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4  Diskussion

4.1 Vitalität und Funktionalität von PBMC aus Leukozytenfiltern

Durchflußzytometrische Bewertung der PBMC-Präparation

Wie in durchflußzytometrischen Analysen gezeigt, enthielten die PBMC ca. 70 % Lymphozyten sowie Monozyten und Granulozyten (Abb. 8). In den Arbeiten von Kuhnke (2000), Schmid (2000) und Schmid et al. (2000) wurden mindestens 80 % Lymphozyten gefunden. Der geringere Anteil Lymphozyten könnte Ursache einer starken Interaktion mit Strukturen des Leukozytenfilters sein, so daß die Überdruckspülung während der Zellpräparation nicht zur vollständigen Wiederfindung führte. Es ist aber davon auszugehen, daß die Zusammensetzung weitgehend der bekannten Verteilung im Blut entsprach. So wurden knapp ⅓ der PBMC als CD4+ T-Zellen identifiziert (Abb. 8).

Vitalität

Die PBMC waren auch noch vital, wenn sie über mehrere Stunden in den Leukozytenfiltern verblieben. Bei der maschinellen und Zählkammer-Zellzählung mit Trypanblau zeigte sich ebenso wie bei durchflußzytometrischen Untersuchungen mit PJ, daß bis zu 99 % der Zellen lebensfähig waren. Trotzdem stellte sich heraus, daß keine Erkenntnisse und Erfahrungen über den Sauerstoffverbrauch von aus Leukozytenfiltern gewonnenen PBMC vorlagen. Da der intakte Sauerstoffverbrauch ein zuverlässiger Parameter für die Vitalität und Funktionalität von Immunzellen ist, weil er deren Energiebedarf für sowohl lebenserhaltende als auch spezifische zelluläre Funktionen reflektiert (Buttgereit et al. 2000), wurde mit ihm die unbeeinträchtigte Funktionalität von PBMC aus Leukozytenfiltern nachgewiesen.

Sauerstoffverbrauch von PBMC aus Leukozytenfiltern

Die Untersuchungsergebnisse sind von den Versuchsbedingungen abhängig. Nach Müller et al. (1986) und Buttgereit et al. (1991, 1992) haben die Zusammensetzung des Inkubationsmediums (Glukose und Aminosäuren), Substanzen zur Hemmung bakteriellen Wachstums, die Temperatur, die Zeit der Äquilibrierung mit Luftsauerstoff und die Zugabe von Hemmstoffen einen deutlichen Einfluß. Die Versuchsbedingungen wurden an verschiedenen Zellsystemen getestet und optimiert (Müller et al. 1986, Buttgereit et al. 1991, 1992, Schmid et al. 2000, Wertenauer 2000, Lünemann et al. 2001, Schmid et al. 2001, Kuhnke et al. 2003, Naumann 2004) und in der vorliegenden Untersuchung angewendet. Unter Berücksichtigung der sehr viel [Seite 62↓]genaueren maschinellen Zellzählung (ermittelter Korrekturfaktor: 1,5) war die Basal- (Tab. 7) und Con A-stimulierte Atmung mit Werten aus früheren Untersuchungen von PBMC aus Buffy coat-Präparationen gesunder Blutspender vergleichbar.

Tab. 7: Vergleich des Sauerstoffverbrauchs humaner PBMC

Methode

Temperatur (°C)

Sauerstoffverbrauch

Referenz

Amperometrie

37

2,782

vorgestellte Arbeit (2004)

Amperometrie

37

5,842

Naumann (2004)

Amperometrie

37

3,842

Kuhnke et al. (2003)

Amperometrie

37

6,092

Schmid et al. (2001)

Amperometrie

37

6,912

Lünemann et al. (2001)

Amperometrie

37

3,082

Wertenauer (2000)

Amperometrie

37

7,092

Schmid et al. (2000)

Lumineszenz

22

2,811 (= 4,682)

Trübel und Barnikol (1998)

Amperometrie

26

2,191 (= 3,652)

Bondeson und McCabe (1992)

Amperometrie

37

51 (= 8,332)

Maddock et al. (1985)

Amperometrie

37

3,521 (= 5,872)

Kuna et al. (1979)

1mmol O2/1011 Zellen/h
2nmol O2/107 Zellen/min

Mögliche Abweichungen können dadurch entstehen, daß Clark-Elektroden selbst Sauerstoff verbrauchen (Gleichmann und Lübbers 1960) und Zellen durch Rühreffekte während der Sauerstoffverbrauchsmessung zerstört werden (Trübel und Barnikol 1998). Bei durchflußzytometrischen Kontrollen mit PJ konnte aber keine signifikante Erhöhung des Anteils nekrotischer Zellen beobachtet werden. Wichtig zu erwähnen ist auch der metabolische Verdrängungseffekt, der für kultivierte Lymphozyten beschrieben wurde (Hedeskov und Esmann 1966, Talstad 1972, Sand et al. 1977, Trübel und Barnikol 1998). Er führt in Abhängigkeit von der Zellkonzentration zu ganz unterschiedlichen Werten für den Sauerstoffverbrauch, weil mit steigender Zellkonzentration die spezifische zelluläre Sauerstoffaufnahme exponentiell sinkt (Trübel und Barnikol 1998). Sand et al. (1977) konnten ausschließen, daß dafür Nährstoffdepletion, pH-Wert-Veränderungen, Ansammlung von Laktat, Schädigung der Zellen durch die Verdünnung oder Gasdiffusion ursächlich sind. Sie vermuteten die Abgabe humoraler Faktoren. Die vorliegende Arbeit sowie alle ab dem Jahr 2000 (Tab. 7) sind im selben Untersuchungslabor entstanden, so daß die Zellzahlen und alle anderen [Seite 63↓]Bedingungen weitgehend normiert waren. Außerdem war in Übereinstimmung mit den Daten von Schmid (2000) mit steigender Zellzahl ein proportionaler Anstieg des zellulären Sauerstoffverbrauchs verbunden (Tab. 3). Es wird aber der Vergleich mit den anderen Literaturstellen erschwert. Dort wurden zwar die gleichen Techniken verwendet, jedoch die eingesetzten Zellkonzentrationen nicht angegeben (Kuna et al. 1979, Bondeson und McCabe 1992) oder die Messungen bei niedrigeren Zellkonzentrationen durchgeführt (Maddock et al. 1985). Die Kontaktzeit mit Ficoll® könnte darüber hinaus beachtlichen Einfluß auf die Vitalität der Zellen gehabt haben (Trübel und Barnikol 1998). Daneben wirken sich Zentrifugation und lange Standzeiten ungünstig aus (Crowley et al. 1975). Zuletzt ist zu berücksichtigen, daß in manchen Arbeiten bei geringeren Temperaturen (Reaktionsgeschwindigkeits-Temperatur-Regel), in anderen Zellkulturmedien und mit anderen Methoden gemessen wurde (s. Tab. 7).

Crabtree-Effekt: Unterdrückung des Sauerstoffverbrauchs in Gegenwart von Glukose

Die Zusammensetzung des Zellkulturmediums hatte bis auf die Glukosekonzentration keinen Einfluß auf die Basalatmung der Zellen (Abb. 12). Der Anstieg des Sauerstoffverbrauchs und der Stimulierbarkeit mit Con A in Abwesenheit von Glukose (Abb. 12, 13, 15) ist auf den erstmals von Crabtree (1929) an Tumorzellen beobachteten Crabtree-Effekt zurückzuführen. Ohne zugesetztes äußeres Stoffwechselsubstrat war die Atmung der Tumorzellen höher als in Gegenwart von Glukose, weil die Energiegewinnung über die aerobe Glykolyse ausfiel. Der Effekt läßt sich bei allen Zellen nachweisen, die aerobe Glykolyse betreiben (Rapoport 1987). Er wurde auch für Immunzellen beschrieben (Bielka 1963, Seitz 1965, Kirschner et al. 1972, Guppy et al. 1993), konnte aber in seiner Funktion bis heute nicht eindeutig aufgeklärt werden (Thierie 2004). Demnach könnten PBMC den Energieverlust, den sie in Abwesenheit von Glukose durch den Ausfall der ATP-Synthese über die Glykolyse erleiden, durch eine verstärkte Energiegewinnung über die sauerstoffverbrauchende Oxidation anderer energieliefernder Substrate kompensieren.

Sauerstoffverbrauch von PBMC aus Vollblut

Der Sauerstoffverbrauch von frisch aus Vollblut präparierten PBMC lag deutlich über dem der PBMC aus Leukozytenfiltern (vgl. Abb. 12-14). Eine Ursache könnte die veränderte Expression von Oberflächenrezeptoren durch die Leukozytenapherese sein (Apherese-Standard der Deutschen Arbeitsgemeinschaft für Klinische Nephrologie e.V.). Der prozentuale Anstieg des Sauerstoffverbrauchs infolge Con A war aber vergleichbar mit dem der PBMC aus [Seite 64↓]Leukozytenfiltern (vgl. Abb. 13, 14). Es könnten auch verschiedene Thrombozytenzahlen aufgrund der unterschiedlichen Bedingungen der Präparation entscheidend gewesen sein. Bei den Leukozytenfilterpräparationen fielen diese wahrscheinlich geringer aus, weil sich die Blutplättchen fest an die Filterstrukturen anlagerten. Obwohl kleiner und absolut sehr viel weniger Sauerstoff verbrauchend als der durchschnittliche Lymphozyt, ist der relative Sauerstoffverbrauch pro Blutvolumeneinheit aufgrund der höheren Anzahl größer (Wagner et al. 1956). Deswegen sind Thrombozyten eine erhebliche Quelle von Unklarheiten bei Messungen der Atmung von Leukozyten.

Einfluß der magnetisch aktivierten Zellsortierung auf den Sauerstoffverbrauch

Anfangs dauerte die Isolierung von CD4+ T-Zellen und CD14+ Monozyten mittels magnetisch aktivierter Zellsortierung insgesamt ca. 5 h. Der Sauerstoffverbrauch von über diesen Zeitraum aufbewahrten PBMC war geringer als unmittelbar nach Präparation (vgl. Abb. 12, 15). Demzufolge konnte Con A nicht mehr so stark, aber dennoch deutlich wirken (vgl. Abb. 13, 15). Das Absinken der Basal- und Con A-Atmung fiel in glukosehaltigem Medium geringer aus (vgl. Abb. 12, 15). Die Schritte für die magnetisch aktivierte Zellisolierung wurden deshalb so optimiert, daß die Zeitdauer deutlich reduziert war.

In Übereinstimmung mit Daten von Miltenyi et al. (1990) wurde ausgeschlossen, daß die Zellen durch MicroBeadsTM voraktiviert oder beeinträchtigt waren. Auch die Hindurchleitung durch den vollautomatischen Separator hatte keine Auswirkungen. Demnach verursachten MicroBeadsTM keinen Effekt auf die ruhende und Con A-stimulierte Zellatmung (Abb. 16). PBMC, die durch den vollautomatischen Separator hindurchgeleitet wurden (Negativfraktion), zeigten eine normale Ruhe- und Con A-Atmung (vgl. Abb. 12, 17).

Es ist zusammenfassend davon auszugehen, daß PBMC in ihrer zellulären Vitalität und Funktionalität nicht wesentlich beeinflußt werden, wenn sie über einen gewissen Zeitraum in Leukozytenfiltern aufbewahrt und in einer magnetisch aktivierten Zellsortierung weiterverarbeitet werden.

4.2 Sauerstoffverbrauchsmessungen bei CD4+ T-Zellen

4.2.1 Sauerstoffverbrauch von ruhenden CD4+ T-Zellen

Einfluß der Sauerstoffsättigung des Zellkulturediums

In den vorliegenden Untersuchungen wurde erstmals der Sauerstoffverbrauch von isolierten [Seite 65↓]CD4+ T-Zellen untersucht. Im glukosehaltigen Zellkulturmedium ging der kontinuierlich gemessene Sauerstoffverbrauch bis zur 10%igen Sättigung des Mediums mit Sauerstoff um
38,1 % zurück, im glukosefreien um 47,6 % (Abb. 18). Die dafür notwendigen Messungen dauerten 2-3 h. Bei allen anderen durchgeführten Sauerstoffverbrauchsmessungen handelte es sich jedoch um Kurzzeitmessungen (ca. 10 min). Diese sind üblicherweise dann abgeschlossen gewesen, wenn nur 20-30 % des Sauerstoffs im Medium veratmet waren, die Sauerstoffsättigung sich also auf einem Niveau von 70-80 % befand. Demzufolge konnte eine weitgehende Unabhängigkeit des Sauerstoffverbrauchs der CD4+ T-Zellen von der Sauerstoffkonzentration des Mediums festgestellt werden. Die beobachtete Abnahme des Sauerstoffverbrauchs beeinträchtigte daher nicht die Meßergebnisse. Außerdem konnte gezeigt werden, daß die Abnahme des Sauerstoffverbrauchs mit sinkender Sauerstoffkonzentration nicht mit einem Verlust der Zellatmungsfunktion einherging. Nach vollständiger Extraktion des Sauerstoffs aus dem Medium und anschließender Wiederbelüftung wurde der gleiche Wert beobachtet wie zu Beginn des Experiments (Abb. 18). Die von Schmid (2000) gefundenen Daten für PBMC wiesen eine stärkere, aber auch nicht vollständige Unabhängigkeit des Sauerstoffverbrauchs von der Sauerstoffkonzentration auf. Möglicherweise gibt es zwischen den unterschiedlichen Zellpopulationen ungleiche Empfindlichkeiten, so daß in Schmid’s Arbeit (2000) mit PBMC der offenbar bei den CD4+ T-Zellen auftretende Effekt überdeckt wurde.

Einfluß der Zellkonzentration

Eine ansteigende Zellkonzentration war ebenso wie bei den PBMC (Tab. 3) mit einem proportionalen Anstieg des Sauerstoffverbrauchs verbunden (Tab. 4). Der Nachweis erfolgte durch die Verwendung von Zellsuspensionen mit unterschiedlichen Zellkonzentrationen in verschiedenen Zellkulturmedien. Der metabolische Verdrängungseffekt (s. Pkt 4.1) kam nicht zum Tragen, weil die Messungen zügig abgeschlossen und die Zellen nicht verdünnt wurden.

Gesamtsauerstoffverbrauch von CD4+ T-Zellen

Wie Tabelle 8 zeigt, war der mittlere Sauerstoffverbrauch von CD4+ T-Zellen geringer als der von PBMC und CD14+ Monozyten. Vergleichend gegenübergestellt wurden nur die Werte aus RPMI 1640 ± Glukose, weil in diesen Medien auch alle spezifischen Funktionen der CD4+ T-Zellen und CD14+ Monozyten gemessen wurden. Der Anstieg des Sauerstoffverbrauchs in glukosefreiem Medium ist auch auf den Crabtree-Effekt zurückzuführen. Der Sauerstoffverbrauch der Monozyten leistet offensichtlich einen bedeutenden Beitrag zur [Seite 66↓]Gesamtatmung der PBMC. Schon Weening et al. (1974) vermuteten hinter der Variabilität der Atmung von Leukozyten Differenzen in der Zellkomposition der Präparationen. Der starke monozytäre Sauerstoffverbrauch erklärt aber die höhere Basalatmung der PBMC nicht vollständig. Granulozyten sind auch immer Bestandteil von PBMC-Präparationen, die mit der Ficoll®-Methodik durchgeführt wurden (Weening et al. 1974, Sagone et al. 1976, Trübel und Barnikol 1998, Kuhnke 2000). Nach Reiss und Roos (1978) verbrauchen Granulozyten deutlich mehr Sauerstoff als Monozyten. Der Zymosan-stimulierte Sauerstoffverbrauch der Monozyten betrug dort nur 39 ± 6 % von dem der Granulozyten. Der Mehrgehalt an Mitochondrien ist die wahrscheinlichste Ursache für die stärkere Monozytenatmung (s. Pkt. 4.4).

Tab. 8: Vergleich des Sauerstoffverbrauchs verschiedener ruhender Immunzellpopulationen (nmol O2/min/107 Zellen)

 

RPMI 1640 ohne Glukose

RPMI 1640 mit Glukose

PBMC

2,81

2,39

CD4+ T-Zellen

2,34

2,18

CD14+ Monozyten

6,05

4,55

4.2.2 Sauerstoffverbrauch von Con A-stimulierten CD4+ T-Zellen

Um die Stimulationsfähigkeit des Sauerstoffverbrauchs von isolierten CD4+ T-Zellen grundsätzlich zu prüfen, wurden aufgrund der Erfahrungen mit PBMC zunächst Experimente mit Con A durchgeführt. Dabei war in Übereinstimmung mit Angaben in der Literatur (Abbas et al. 1996) in einigen Experimenten keine und im Mittel aller durchgeführten Experimente nur eine im Vergleich zu den PBMC deutlich geringere Reaktion auf die Zugabe des Lektins zu verzeichnen (vgl. Abb. 13, 20). Dies steht scheinbar im Widerspruch mit der Tatsache, daß Con A den Sauerstoffverbrauch von Lymphozyten stimuliert (Lakin-Thomas und Brand 1988, Buttgereit et al. 1992, Buttgereit et al. 1993, Guppy et al. 1993, Krauss et al. 1999). Der Grund für die deutlich geringere Reaktion der isolierten CD4+ T-Zellen auf Con A liegt darin, daß bei einer Kreuzvernetzung der TCR-Komplexe durch Lektine zusätzliche Signale von akzessorischen Zellen wie Monozyten, Makrophagen, dendritischen Zellen und B-Lymphozyten für eine vollständige Aktivierung benötigt werden. Akzessorische Zellen ergänzen die TCR-vermittelten Signale zu einer vollständigen Antwort mit Hilfe ihrer costimulatorischen Moleküle, die sie bei der Bindung an die Rezeptoren von T-Zellen aufweisen (Abbas et al. 1996). In den vorliegenden Untersuchungen konnte die Con A-Stimulation jedoch nicht [Seite 67↓]verstärkt werden, wenn PBMC aus der Negativfraktion der magnetisch aktivierten Zelltrennung hinzugegeben wurden (Abb. 20). Dies lag unter Umständen an dem gewählten Verhältnis von 1:7 zwischen PBMC und CD4+ T-Zellen (Hedfors et al. 1975, Hem 1979). Der Fokus dieser Arbeit war aber nicht auf die Ermittlung eines optimalen Verhältnisses zu richten.

In weiterführenden Untersuchungen sollte geklärt werden, ob möglicherweise andere hochgereinigte Immunzellpopulationen wie Neutrophile oder Monozyten stärker auf Con A reagieren als CD4+ T-Zellen. Dadurch könnte ebenfalls die stärkere Reaktion von PBMC auf Con A gegenüber CD4+ T-Zellen erklärt werden. Für Neutrophile wurde berichtet, daß der Sauerstoffverbrauch im Mittel um 61 % höher war als der von Monozyten desselben Spenders, wenn die Zellen mit Zymosan stimuliert wurden (Reiss und Roos 1978). Weiterhin wurde für Neutrophile eine Con A-induzierte Aktivierung der Zellmembran-ständigen NADPH-Oxidase beschrieben (Lu und Grinstein 1989, Rossi et al. 1989). Das Enzym bildet unter starkem Sauerstoffverbrauch Superoxidradikale, die sehr schnell in Wasserstoffperoxid und Hydroxyl-Radikale umgewandelt werden. Diese Stoffe weisen im Rahmen der Phagozytose eine bakterizide und fungizide Wirkung auf. Der sauerstoffabhängige Mechanismus wird als Respiratorischer Burst bezeichnet. Monozyten sind ebenfalls mit Con A stimulierbar (Romeo et al. 1973, Petty und Ware 1979, Matsuo et al. 1996).

4.3 Sauerstoffverbrauchsmessungen bei CD14+ Monozyten

Der Sauerstoffverbrauch von nahezu 100%ig angereicherten CD14+ Monozyten wurde ebenso wie der von isolierten CD4+ T-Zellen erstmals in der vorliegenden Arbeit untersucht. Die Erkenntnisse über den Einfluß der Sauerstoffsättigung des Zellkulturmediums, der Zellkonzentration und der Inkubation in unterschiedlichen Zellkulturmedien, die bei den PBMC und CD4+ T-Zellen gewonnen wurden, sind auf die CD14+ Monozyten übertragen worden.

Der höhere Sauerstoffverbrauch in glukosefreiem Medium (Abb. 29, Tab. 8) ist ebenso wie bei den PBMC und CD4+ T-Zellen auf den Crabtree-Effekt zurückzuführen. In der Arbeit von Reiss und Roos (1978) wurde schon der monozytäre Sauerstoffverbrauch mit einer Clark-Elektrode untersucht. Die Zellen waren aber nur zu 82 % angereichert. Der Rest bestand aus Granulozyten (3 %) und Lymphozyten (15 %). Der gefundene Wert war mit 1 nmol O2/min/107 Zellen deutlich geringer als die in der vorgestellten Arbeit gefundenen. An dieser Stelle wird aber auf den Punkt 4.1 hingewiesen. Die dort diskutierten Punkte zum Vergleich von Werten unterschiedlicher Arbeiten sind hier ebenso gültig. Weiterhin werden die Auswirkungen verschiedener Präparationstechniken kontrovers diskutiert (Glasser und Fiederlein 1990, Zhao [Seite 68↓]et al. 2003). Diese können offenbar zu Veränderungen in der Funktionalität von Immunzellen führen. So führte bei der Arbeit von Zhao et al. (2003) die Ficoll®-Präparationstechnik bei polymorphkernigen Zellen zu einem signifikant höheren Respiratorischen Burst als in unfraktioniertem Vollblut. Es gibt Informationen über Veränderungen im Expressionsprofil der mRNA von Monozyten, die durch die Ficoll®-Präparationstechnik gewonnen wurden (Grützkau 2003). Reiss und Roos (1978) konnten aber keine Aktivierung des Sauerstoffverbrauchs der Monozyten feststellen, die dort durch Glasadhäsions-Präparationstechnik gewonnen wurden. Der Wert von 4,83 nmol O2/min/107 Zellen, der von Chvapil et al. (1977) für Peritonealmakrophagen von Rattten gefunden wurde, kommt denen in der vorgestellten Arbeit sehr nahe. Er wurde aber in einem anderen Zellkulturmedium ermittelt.

4.4 Titration des Sauerstoffverbrauchs mit Myxothiazol bei CD4+ T-Zellen und CD14+ Monozyten

Um in späteren Experimenten zur Quantifizierung von spezifischen Funktionen von CD4+ T-Zellen und CD14+ Monozyten gezielt und schrittweise die Energiesynthese über die OXPHOS zu vermindern, wurde der Sauerstoffverbrauch mit Myxothiazol titriert. Monozyten zeigten eine deutlich geringere Empfindlichkeit gegenüber Myxothiazol als CD4+ T-Zellen (vgl. Abb. 24, 25, 30, 31). Ihre Atmung war erst bei einer Konzentration von 40 pmol Myxothiazol/107 Zellen vollständig gehemmt. Bei den CD4+ T-Zellen waren nur 22 pmol/107 Zellen notwendig gewesen. Die Tabelle 11 zeigt die Myxothiazoldosen für eine 50%ige Hemmung der Atmung beider Zellarten im Vergleich. Sie wurden wegen der größeren Genauigkeit nicht durch Ablesung, sondern anhand der Funktionen der vier Titrationskurven ermittelt (Tab. 9, 10). Hierbei kam die geringere Empfindlichkeit der CD14+ Monozyten gegenüber dem Atmungskettenhemmstoff ebenfalls zum Ausdruck. Die wahrscheinlichste Ursache für diese Beobachtung liegt darin, daß Monozyten mehr Mitochondrien und damit mehr zu hemmende Komplexe III enthalten als CD4+ T-Zellen. Der Mitochondriengehalt limitiert den maximal möglichen Sauerstoffverbrauch durch die OXPHOS. Monozyten atmen deutlich stärker als CD4+ T-Zellen (Tab. 8). Darüber hinaus besitzen Monozyten deutlich mehr Raum für Mitochondrien. Sie sind größer und haben ein kleineres Kern-Zytoplasma-Verhältnis als Lymphozyten. Die CD14+ Monozyten zeigten in der zweidimensionalen Darstellung des Vorwärts-Seitwärts-Streulichts im Durchflußzytometer deutlich mehr Granula als CD4+ T-Zellen (vgl. Abb. 8, 11). Von Herrn Dr. med. H. Jastrow, Anatomisches Institut der Johannes Gutenberg-Universität in Mainz, freundlicherweise zur Verfügung gestellte, [Seite 69↓]elektronenmikroskopische Aufnahmen von Lymphozyten und Monozyten lassen auch auf eine höhere Anzahl von Mitochondrien in Monozyten schließen. In der Literatur liegen erstaunlicherweise kaum Untersuchungen vor (Tab. 12). In weiteren Analysen wird daher genauer zu klären sein, warum periphere CD14+ Monozyten deutlich stärker atmen als CD4+ T-Zellen und sich unempfindlicher gegenüber Myxothiazol zeigen.

Tab. 9: Nach der Methode der kleinsten Quadrate ermittelte Funktionen für die Myxothiazol-Titrationskurven der CD4+ T-Zellen

RPMI 1640 ohne Glukose

f(x) = 0,0013x4 - 0,0854x3 + 2,0637x2 - 22,057x + 100

RPMI 1640 mit Glukose

f(x) = -0,021x3 + 1,0475x2 - 16,905x + 100

Tab. 10: Nach der Methode der kleinsten Quadrate ermittelte Funktionen für die Myxothiazol-Titrationskurven der CD14+ Monozyten

RPMI 1640 ohne Glukose

f(x) = -0,0019x3 + 0,2112x2 - 7,7185x + 100

RPMI 1640 mit Glukose

f(x) = -0,0019x3 + 0,2041x2 - 7,372x + 100

Tab. 11: Myxothiazoldosis für eine 50%ige Hemmung der Atmung (pmol Myxothiazol/107 Zellen)

 

RPMI 1640 ohne Glukose

RPMI 1640 mit Glukose

CD4+ T-Zellen

3,02

3,77

CD14+ Monozyten

8,17

8,71

Tab. 12: Anzahl Mitochondrien pro Zelle

Zellart

Spezies

Mittlere Anzahl

Referenz

Lymphozyt (Blut)

Mensch

29

Kirschner et al. 1972

Lymphoblast (Lymphknoten)

Mensch

9,3

Schumacher et al. 1973

T-Lymphozyt (Blut)

Mensch

3,18

Nagy et al. 2004

Makrophage (Peritoneum)

Ratte

139,6

Mayhew und Williams 1974


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Das Vorhandensein von Glukose sorgte für eine stärkere Unempfindlickeit beider Zellarten gegenüber Myxothiazol (Tab. 11). Außerdem war die extramitochondriale Atmung, die nicht Myxothiazol-hemmbar ist, höher (Tab. 13). Eine mögliche Erklärung dafür liegt darin, daß sich durch Glykolysierung Zuckerreste unter Abspaltung von Wasser an organische Verbindungen wie Proteine und Lipide anlagern. Nach Takamiya et al. (2003) setzt die glykolysierte Form der Superoxiddismutase (SOD) mehr Substrat in Form von Superoxidradikalen um. Diese Radikale müssen aufgrund der Aufrechterhaltung des chemischen Gleichgewichts durch verstärkte Atmung wieder nachgeliefert werden. Demgegenüber sorgt das Fehlen von Glukose für eine gesteigerte SOD-mRNA-Expression in CD4+ T-Zellen (Dziurla 2004). Das Enzym wird also über die Glukosekonzentration reguliert. Die Aktivität wird durch Glykolysierung und die Konzentration bei Glukosemangel durch Transkriptionssteigerung erhöht. Die SOD ist neben der aktivierten NADPH-Oxidase ein bedeutender extramitochondrialer Sauerstoffverbraucher.

An Rattenthymozyten wurde mit maximal 2 % eine vergleichsweise geringe extramitochondriale Atmung ermittelt (Lakin-Thomas und Brand 1988). Roos und Loos (1970, 1972) fanden bei Lymphozyten mit KCN 10-15 % extramitochondriale Atmung. An PBMC konnten Schmid et al. (2000) einen Anteil von weniger als 5 % ermitteln. In den vorliegenden Untersuchungen sind folgende Werte durch Mittelwertbildung des relativen Sauerstoffverbrauchs der letzten drei Punkte auf der Titrationskurve (vgl. Abb. 24, 25, 30, 31) ermittelt worden:

Tab. 13: Relativer Anteil der extramitochondrialen Atmung an der zellulären Gesamtatmung

 

RPMI 1640 ohne Glukose

RPMI 1640 mit Glukose

CD4+ T-Zellen

10,5 %

12,1 %

CD14+ Monozyten

6,6 %

10,9 %

Die Angaben der Tabelle 13 stimmten überein mit den Angaben von Roos und Loos (1970, 1972). Sie waren nahe der von Lakin-Thomas und Brand (1988) und Schmid et al. (2000). Die extramitochondriale Atmung aller Körperzellen beläuft sich im Mittel auf etwa 10 % (Rolfe und Brown 1997). Es fiel auf, daß die CD4+ T-Zellen unabhängig von der Glukosekonzentration eine höhere extramitochondriale Atmung hatten. Demnach wird in Monozyten weitaus mehr Sauerstoff in der OXPHOS metabolisiert als in CD4+ T-Zellen. Nach Reiss und Roos (1978) werden bei Monozyten ca. 70 % des Sauerstoffs in der OXPHOS metabolisiert. Die Zellatmung wurde dort mit Antimycin A titriert. Die Titrationskurve näherte sich ebenso wie in der [Seite 71↓]vorliegenden Arbeit (Abb. 30, 31) und der Arbeit von Buttgereit und Brand (1995) asymptotisch der maximal möglichen Hemmung des Sauerstoffverbrauchs. Buttgereit und Brand (1995) fanden ebenfalls mittels Myxothiazol heraus, daß auch in Rattenthymozyten ca. 70 % des Sauerstoffs in der OXPHOS metabolisiert werden.

4.5 Effekte eines beeinträchtigten Energiestoffwechsels auf die PMA-Ionomycin-induzierte Zytokinsynthese bei CD4+ T-Zellen

4.5.1 Aktivierung und Differenzierung von T-Lymphozyten

Aktivierung und Differenzierung von T-Lymphozyten verlangt die gleichzeitige Stimulation sowohl des T-Zell-Rezeptors (TCR) als auch verschiedener Corezeptoren. Dadurch werden Proteintyrosinkinasen aktiviert, die wiederum eine Aktivierung der Phospholipase C-γ bewirken. Im Ergebnis wird das Plasmamembranlipid Phosphatidylinositol-4,5-bisphosphat in zwei sekundäre Botenstoffe, Inositol-1,4,5-Triphosphat und 1,2-Diacylglycerol, aufgespalten (Berridge 1993). Ersterer führt zu einer Erhöhung des intrazellulären Kalziumspiegels durch Freisetzung von Kalzium aus zellulären Speichern, letzterer aktiviert die Proteinkinase C (PKC) (Truneh et al. 1985). Auf diese Art wird eine Abfolge von Signaltransduktionswegen eingeleitet, die zu Zellexpansion und Immunkompetenz führen (Altman et al. 1990). Da unstimulierte periphere T-Lymphozyten spontan kaum oder keine Zytokine synthetisieren (Baran et al. 2001), war eine in vitro Stimulation der Zellen mit PMA und Ionomycin erforderlich. Dadurch wurde die Aktivierung der Zellen simuliert, die beispielsweise in Entzündungsgebieten stattfindet. Die zelluläre Mikroumgebung in solchen Gebieten mit verminderten Sauerstoff- und Glukosekonzentrationen wurde durch die verminderte Sauerstoffverwertung infolge Myxothiazolhinzugabe und den Entzug von Glukose nachgeahmt. Die kombinierte Gabe von PMA und Ionomycin überbrückt die Notwendigkeit der Oberflächenrezeptor-Interaktion auf T-Zellen, weil sie direkt die PKC- und Kalzium-Signalpfade aktiviert (Truneh et al. 1985, Kumagai et al. 1987, Altman et al. 1992). Ionomycin ist ein Ca2+-Ionophor und sorgt deshalb für einen Kalziumeinstrom in die Zellen. PMA ist strukturell verwandt mit 1,2-Diacylglycerol und aktiviert daher die PKC. Die Aktivierung der T-Zellen wurde in der vorliegenden Arbeit also dadurch eingeleitet, daß PMA und Ionomycin die Wirkungen der Inositol-Phospholipid-abgeleiteten sekundären Botenstoffe imitierten, deren Freisetzung normalerweise durch eine TCR-CD3-Komplex-Aktivierung erfolgt (Altman et al. 1992).


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4.5.2  Wirkungen von Cofaktor- und Vitaminentzug

Die Zusammensetzung des Zellkulturmediums hinsichtlich der Konzentration von Vitaminen und anderen Cofaktoren hatte erheblichen Einfluß auf die Höhe der Zytokinsynthese. Das konnte bei den Untersuchungen zur Etablierung eines Systems festgestellt werden, das zu einer hohen Frequenz von Zytokin-produzierenden Zellen führte (s. Pkt. 3.3). In den Medien C und D konnten signifikant mehr Zytokinproduzenten beobachtet werden, als in den Medien A und B (Abb. 32). Das ist vor allem auf eine verminderte ATP-Synthesekapazität in der OXPHOS infolge des Nichtvorhandenseins von dafür essentiellen Vitaminen und anderen Cofaktoren in den Medien A und B zurückzuführen. Durch eine Behandlung mit Cofaktoren konnten Marriage et al. (2004) über die Ernährung eine Verbesserung der mitochondrialen ATP-Synthese in Lymphozyten bei Patienten mit Störungen in der OXPHOS bewirken. Bei Kontrollymphozyten gesunder Spender führte aber nur die Komponente Coenzym Q 10 bei der kombinierten Cofaktorbehandlung zu einer gesteigerten ATP-Synthese. Dennoch sind in den Medien C und D ein Großteil der Vitamine vorhanden gewesen, die auch in der Cofaktorbehandlung von Marriage et al. (2004) zu finden waren. Allein durch die Zugabe von FCS (= Unterschied zwischen Medium A und B) war eine Zunahme der Zytokinproduzenten zu beobachten. In FCS sind eine Vielzahl von essentiellen Mikronährstoffen und Wachstumsfaktoren enthalten. Es bietet der Zelle die gewohnte Umgebung. Die Zunahme der Zytokinproduzenten konnte durch die Zugabe von Vitaminen (= Unterschied zwischen Medium B und C) noch erheblich gesteigert werden. Aus diesen Gründen wurden in der vorliegenden Arbeit in Übereinstimmung mit den Berichten von Erickson et al. (2000), Calder und Kew (2002), Keusch (2003) und Marriage et al. (2004) weitere Anhaltspunkte für den nutritiven Einfluß auf die Funktion von Zellen des Immunsystems gefunden. Nach Meinung der Autoren läßt sich der nutritive Einfluß auf das gesamte Immunsystem und die mitochondriale Energiegewinnung ausdehnen. So führte der Entzug von Wachstumsfaktoren zu einer verminderten Aktivität der OXPHOS bei T-Zellen, weil das mitochondriale Membranpotential und damit der Sauerstoffverbrauch abnahmen (Thompson et al. 1999).

4.5.3 Wirkungen einer vollständigen Hemmung der OXPHOS unter glukosefreien Bedingungen

In der vorgestellten Untersuchung konnte erfolgreich ein Modell entwickelt werden, daß die Situation in einem Entzündungsgebiet vereinfacht nachstellte. Das Modell bestand aus vier Faktoren: Es wurden (1) wichtige Immunzellfraktionen untersucht, die in Entzündungsgebiete [Seite 73↓]einwandern, (2) Sauerstoffmangel mit Myxothiazol nachgeahmt, (3) Glukose als wichtigstes nutritives Substrat entzogen und (4) die Zellen aktiviert. Somit konnte die Situation in Gebieten mit geringen Sauerstoff- und Glukosekonzentrationen (s. Einleitung) standardisiert in vitro angewendet werden. Im Ergebnis wurden mit den Daten zum ersten Mal die Energieanforderungen für das Überleben und spezifische Immunfunktionen von humanen peripheren CD4+ T-Zellen quantifiziert (s. Pkt. 3.6 u. Hypothese 1 in Pkt. 4.10).

Zur Nachahmung von Sauerstoffmangel mit Myxothiazol ist zu bemerken, daß die Methode der Deoxygenierung mit N2 zur Disposition stand. In Übereinstimmung mit Rabinowitz et al. (1968) kamen aber erhebliche Zweifel an ihrer Effektivität auf. Es ist sehr kompliziert, Flüssigkeiten vollständig von Sauerstoff zu befreien und diese Situation anschließend aufrechtzuerhalten. Durch die Verwendung eines spezifischen Hemmstoffs der OXPHOS wie Myxothiazol kann intrazellulär der Sauerstoffverbrauch stufenweise bis zur Vollständigkeit unterdrückt werden (s. Abb. 24, 25, 30, 31). Das ist mit der Methode der Deoxygenierung nur sehr schwierig, wenn überhaupt zu erreichen. Die Wirkung von Myxothiazol ist außerdem mit der Situation einer schweren Sepsis zu vergleichen. Hier wird eine erworbene intrinsische Störung der Fähigkeit von Zellen diskutiert, Sauerstoff zu verbrauchen und ATP trotz normaler Sauerstoffkonzentrationen (zytopathische Hypoxie) zu synthetisieren (Crouser et al. 2002, Fink 2002, Gellerich et al. 2002, Brealey et al. 2004).

Zunächst lassen sich die gefundenen Daten so interpretieren, daß die Energieanforderungen für die Zytokinsynthese entweder durch glykolytische oder durch oxidative Energiegewinnung austauschbar gesichert werden können (Abb. 33-35). Der separate Entzug von Glukose hatte ebensowenig Auswirkungen wie die separate vollständige Hemmung des Sauerstoffverbrauchs. Erst die simultane und vollständige Hemmung sowohl der Atmung als auch der Glykolyse mündete in einer dramatischen Reduzierung der Zytokinsynthese. Diese Beobachtungen passen zu Beobachtungen von MacDonald und Koch (1977) an T-Zellen. Dort war die T-Zell-vermittelte Zytolyse erst bei vollständiger und gleichzeitiger Hemmung von Atmung und Glykolyse vermindert. In der Arbeit von Zuckerberg et al. (1994) wurde mit ansteigender Hypoxie eine dramatische Reduzierung der IL-2-mRNA von PMA-Ionomycin-stimulierten T-Zellen beobachtet. Caldwell et al. (2001) fanden, daß sich reduzierte Sauerstoffkonzentrationen beeinträchtigend auf die Entwicklung von zytotoxischen T-Zellen und die Zytokinsynthese auswirkten. Nach McLaughlin et al. (1996) verhinderten reduzierte Sauerstoffkonzentrationen den TCR-induzierten Zelltod und die Induktion eines wichtigen Regulatorgens in unreifen T-[Seite 74↓]Zellen des Thymus. Demzufolge werden also Überleben und Differenzierung von T-Zellen durch die umgebende Sauerstoffkonzentration beeinflußt.

Dennoch überrascht die große Adaptationsfähigkeit der Zellen an Energiemangel. Dies beweist zwar, daß CD4+ T-Zellen unter widrigsten Bedingungen, wie sie beispielsweise in Entzündungsgebieten herrschen, überleben und ihre Funktionen ausüben können. Da aber in Kurzzeitexperimenten mit der Clark-Elektrode ca. zwei Drittel des Sauerstoffverbrauchs von Con A-stimulierten Lymphozyten (Schmid et al. 2000) und vier Fünftel des Sauerstoffverbrauchs von Con A-stimulierten Rattenthymozyten (Buttgereit und Brand 1995) spezifischen Prozessen wie der Proteinbiosynthese mit jeweils 15 und 21, der Na+-K+-ATPase mit jeweils 15 und 10, der Ca2+-ATPase mit jeweils 15 und 10 und der RNA/DNA-Synthese mit jeweils 8 und 15 % zugeordnet werden konnten, dürfen die vorliegenden Daten diesen zur Seite gestellt werden. Es wird vermutet, daß viel mehr Energie als bisher angenommen in sog. futile cycles, also sinnlosen Prozessen oder ineffizient zur Sicherung verschiedener Funktionen verbraucht wird. So werden beispielsweise in verschiedenen Säugetierzellen bis zu 40 % der Proteine, in Makrophagen sogar bis zu 55 %, sofort nach ihrer Synthese wieder degradiert (Schubert et al. 2000, Princiotta et al. 2003). Bei diesen zu degradierenden Proteinen handelt es sich um sog. fehlerhafte ribosomale Produkte (DRiPs, defective ribosomal products). Sie erreichen nie eine native Struktur, weil sie während der Translation oder posttranslationellen Prozessen fehlerhaft gefaltet wurden (Schubert et al. 2000). Der energetische Verbrauch für solche sinnlosen oder ineffizienten Prozesse wurde natürlich in den Arbeiten von Schmid et al. (2000) und Buttgereit und Brand (1995) mitbilanziert. Er beläuft sich allein bei der Proteindegradation auf über 10 % (Lehner 2003 nach Princiotta et al. 2003). Ursache der unerwartet großen Adaptationsfähigkeit an Energiemangel über einen längeren Versuchszeitraum könnte demzufolge die Abschaltung derartiger Prozesse sein, ohne daß dies Auswirkungen auf Zellüberleben und -funktionalität hätte. Die Zelle besitzt also Potential, die Effizienz der Energieverwertung zu erhöhen, indem sie weniger bedeutsame oder auch für das unmittelbare Zellüberleben unwichtige Prozesse abschaltet.

Darüber hinaus wird die Existenz von sog. mitochondrialen Schwellenwerten diskutiert. Es ist möglich, beträchtlich die Aktivität von Komplexen der mitochondrialen Atmungskette (z. B. Komplex I um 85 % und Komplex IV um 75 %) bis hin zu einem kritischen Wert zu hemmen oder durch Mutation auszuschalten, ohne Auswirkungen auf die ATP-Synthese (Davey und Clark 1996, Farge et al. 2002, Rossignol et al. 2003). Dieses Phänomen wird Biochemischer [Seite 75↓] Schwellenwert genannt. Zellen unterschiedlicher Organe zeigen unterschiedliche biochemische Schwellenwerte (Rossignol et al. 1999). In glukosefreiem Medium könnte die Existenz eines solchen Schwellenwertes teilweise für das Fehlen eines Effektes auf die Zytokinsynthese verantwortlich sein.

Auf der anderen Seite deuten weitere Daten darauf hin, daß sich PMA-Ionomycin-stimulierte CD4+ T-Zellen in besonderer Weise an Energiemangel durch Glukoseentzug und Komplex III-Hemmung anpassen können. Als wesentliche Ursache des unerwartet hohen adaptativen Potentials wird eine stark gesteigerte OXPHOS in den Mitochondrien vermutet. Dadurch wurde im Ergebnis deutlich mehr ATP zur Verfügung gestellt als durch die weiter unten diskutierte Glykogenolyse. Durch Spontanglykogenolyse (Doenecke 1973) und den starken Stimulus werden vermeintliche Glykogenvorräte ohnehin schnell abgebaut gewesen sein. Dies wurde aus der Beobachtung abgeleitet, daß sich nach 3 h unabhängig von der Myxothiazoldosis eine stark überschießende Reaktion des Sauerstoffverbrauchs zeigte (Abb. 21). In Punkt 4.10 wird in Hypothese 1 diskutiert, daß einige wenige, nicht Myxothiazol-gehemmte Mitochondrien ihre Aktivität sehr stark steigerten. Dadurch wurde der Energieverlust der ausgefallenen Mitochondrien kompensiert. Zusätzlich kompensieren mußte aber auch die anaerobe Glykolyse, weil sich bei vollständigem Glukoseentzug die Zytokinsynthese stark verminderte.

Zu den bereits erwähnten Glykogenvorräten ist folgendes zu bemerken: Bei vollständiger Unterdrückung der mitochondrialen Atmung mit den max1- und max2-Myxothiazoldosen und gleichzeitigem Glukoseentzug konnten die CD4+ T-Zellen ihren Energiehaushalt durch die normalerweise alternativ zur Verfügung stehende glykolytische Energiegewinnung nicht mehr aufrechterhalten und starben ab (Abb. 22). Da im glukosefreien Medium immerhin bis zu einer Hemmung des Sauerstoffverbrauchs um 80 % noch kein Effekt auf die Zytokinsynthese zu beobachten war, könnten die Zellen auf ihre geringen Glykogenreserven zurückgegriffen und durch Glykogenolyse zumindest einen kleinen Teil ihres Energiebedarfs gesichert haben. Es wurde gezeigt, daß Lymphozyten Glykogenreserven enthalten (Leikin 1961, Seitz und Luganova 1968, Doenecke 1973, Gunzer et al. 1978), die durch Phythämagglutinin (PHA) mobilisiert und zur Energiegewinnung abgebaut werden (Doenecke 1973). Außerdem wurden in Lymphozyten Enzymaktivitäten des Glykogenstoffwechsels nachgewiesen (Seiler und Kelleter 1973, Gunzer et al. 1978).

Bei den IL-2-, TNF-α- und IL-4-Produzenten konnte ein Alles-oder-Nichts-Prinzip hinsichtlich der Zytokinsynthese in Abhängigkeit von der Energieverfügbarkeit beobachtet werden. Die MFI [Seite 76↓]der Myxothiazol-gehemmten Zellen, die als Zytokin-positiv identifiziert wurden, waren im Gegensatz zur MFI der IFN-γ-Produzenten über alle Niveaus der Atmungshemmung hinweg nicht verringert. Die stimulierte Zelle stellte also entweder die Zytokinsynthese vollständig ein oder sie wurde konstant gehalten. Demnach könnte es hier bis zu drei Unterpopulationen geben: (1) Zellen, die von Anfang an Nichtproduzenten sind, (2) Zellen, die Produzenten sind, jedoch bei Energiemangel ihre Synthese vollständig einstellen und (3) Zellen, die sich vollkommen unbeeindruckt von einer vollständig unterdrückten OXPHOS zeigen. Es ist bekannt, daß unterschiedliche T-Zellklone in ihrer Zytokinproduktion variieren und auf diese Art in ihren funktionellen Eigenschaften. (Schauer et al. 1996). Wahrscheinlich handelte es sich bei den trotz vollständiger Atmungshemmung weiterhin Zytokin-positiven Zellen um diejenigen, deren Komplexe III bzw. Mitochondrien nicht vollständig durch Myxothiazol gehemmt wurden (s. Hypothese 1 in Pkt. 4.10). Diese Zellen waren noch in der Lage, ihre Energiegewinnung aus der OXPHOS aufrechtzuerhalten und damit die Energieanforderungen für überlebenswichtige und spezifische Funktionen zu sichern.

4.5.4 Wirkungen einer vollständigen Hemmung der OXPHOS unter glukosehaltigen Bedingungen

Unter glukosehaltigen Bedingungen konnten auf jedem Niveau der Atmungshemmung keine Auswirkung auf die Zytokinsynthese beobachtet werden (Abb. 33-35). Was könnten die Ursachen dafür sein? Bental und Deutsch (1993) konnten an PMA-Ionomycin-stimulierten T-Zellen innerhalb der ersten 2 h eine 6fach gesteigerte Glykolyserate beobachten. Diese steigerte sich bis auf das 15fache nach 48 oder 96 h und korrelierte mit einer erhöhten Laktatbildung. Wu und Marliss (1993) konnten bei PMA-Ionomycin-Stimulationen an Peritonealmakrophagen von Ratten die Steigerung des Pentosephosphatzyklusses und der Glykolyse messen. Für die untersuchten CD4+ T-Zellen ist es also während einer PMA-Ionomycin-Stimulation möglich, das Defizit aus der mit Myxothiazol unterdrückten oxidativen Energiegewinnung durch alternative ATP-Synthesewege auszugleichen. Die Stimulation treibt ohnehin direkt und/oder indirekt durch den erhöhten Bedarf die glykolytische Energiesynthese an. Dieser Mechanismus ist für die Abwanderung von T-Zellen in Gebiete mit geringen Sauerstoffpartialdrücken sinnvoll.

In diesem Zusammenhang wird auch die Energiesynthese über die Glutaminolyse diskutiert (Ardawi 1988, Calder 1995). Glutamin war Bestandteil aller verwendeten Zellkulturmedien. Trotzdem muß die Energiegewinnung über die OXPHOS signifikant den Energiebedarf für die [Seite 77↓]Zytokinsynthese gedeckt haben. Die Zytokinsynthese funktionierte unter glukosefreien Bedingungen und war bei gleichzeitig vollständig gehemmter OXPHOS stark vermindert. Hinzu kommt, daß menschliche Blutlymphozyten unter aeroben Bedingungen Glukose fast vollständig zu CO2 und Wasser veratmen, während die aerobe Glykolyse praktisch keine Rolle spielt (Kelleter et al. 1973). Die vielleicht bemerkenswerteste Eigenschaft der Lymphozyten im Glukosestoffwechsel ist ihre Fähigkeit, unter anaeroben Bedingungen durch verstärkte Glykolyse etwa dieselben ADP-ATP-Spiegel zu halten wie unter aeroben Bedingungen. (Kelleter et al. 1973). Höchstwahrscheinlich leiten also zwei Faktoren unter glukosehaltigen Bedingungen die glykolytische Kompensation des Energieverlustes aus der unterdrückten Atmung und damit die vollkommen unbeeinträchtigte Zytokinsynthese ein: Der PMA-Ionomycin-Stimulus und der mittels Myxothiazol simulierte Sauerstoffmangel. Nach Merlo-Pich et al. (2004) wird die Glykolyse in Lymphozyten in dem Maß gesteigert wie die mitochondriale Atmung gehemmt wurde. Die aerobe Glykolyse spielt aber nur eine stark untergeordnete Rolle bei der Sicherung des Energiebedarfs für die Zytokinsynthese. Glukoseentzug verursachte keine statistisch signifikante Verminderung der Zytokinsynthese (Abb. 33-35). Die OXPHOS spielte also eine sehr viel bedeutendere Rolle. Dadurch verwundert es nicht, daß die Zytokinsynthese so lange aufrechterhalten wurde.

Buttgereit und Brand (1995) stellten an Con A-stimulierten Thymozyten von Ratten mittels amperometrischer Sauerstoffverbrauchsmessung fest, daß nach 30%iger Hemmung des Sauerstoffverbrauchs mit Myxothiazol die Cycloheximid-gehemmte Proteinbiosynthese nur noch 40 % Prozeßaktivität aufwies, obwohl Glukose zur Kompensation zur Verfügung stand. Demgegenüber hatte unter gleichen Bedingungen die vollständige Hemmung des Sauerstoffverbrauchs von CD4+ T-Zellen keine Auswirkungen auf die Zytokinsynthese. In länger andauernden Experimenten wie der sechsstündigen PMA-Ionomycin-Stimulation können sich CD4+ T-Zellen durch Umschaltprozesse sehr wahrscheinlich besser adaptieren als in Kurzzeitexperimenten wie der amperometrischen Sauerstoffverbrauchsmessung. Weiterhin wird vermutet, daß schon die glykolytische ATP-Gewinnung zur Kompensation ausreichte, weil durch die Betrachtung der Zytokinsynthese nur ein kleiner Teil der gesamten Proteinbiosynthese berücksichtigt wurde. Zudem stellen PMA und Ionomycin in Kombination ein Maximalstimulans der Proteinbiosyntheserate dar (Miyamoto et al. 2000). Diehn et al. (2002) berichten, daß bei T-Zellen durch diesen Stimulus die Expressionsmuster von mehr als 3000 Genen verändert werden. Das läßt auf enorme Veränderungen im gesamten Proteinspektrum der PMA-Ionomycin-aktivierten T-Zelle schließen. Hinzu kommt, daß unter den o. g. Bedingungen [Seite 78↓]wahrscheinlich die Synthese von anderen Proteinen zurückgeht, aber die der wichtigen Zytokine (eine der Hauptfunktionen) eben nicht.

4.6 Effekte eines beeinträchtigten Energiestoffwechsels auf die Proliferation bei CD4+ T-Zellen

4.6.1 Wirkungen einer vollständigen Hemmung der OXPHOS unter glukosefreien Bedingungen

In früheren Studien zur Aktivierung von Lymphozyten wurden mitogene Pflanzenlektine wie Con A, PHA und Pokeweed Mitogen genutzt, später die physiologischere Variante der CD3/CD28-Stimulation. Damit konnten ähnlich wie bei einer antigenen Stimulation Zellwachstum (Blastenbildung) und Proliferation bei der Hauptmasse der Zellpopulation induziert werden, die meist innerhalb von 1 h zu gesteigerter Glukoseverwertung führten (Roos und Loos 1973, Sagone et al. 1974, Culvenor und Weidemann 1976, Hume et al. 1978, Frauwirth et al. 2002). Zusätzlich induzierte die Stimulation einen schnellen, aber nur moderaten Anstieg des Sauerstoffverbrauchs (Roos und Loos 1973, Hume et al. 1978, Krauss et al. 2001). Es wurde an Con A-stimulierten Lymphozyten eine Steigerung des Sauerstoffverbrauchs um 30-50 % gefunden (Buttgereit et al. 1993, Buttgereit und Brand 1995, Krauss et al. 2001, Schmid et al. 2000, 2001). Ausdruck der viel dramatischeren Steigerung der Glykolyse ist die signifikante Erhöhung der Laktatproduktion (Frauwirth und Thompson 2004) um 350 % (Roos und Loos 1973). Nach Brand et al. (1986) ist die Glukoseverwertung in proliferierenden Thymozyten von Ratten 36fach gesteigert, aber die Oxidation zu CO2 nur verdoppelt. Etwa 90 % wird in Laktat umgewandelt. Das konnten auch Frauwirth et al. (2002) an humanen CD3/CD28-stimulierten T-Lymphozyten finden. Laktatproduktion bei normaler Sauerstoffverfügbarkeit wird als aerobe Glykolyse bezeichnet. Sie ist ursprünglich an Tumorzellen entdeckt worden (Warburg-Effekt) (Warburg et al. 1926). Ruhende Lymphozyten zeigen keine aerobe Glykolyse (Seitz und Luganova 1968). Die gesteigerte aerobe Glykolyse in Anwesenheit von Glukose ist zumindest bei einer CD3/CD28-Stimulation von Lymphozyten Rezeptor-induziert (Frauwirth et al. 2002) und nicht durch Sauerstoffmangel, so wie bei der Laktatbildung im Muskel. Die Hemmung der OXPHOS per sé mit TTFB (Entkoppler), Oligomycin oder KCN induziert aber auch eine verstärkte Glykolyse. Roos und Loos (1973) konnten dadurch bei Lymphozyten einen Anstieg der Laktatakkumulation um 400-600 % verursachen, der durch Anwesenheit von PHA noch verstärkt wurde.

Während der Proliferation von Lymphozyten ist also v. a. die aerobe Glykolyse stark gesteigert, [Seite 79↓]aber auch die Atmung wird erhöht (Roos und Loos 1973, Sagone et al. 1974, Culvenor und Weidemann 1976, Wang et al. 1976, Hume et al. 1978). Dies erklärt die um durchschnittlich 62,6 % geringeren Ausgangswerte der Proliferation bei den CD4+ T-Zellen in glukosefreiem Medium (Abb. 36, 37). Glukose fehlte hier außerdem als wichtiger Zellbaustein. Hinzu kommen könnte der hemmende Einfluß von ROS auf die Proliferation infolge Glukoseentzug (Aulwurm und Brand 2000). In der aeroben Glykolyse anfallendes Pyruvat akzeptiert und neutralisiert somit ROS (Brand 1997). Durch die vollständige Hemmung des Sauerstoffverbrauchs hingegen wurde die Proliferation mit 56,4 % weniger stark gehemmt. Der Entzug von Glukose hat also stärkere Auswirkungen als die Hemmung des Sauerstoffverbrauchs und erklärt somit die überraschend ausgeprägte Anpassungsfähigkeit der Zellen an den simulierten Sauerstoffmangel. Exogener Sauerstoffmangel wirkt sich ebenfalls beeinträchtigend auf die Proliferation von T-Zellen aus (Naldini et al. 1997, Naldini und Carraro 1999, Conforti et al. 2003).

Die Möglichkeit der CD4+ T-Zellen, mehrere Energiesynthesewege nutzen zu können, macht sie elastischer in der Reaktion auf Energiemangelsituationen. Die Tatsache, daß infolge der initial vollständig gehemmten mitochondrialen Atmung die Proliferation nur um 56,4 % vermindert war, deutet auf zwei Dinge hin: (1) Die Proliferation ist kein Parameter der OXPHOS selbst. (2) Innerhalb der OXPHOS müssen Veränderungen stattgefunden haben, die im Zusammenhang mit der in Punkt 4.10 (Hypothese 1) diskutierten, überschießenden Reaktion des Sauerstoffverbrauchs in PMA-Ionomycin-stimulierten CD4+ T-Zellen stehen könnten.

4.6.2 Wirkungen einer vollständigen Hemmung der OXPHOS unter glukosehaltigen Bedingungen

Nach Frauwirth und Thompson (2004) gibt es zwei wichtige Erklärungsmöglichkeiten für die Umschaltung auf aerobe Glykolyse während der Lymphozytenaktivierung (Proliferation), weil der Glukosestoffwechsel nicht einfach aufgrund der verringerten ATP-ADP-Ratio gesteigert wird: (1) Lymphozyten sind evtl. unfähig, die OXPHOS für die Sicherstellung des energetischen Bedarfs ausreichend zu steigern und hyperinduzieren deshalb die Glykolyse. (2) Alternativ könnte die Umschaltung auf die Glykolyse aus einer primären Stimulation von Glukoseaufnahme und -katabolismus resultieren, die den zellulären Bedarf für die ATP-Produktion über die OXPHOS überschreitet. Übermäßig synthetisiertes Pyruvat und NADH treiben die Laktatbildung an. Dadurch wird der NAD+-Pool regeneriert. Wahrscheinlicher ist die erste Erklärungsmöglichkeit. In der vorliegenden Arbeit wurde festgestellt, daß Mitochondrien [Seite 80↓]PMA-Ionomycin-stimulierter CD4+ T-Lymphozyten über ein enormes, aber begrenztes Steigerungspotential ihrer Atmungskettenaktivität verfügen (s. Hypothese 1 in Pkt. 4.10 u. Tab. 18). Dazu ist zu ergänzen, daß die OXPHOS zwar effizienter ATP synthetisiert (38 Mol ATP/Mol Glukose vs. 2 Mol glykolytisch gewonnenes ATP/Mol Glukose). Es ist aber nicht geklärt mit welcher Intensität. Der energetische Bedarf für einige spezifische Funktionen wie die Zytokinsynthese konnte aber durch die Steigerung der OXPHOS allein gesichert werden. Dies ist in den entsprechenden Versuchen nachgewiesen worden (Abb. 33-35). Hier könnten sich sogar beide o. g. Erklärungsansätze ergänzt haben. Die PMA-Ionomycin-Stimulation war immer von einer pH-Wert-Veränderung in den sauren Bereich begleitet, erkennbar an der Verfärbung des Phenolrotindikators des Zellkulturmediums. Eine Ursache dafür könnte Laktatbildung gewesen sein, aber auch HCO3-Bildung aus übermäßig anfallendem CO2 könnte stattgefunden haben.

Wie bereits diskutiert wurde, ist also die Proliferation von Lymphozyten in stärkerem Maß von der glykolytischen als von der oxidativen Energiegewinnung abhängig. Das erklärt, daß bei Verfügbarkeit von Glukose und bis zur vollständigen Hemmung des Sauerstoffverbrauchs keine statistisch signifikante Beeinträchtigung der Proliferation beobachtet werden konnte (Abb. 36, 37). Die Energieverluste aus der stufenweise immer stärker unterdrückten mitochondrialen Atmung wurden durch eine gesteigerte Glykolyserate kompensiert. Diese Beobachtung stimmt mit Daten von Roos und Loos (1973) überein. Sie konnten durch Hemmung der Atmung mit TTFB (Entkoppler), Oligomycin oder KCN eine 600-800%ige Steigerung der Laktatakkumulation in PHA-stimulierten Lymphozyten induzieren.

Trotz der höchstwahrscheinlich größeren Bedeutung der glykolytischen Energiegewinnung zur Sicherung des Energiebedarfs der Proliferation ist die oxidative Energiegewinnung unbedingt erforderlich und überaus bedeutend. Dadurch befindet sich die Proliferationsaktivität in glukosehaltigem Zellkulturmedium auf einem sehr viel höheren Niveau als unter glukosefreien Bedingungen (50,7 ± 3,7 % vs. 19,0 ± 1,0 %). Die synthetisierte Energie aus der Glykolyse und der OXPHOS zusammengenommen sichert die unverminderte Proliferation über den gesamten Bereich des Niveaus der Atmung (Abb. 36).


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4.7  Effekte eines beeinträchtigten Energiestoffwechsels auf die Phagozytoseaktivität von CD14+ Monozyten

4.7.1 Wirkungen einer vollständigen Hemmung der OXPHOS unter glukosefreien Bedingungen

Die in den vorliegenden Untersuchungen gefundenen Ausgangswerte (Abb. 38, 39) stimmten mit Angaben von Thies et al. (2001) weitgehend überein. Diese fanden in Untersuchungen mit Vollblut gesunder Spender, daß 20 % der Monozyten Escherichia coli phagozytiert hatten.

Bei vollständiger Hemmung der OXPHOS war im glukosefreien Medium die Phagozytose um 31,3 % im Vergleich zum Ausgangswert vermindert (Abb. 38, 39). Diese Daten stimmen mit ähnlichen Beobachtungen von Reiss und Roos (1978) überein. Sie konnten durch den Atmungskettenhemmstoff Antimycin A den Sauerstoffverbrauch und damit die Aufnahme von Zymosan vollständig blockieren, weil die Monozytenphagozytose sehr stark von der OXPHOS abhängig ist. Dies dürfte aber, wie in der vorliegenden Arbeit gefunden, nur dann der Fall sein, wenn die Zellen nicht auf die glykolytische ATP-Gewinnung zurückgreifen können. Die Autoren konnten aber im Gegensatz zur vorliegenden Arbeit schon ab einer ca. 50%igen Hemmung des Sauerstoffverbrauchs einen kontinuierlichen und dosisabhängigen Rückgang der Phagozytose beobachten. Mit den drei höchsten Konzentrationen von Antimycin A konnte der Sauerstoffverbrauch nicht weiter unterdrückt, die Zymosanaufnahme aber weiter bis zur Vollständigkeit blockiert werden. Da aber bei den PMA-Ionomycin-stimulierten CD4+ T-Zellen Myxothiazoldosen über 22 pmol im glukosefreien Medium zum Zelltod führten (Abb. 22), wurde auf eine Erhöhung der Dosis über 40 pmol bei den CD14+ Monozyten verzichtet (Abb. 30, 31). In der Übersichtsarbeit von Lewis et al. (1999) sind andere Arbeiten beschrieben worden, in denen infolge exogenen Sauerstoffmangels eine verminderte Phagozytose bei Makrophagen beobachtet wurde.

Zellen des phagozytären Systems besitzen u. a. Rezeptoren für Komplement (C3b) und den konstanten Teil des Immunglobulinmoleküls (Fc), die eine Anheftung von Bakterien an die Zelle vermitteln. Der Anheftung geht ein aktiver Prozeß der Zellbewegung (Chemotaxis) und Protrusion von Zytoplasmafortsätzen (Pseudopodienbildung) voraus, der von löslichen Faktoren wie Endotoxinen und Interleukinen beeinflußt wird. Dieser Vorgang (Culic et al. 1997, Wells et al. 1999) sowie die anschließende Aufnahme über die Zellmembran, die intrazelluläre Prozessierung und die Präsentation von prozessierten Fragmenten an der Zelloberfläche (Authier et al. 1996, Groettrup et al. 1996, York und Rock 1996) sind temperatur- und [Seite 82↓]energieabhängig. Das wurde durch den Kontrollansatz bei einer Inkubationstemperatur von 0 °C bestätigt. Hier konnte in beiden Zellkulturmedien keine Phagozytose festgestellt werden. Bei der Betrachtung der Ergebnisse aus dem glukosefreien Medium bei vollständiger Hemmung der Atmung ist denkbar, daß die geringere ATP-Verfügbarkeit aus der OXPHOS schon zu einer Einschränkung der Bewegungsfähigkeit zu den Bakterien und so zu einer geringeren Phagozytoseaktivität führte. Zusätzlich stand natürlich auch weniger Energie für die anderen, an der Phagozytose beteiligten Prozesse zur Verfügung (Pseudopodienbildung, Anheftung), so daß auch hier die Ursachen für eine geringere Phagozytoseaktivität zu suchen sind. Wichtig an dieser Stelle zu erwähnen ist die Prozessierung. Im Phagozyt liegt das Bakterium eingeschlossen von der Plasmamembran als primäres Phagosom vor. Dieses entwickelt sich durch Fusion mit Lysosomen zum sekundären Phagosom. In diesem findet dann verstärkt der Verdauungsvorgang des Bakteriums mit Hilfe von Enzymen statt. Auch hier ist bei Energiemangel mit einer starken Beeinträchtigung zu rechnen. Hinzu kommt, daß als bakterizide Mechanismen bereits im primären Phagosom eine Ansäuerung und eine oxidative Abtötung stattfinden. Dazu sind auch erhebliche Energiemengen erforderlich (Authier et al. 1996) und demzufolge eine uneingeschränkt funktionsfähige mitochondriale Atmungskette. Weiterhin ist die eingeschränkte Energiebereitstellung für die Vielzahl der am Respiratorischen Burst beteiligten Enzyme zu erwähnen. So könnten zwar Bakterien noch phagozytiert, nicht aber mehr eliminiert werden. Da dieser Prozeß und der phagosomale Verdauungsvorgang der Aufnahme der Bakterien nachgelagert sind, werden sie in der energetischen Hierarchie bei Energiemangel keine Energie mehr zur Verfügung gestellt bekommen. Die Phagozytose fällt bei vollständiger Unterdrückung der OXPHOS nicht gänzlich, sondern nur teilweise aus (Abb. 38, 39). Durch die Abschaltung Phagozytose-nachgelagerter Prozesse wird Energie für die zunächst dringender benötigte Phagozytose eingespart.

4.7.2 Wirkungen einer vollständigen Hemmung der OXPHOS unter glukosehaltigen Bedingungen

Monozyten besitzen die Fähigkeit, besonders im aktivierten Zustand große Energiemengen über die Glykolyse zu gewinnen. So gibt es frühe Berichte darüber, daß Hemmstoffe der Glykolyse nicht nur die ATP-Synthese, sondern gleichzeitig die Aufnahme von Bakterien oder Erythrozyten in diese Zellen (Sbarra und Karnovsky 1959, Oren et al. 1963, Cline und Lehrer 1968, Kay et al. 1980) und die Chemotaxis und Ausbreitung (Kay et al. 1980) unterdrücken. Dementsprechend ist die nicht meßbare Beeinträchtigung der Phagozytose bei vollständiger [Seite 83↓]initialer Hemmung der OXPHOS im glukosehaltigen Zellkulturmedium zu erklären (Abb. 38, 39). Die Monozyten greifen hier auf die Energiegewinnung über die Glykolyse zurück. Nach Kawaguchi et al. (2001) können Makrophagen innerhalb von 1 min nach Beginn einer Hypoxie die Glykolyse über die Aktivierung der Phosphofructokinase drastisch steigern. Makrophagen, die sich von Monozyten ableiten, gehören zu den Zellen, die sich an geringe Sauerstoffkonzentrationen durch Umschaltung von aerober auf die anaerobe Glykolyse für die ATP-Synthese adaptieren (Lewis et al. 1999, Kato und Walz 2000). Es ist davon auszugehen, daß periphere Monozyten ebenfalls über diesen Mechanismus verfügen und auf ihn auch im Falle einer wie in der vorgestellten Arbeit nachgeahmten Hypoxiesituation zurückgreifen. Marsin et al. (2002) konnten ebenfalls an Monozyten mit Oligomycin eine gesteigerte Glykolyse induzieren. Im glukosefreien Medium konnten die Zellen während der Phagozytose nicht auf die Energiegewinnung über die Glykolyse zurückgreifen. Demzufolge war die Phagozytoseaktivität von vornherein um 40,9 % verringert. Da durch vollständige Hemmung des Sauerstoffverbrauchs in Abwesenheit von Glukose nur eine Hemmung um 31,3 % zu verzeichnen war, spielt die glykolytische Energiegewinnung bei der Phagozytose eine bedeutendere Rolle.

4.8 Hierarchie der Abhängigkeit der untersuchten Immunfunktionen von der glykolytischen und oxidativen Energiegewinnung

Beim Vergleich mit den anderen untersuchten Immunfunktionen nahm die Proliferation den höchsten Rang in der Abhängigkeit von der glykolytischen Energiegewinnung ein (Tab. 14).

Tab. 14: Hierarchie der Abhängigkeit der Immunfunktionen von der Glykolyse

Immunfunktion

Mittlere Beeinträchtigung bei Glukoseabwesenheit (%)

Proliferation

62,6

Phagozytose

40,9

Zytokinsynthese

0

Die Hierarchie der Abhängigkeit der untersuchten Immunfunktionen von der OXPHOS gestaltete sich wie in Tabelle 15 dargestellt.


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Tab. 15: Hierarchie der Abhängigkeit der Immunfunktionen von der OXPHOS

Immunfunktion

Mittlere Beeinträchtigung durch nachgeahmten Sauerstoffmangel (%)1

IL-2-Synthese

81,9

TNF-α-Synthese

67,7

IL-4-Synthese

57,9

Proliferation

56,4

IFN-γ-Synthese

54,2

Phagozytose

31,3

1Der nachgeahmte Sauerstoffmangel wurde durch die submaximale Myxothiazoldosis erzeugt.

Im Hinblick auf die evolutionäre Entwicklung des Immunsystems sind diese Hierarchien verständlich. Vor allem die Phagozytose ist ein sehr früher Prozeß in der Evolution des Immunsystems. Er war bereits bei geringen Sauerstoffkonzentrationen in der Atmosphäre existent und gehört deshalb zum angeborenen Immunsystem. Erst als die Sauerstoffkonzentrationen anstiegen, begannen sich wahrscheinlich Vorläufer der heutigen Mitochondrien als eigenständige Organismen zu entwickelten. Diese wanderten später in andere Zellen ein. Auf diese Art könnte es möglich geworden sein, mittels OXPHOS die Energie für zusätzliche Prozesse wie die Zytokinsynthese bereitzustellen.

Die Proliferation war bei Glukoseentzug am stärksten, umgekehrt jedoch nicht am wenigsten durch vollständige Hemmung der OXPHOS beeinträchtigt. Dies könnte daraus resultierten, daß durch die aerobe Glykolyse vermutlich Faktoren bereitgestellt werden, die durch Reaktionen im Zitratzyklus nicht verfügbar gemacht werden können (Frauwirth und Thompson 2004). Wurde die Glykolyse von Lymphozyten mit 2-Deoxyglukose in Gegenwart der alternativen Zitratzyklussubstrate Aspartat und Acetat gehemmt, so war die PHA-induzierte Proliferation trotz erhaltener Energiesynthesekapazität blockiert (Roos und Loos 1973). Das gleiche Ergebnis zeigten auch die vorliegenden Versuche. Hier wurde zur Hemmung der Glykolyse lediglich glukosefreies Zellkulturmedium verwendet. Alle anderen Faktoren blieben unverändert. Bei dem unbekannten und essentiellen Faktor, der durch die Glykolyse bereitgestellt wird und die Proliferation in besonderer Weise unterstützt, könnte es sich um Pyruvat handeln. Pyruvat ist ein effektiver ROS-Akzeptor. ROS fallen vermehrt an bei gesteigerter OXPHOS-Aktivität, die durch Mitogenstimulation ausgelöst wird. Brand (1997) sieht darin einen Sinn der gesteigerten aeroben Glykolyse bei der Lymphozytenaktivierung, weil ROS Proliferation verhindern. [Seite 85↓]Weiterhin werden die Bereitstellung von Zwischenprodukten für die RNA/DNA-Synthese (Calder 1995) und eine metabolische Kontrollfunktion (Newsholme et al. 1985b) diskutiert.

Die Synthese des Zytokins IFN-γ war unter den untersuchten Zytokinen am wenigsten von der OXPHOS abhängig. Das äußerte sich auch im bereits erwähnten Alles-oder-Nichts-Prinzip: Während die CD4+ T-Zellen nicht oder kaum in der Lage waren, die IL-2- (- 8 %), TNF-α- und IL-4-Synthese (jeweils ± 0 %) zu verringern und dadurch an die vollständige Hemmung der OXPHOS zu adaptieren, reduzierten sie die Intensität der IFN-γ-Synthese bevor sie sie vollständig einstellten. Ausdruck dafür war die statistisch signifikant verringerte MFI
(- 49,46 %). Die vergleichsweise geringe Unempfindlichkeit der IFN-γ-Synthese gegenüber Sauerstoffmangel ist biologisch sinnvoll. IFN-γ ist ein bedeutender Aktivator von Monozyten/Makrophagen, die vornehmlich in sauerstoffarmen Arealen agieren.

4.9 Einfluß des Hypoxie-induzierbaren Faktors-1 auf die ATP-Synthese bei Myxothiazol-gehemmten PMA-Ionomycin-stimulierten CD4+ T-Zellen

HIF-1α stellt die α-Untereinheit des Transkriptionsfaktors Hypoxie-induzierbarer Faktor-1 (HIF-1) dar, der zusätzlich eine zweite, die β-Untereinheit enthält. Die im Zytosol vorkommende und ständig nachsynthetisierte α-Untereinheit wird unter normoxischen Bedingungen sofort ubiquitiniert und in Proteasomen degradiert (Huang et al. 1998, Kallio et al. 1999). Unter hypoxischen Bedingungen ist die sauerstoffabhängige Degradation unterbunden und die α-Untereinheit gelangt in den Zellkern. Dort lagert sie sich mit der constitutiv exprimierten β-Untereinheit zum vollständigen Transkriptionsfaktor HIF-1 zusammen (Gaber et al. 2004). HIF-1 steuert im Zellkern verschiedene Zielgensequenzen (Distler et al 2004), u. a. die der anaeroben Energiegewinnung an. Dazu gehören transmembranäre Glukosetransporter und zentrale Enzyme der Glykolyse (Iyer et al. 1998). Die Entdeckung von HIF-1 als Hauptregulator der sauerstoffabhängigen Genexpression (Wang und Semenza 1993) sowie die Klonierung und molekulare Charakterisierung (Wang et al. 1995) waren wichtige Schritte für die Aufklärung des Mechanismus, welcher der Adaptation der Zelle an reduzierte Sauerstoffkonzentrationen zugrunde liegt.

HIF-1α ist also ein Schlüsselregulator der Glykolyse (Ryan et al. 1998, Seagroves et al. 2001). In den vorliegenden Untersuchungen wurde deshalb vermutet, daß der Faktor für die unerwartet lange energetische Adaptation und damit das Überleben und die Funktionalität in den Myxothiazol-gehemmten CD4+ T-Zellen verantwortlich sein könnte. Aus diesem Grund wurde die entscheidende, sauerstoffabhängige α-Untereinheit untersucht.


[Seite 86↓]

Auf mRNA-Ebene war zunächst nicht zu erwarten, daß unterschiedliche Expressionsmuster gefunden werden. HIF-1α wird posttranslationell, also auf Proteinebene reguliert (Gaber et al. 2004). Die Untersuchungen sollten aber klären, ob bestimmte Mechanismen in Gang gesetzt werden, die erst durch die Anwesenheit von PMA, Ionomycin und Myxothiazol ermöglicht und vielleicht durch die An- oder Abwesenheit von Glukose im Zellkulturmedium noch zusätzlich beeinflußt werden. Die gefundenen Daten zeigten eine Begünstigung der HIF-1α-mRNA-Expression durch die PMA-Ionomycin-Stimulation und Myxothiazol (Abb. 40). Dies steht scheinbar im Gegensatz zu der Auffassung, daß HIF-1α ausschließlich posttranslationell, also nicht auf mRNA-Ebene reguliert wird. Tatsächlich konnten aber auch schon Lukashev et al. (2001) eine Hypoxie-unabhängige Stimulation der HIF-1α-mRNA-Synthese durch TCR- und PMA-Ionomycin-Stimulation in Maus-T-Zellen induzieren. In weiteren Untersuchungen wird deshalb zu prüfen sein, ob PMA, Ionomycin und Myxothiazol beispielsweise Auswirkungen auf den Transkriptionsapparat haben oder über die Signaltransduktion stimulierend wirken und so zu einer Verstärkung der HIF-1α-mRNA-Expression führen. Hinweise dahingehend fanden sich in der Arbeit von Lukashev et al. (2001).

Wichtiger war jedoch die Untersuchung auf Proteinebene. Es fand sich in Übereinstimmung mit den Berichten von Chandel et al. (2000) und Hagen et al. (2003) in den normoxischen Kontrollen keine und in den hypoxischen Kontrollen eine starke HIF-1α-Proteinexpression, weil das Protein sofort jeweils degradiert oder stabilisiert wurde (Abb. 41). Die PMA-Ionomycin-Stimulation hatte wie auf mRNA-Ebene ebenfalls eine begünstigende Wirkung. Das spricht nochmals für weitere Untersuchungen hinsichtlich der Auswirkungen einer Stimulation. Es gibt bereits Hinweise, daß PMA HIF-1α induziert (Hossain et al. 2000, Lukashev et al. 2001, Chun et al. 2003, Jung et al. 2003). In den vorliegenden Untersuchungen war der Faktor jedoch bei Vorhandensein von Myxothiazol nicht mehr detektierbar (Abb. 41). Die Schlußfolgerung lautete deshalb, daß HIF-1 für die Aufrechterhaltung der Energiebereitstellung und damit des Überlebens und der Funktionalität in CD4+ T-Zellen bei vollständiger Unterdrückung der Atmung durch Myxothiazol nicht entscheidend sein konnte. Neuere Studien sprechen ohnehin dafür, daß HIF-1α in Lymphozyten eher auf funktionelle Eigenschaften wirkt (Kojima et al. 2003).

Welche Erklärungen gibt es dafür? Die wichtigste ist die verminderte Stabilisierung des Faktors in Anwesenheit von Myxothiazol. Diese These beruht auf einem von Chandel et al. (2000) vorgeschlagenen Modell für die zelluläre Sauerstoffsensorik: Hypoxie treibt die [Seite 87↓]Superoxidbildung (ROS-Synthese) am Komplex III der mitochondrialen Atmungskette an. Superoxid wird anschließend durch die SOD in H2O2 umgewandelt. Zusammen mit bestimmten Botenstoffen löst H2O2 im Zytosol die Stabilisierung des HIF-1α-Proteins aus. In der vorgestellten Arbeit wird Komplex III mit Myxothiazol stufenweise bis zur Vollständigkeit blockiert. Dadurch wird die ROS-Bildung immer stärker oder ganz unterbunden. Im Ergebnis ist die Stabilisierung von HIF-1α vermindert oder wie gezeigt vollständig gehemmt (Abb. 41).

Darüber hinaus könnte ein vermehrter Abbau des Faktors hinzugekommen sein. NO, das durch die PMA-Ionomycin-Stimulation entsteht (Valdez und Boveris 2001), und andere Hemmstoffe der mitochondrialen Atmungskette wie Myxothiazol führten in den Arbeiten von Hagen et al. (2003) und Mateo et al. (2003) zu einer Hemmung der Stabilisierung des HIF-1α-Proteins trotz niedriger Sauerstoffkonzentrationen. Als Ursache wurde die gesteigerte Prolylhydroxylase-abhängige Degradation von HIF-1α angegeben (Hagen et al. 2003). Die Proteinstabilität von HIF-1α wird in Abhängigkeit vom Sauerstoff (Wenger 2002, Pugh und Ratcliffe 2003, Safran und Kaelin 2003) durch eine Familie von Prolylhydroxylasen reguliert (Bruick und McKnight 2001, Epstein et al. 2001). Bei niedrigen Sauerstoffkonzentrationen ist die Aktivität der Prolylhydroxylasen gehemmt. HIF-1α reichert sich im Zytosol an und heterodimerisiert im Zellkern mit der β-Untereinheit von HIF-1. Hagen et al. (2003) konnten aber demonstrieren, daß unter Hypoxie durch die Hemmung der Atmungskette mit Myxothiazol nicht veratmeter Sauerstoff in die Richtung von nicht Atmungssauerstoff-abhängigen Zielen wie den Prolylhydroxylasen umverteilt wird. So konnten die von ihnen untersuchten Zellen Hypoxie nicht registrieren, weil HIF-1α degradiert wurde.

Zukünftige Untersuchungen müssen die Frage klären, warum PMA und Ionomycin sowie die Anwesenheit von Glukose die HIF-1α-Proteinexpression verstärken.

4.10 Anstieg des zellulären Sauerstoffverbrauchs zur Sicherstellung des ATP-Bedarfs bei Myxothiazol-gehemmten PMA-Ionomycin-stimulierten CD4+ T-Zellen

Hypothese 1: Nicht Myxothiazol-gehemmte Mitochondrien übernehmen die Energiesynthese

Nach den vorliegenden Erkenntnissen konnte HIF-1 in den durchgeführten Experimenten nicht entscheidend sein für die Sicherstellung des Energiebedarfs bei den Myxothiazol-gehemmten PMA-Ionomycin-stimulierten CD4+ T-Zellen. Es wurde die Vermutung aufgestellt, daß funktionsfähig verbliebene, nicht Myxothiazol-gehemmte Mitochondrien über ein enormes Steigerungspotential ihrer Atmungskettenaktivität verfügen. Dadurch wird der Energieverlust [Seite 88↓]aus den ausgefallenen Mitochondrien kompensiert. Rossignol et al. (2003) nehmen an, daß eine starke Erhöhung der Aktivität von Atmungskettenkomplexen das Phänomen des Biochemischen Schwellenwertes (s. Pkt. 4.5.3) erklärt. Dieser Effekt wird als Reserve für die Kompensation von Defiziten genutzt.

In Übereinstimmung mit der Vermutung und den nachfolgend diskutierten, in dieser Arbeit erhobenen Daten konnten Frauwirth et al. (2002) an CD28-costimulierten T-Zellen eine 4fache Steigerung des Sauerstoffverbrauchs und demzufolge der OXPHOS beobachten. Dort war ebenfalls die Glykolyse durch Glukoseentzug unterdrückt. Diese kompensatorische Regulation der Bioenergetik war reflektiert von der Fähigkeit der Zellen, zu überleben und zu proliferieren. Nach Hinzugabe der submaximalen Myxothiazoldosis wurden noch wenige funktionsfähige, durch den Entkoppler FCCP stimulierbare Komplexe III bzw. Mitochondrien beobachtet (Abb. 27, 28). Der Sauerstoffverbrauch konnte aber über die submaximale Myxothiazoldosis hinaus nicht weiter gesenkt werden (Abb. 24, 25). Dies gab Anlass zu der o. g. Vermutung. Außerdem wird sich zwischen Myxothiazol und gehemmten Komplexen III bzw. Mitochondrien immer ein chemisches Gleichgewicht einstellen. Es gibt jedoch Variationen in der Anzahl Mitochondrien pro Lymphozyt (Tab. 12). Nach Andersen et al. (1970) enthalten einzelne PHA-stimulierte Lymphozyten sogar bis zu 200 an der Zahl. Die jeweils zugegebene Myxothiazoldosis stellt aber immer eine feste Größe dar (Zugabe bezogen auf die Zellzahl). So besteht die Möglichkeit, daß bei der submaximalen Myxothiazoldosis Zellen übrig geblieben sind, die nur begrenzt Myxothiazol-beeinträchtigt waren.

Um die Hypothese 1 zu überprüfen, wurden die Zellen mit Myxothiazol auf die unterschiedlichen Niveaus der Atmungshemmung eingestellt, mit PMA und Ionomycin stimuliert und der Verlauf des Sauerstoffverbrauchs über 6 h gemessen. Die Abbildung 21 zeigt, daß die CD4+ T-Zellen auf den unterschiedlichen Niveaus der Atmungshemmung in Anwesenheit von PMA und Ionomycin außerordentlich stark ihren Sauerstoffverbrauch steigern können. Die Steigerungsfaktoren lagen im Bereich des von Frauwirth et al. (2002) gefundenen (s. o.). Dies liefert einen Hinweis auf die Richtigkeit der Hypothese 1 ebenso wie die Tatsache, daß nicht Myxothiazol-gehemmte Zellen ebenfalls diesen Effekt in abgeschwächter Form zeigten, weil PMA und Ionomycin den Sauerstoffverbrauch stimulieren werden. Krauss und Brand (2000) fanden bei Rattenthymozyten, daß 50 % der Antwort des Sauerstoffverbrauchs auf Con A über die PKC und 30 % über Calcineurin abgewickelt wurden, also über Botenstoffe, die durch PMA und Ionomycin aktiviert werden (Isakov und Altman 2002). Der überschießende [Seite 89↓]Effekt der Atmung ist aber auch bei den nicht PMA-Ionomycin-stimulierten, nur Myxothiazol-gehemmten Zellen zu beobachten. Diese Beobachtungen liefern Anhaltspunkte für einen Synergismus: Angetrieben sowohl durch die Myxothiazolhemmung als auch die gleichzeitige PMA-Ionomycin-Stimulation steigern die Zellen enorm ihren mitochondrialen Sauerstoffverbrauch. Dabei nimmt die Steigerung je Komplex III bzw. Mitochondrium sogar mit steigender Myxothiazoldosis zu und endet interessanterweise immer auf einem ähnlich hohen Niveau, das bei der submaximalen und stärkeren Myxothiazoldosen jedoch nicht mehr erreicht wurde. Das bedeutet also, daß immer weniger Komplexe III bzw. Mitochondrien immer mehr Arbeit zu leisten im Stande sind bis ein bestimmter kritischer Wert erreicht wird (Stichwort: Biochemischer Schwellenwert, s. Pkt. 4.5.3). In den Tabellen 16 und 17 ist dies anhand der Versuche im glukosefreien Medium verdeutlicht. Dort fiel die Kompensationsmöglichkeit der glykolytischen ATP-Gewinnung aus. Deshalb sind die Werte mit Sicherheit auf mitochondriale Atmung zurückzuführen. Die ATP-Menge wurde unter den in Punkt 3.6 genannten Voraussetzungen berechnet.

Tab. 16: Sechsstündiger Sauerstoffverbrauch (nmol) von 107 CD4+ T-Zellen unter glukosefreien Bedingungen

 

Unstimuliert

Stimuliert

Differenz (stimuliert - unstimuliert)

100 % Atmung

779

1045

266

50 % Atmung

664

914

250

10 % Atmung

494

774

280

0 % Atmung1

355

450

95

1Nach der submaximalen Myxothiazoldosis sind aber noch durch FCCP entkoppelbare Komplexe III bzw. Mitochondrien vorhanden gewesen (Abb. 27, 28).

Tab. 17: Sechsstündiger Energieverbrauch (µmol ATP) von 107 CD4+ T-Zellen unter glukosefreien Bedingungen

 

Unstimuliert

Stimuliert

Differenz (stimuliert - unstimuliert)

100 % Atmung

4,68

6,27

1,59

50 % Atmung

3,99

5,48

1,49

10 % Atmung

2,96

4,64

1,68

0 % Atmung1

2,13

2,70

0,57

1Nach der submaximalen Myxothiazoldosis sind aber noch durch FCCP entkoppelbare Komplexe III bzw. Mitochondrien vorhanden gewesen (Abb. 27, 28).


[Seite 90↓]

Nach den Tabellen 16 und 17 sind mindestens 450 nmol O2/6 h/107 CD4+ T-Zellen bzw. 2,70 µmol ATP/6 h/107 CD4+ T-Zellen notwendig, um das Überleben und die restliche Funktionalität der Zellen zu sichern (minimaler ATP-Bedarf) (vgl. Abb. 33-35). Wenn diese Werte unterschritten werden, gehen die Zellen in den nekrotischen Zustand über (Abb. 22). Ein durchschnittlich einzelnes, übrig gebliebenes Mitochondrium pro Zelle ist in der Lage, seinen Sauerstoffverbrauch und damit seine Energiesynthese um das 10fache gegenüber der anfänglichen Steigerungsfähigkeit zu erhöhen (Tab. 18). Dabei wurde angenommen, daß durch Myxothiazol die Mitochondrien immer nacheinander und vollständig funktionsunfähig gemacht werden. Auf dem Atmungsniveau von 0 %, das durch die submaximale Myxothiazoldosis erzeugt wurde, war dann höchstwahrscheinlich noch ein funktionsfähiges Mitochondrium übrig.

Tab. 18: Steigerung des Sauerstoffverbrauchs (fmol) von Mitochondrien in CD4+ T-Zellen, induziert durch PMA und Ionomycin

Atmungsniveau

Mitochondrien/Zelle1

Steigerung O2-Verbrauch/Mitochondrium

100 %

29

0,92

50 %

14,5

1,72

10 %

2,9

9,66

0 %

1

9,5

1Es wurde der Wert von Kirschner et al. (1972) zugrunde gelegt (Tab. 12). Der Wert von Nagy et al. (2004) war zu gering und deshalb nicht überzeugend. Er blieb hier unberücksichtigt.

In glukosefreiem Medium war der überschießende Effekt der Atmung noch stärker als in glukosehaltigem. Dies läßt auf Entlastung durch Energiegewinnung über die Glykolyse in glukosehaltigem Medium schließen, die ohnehin durch den Stimulus angetrieben gewesen sein wird. Neuere Erkenntnisse deuten darauf hin, daß bei T-Zellen nicht nur der ATP-Bedarf aufgrund eines gesteigerten Verbrauchs (ATP/ADP-Ratio) Antriebskraft für eine gesteigerte Glykolyserate ist, sondern die direkte Stimulation des CD28-Rezeptors (Frauwirth et al. 2002). Die Beobachtung, daß die Kurven der nicht stimulierten Zellen in beiden Medien nahezu identisch verliefen (Abb. 21), ist ein weiteres Indiz dafür. Die Hypothese 1 wurde noch dadurch untermauert, daß der überschießende Effekt der Atmung durch stärkere Myxothiazoldosen (max1, max2) fast vollständig unterdrückt werden konnte. Hierbei ist aber zu bedenken, daß dieser Effekt besonders im glukosefreien Medium überwiegend durch Eintreten von Zelltod verursacht wurde (Abb. 22).


[Seite 91↓]

Die Hypothese 1 wird eindeutig favorisiert. Daneben kommen für die überschießende Reaktion des Sauerstoffverbrauchs bei Myxothiazol-gehemmten PMA-Ionomycin-stimulierten CD4+ T-Zellen auch die nachfolgend diskutierten Ursachen in Frage (Hypothesen 2-4). Die Hypothese 2 wird wegen der höheren Wahrscheinlichkeit, einen zusätzlichen Beitrag geleistet zu haben, detailliert diskutiert. Die Hypothesen 3 und 4 sind eher unwahrscheinlich oder leisten, wenn doch möglich, nur einen sehr geringen zusätzlichen Beitrag.

Der metabolische Verdrängungseffekt (s. Pkt. 4.1) konnte als Ursache ausgeschlossen werden. Dazu wurden CD4+ T-Zellen mit PMA und Ionomycin stimuliert, die zuvor nicht auf eine Zellzahl von 4x106/ml verdünnt wurden. Nach 3 h konnte ebenfalls der überschießende Effekt der Atmung beobachtet werden. Außerdem trat dieser Effekt bei unstimulierten Myxothiazol-unbehandelten Zellen nicht auf (Abb. 21).

Hypothese 2: Gesteigerter oxidativer Metabolismus infolge ROS-Synthese-Aktivierung oder Zunahme des Sauerstoffverbrauchs als Maß der Superoxidbildung

Phagozyten (Makrophagen, Neutrophile, Eosinophile) und B-Lymphozyten reagieren im Falle einer Aktivierung mit dem sog. Oxidativen oder Respiratorischen Burst, einem starken Anstieg ihres oxidativen Stoffwechsels. In dessen Ergebnis werden durch das Zellmembran-ständige Enzym NADPH-Oxidase, auch Respiratory Burst Oxidase genannt, ROS synthetisiert (Babior 1999, Jackson et al. 2004). Die so gebildeten ROS dienen im wesentlichen als Teil der angeborenen Immunität der antimikrobiellen Abwehr. Mit diesem Prozeß verbunden ist ein starker Anstieg des Sauerstoffverbrauchs.

Es gibt Berichte darüber, daß in PMA-aktivierten Lymphozyten und bestimmten Jurkat-Zellinien der oxidative Stoffwechsel ebenfalls stimulierbar ist (Sekkat et al. 1988, Benichou et al. 1989, Rabesandratana et al. 1992, Chamulitrat 1999, Tatla et al. 1999). Rabesandratana et al. (1992) berichteten, daß ROS in unseparierten Leukozyten nicht nur von Neutrophilen und Monozyten, sondern in geringerem Maß auch in Lymphozyten generiert wurden. Diese Reaktion korrelierte mit der Aktivierung der PKC. Allerdings konnte PMA die ROS-Synthese in isolierten Lymphozyten nicht auslösen, dennoch aber in bestimmten Jurkat-Zellinien (Sekkat et al. 1988, Benichou et al. 1989). Die Jurkatzellen zeigten isoliert zunächst keine Antwort. Sie konnten aber durch die Zugabe von Neutrophilen dazu angeregt werden, in Gegenwart von PMA ROS zu synthetisieren (Rabesandratana et al. 1992). Tatla et al. (1999) fanden einen starken und schnellen Anstieg der ROS-Aktivität in T-Zellen nach Aktivierung mit PMA in [Seite 92↓]Kombination mit einem Ca2+-Ionophor. Diese war auch reguliert durch die Anwesenheit von akzessorischen Zellen. Dagegen reichte die Gabe von PMA/Ionomycin bei isolierten T-Zellen aus, um einen schnellen intrazellulären Anstieg von ROS zu induzieren (Remans et al. 2004). Ebenso konnte Chamulitrat (1999) nachweisen, daß Lymphozyten nach PMA-Stimulation in der Lage sind, ROS zu bilden. Er konnte aber nicht genau zwischen B- und T-Zellen differenzieren, weil Lymphozyten aus Peyerschen Plaques und Lymphknoten des Mesenteriums verwendet wurden. Die Tatsache, daß in Myxothiazol-unbehandelten PMA-Ionomycin-stimulierten CD4+ T-Zellen ebenfalls die überschießende Reaktion des Sauerstoffverbrauchs beobachtet wurde (Abb. 21), könnte für einen vom Myxothiazol unabhängigen Effekt sprechen. Demzufolge wird hier die Hypothese des gesteigerten oxidativen Metabolismus infolge ROS-Synthese-Aktivierung oder anders formuliert die Hypothese der Zunahme des Sauerstoffverbrauchs als Maß der Superoxidbildung diskutiert. Der Effekt konnte aber durch die max1- und max2-Myxothiazoldosis in glukosehaltigem Medium deutlich abgeschwächt werden (Abb. 21). Hierbei ist aber zu bedenken, daß dieser Effekt besonders im glukosefreien Medium überwiegend durch Eintreten von Zelltod verursacht wurde (Abb. 22).

Nach Devadas et al. (2002) produzieren T-Lymphozyten ROS nach Stimulation ihres Antigen-Rezeptors, obwohl es bis dahin keine Hinweise auf die Expression des vollständigen NADPH-Oxidase-Komplexes in diesen Zellen gab (Babior 1992). Unter den bekannten Untereinheiten des Enzyms exprimieren sie dennoch eine, so daß in T-Zellen entweder ein alternativer NADPH-Komplex existent ist oder sie ROS über alternative Wege generieren können (Reth 2002). ROS gelten mittlerweile auch als wichtige sekundäre Botenstoffe bei der Aktivierung von Makrophagen und Lymphozyten (Tatla et al. 1999, Reth 2002, Kwon et al. 2003, Jackson et al. 2004, Williams und Kwon 2004). Sie sind dafür zwar nicht absolut notwendig (Tatla et al. 1999), könnten aber aufgrund des überaus starken PMA-Ionomycin-Stimulus in großen Mengen anfallen und so in den vorgestellten Experimenten den zellulären Sauerstoffverbrauch in die Höhe getrieben haben. Es gibt Berichte, nach denen das Influenza-Virus der weltweiten Grippewelle von 1918 deshalb so tödlich gewesen sein könnte, weil es einen Oxidativen Burst in den befallenen Lungenzellen induzierte, der zu einer Überreaktion des Immunsystems führte (Reth 2002). Insofern könnten ROS sowohl para- als auch autokrine Wirkung auf PMA-Ionomycin-stimulierte CD4+ T-Zellen haben und deren Sauerstoffverbrauch außerordentlich ansteigen lassen. Tatla et al. (1999) sprechen davon, daß die T-Zell-Aktivierung von gesteigerter metabolischer Aktivität und oxidativer Atmung begleitet wird und es möglich erscheint, daß die Produktion von ROS eine simple Begleiterscheinung der gesteigerten [Seite 93↓]Atmungsaktivität ist.

Die geäußerte Vermutung wird durch weitere Daten der Arbeit von Chamulitrat (1999) gestützt. Er konnte in Übereinstimmung mit den Daten der vorliegenden Arbeit zeigen (Abb. 21), daß der Sauerstoffverbrauch von Lymphozyten infolge PMA-Stimulation um das 6fache anstieg. Dieser Anstieg fiel in glukosefreiem Medium noch stärker aus und konnte unabhängig von der Glukosekonzentration sogar noch weiter erhöht werden, wenn Na2SO3 hinzugefügt wurde. Na2SO3 wird in Anwesenheit von ROS zu OOSO3ˉ (Sulfit-Radikal) reduziert. Damit stellte Chamulitrat (1999) einen klaren Zusammenhang her zwischen der Stimulation des zellulären Sauerstoffverbrauchs bei Lymphozyten durch PMA aufgrund der gesteigerten Aktivität der NADPH-Oxidase. Der Autor konnte auch zeigen, daß sowohl ohne PMA-Stimulation als auch bei Glukoseentzug keine Radikalbildung möglich war. Nicht wie bei Neutrophilen, bei denen ein rascher Superoxid-Burst auftritt, begann die ROS-Synthese schleichend und war lang anhaltend (Chamulitrat et al. 1999). Dies würde auch erklären, warum in der vorliegenden Untersuchung die Zugabe von PMA und Ionomycin zu Beginn der Stimulation keinen (Daten nicht gezeigt) und erst nach 3 h einen deutlichen Effekt auf den Sauerstoffverbrauch hatte (Abb. 21).

Weitere Beobachtungen von Chamulitrat et al. (1999) stützten die Ansicht, nach der während einer PMA-Stimulation Lymphozyten vermehrt Glukose im Pentosephosphatzyklus verwerten. In der ersten Reaktion des Zyklusses wird durch das Enzym Glukose-6-Phosphat-Dehydrogenase (G-6-P-DH) Glukose-6-Phosphat in 6-Phosphoglukonolakton umgewandelt, wobei NADPH entsteht. Das NADPH wird anschließend durch die NADPH-Oxidase oxidiert. Dabei wird molekularer Sauerstoff zum Superoxidradikal reduziert. Insofern könnte der durch PMA verstärkt angetriebene Pentosephosphatzyklus vermehrt Substrat für die im unstimulierten Zustand ruhende NADPH-Oxidase in T-Lymphozyten liefern. Wu und Marliss (1993) konnten an Peritonealmakrophagen von Ratten ebenfalls einen gesteigerten Pentosephosphatzyklus infolge PMA-Ionomycin-Stimulation beobachten, ebenso wie Sagone et al. (1974) an Lymphozyten infolge Mitogenstimulation. Sollte sich in zukünftigen Untersuchungen herausstellen, daß die Aktivität des Enzyms G-6-P-DH in PMA-Ionomycin-stimulierten CD4+ T-Zellen erhöht ist, so wäre dies ein zusätzliches Indiz für die Richtigkeit der Hypothese 2. Die mRNA des Enzyms SOD wird in PMA-Ionomycin-stimulierten CD4+ T-Zellen im Vergleich zu unstimulierten Kontrollzellen vermehrt exprimiert (Dziurla 2004). Dadurch wird die Hypothese gestützt. Auch im glukosefreien Medium wurde ein starker Anstieg des [Seite 94↓]Sauerstoffverbrauchs der CD4+ T-Zellen nach PMA-Ionomycin-Stimulation beobachtet (Abb. 21). Deshalb mußte davon ausgegangen werden, daß die Glukose aus dem FCS den beschriebenen Mechanismus noch ermöglichen konnte. Zukünftig ist die Verfügbarkeit von Glukose durch Verwendung von dialysiertem FCS vollständig zu unterdrücken und anschließend zu prüfen, ob der beobachtete Effekt noch auftritt.

Neueste Untersuchungen zeigen, daß humane T-Zellen eine funktionelle Phagozyten-typische NADPH-Oxidase exprimieren, die nach TCR-Stimulation aktiviert wird (Jackson et al. 2004). Demnach verursacht TCR-Stimulation sogar drei separate Ereignisse, die in ROS-Generierung münden: (1) Schnell auftretende, vorübergehende und unabhängig von der NADPH-Oxidase auftretende H2O2-Synthese, (2) anhaltende und von der NADPH-Oxidase abhängige H2O2-Synthese und (3) zeitverzögerte Superoxidsynthese, die abhängig von FasL-Fas war.

Diese Hypothese 2 würde bedeuten, daß die Energiesynthese vollständig unterdrückt werden kann, die spezifischen Immunfunktionen aber dennoch erhalten bleiben. Der gesteigerte Sauerstoffverbrauch infolge der aktivierten NADPH-Oxidase dient nicht der oxidativen Energiesynthese, stellt also keinen Kompensationsmechanismus dar.

Die Hypothese widerspricht aber aus mehreren Gründen nur scheinbar dem Befund, daß
HIF-1α in Anwesenheit von Myxothiazol und PMA/Ionomycin nicht stabilisiert wurde, weil Myxothiazol die ROS-Synthese am Komplex III der mitochondrialen Atmungskette blockiert (s. Pkt. 4.9). Die überschießende Reaktion des Sauerstoffverbrauchs ist nicht Ausdruck einer ROS-Synthese, die für die Stabilisierung von HIF-1α ausreicht. Anhaltspunkte dafür sind die Stabilisierung des Faktors in unstimulierten sowie PMA-Ionomycin-stimulierten CD4+ T-Zellen unter hypoxischen Bedingungen (Abb. 41) und die vollständige Degradation in PMA-Ionomycin-stimulierten CD4+ T-Zellen unter normoxischen Bedingungen (Dziurla 2004). Die unter Hypoxie gesteigerte Bildung von ROS an Komplex III ist also entscheidend für die
HIF-1α-Anreicherung in den Zellen. Die PMA-Ionomycin-Stimulation hat unter hypoxischen Bedingungen nur einen additiven Effekt. Nach neuesten Berichten ist es darüber hinaus unwahrscheinlich, daß die hier diskutierte ROS-Synthese der Phagozyten-typischen NADPH-Oxidase überhaupt an der Regulation von HIF-1 beteiligt ist (Goyal et al. 2004). Dafür wird eher die ROS-Synthese durch sog. low-output-Isoformen von NADPH-Oxidasen verantwortlich gemacht, besonders die von Nox1 (Goyal et al. 2004).

Aufgrund der soeben diskutierten Arbeiten und der nicht 100%igen Reinheit der CD4+ T-Zellen [Seite 95↓]in den PMA-Ionmomycin-Experimenten der vorgestellten Arbeit (Abb. 9, 10), ist die Möglichkeit der gesteigerten ROS-Synthese als Ursache des überaus starken Anstiegs des Sauerstoffverbrauchs der Zellen zu diskutieren. Um diese Hypothese zu überprüfen, sollte in zukünftigen Experimenten dieser Art zunächst die 100%ige Reinheit der CD4+ T-Zellen durch Optimierung der magnetisch aktivierten Zellsortierung sichergestellt werden. Weiterhin sollten durchflußzytometrische Analysen durchgeführt werden, um die Sauerstoffmetabolitensynthese in CD4+ T-Zellen nach PMA-Ionomycin-Stimulation direkt zu untersuchen. Die dafür notwendigen Fluoreszenzfarbstoffe sind kommerziell erhältlich. Liesse sich die ROS-Synthese in isolierten CD4+ T-Zellen infolge einer PMA-Ionomycin-Stimulation nachweisen, so könnte dies darüber hinaus die abnormale Expression von Genen reflektieren, die normalerweise nur in Phagozyten aktiviert werden.

Abschließend soll für die CD4+ T-Zellen ein Experiment zur Stützung der Hypothese 2 vorgestellt werden, das von Udilova (1999) an PMN zum Nachweis von Superoxidradikalen durchgeführt wurde: Da Zellen Sauerstoff auch ohne Stimulierung verbrauchen, wurde zuerst die Basalatmung gemessen. Kurz nach Zugabe von PMA nahm der Sauerstoffverbrauch stark zu. Opsoniertes Zymosan zur Stimulierung der Radikalbildung hatte einen qualitativ identischen Effekt. Da aber weder 2,4-Dinitrophenol (Entkoppler) noch Zyanid die Zunahme des zellulären Sauerstoffverbrauchs beeinflussen konnten, wurde diese als von der mitochondrialen Atmung unabhängig angesehen. Dagegen konnte durch Diphenyleniodoniumchlorid, einem Inhibitor der Superoxidradikal-produzierenden NADPH-Oxidase, der Sauerstoffverbrauch vollkommen gehemmt werden. Demzufolge wurde der erhöhte Sauerstoffverbrauch bei der Aktivierung von PMN als Folge der Bildung von Superoxidradikalen interpretiert. Die Basalatmung wurde vom Sauerstoffverbrauch während des Respiratorischen Burst subtrahiert und die so errechnete Differenz als Maß der Superoxidbildung betrachtet.

Hypothese 3: Gesteigerter oxidativer Metabolismus infolge RNS-Synthese-Aktivierung (RNS oder NOS = Reactive Nitrogen Species)

In diesem Abschnitt soll diskutiert werden, ob die gesteigerte Synthese von NOS zu einem gesteigerten Verbrauch von Sauerstoff führt und so den Anstieg des Sauerstoffverbrauchs während der PMA-Ionomycin-Stimulation (Abb. 21) erklärt. Für Phagozyten (Granulozyten, Monozyten) ist bekannt, daß bei der Phagozytose der Sauerstoffverbrauch durch Aktivierung der NADPH-Oxidase steil ansteigt. Es entstehen große Mengen von Superoxidradikalen, die zytotoxisch wirken. In beträchtlichem Maß wird aber zusätzlich auch das sehr reaktive, [Seite 96↓]zytotoxische NO gebildet, das durch Nitrosylierung und Peroxidbildung phagozytiertes Material angreift und degradiert. NO wird aus der Aminosäure L-Arginin und molekularem Sauerstoff durch die NO-Synthetase in nahezu allen Säugetierzellen generiert (Nisoli et al. 2004). Paradoxerweise kann NO nützliche und zellschädigende Wirkungen auslösen. Entweder agiert es als direkter Botenstoff oder ist indirekt toxisch, weil es mit Superoxid zu Peroxinitrit (ONOO-) umgewandelt wird. ONOO- weist verschiedene zellschädigende Wirkungen auf wie
z. B. die irreversible Hemmung der Atmung und die Schädigung von Enzymen und mitochondrialen Atmungskettenkomplexen. Beide Effekte können simultan auftreten. Nagy et al. (2003) konnten zeigen, daß eine anti-human CD3/CD28-Stimulation von T-Zellen zu einer gesteigerten Expression der endothelialen (eNOS) und neuronalen, nicht aber der induzierbaren NO-Synthetase (iNOS) sowie einer vermehrten Produktion von NO führt. Ebenso induzierte eine PMA-Ionomycin-Stimulation von Lymphozyten eine starke Steigerung der NO-Synthese (Valdez und Boveris 2001). Da für die Synthese von NO Sauerstoff benötigt wird, könnte daraus ein gesteigerter Sauerstoffverbrauch während der Stimulation resultieren, der nicht für die Synthese von ATP verbraucht wird. In neueren Arbeiten wurde NO als ein Schlüsselsignal erkannt, daß die mitochondriale Atmung (Brown 1999) und Biogenese (Nisoli et al. 2003, Nagy et al. 2004) reguliert und so die Zellaktivierung und -proliferation absichert. NO blockiert reversibel die Cytochrom c-Oxidase, Komplex IV der Atmungskette, in Konkurrenz mit Sauerstoff. Demzufolge hat die Hemmung der NO-Synthetase die Stimulierung der Gewebe- und gesamten Körperatmung zur Folge (Brown 1999).

Hypothese 4: Mitochondriale Biogenese

Der bedeutende bioenergetische Prozeß der ATP-Synthese findet in Organellen statt, die nicht statisch sind. Mitochondrien befinden sich innerhalb der Zelle in steter Bewegung. Dabei finden ständig verschiedene Fusions- und Teilungsprozesse statt (Nisoli et al. 2004). Dieser hohe Grad von Plastizität wird von Variationen in Größe, Anzahl und Masse der Mitochondrien begleitet, die in komplexen Prozessen durch eine Vielzahl von physiologischen Stimuli und Differenzierungsstadien ausgelöst werden. Mitochondrien sind in der Lage, zu dem Ort des größten zellulären Energiebedarfs zu wandern.

Eine Erklärung des starken Anstiegs des Sauerstoffverbrauchs nach PMA-Ionomycin-Stimulation bei CD4+ T-Zellen könnte demzufolge auch in der mitochondrialen Biogenese zu suchen sein. Auf diese Art werden neue, funktionstüchtige Atmungskettenkomplexe bereitgestellt, die selbst wiederum durch den Stimulus angetrieben werden. Nisoli et al. (2004) [Seite 97↓]berichten, daß es drei Möglichkeiten der mitochondrialen Biogenese gibt. Die wichtigste ist das Wachstum und die Teilung von präexistierenden Mitochondrien. Weiterhin kommen die de novo Synthese aus submikroskopischen Vorgängern im Zytoplasma und die Bildung aus anderen Membranstrukturen der Zelle vor.

Die mitochondriale Teilung kann durch eine Vielzahl von Substanzen induziert werden. Dazu gehören Hemmstoffe des Sauerstoffverbrauchs bzw. der OXPHOS, Kalziumeinstrom-Regulatoren, Phorbolester und Mitogene. Bei den Hemmstoffen des Sauerstoffverbrauchs bzw. der OXPHOS handelt es sich beispielsweise um Stickstoffmonoxid (Nisoli et al. 2003, Fiorucci et al. 2004, Nagy et al. 2004), Benzodiazepine (Vorobjev und Zorov 1983) und den Entkoppler 2,4-Dinitrophenol (Kawahara et al. 1991). Nach Andersen et al. (1970) hatte die Zellgröße, nicht aber die Sauerstoffkonzentration einen Einfluß auf die mittlere Anzahl von Mitochondrien pro PHA-stimuliertem Blutlymphozyt. Insofern wäre denkbar, daß durch die Anwesenheit von Myxothiazol die Bildung neuer Mitochondrien während der sechsstündigen PMA-Ionomycin-Stimulation induziert wird, um dem Energieverlust entgegenzuwirken. Es waren ohnehin nicht alle Mitochondrien durch die submaximale Myxothiazoldosis gehemmt, weil mit anschließender FCCP-Entkopplung eine Steigerung des Sauerstoffverbrauchs beobachtet wurde (Abb. 27, 28). Mitochondrien können sich in lebenden Zellen innerhalb kürzester Zeit (2-3 h) infolge der Behandlung mit Atmungskettenhemmstoffen reversibel fragmentieren (Vorobjev und Zorov 1983, Lyamzaev et al. 2004) oder schnell (innerhalb der ersten 2 h nach Belüftung) in Zellen wiedererscheinen, die aufgrund anaerober Kultivierung keine Mitochondrien mehr enthalten (Andersen et al. 1970). Darüber hinaus könnte demzufolge die PMA-Ionomycin-Stimulation selbst eine mitochondriale Biogenese einleiten, weil Phorbolester und Kalziumeinstrom-Regulatoren dazu in der Lage sind (Nisoli et al. 2004).

Van den Bogert et al. (1989) berichten, daß während der Aktivierung von Thymozyten mit Con A mitochondriale Biogenese eingeleitet wird, um ausreichend ATP für die energiepflichtige Blastogenese bereitzustellen. Die Zellen wurden bis zu 50 h mit dem Mitogen kultiviert. Nach Andersen et al. (1972) erhöht sich die mittlere Anzahl von 29 Mitochondrien pro Blutlymphozyt um mehr als das Doppelte, wenn sie in Anwesenheit des Mitogens PHA für 48 h kultiviert werden. Dabei enthalten manche Lymphozyten bis zu 200 Mitochondrien. Auch Douglas et al. (1973) beobachteten einen Mitogen-induzierten Anstieg der Mitochondrienanzahl in Lymphozyten. Ob mitochondriale Biogenese auch eine Ursache ist für die Hochregulation des Sauerstoffverbrauchs in Myxothiazol-gehemmten PMA-Ionomycin-stimulierten und im übrigen [Seite 98↓]auch -unstimulierten CD4+ T-Zellen (Abb. 21), müssen zukünftige Untersuchungen klären. Beispielsweise könnten ultrastrukturelle Analysen von Myxothiazol-gehemmten PMA-Ionomycin-stimulierten und -unstimulierten CD4+ T-Zellen gemacht werden. Parallel dazu bliebe nach Nisoli et al. (2004) außerdem herauszufinden, ob die NO-induzierte mitochondriale Biogenese überhaupt funktionell relevant ist für den Sauerstoffverbrauch und die Zellatmung.

In glukosefreiem Medium war der überschießende Effekt des Sauerstoffverbrauchs besonders stark ausgeprägt (Abb. 21). Hier könnte mitochondriale Biogenese infolge Glukosemangel, wie er von Weber et al. (2002) beobachtet und als Kompensation der verminderten Versorgung mit glykolytischem ATP vermutet wurde, einen zusätzlichen Beitrag geleistet haben. Denkbar ist auch, daß die Zellen, die deutlich mehr Mitochondrien enthalten als der Durchschnitt, auch deutlich weniger anfällig sind für die eingesetzten Myxothiazolkonzentrationen (Hypothese 1). Myxothiazol wird im Mittel möglicherweise immer eine bestimmte Anzahl der vorhandenen Mitochondrien einer Zelle nacheinander vollständig funktionsunfähig machen bis sich ein Gleichgewicht eingestellt hat. Somit wären dann immer Zellen übrig, in denen vollständig funktionsfähige Mitochondrien vorhanden sind, die für die Sicherstellung der Energieanforderungen während der Stimulation sorgen, teilungsfähig sind und das Alles-oder-Nichts-Prinzip (s. Pkt. 4.5.3) der Zytokinsynthese ermöglichen.

Gegen die Hypothese 4 spricht jedoch folgendes, durchgeführtes Experiment (Abb. 23): Nach 3 h PMA-Ionomycin-Stimulation wurde zu den CD4+ T-Zellen der Entkoppler FCCP gegeben. Wenn bis dahin mitochondriale Biogenese stattgefunden hätte, müßte eine Entkopplung und demzufolge ein Anstieg des Sauerstoffverbrauchs über den überschießenden Effekt hinaus zu verzeichnen gewesen sein. Dies war jedoch nicht der Fall. Hypothese 4 ist aber dadurch nicht vollständig zu entkräften, weil PMA und Ionomycin sofort die neu gebildeten Mitochondrien zur Maximalleistung angetrieben haben könnten, so daß FCCP keine Wirkung zeigte.

Abschließend soll an dieser Stelle darauf hingewiesen werden, daß die NO-induzierte mitochondriale Biogenese die unbeeinträchtigte Proliferation von CD4+ T-Zellen nach anti-human CD3/CD28-Stimulation (s. auch Pkt. 3.4, 4.6 u. Abb. 36, 37) zusätzlich erklären könnte. Mit der Proliferation von Lymphozyten ist die mitochondriale Biogenese verbunden und damit die Aktivitätssteigerung von Atmungskettenkomplexen sowie deren de novo Synthese (van den Bogert et al. 1988, 1989). Wahrscheinlich wird infolgedessen der zelluläre Sauerstoffverbrauch ansteigen. Ein Indiz für eine NO-vermittelte mitochondriale Biogenese infolge CD3/CD28-Stimulation war die Blastenbildung und die Zunahme der Granularität der Zellen in der [Seite 99↓]durchflußzytometrischen Analyse der Proliferation (Daten nicht gezeigt). Möglicherweise ist im Verlauf der durchgeführten Proliferationsexperimente durch die mitochondriale Biogenese das Verhältnis zwischen initial zugegebener Myxothiazolmenge und den Komplexen III so gering geworden, daß Myxothiazol den Sauerstoffverbrauch nicht mehr blockieren konnte. In zukünftigen Untersuchungen müßte demzufolge Myxothiazol im Verlauf des Experiments immer wieder appliziert werden, um den Effekt einer unterdrückten OXPHOS über die Dauer von 96 h konstant aufrechtzuerhalten. Bei der in diesem Abschnitt genannten Vermutung würde es sich in Hinsicht auf die Hypothese 2 um einen für die oxidative Energiesynthese notwendigen Anstieg des Sauerstoffverbrauchs handeln und nicht um einen wie möglicherweise bei der PMA-Ionomycin-Stimulation durch die induzierte ROS-Synthese gesteigerten. Gestützt wird dies durch die Tatsache, daß es bei T-Zellen nicht möglich war, eine ROS-Synthese durch eine PMA/CD28- oder CD3/CD28-Stimulation zu induzieren, aber dennoch eine starke T-Zell-Aktivierung (Tatla et al. 1999).


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06.06.2005