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3  Ergebnisse

3.1 Durchflußzytometrische Bewertung der Zelltrennungen

3.1.1 PBMC-Präparation

Wie in durchflußzytometrischen Analysen gezeigt werden konnte, setzten sich frisch isolierte PBMC aus Leukozytenfiltern aus ca. 70 % Lymphozyten, 10 % Monozyten und 20 % Granulozyten zusammen. Damit waren im Vergleich zu Vollblut, in dem ca. 30 % Lymphozyten, 10 % Monozyten und 60 % Granulozyten gefunden wurden, die Lymphozyten deutlich angereichert. Die folgende Abbildung zeigt beispielhaft zweidimensionale Dot-plot-Darstellungen des Vorwärts-Seitwärts-Streulichts einer Vollblut- und einer PBMC-Untersuchung sowie eine zweidimensionale Dot-plot-Darstellung der Fluoreszenz von mit anti-human CD4-FITC gefärbten PBMC.

Abb. 8: Durchflußzytometrische Analyse von Vollblut (A) und PBMC (B). R = Region. In A sind durch R1, R2 und R3 jeweils die Lymphozyten, Monozyten und Granulozyten eingegrenzt, in B durch R2, R3 und R4. Ungefärbte Zellen zeigt R5. Die prozentualen Anteile der einzelnen Regionen und damit der Zellpopulationen sind tabellarisch aufgeführt. Bei 27,0 % der PBMC handelte es sich in diesem Beispiel um CD4+ T-Zellen (R7). Monozyten waren mit dem Antikörper markiert, weil sie das CD4-Oberflächenantigen schwach exprimieren (R6).


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3.1.2  Magnetisch separierte CD4+ T-Zellen und CD14+ Monozyten

In anderen durchflußzytometrischen Analysen konnte für alle magnetisch aktivierten Zellsortierungen eine bis zu 99%ige Reinheit nachgewiesen werden. Generell waren bis zu
99 % der Zellen lebensfähig. Die Abbildung 9 zeigt zweidimensionale Dot-plot-Darstellungen der Fluoreszenz von mit MultiTest-ReagenzTM gefärbten CD4+ T-Zellen. Später wurde nur noch mit anti-human CD4-FITC-Antikörpern gearbeitet (Abb. 10).

Abb. 9: Durchflußzytometrische Erfolgskontrolle einer magnetisch aktivierten Zellsortierung von CD4+ T-Zellen mittels MultiTest-ReagenzTM. In diesem Beispiel waren 94,1 % der Zellen lebensfähig (R1). Von den lebensfähigen Zellen waren 99,4 % CD4-positiv.


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Abb. 10: Durchflußzytometrische Erfolgskontrolle einer magnetisch aktivierten Zellsortierung von CD4+ T-Zellen mittels anti-human CD4-FITC-Antikörpern. In diesem Beispiel waren
98,6 % der Zellen lebensfähig (R1). Von den lebensfähigen Zellen waren 98,9 % CD4-positiv (R2). In geringem Umfang waren CD4­negative Zellen (R3) und Monozyten (R4) vorhanden.

Die folgende Abbildung zeigt zweidimensionale Dot-plot-Darstellungen der Fluoreszenz von mit anti-human CD14-FITC gefärbten Monozyten.

Abb. 11: Durchflußzytometrische Erfolgskontrolle einer magnetisch aktivierten Zellsortierung von CD14+ Monozyten mittels anti-human CD14-FITC-Antikörpern. In diesem Beispiel waren 97,9 % der Zellen lebensfähig (R1). Von den lebensfähigen Zellen waren 98,7 % CD14-positiv. PJ = Propidiumjodid.


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3.2  Sauerstoffverbrauchsmessungen mit der Clark-Elektrode

3.2.1 Sauerstoffverbrauch von ruhenden und stimulierten PBMC

In diesem Untersuchungsabschnitt wurden zunächst standardisierte Bedingungen für die Sauerstoffverbrauchsmessungen an unterschiedlichen Zellpopulationen hergestellt Es lagen keine Erkenntnisse und Erfahrungen über den Sauerstoffverbrauch von aus Leukozytenfiltern gewonnenen Zellen vor. Deshalb diente die Sauerstoffverbrauchsmessung gleichzeitig als Nachweis dafür, daß diese Zellen vital und funktionell aktiv sind.

Wie in der folgenden Tabelle dargestellt, konnte unabhängig von der Zusammensetzung des Zellkulturmediums eine positive, relativ enge Korrelation (r) zwischen der eingesetzten Zellmenge und dem Sauerstoffverbrauch von frisch aus Leukozytenfiltern präparierten PBMC festgestellt werden. Die von Null verschiedene Signifikanz wurde mit dem T-Test nach Student berechnet.

Tab. 3: Zusammenhang zwischen Zellzahl und Sauerstoffverbrauch von PBMC in verschiedenen Zellkulturmedien

 

BE ohne Glukose

BE mit Glukose

RPMI 1640 ohne Glukose

RPMI 1640 mit Glukose

r

0,84

0,93

0,62

0,56

Signifikanz

+

+

+

+

n

28 (11 Präp.)

8 (4 Präp.)

46 (15 Präp.)

43 (16 Präp.)

In den folgenden zwei Abbildungen sind die Sauerstoffverbrauchsraten ruhender und Con A-stimulierter PBMC aus Leukozytenfiltern in den verschiedenen Zellkulturmedien dargestellt.


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Abb. 12: Sauerstoffverbrauch ruhender PBMC in verschiedenen Zellkulturmedien. In BE ohne Glukose wurden insgesamt 28 Messungen durchgeführt (11 Präp.), in BE mit Glukose 8 (4 Präp.), in RPMI 1640 ohne Glukose 46 (15 Präp.) und in RPMI 1640 mit Glukose 43 (16 Präp.). * p = 0,003.

Abb. 13: Sauerstoffverbrauch Con A-stimulierter PBMC in verschiedenen Zellkulturmedien. In BE ohne Glukose wurden insgesamt 28 Messungen durchgeführt (11 Präp.), in BE mit Glukose 8 (4 Präp.), in RPMI 1640 ohne Glukose 20 (10 Präp.) und in RPMI 1640 mit Glukose 28 (11 Präp.). * p = 0,037.


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Der basale Sauerstoffverbrauch in BE mit Glukose war um 16,8 ± 2,5 % niedriger als in BE ohne Glukose. Aufgrund der geringen Anzahl von unabhängigen Experimenten (Präparationen) in BE mit Glukose wurde jedoch die statistische Signifikanz verfehlt. In BE ohne Glukose bewirkte die Zugabe von Con A einen statistisch signifikanten Anstieg des Sauerstoffverbrauchs um 45,4 ± 5,2 % (p = 0,001). In BE mit Glukose stieg er dadurch um 24,7 ± 2,9 % an. Aus genanntem Grund konnte dieser Anstieg statistisch jedoch nur als tendenziell eingestuft werden. Die in den RPMI-Medien beobachteten Basalatmungen der PBMC unterschieden sich von denen der BE-Medien statistisch nicht signifikant. Der um 17,6 ± 5,4 % geringere Sauerstoffverbrauch in RPMI 1640 mit Glukose war wie auch dessen Anstieg um 37,3 ± 5,0 % infolge Con A-Zugabe statistisch signifikant (p = 0,003 und 0,001). Wenn die Zellen in RPMI 1640 ohne Glukose mit Con A stimuliert wurden, stieg deren Sauerstoffverbrauch statistisch signifikant um 40,7 ± 6,6 % (p = 0,002).

In Anlehnung an frühere, auch eigene Untersuchungen (Wertenauer 2000, Schmid 2000, Schmid et al. 2000, Schmid et al. 2001, Lünemann et al. 2001, Kuhnke et al. 2003, Naumann 2004) wurde Con A in einer Endkonzentration von 33,3 bis 49,7 µg pro 107 Zellen eingesetzt und lag damit in einem allgemein zur Stimulation eingesetzten Bereich von 3-5 µg/106 Zellen.

Eine Änderung der Aminosäurenzusammensetzung des Zellkulturmediums und die Zugabe von Vitaminen und Cofaktoren (= Unterschied zwischen BE und RPMI 1640) hatte keine statistisch signifikanten Veränderungen in der Basal- und Con A-stimulierten Atmung der PBMC aus den Leukozytenfiltern zur Folge. Dagegen bestand in RPMI 1640 ohne Glukose eine statistisch signifikant stärkere Stimulationsfähigkeit (p = 0,037), die in BE mit Glukose jedoch aufgrund des geringen Umfangs der Präparationen verfehlt wurde.

Die gefundenen Daten für die PBMC aus Leukozytenfiltern wurden mit denen von aus humanem Vollblut gewonnenen PBMC verglichen. Dazu wurden unmittelbar nach Präparation die in Abbildung 14 dargestellten Daten gemessen. Sowohl Basal- als auch Con A-Atmung waren statistisch signifikant höher im Vergleich zu den korrespondierenden Werten der PBMC aus Leukozytenfiltern (p = 0,006 bzw. 0,01). Mit einem Korrelationsfaktor von 0,88 konnte auch hier ein tendenziell enger Zusammenhang zwischen eingesetzter Zellzahl und Sauerstoffverbrauch gefunden werden. Dieser war jedoch aufgrund der geringen Anzahl von Präparationen statistisch nicht signifikant verschieden von Null. Der Anstieg der Atmung infolge Con A-Zugabe um 26,3 ± 3,2 % verfehlte aus diesem Grund nur knapp die statistische Signifikanz (p = 0,068). Er fiel geringer aus als bei den PBMC aus Leukozytenfiltern.


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Abb. 14: Sauerstoffverbrauch ruhender und Con A-stimulierter PBMC in BE ohne Glukose
(n = 8 [4 Präp.]). Das Blut zur PBMC-Gewinnung wurde zum Vergleich mit der Atmung von PBMC aus Leukozytenfiltern durch Punktion einer Vene gewonnen.

Die Präparation von CD4+ T-Zellen und CD14+ Monozyten mittels magnetisch aktivierter Zellsortierung nahm darüber hinaus einen mehrstündigen Zeitraum in Anspruch. Bei den folgenden Untersuchungen wurden deshalb frisch aus Leukozytenfiltern präparierte PBMC über einen Zeitraum von 5 h bei 0 °C in verschiedenen Zellkulturmedien aufbewahrt. Anschließend wurde ihre uneingeschränkte Sauerstoffverbrauchsaktivität und Stimulationsfähigkeit mit Con A überprüft. Die Ergebnisse sind in der folgenden Abbildung dargestellt.

Abb. 15: Sauerstoffverbrauch ruhender und Con A-stimulierter PBMC 5 h nach Präparation in BE ohne (n = 14 [7 Präp.]) und mit Glukose (n = 8 [4 Präp.]). * p = 0,016.


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Der Sauerstoffverbrauch der PBMC in BE ohne Glukose war statistisch signifikant geringer als unmittelbar nach Präparation (p = 0,031). Nach Zugabe von Con A nahm er um 30,4 ± 2,8 % statistisch signifikant zu (p = 0,016), war aber ebenfalls statistisch signifikant geringer als unmittelbar nach Präparation (p = 0,031). Das Absinken der Basal- und Con A-Atmung nach 5 h fiel in glukosehaltigem Medium geringer aus und war statistisch nicht signifikant. Die Stimulationsfähigkeit des Sauerstoffverbrauchs lag hier bei 16,9 ± 3,0 %. Sie war aber aufgrund der kleinen Anzahl von Experimenten statistisch nicht gesichert.

Zuletzt wurde in diesem Untersuchungsabschnitt nachgewiesen, daß die magnetisch aktivierte Zellsortierung keinerlei Einfluß auf die Sauerstoffverbrauchsaktivität und Stimulationsfähigkeit der PBMC hatte. Die folgende Abbildung zeigt, daß MicroBeadsTM keine Veränderungen dieser Funktionen bewirkten. Wenn nach Hinzugabe der MicroBeadsTM Con A hinzugefügt wurde, stieg der Sauerstoffverbrauch um 48,2 ± 9,4 %.

Abb. 16: Sauerstoffverbrauch von PBMC nach Zugabe von anti-human CD4-MicroBeadsTM
(n = 5 [5 Präp.]) und Con A (n = 2 [bei 2 der 5 Präp.]) in BE ohne Glukose.

Wie die Abbildung 17 zeigt, war der Sauerstoffverbrauch von ruhenden und Con A-stimulierten PBMC aus Negativfraktionen magnetisch aktivierter Zellsortierungen ebenfalls unbeeinträchtigt. Der Con A-stimulierte Sauerstoffverbrauch war um 37,1 ± 4,7 % statistisch signifikant höher als der unstimulierte (p < 0,001).


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Abb. 17: Sauerstoffverbrauch ruhender und Con A-stimulierter PBMC aus Negativfraktionen magnetisch aktivierter Zellsortierungen in BE ohne Glukose (n = 30 [14 Präp.]). * p < 0,001.

3.2.2 Sauerstoffverbrauch von ruhenden und stimulierten CD4+ T-Zellen

Der kontinuierlich gemessene Sauerstoffverbrauch von CD4+ T-Zellen ging bis zur 10%igen Sättigung des glukosehaltigen Zellkulturmediums mit Sauerstoff um 38,1 % zurück. Das wurde in mehreren unabhängigen Experimenten gezeigt. In glukosefreiem Zellkulturmedium ging der Wert um 47,6 % zurück. In der folgenden Abbildung sind diese Beobachtungen dargestellt.

Abb.18: Sauerstoffverbrauch von CD4+ T-Zellen in RPMI 1640 unter kontinuierlich fallender Sauerstoffsättigung. Beide Kurven wurden durch ununterbrochene Messungen mit Zellen aus jeweils drei unabhängigen Zellpräparationen ermittelt. WB = Wiederbelüftung.

Zwischen der eingesetzten Zellmenge und dem Sauerstoffverbrauch konnte ebenso wie bei den PBMC unabhängig von der Zusammensetzung des Zellkulturmediums eine positive und enge [Seite 41↓]Korrelation festgestellt werden. In der folgenden Tabelle sind die Werte gezeigt. Die von Null verschiedene Signifikanz wurde mit dem T-Test nach Student berechnet.

Tab. 4: Zusammenhang zwischen Zellzahl und basalem Sauerstoffverbrauch von CD4+ T-Zellen in verschiedenen Zellkulturmedien

 

BE ohne Glukose

RPMI 1640 ohne Glukose

RPMI 1640 mit Glukose

r

0,80

0,88

0,95

Signifikanz

+

+

+

n

55 (24 Präp.)

143 (46 Präp.)

126 (42 Präp.)

Die dazugehörige Abbildung 19 zeigt den Sauerstoffverbrauch von ruhenden CD4+ T-Zellen in RPMI 1640.

Abb. 19: Sauerstoffverbrauch ruhender CD4+ T-Zellen in RPMI 1640 ohne (n = 143 [46 Präp.]) und mit Glukose (n = 126 [42 Präp.]). * p = 0,014.

Der Sauerstoffverbrauch in RPMI 1640 mit Glukose war um 7,3 ± 1,8 % statistisch signifikant niedriger (p = 0,014) als in RPMI 1640 ohne Glukose. Der in BE ohne Glukose gemessene Wert (n = 55 [24 Präp.]) war identisch mit dem in RPMI 1640 ohne Glukose (p = 0,426) (Daten nicht gezeigt). Deshalb war ebenso wie bei den PBMC davon auszugehen, daß eine veränderte Aminosäurenzusammensetzung und die Zugabe von Vitaminen und Cofaktoren (= Unterschied zwischen BE und RPMI 1640) keinen Einfluß auf den basalen Sauerstoffverbrauch hatten.


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Um die Stimulationsfähigkeit des Sauerstoffverbrauchs zu prüfen, wurden zunächst Experimente mit Con A durchgeführt. Dabei konnte nur ein geringer Effekt erzielt werden, selbst wenn PBMC der Negativfraktion der magnetischen Zellsortierung als Antigen-präsentierende Zellen hinzugegeben wurden. Im Mittel war die Beobachtung dennoch statistisch gesichert. In der folgenden Abbildung sind die Ergebnisse dieser Experimente zusammengefaßt.

Abb. 20: Sauerstoffverbrauch Con A-stimulierter CD4+ T-Zellen nach Zugabe von PBMC in bis zu 24 unabhängigen Experimenten in BE ohne Glukose. * p = 0,027 bzw. 0,008.

Demnach konnte durch die Con A-Zugabe der Sauerstoffverbrauch um 12,7 ± 2,2 % statistisch signifikant gesteigert werden (p = 0,027). Wenn Antigen-präsentierende Zellen im Verhältnis 1:7 dazugegeben wurden, verbesserte sich dieser Effekt kaum (+ 14,2 ± 2,9 %). Er war aber ebenfalls statistisch gesichert (p = 0,008).

Bei gleichzeitiger Verwendung der Stimulanzien PMA und Ionomycin stellte sich heraus, daß der Sauerstoffverbrauch von CD4+ T-Zellen sehr stark angeregt wurde. Um den zeitlichen Verlauf während der Stimulation zu untersuchen, wurde er nach 3 und 6 h gemessen. Dabei wurden die Auswirkungen verschiedener Myxothiazoldosen mituntersucht. In Abbildung 21 sind die Ergebnisse dargestellt. Der Sauerstoffverbrauch war demnach in beiden Zellkulturmedien bei unstimulierten und nicht Myxothiazol-behandelten Zellen über 6 h fast gleichbleibend. Im Gegensatz dazu reagierte er bei den Zellen, deren Atmung initial um 40 und 80 % sowie submaximal gehemmt wurde, nach 3 h stark überschießend. Das war unabhängig davon, ob PMA und Ionomycin an- oder abwesend waren. Diese Reaktion fiel im glukosefreien [Seite 43↓]
Abb. 21: Zeitlicher Verlauf des Sauerstoffverbrauchs von CD4+ T-Zellen nach verschiedenen Myxothiazoldosen bei Glukoseverfügbarkeit (links) und unter glukosefreien Bedingungen (rechts) in Ab- (oben) und Anwesenheit (unten) von PMA und Ionomycin.

Medium stärker aus und war nach 6 h nur teilweise aufgehoben. Mit der max1- oder max2-Myxothiazoldosis war dieser Effekt wegen des überwiegenden Eintretens von Zelltod fast vollständig unterdrückt (Abb. 22). Sonst waren immer bis zu 98 % der Zellen lebensfähig. Der überschießende Effekt konnte auch bei den Zellen beobachtet werden, die nicht Myxothiazol-behandelt waren und mit PMA und Ionomycin inkubiert wurden. Hier waren die Zellen im glukosefreien Medium ebenfalls stärker betroffen.

Die Abbildung 23 verdeutlicht, daß in beiden Zellkulturmedien nach 3 h PMA-Ionomycin-Stimulation keine weitere Steigerung der Atmung mit dem Entkoppler FCCP erzeugt werden konnte. Der Sauerstoffverbrauch der Zellen wurde dazu initial mit der submaximalen Myxothiazoldosis unterdrückt. Dieses Ergebnis bedeutete, daß sich unter diesen Bedingungen die Atmung der Zellen bereits auf einem (nicht mehr steigerbaren) Maximum befand.


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Abb. 22: Zeitlicher Verlauf der Überlebensraten von PMA-Ionomycin-stimulierten CD4+ T-Zellen nach max1- und max2-Myxothiazoldosis bei Glukoseverfügbarkeit (links) und unter glukosefreien Bedingungen (rechts).

Abb. 23: Sauerstoffverbrauch von CD4+ T-Zellen nach submaximaler Myxothiazoldosis, dreistündiger PMA-Ionomycin-Stimulation und FCCP-Zugabe bei Glukoseverfügbarkeit und unter glukosefreien Bedingungen.

3.2.3 Titration des Sauerstoffverbrauchs mit Myxothiazol bei ruhenden CD4+ T-Zellen

Bei der Titration des Sauerstoffverbrauchs mit Myxothiazol wurde den Zellen während der Sauerstoffverbrauchsmessung schrittweise eine definierte Menge des Hemmstoffs der Atmungskette hinzugefügt. Die eingesetzte Myxothiazolmenge wurde auf die Zellzahl bezogen. Sie verursachte in jedem Fall eine schnelle und stabile Hemmung des zellulären Sauerstoffverbrauchs. In den folgenden zwei Abbildungen sind die ermittelten Titrationskurven dargestellt.


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Abb. 24: Titration des Sauerstoffverbrauchs mit Myxothiazol bei CD4+ T-Zellen in RPMI 1640 ohne Glukose. Jeder Meßpunkt wurde in bis zu 38 unabhängigen Experimenten ermittelt.

Abb. 25: Titration des Sauerstoffverbrauchs mit Myxothiazol bei CD4+ T-Zellen in RPMI 1640 mit Glukose. Jeder Meßpunkt wurde in bis zu 32 unabhängigen Experimenten ermittelt.

Myxothiazoldosen über 22 pmol/107 Zellen konnten den Sauerstoffverbrauch in beiden Medien nicht stärker reduzieren. 50 % der Atmung waren unter glukosefreien Bedingungen bei einer Dosis von 3,02 pmol/107 Zellen gehemmt. Bei Glukoseverfügbarkeit waren dafür 3,77 pmol/107 Zellen notwendig. Die extramitochondriale Atmung ist nicht Myxothiazol-hemmbar. Sie war im glukosehaltigen tendenziell, aber statistisch nicht signifikant höher als im glukosefreien Medium.


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Trotz der hochsensiblen Meßtechnik waren hinter der extramitochondrialen geringste Anteile von mitochondrialer Restatmung zu vermuten. Mit Hilfe von FCCP sollte deshalb geklärt werden, ob eine Dosis von 22 pmol Myxothiazol/107 Zellen ausreichend für eine vollständige Hemmung der Atmung war. Dazu wurde zunächst der Sauerstoffverbrauch in Myxothiazolabwesenheit mit FCCP titriert. Den folgenden zwei Titrationskurven ist zu entnehmen, daß unter glukosefreien Bedingungen mit einer Dosis von 0,5 und bei Verfügbarkeit von Glukose mit einer Dosis von 1 µM FCCP eine Maximalentkopplung zu erzielen war.

Abb. 26: Titration des Sauerstoffverbrauchs mit FCCP bei CD4+ T-Zellen in RPMI 1640.

Nach maximaler Hemmung des Sauerstoffverbrauchs mit 22 pmol Myxothiazol pro 10 7 Zellen und anschließender Zugabe von 0,5 µM bzw. 1 µM FCCP konnte noch ein Sauerstoffverbrauch von rund 0,5 nmol/min/10 7 Zellen in beiden Medien induziert werden (Abb. 27 und 28). Deshalb war hier davon auszugehen, daß noch einige wenige Mitochondrien und/oder Komplexe III der mitochondrialen Atmungskette aktiv waren. Aus diesem Grund wurde die Myxothiazoldosis um das 10- bzw. 100fache erhöht. Der Sauerstoffverbrauch konnte mit diesen höheren Dosen nicht stärker reduziert werden. Der FCCP-Effekt war dann jedoch nicht mehr induzierbar, wodurch eine 100%ige Hemmung der OXPHOS bewiesen wurde. Nach diesen Ergebnissen wurden die Myxothiazoldosen 22, 220 und 2200 pmol/107 Zellen zur Vereinfachung mit submax, max1 und max2 bezeichnet.


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Abb. 27: Sauerstoffverbrauch von CD4+ T-Zellen nach submax-, max1- und max2-Myxothiazoldosis mit anschließender Zugabe von 0,5 µM FCCP in RPMI 1640 ohne Glukose.

Abb. 28: Sauerstoffverbrauch von CD4+ T-Zellen nach submax-, max1- und max2-Myxothiazoldosis mit anschließender Zugabe von 1 µM FCCP in RPMI 1640 mit Glukose.

3.2.4 Sauerstoffverbrauch von ruhenden CD14+ Monozyten

In der folgenden Abbildung ist der Sauerstoffverbrauch ruhender CD14+ Monozyten in RPMI 1640 dargestellt. Im Medium mit Glukose war der Sauerstoffverbrauch um 33,0 ± 9,2 % statistisch signifikant niedriger (p = 0,017) als im glukosefreien Medium.


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Abb. 29: Sauerstoffverbrauch ruhender CD14+ Monozyten in RPMI 1640 ohne (n = 22 [7 Präp.]) und mit Glukose (n = 23 [7 Präp.]). * p = 0,017.

3.2.5 Titration des Sauerstoffverbrauchs mit Myxothiazol bei ruhenden CD14+ Monozyten

Die CD14+ Monozyten reagierten deutlich unempfindlicher auf Myxothiazol als die CD4+ T-Zellen. Bei einer Dosis von 40 pmol Myxothiazol/107 Zellen war unabhängig von der Glukosean- oder -abwesenheit die vollständige Hemmung des zellulären Sauerstoffverbrauchs erreicht. In RPMI 1640 ohne Glukose waren 50 % der Atmung bei einer Dosis von 8,17 pmol/107 Zellen gehemmt. In RPMI 1640 mit Glukose waren 8,71 pmol/107 Zellen notwendig. Ab einer Konzentration von 28 pmol/107 Zellen wirkte Myxothiazol statistisch signifikant stärker, wenn den Zellen keine Glukose zur Verfügung stand (p = 0,005 für 28, p = 0,014 für 32, p = 0,048 für 36 und p = 0,018 für 40 pmol Myxothiazol/107 Zellen). Demnach war die extramitochondriale Atmung im glukosehaltigen Medium statistisch signifikant höher als im glukosefreien Medium. Die Titrationskurven sind in den Abbildungen 30 und 31 dargestellt.

In anderen Sauerstoffverbrauchsexperimenten mit der Clark-Elektrode konnte demonstriert werden, daß der Atmungskettenhemmstoff in der Lage war, den Sauerstoffverbrauch und damit die OXPHOS der CD14+ Monozyten über 1 h stabil auf dem anfangs eingestellten Niveau zu halten (Daten nicht gezeigt). Ob es sich bei der höchsten untersuchten Myxothiazoldosis von 40 pmol/107 Zellen ebenfalls um die submaximale handelte, ist nicht bekannt. Mit diesem Test wurde aber sicher nachgewiesen, daß der Effekt des Atmungskettenhemmstoffs über die Dauer der Untersuchung der Phagozytoseaktivität anhielt.


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Abb. 30: Titration des Sauerstoffverbrauchs mit Myxothiazol bei CD14+ Monozyten in RPMI 1640 ohne Glukose. Jeder Meßpunkt wurde in bis zu sieben unabhängigen Experimenten ermittelt.

Abb. 31: Titration des Sauerstoffverbrauchs mit Myxothiazol bei CD4+ T-Zellen in RPMI 1640 mit Glukose. Jeder Meßpunkt wurde in bis zu neun unabhängigen Experimenten ermittelt.

3.3 Zytokinproduktion von Myxothiazol-behandelten CD4+ T-Zellen nach unspezifischer Stimulation mit PMA und Ionomycin

Um den Effekt einer Myxothiazolbehandlung auf die Zytokinsynthese von CD4+ T-Zellen zu untersuchen, wurde zunächst ein System etabliert, das zu einer hohen Frequenz von Zytokin-[Seite 50↓]produzierenden Zellen führte. Aus Voruntersuchungen mit BE-Medium wurde vermutet, daß sich eine unterschiedliche Zusammensetzung des Zellkulturmediums auf die Synthese von Zytokinen auswirken könnte. Daher wurden die Zellen in folgenden Zellkulturmedien mit PMA und Ionomycin stimuliert:

Die folgende Abbildung läßt erkennen, daß in Medium C und D statistisch signifikant mehr
IL-2-, IFN-γ-, TNF-α- und IL-4-Produzenten auftraten als in Medium A und B (p = 0,031). Dies war nicht Ursache verstärkt auftretender Nekrose in Medium A und B, wie in durchflußzytometrischen Analysen mit PJ gefunden werden konnte (Daten nicht gezeigt). Für nachfolgende Untersuchungen wurden deshalb Medium C und D weiterverwendet.

Abb. 32: Frequenz Zytokin-produzierender CD4+ T-Zellen in verschiedenen Zellkulturmedien aus sechs unabhängigen Zellpräparationen. * p = 0,031 vs. korrespondierenden Wert in Medium A und B.

Anschließend wurden zwei Untersuchungsserien mit je vier unabhängigen Experimenten durchgeführt. Dabei sollte der Einfluß einer stufenweise mittels Myxothiazol unterdrückten [Seite 51↓]oxidativen Energiesynthese auf die Zytokinproduktion untersucht werden. Innerhalb jeder Serie wurden die Zellen jeweils in Medium C oder D aufgenommen, mit ansteigenden Myxothiazoldosen auf unterschiedliche Stufen bis zur vollständigen Hemmung der Atmung eingestellt und mit PMA und Ionomycin stimuliert. Interessanterweise war erst dann ein im Vergleich zu den korrespondierenden Werten im glukosehaltigen Zellkulturmedium statistisch signifikant beeinträchtigender Effekt auf den Anteil der Zytokin-produzierenden Zellen zu beobachten, wenn die Zellen gleichzeitig einem vollständigen Glukoseentzug und einer vollständigen initialen Hemmung ihrer oxidativen Energiesynthese ausgesetzt waren (p = 0,029 für alle untersuchten Zytokine). Dabei war auch die mittlere Fluoreszenzintensität (MFI) der IFN-γ-produzierenden Zellen statistisch signifikant vermindert (p = 0,029) (Daten nicht gezeigt). Die MFI der IL-2-produzierenden Zellen war tendenziell vermindert. Bemerkenswert war die Beobachtung, daß die Ausgangswerte der Anteile der Zytokin-produzierenden Zellen und deren MFI in glukosefreiem Medium tendenziell geringer waren. In der folgenden Darstellung sind die Ergebnisse der drei wichtigsten untersuchten Stufen des Sauerstoffverbrauchs als Mittelwerte gezeigt.

Abb. 33: Frequenz Zytokin-produzierender CD4+ T-Zellen in Abhängigkeit vom Sauerstoffverbrauch bei Glukoseverfügbarkeit (A) und unter glukosefreien Bedingungen (B) in jeweils sechs unabhängigen Experimenten.

Die zweidimensionalen Dot-plot-Darstellungen der Fluoreszenz von mit anti-human IL-2-FITC, [Seite 52↓]IFN-γ-Cy5, TNF-α-FITC und IL-4-Cy5 gefärbten CD4+ T-Zellen zeigen beispielhaft die Ergebnisse eines einzelnen Versuchs aus FACS-analytischer Sicht (Abb. 34 und 35).

In FACS-Analysen mit Annexin-V-FITC und PJ konnte ausgeschlossen werden, daß die geringeren Anteile von Zytokin-produzierenden Zellen in glukosefreiem Medium bei vollständiger Hemmung der Atmung auf einer signifikanten Erhöhung des Anteils apoptotischer und nekrotischer Zellen beruhten (Daten nicht gezeigt). Bei Kontrollen mit nicht stimulierten unbehandelten und Myxothiazol-behandelten Zellen konnten in keinem Fall Zytokin-produzierende oder die Zunahme des Anteils nekrotischer Zellen nachgewiesen werden (Daten nicht gezeigt).

Abb. 34: Glukoseentzug und vollständig gehemmter zellulärer Sauerstoffverbrauch reduzieren sehr deutlich den relativen Anteil von IL-2- und IFN-γ-produzierenden CD4+ T-Zellen.


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Abb. 35: Glukoseentzug und vollständig gehemmter zellulärer Sauerstoffverbrauch reduzieren sehr deutlich den relativen Anteil von TNF-α- und IL-4-produzierenden CD4+ T-Zellen.

Da für die isolierten CD4+ T-Zellen ein Reinheitsgrad von bis zu 99 % nachgewiesen wurde und Phorbolester wie PMA das CD4-Antigen herunterregulieren (Baran et al. 2001), wurde auf die Gegenfärbung des CD4-Rezeptors verzichtet. Zur Absicherung konnte in eigenen Experimenten die Herunterregulation des CD4-Antigens durch die PMA-Ionomycin-Stimulation bestätigt werden (Daten nicht gezeigt).


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3.4  Proliferation von Myxothiazol-behandelten CD4+ T-Zellen nach spezifischer Stimulation mit anti-human CD3- und CD28-Antikörpern

In den nachfolgenden Experimenten wurde der Einfluß einer stufenweise mittels Myxothiazol gehemmten Zellatmung auf die Proliferation von CD4+ T-Zellen untersucht. Dazu wurden zwei Untersuchungsserien mit je vier bzw. fünf unabhängigen Experimenten durchgeführt. Innerhalb jeder Serie wurden die Zellen jeweils in Medium C oder D aufgenommen, mit ansteigenden Myxothiazoldosen auf unterschiedliche Stufen bis zur vollständigen Hemmung der Atmung eingestellt und anschließend mit anti-human CD3- und CD28-Antikörpern stimuliert. Die gewonnenen Erkenntnisse waren denen der Zytokinuntersuchungen sehr ähnlich. Glukoseentzug verursachte im Vergleich zum korrespondierenden Wert des glukosehaltigen Zellkulturmediums einen statistisch signifikant geringeren Ausgangswert proliferierender Zellen (p = 0,014). Erst bei vollständiger Unterdrückung der Atmung und gleichzeitigem Glukoseentzug konnte eine deutliche Verminderung des Anteils proliferierender Zellen erzielt werden. Diese verfehlte aufgrund der Anzahl von vier Experimenten nur knapp die statistische Signifikanz (p = 0,068). Die Abbildung 36 zeigt die Mittelwerte der drei wichtigsten untersuchten Stufen des Sauerstoffverbrauchs. Die zweidimensionalen Dot-plot-Darstellungen und Histogramme der Fluoreszenz von mit CFDA, SE markierten CD4+ T-Zellen zeigen beispielhaft die Ergebnisse eines einzelnen Versuchs aus FACS-analytischer Sicht (Abb. 37).

Abb. 36: Frequenz proliferierender CD4+ T-Zellen in Abhängigkeit vom Sauerstoffverbrauch bei Glukoseverfügbarkeit und unter glukosefreien Bedingungen.


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Abb. 37: Glukoseentzug und vollständig gehemmter zellulärer Sauerstoffverbrauch vermindern sehr deutlich den relativen Anteil von proliferierenden CD4+ T-Zellen.

In FACS-Analysen mit PJ konnte hier ebenfalls ausgeschlossen werden, daß die geringeren Anteile von proliferierenden Zellen in glukosefreiem Medium bei vollständiger Hemmung der Atmung auf einer signifikanten Erhöhung des Anteils nekrotischer Zellen beruhten (Daten nicht gezeigt). Bei Kontrollen mit nicht stimulierten unbehandelten und Myxothiazol-behandelten Zellen konnten in keinem Fall proliferierende oder die Zunahme des Anteils nekrotischer Zellen nachgewiesen werden (Daten nicht gezeigt).


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3.5  Phagozytose von Myxothiazol-behandelten CD14+ Monozyten

Nachdem gezeigt werden konnte, daß CD4+ T-Zellen ihre Funktionalität selbst in ausgeprägten Energiemangelsituationen aufrechterhalten können, ohne dabei nekrotisch zu werden, wurde diesbezüglich zum Vergleich eine andere Immunzellart untersucht. T-Zellen sind Zellen, die die adaptative Immunität vermitteln. Ziel der folgenden Experimente war es, die Reaktion einer spezifischen Funktion von Monozyten auf Energiemangel zu prüfen. Monozyten sind Zellen der angeborenen Immunität. Im Ergebnis dieser Untersuchungen sollte das funktionelle Verhalten von Zellen der angeborenen Immunität mit dem von Zellen der adaptativen Immunität bei Energiemangel verglichen werden.

Es wurden wiederum zwei Untersuchungsserien mit je vier unabhängigen Experimenten durchgeführt. Innerhalb jeder Serie wurden CD14+ Monozyten jeweils in Medium C oder D aufgenommen, mit ansteigenden Myxothiazoldosen auf unterschiedliche Stufen bis zur vollständigen Hemmung der Atmung eingestellt und mit FITC-markierten Escherichia coli Bakterien des Phagotest®-Kits inkubiert. Auch hier verursachte Glukoseentzug im Vergleich zum korrespondierenden Wert im glukosehaltigen Zellkulturmedium einen statistisch signifikant geringeren Ausgangswert phagozytierender Zellen (p = 0,021). Erst bei vollständiger Unterdrückung der Atmung und gleichzeitigem Glukoseentzug konnte eine Verminderung des Anteils phagozytierender Zellen erzielt werden. Die statistische Signifikanz wurde aufgrund von vier Experimenten aber knapp verfehlt (p = 0,068). Die Abbildung 38 zeigt die Mittelwerte der drei wichtigsten untersuchten Stufen des Sauerstoffverbrauchs. Die zweidimensionalen Dot-plot-Darstellungen der Fluoreszenz von CD14+ Monozyten, die die Escherichia coli-FITC-markierten Bakterien inkorporiert haben, zeigen die Ergebnisse aus FACS-analytischer Sicht (Abb. 39). Hierbei sind die Daten eines einzelnen Versuchs beispielhaft abgebildet.

In mitgeführten Kontrollansätzen, die 1 h bei 0 °C inkubiert wurden, konnte in keinem Fall Phagozytoseaktivität gefunden werden (Daten nicht gezeigt).


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Abb. 38: Frequenz phagozytierender CD14+ Monozyten in Abhängigkeit vom Sauerstoffverbrauch bei Glukoseverfügbarkeit und unter glukosefreien Bedingungen.

Abb. 39: Glukoseentzug und vollständig gehemmter zellulärer Sauerstoffverbrauch vermindern sehr deutlich den relativen Anteil phagozytierender CD14+ Monozyten.

3.6 Berechnung des minimalen ATP-Bedarfs für das Überleben und die vollständige Funktionalität von CD4+ T-Zellen

Im folgenden Abschnitt wurde der minimale ATP-Bedarf berechnet, der das Überleben und die [Seite 58↓]vollständige Funktionalität von CD4+ T-Zellen bei einer PMA-Ionomycin-Stimulation ermöglichte. Dazu wurde zunächst das Integral unter den zeitlichen Verlaufskurven des Sauerstoffverbrauchs gebildet, die in Anwesenheit von PMA, Ionomycin und submaximaler Myxothiazoldosis in glukosehaltigem oder -freiem Zellkulturmedium ermittelt wurden (Abb. 21). In Tabelle 5 sind die Daten dargestellt. Anschließend wurde daraus die ATP-Menge berechnet. Dabei wurde vorausgesetzt, daß die ATP-Synthese dem ATP-Verbrauch entsprach. Weiterhin wurde ein P/O-Quotient von 3 angenommen. Der extramitochondriale Sauerstoffverbrauch wurde nicht berücksichtigt, weil er keinen Beitrag zur ATP-Synthese leistet. Er wurde mit 10 % veranschlagt (Tab. 13) und vom Gesamtsauerstoffverbrauch abgezogen. In Tabelle 6 sind die berechneten ATP-Werte aufgeführt.

Tab. 5: Minimaler Sauerstoffbedarf von 107 CD4+ T-Zellen für 6 h PMA-Ionomycin-Stimulation

RPMI 1640 ohne Glukose

RPMI 1640 mit Glukose

450 nmol

278 nmol

Tab. 6: Minimaler ATP-Bedarf aus der OXPHOS von 107 CD4+ T-Zellen für 6 h PMA-Ionomycin-Stimulation

RPMI 1640 ohne Glukose

RPMI 1640 mit Glukose

2,70 µmol

1,67 µmol

Durch die Bildung der Differenzen konnte der Energieanteil abgeschätzt werden, zu dessen Synthese die Glykolyse beitrug. Die genauen Anteile der OXPHOS und der Glykolyse an der zellulären Energiegewinnung sind jedoch nicht abschätzbar, weil die glykolytische ATP-Gewinnung durch die Anwesenheit von Sauerstoff gehemmt wird (Pasteur-Effekt). Darüber hinaus kann bei Glukoseverfügbarkeit nicht ermittelt werden, wieviel ATP in der Glykolyse und der Endoxidation aus Glukose entstehen. Trotzdem geben die folgenden Werte eine gute Schätzung wieder:

Δ O2 = 172 nmol/6 h/107 Zellen

Δ ATP = 1,03 µmol/6 h/107 Zellen


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Demzufolge können offenbar funktionsfähig verbliebene, d. h. nicht durch die submaximale Myxothiazoldosis gehemmte Mitochondrien ihre Kapazität sehr stark erhöhen, um den Energiebedarf nach PMA-Ionomycin-Stimulation zu decken. Dadurch wird einerseits das Überleben gesichert. Andererseits wird aber nur eine gewisse Restfunktionalität, d. h. ein wenig Zytokinproduktion (Abb. 33-35) und ein wenig Proliferation (Abb. 36, 37) ermöglicht. Im Falle von Glukoseverfügbarkeit ist die Glykolyse offenbar in der Lage, die Energieverluste infolge einer eingeschränkten OXPHOS zu kompensieren. So wird beides gesichert: Überleben und vollständige Funktionalität. Der minimale Sauerstoffbedarf war hier nahezu halbiert.

3.7 Beeinflussung der HIF-1α-mRNA- und -Proteinexpression bei CD4+ T-Zellen durch Myxothiazol und PMA-Ionomycin-Stimulation

Im weiteren Verlauf der Untersuchungen wurde vermutet, daß die sauerstoffabhängige
α-Untereinheit des Transkriptionsfaktors HIF-1 verantwortlich sein könnte für die Aufrechterhaltung der Energiesynthese und somit für das Überleben und die Funktionalität in den PMA-Ionomycin-stimulierten, aber Myxothiazol-gehemmten CD4+ T-Zellen. Deshalb wurde das aus der Stimulation resultierende Expressionsmuster der α-Untereinheit des Transkriptionsfaktors in der semiquantitativen PCR und im Western-Blot untersucht.

Wie in der Abbildung 40 zu erkennen, konnte bereits auf mRNA-Ebene in drei unabhängigen Experimenten unter Verwendung von Medium D eine Zunahme der Bandenintensität beobachtet werden. Diese korrelierte bei unstimulierten Zellen mit fortschreitender Zeit und höherer Myxothiazoldosis. Selbiges traf für stimulierte Zellen zu. Die Expression der HIF-1α-mRNA war aber insgesamt höher. Die stärkste Bandenintensität lag bei PMA-Ionmycin-stimulierten Zellen vor, deren Atmung 50%ig oder nahezu vollständig gehemmt wurde. Kontrollen, die zum Zeitpunkt 0 Stunden lysiert wurden und als normoxisch anzusehen waren, zeigten ebenso wie Kontrollen mit A. dest. keinerlei mRNA-Expression.

In den Western-Blot-Analysen konnte in jeweils drei unabhängigen Experimenten in Medium C und D gezeigt werden, daß das HIF-1α-Protein unter hypoxischen Bedingungen nicht abgebaut wurde (Abb. 41). Die Hypoxie wurde durch Inkubation der Zellen in geschlossenen Gefäßen erzeugt. Die Bandenintensität war bei stimulierten Zellen und in Anwesenheit von Glukose stärker ausgeprägt. Die Zugabe der submaximalen Myxothiazoldosis war verbunden mit einer Degradation des HIF-1α-Proteins trotz hypoxischer Bedingungen und unabhängig von der Anwesenheit von Glukose, PMA und Ionomycin. Kontrollen, die zum Zeitpunkt 0 Stunden lysiert wurden und als normoxisch anzusehen waren, zeigten keinerlei Bandenintensität.


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Abb. 40: HIF-1α-mRNA-Expressionsnachweis auf cDNA-Ebene mittels semiquantitativer PCR. Dargestellt ist beispielhaft das Ergebnis eines einzelnen Versuchs in Medium D mit PMA-Ionomycin-stimulierten und unstimulierten CD4+ T-Zellen. 1 = 100 % Atmung, 2 = 50 % Restatmung, 3 = vollständige Atmungshemmung mit der submaximalen Myxothiazoldosis, Kontrolle = A. dest.

Abb. 41: HIF-1α-Protein-Expressionsnachweis mittels Western-Blot-Analyse. Es wurden PMA-Ionomycin-stimulierte und unstimulierte CD4+ T-Zellen eines Experiments unter Glukoseverfügbarkeit (A) und unter glukosefreien Bedingungen (B) verwendet. N = Normoxie, H = Hypoxie, M = submaximale Myxothiazoldosis, (+) = CoCl2-behandelte HeLa-Zell-Positivkontrolle.


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06.06.2005