelluläre Sauerstoffverbrauch von Immunzellen gesteigert (Bielka 1963, Seitz 1965, Kirschner et al. 1972, Guppy et al. 1993). Dieser Effekt wird umgekehrter Pasteur-Effekt oder Crabtree-Effekt (Crabtree 1929) genannt. Anstelle von Glukose können verstärkt Aminosäuren zur Energiegewinnung oxidiert werden. Möglicherweise gewinnen alle myeloiden Zellen ihre Energie sowohl unter aeroben als auch anaeroben Bedingungen über die Glykolyse (Sbarra und Karnovsky 1959, Cramer et al. 2003). Deshalb verfügen sie offenbar nicht über den Pasteur-Effekt (Cramer et al. 2003).


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Ruhende Lymphozyten und Monozyten besitzen keine bedeutsamen intrazellulären Glykogenspeicher (Fiorucci et al. 2004). Sie sind deshalb auf den Import von extrazellulärer Glukose und die anschließende Glykolyse im Zytosol zur ATP-Synthese angewiesen (Levene und Meyer 1912a, Kempner 1939, Roos und Loos 1970, Sagone et al. 1974). Die Regulation der Glukoseaufnahme in Lymphozyten ist aber nur teilweise entschlüsselt. Der bisherigen Auffassung nach sind Glukoseaufnahme und Glykolyse durch das intrazelluläre Niveau von ATP und anderen Metaboliten homöostatisch reguliert. Es mehren sich jedoch Hinweise, daß bioenergetische Funktionen dieser Zellen selektives Ziel von costimulatorischen Molekülen wie CD28 sind (Frauwirth et al. 2002, Frauwirth und Thompson 2004) oder durch Moleküle des Radikalstoffwechsels wie Stickstoffmonoxid (NO) (Fiorucci et al. 2004) und reaktive Sauerstoffspezies (ROS) (Arai et al. 2004, Remans et al. 2004) geregelt werden.

1.2 Ableitung der Aufgabenstellungen

(1) Entwicklung eines in vitro Modells, in dem die zelluläre Energiegewinnung vermindert ist

Einleitend wurde dargestellt, daß die Funktion von Lymphozyten und Monozyten von einer konstanten und ausreichenden Versorgung mit Energie abhängig ist. Die Energie wird durch die Metabolisierung von Sauerstoff und Glukose produziert. Bei schweren Erkrankungen oder in Entzündungsgebieten wird die zelluläre Energieversorgung möglicherweise drastisch beeinträchtigt, weil eine ausreichende Versorgung mit Sauerstoff und Nährstoffen nicht mehr gewährleistet ist. So ist die Mikroumgebung in entzündeten Geweben durch niedrige Sauerstoff- und Glukose- und hohe Konzentrationen von Laktat und reduktiven Metaboliten gekennzeichnet (Kittlick 1986, Schor et al. 2000, Saadi et al. 2002). Bei der Rheumatoiden Arthritis (RA) finden sich in betroffenen Gelenken ganz ähnliche Situationen. Hypoxie, erhöhte CO2-Konzentrationen, die zu einer synovialen Azidose führen, und verstärkte Laktat- und Acetatansammlung sind Ausdruck des anaeroben Stoffwechsels (Stevens et al. 1991). Areale mit geringen Sauerstoffpartialdrücken als ein gemeinsames Hauptmerkmal liegen auch in malignen Tumoren (Vaupel et al. 1989), Wunden (Kivisaari 1975) und arteriosklerotischen Plaques (Bjornheden et al. 1999) vor. Es gibt Hinweise dafür, daß während einer Sepsis die zelluläre Energetik nicht durch eine inadäquate Gewebedurchblutung gestört ist, sondern durch eine beeinträchtigte Atmung aufgrund einer erworbenen intrinsischen Störung in der mitochondrialen Atmungskette (zytopathische Hypoxie) (Crouser et al. 2002, Fink 2002, Gellerich et al. 2002, Brealey et al. 2004). Aus entwicklungsbiologischer Sicht unterliegen Immunzellen während ihrer Reifung aufgrund der Migration zwischen den unterschiedlichen [Seite 14↓]Organen (Knochenmark, Thymus, Blut, Lymphknoten) aber auch starken Schwankungen der Sauerstoff- und Nährstoffkonzentrationen (Westermann und Bode 1999).

Zusammenfassend läßt sich also festhalten: Effektorzellen des angeborenen Immunsystems (Cramer et al. 2003) und Zellen der adaptativen Immunantwort geraten in eine Situation der suboptimalen Energieversorgung, wenn sie in Gebiete mit verringerten Sauerstoff- und Glukosekonzentrationen eingewandert sind. Sie müssen unter diesen erschwerten Bedingungen aber trotzdem funktionieren. Deshalb war in der vorliegenden Untersuchung ein in vitro Modell zu entwickeln, in dem durch graduelle und definierte Reduzierung der ATP-Bereitstellung in der OXPHOS mittels Myxothiazol, graduelle und definierte Reduzierung von Nährstoffen in der zellulären Mikroumgebung und Aktivierung verschiedener Immunzellfraktionen solche Bedingungen wirkungsvoll nachgestellt sind. Es sollte herausgefunden werden, ob Immunzellen unter diesen Bedingungen in der Lage sind, energetisch nicht nur ihre lebenserhaltenden, sondern auch ihre spezifischen Funktionen aufrechtzuerhalten.

(2) Untersuchung der Hierarchie der bioenergetischen Bedeutsamkeit von spezifischen Immunfunktionen mit Hilfe des zu entwickelnden in vitro Modells

Für allgemeine Zellfunktionen wie die Makromolekülsynthese oder der Ionentransport konnte aus bioenergetischer Sicht bei B- und T-Lymphozyten eine hierarchische Ordnung nachgewiesen werden (Buttgereit et al. 1991, Buttgereit et al. 1992, Buttgereit und Brand 1995, Schmid et al. 2000). So wird in Situationen der Unterversorgung zunächst die Proteinbiosynthese drastisch reduziert, während der überlebenssichernde Ionentransport noch aufrechterhalten wird. In dieser Arbeit sollte mit Hilfe des zu entwickelnden in vitro Modells die erstmalige Charakterisierung spezifischer Immunfunktionen hinsichtlich einer Hierarchie ihrer bioenergetischen Bedeutsamkeit angestrebt werden. Myxothiazol und/oder Entzug von Nährstoffen (Glukose) bewirken eine ATP-Reduktion und zwingen daher betroffene Zellen zur Einsparung metabolischer Energie. Das könnte sich in einer Verminderung bzw. Abschaltung von spezifischen Immunfunktionen widerspiegeln. Dabei könnte sich eine Reihenfolge des Abschaltens spezifischer Funktionen herausstellen. Diese Hierarchie würde die relative bioenergetische Bedeutsamkeit der einzelnen Immunfunktion reflektieren.

(3) Auswahl der zu untersuchenden Immunzellen und spezifischen Immunfunktionen

Für die Untersuchungen wurden folgende Immunzellen und spezifische Immunfunktionen ausgewählt:


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T-Lymphozyten: (i) Zellulärer Sauerstoffverbrauch von humanen peripheren CD4+ T-Zellen als Maß für den ATP-Bedarf von sowohl lebenserhaltenden als auch spezifischen zellulären Funktionen, (ii) Zytokinproduktion und (iii) Proliferation als Effektorfunktionen.

Monozyten: (iv) Zellulärer Sauerstoffverbrauch von humanen peripheren CD14+ Monozyten als Maß für den ATP-Bedarf von sowohl lebenserhaltenden als auch spezifischen zellulären Funktionen und (v) deren Phagozytoseaktivität.

Bei der Auswahl der Immunzellen und Immunfunktionen wurde auf repräsentative Relevanz geachtet. CD4+ T-Zellen und Monozyten/Makrophagen infiltrieren verstärkt das chronisch entzündete Synovium in der RA (Morita et al. 1998, Tak und Bresnihan 2000). Es wird vermutet, daß der Krankheitsprozeß durch das Zytokinprofil der Zellen beeinflußt wird (Germann et al. 1995, Maeda et al. 2002). Lymphozyten wandern aber auch in Tumore ein (Loeffler et al. 1990, Turner et al. 1999). Monozyten/Makrophagen akkumulieren in großer Anzahl in hypoxischen und ischämischen Arealen von pathologisch veränderten Geweben wie soliden Tumoren, in arteriosklerotischen Plaques, in arthritischen Gelenken (Lewis et al. 1999, Burke et al. 2003) und in Entzündungsgebieten (Kittlick 1986, Cramer et al. 2003). Während einer Sepsis-induzierten Immunparalyse kommt es zu einer merklichen Erhöhung der zirkulierenden CD4+CD25+ regulatorischen T-Zellen (Monneret et al. 2003).

Diese Situationen sollten im Labor unter idealen Bedingungen nachgestellt werden. Damit sollten Erkenntnisse zu Funktion und Regulation in relevanten Immunzellen unter diesen Bedingungen erlangt werden.


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06.06.2005