Aus der Medizinischen Klinik mit Schwerpunkt
Rheumatologie und Klinische Immunologie
der Medizinischen Fakultät der Charité -
Universitätsmedizin Berlin

Dissertation

Untersuchungen zu Wirkungen einer
eingeschränkten Energiesynthese auf
Funktionen von humanen Immunzellen

zur Erlangung des akademischen Grades
Doctor rerum medicarum (Dr. rer. medic.)

vorgelegt der Medizinischen Fakultät der Charité -
Universitätsmedizin Berlin

von
Robert Tripmacher
aus Berlin

Dekan: Prof. Dr. med. M. Paul

Gutachter:
1. Prof. Dr. med. B. Manger
2. Prof. Dr. med. R. H. Straub
3. Prof. Dr. med. F. Buttgereit

eingereicht am: 22.12.2004

Datum der Promotion: 13.05.2005

Kurzdarstellung

Hintergrund: Die Funktion von Immunzellen hängt von einer konstanten und ausreichenden Energieversorgung ab, die über die OXPHOS in den Mitochondrien und die Glykolyse im Zytosol realisiert wird. Die wichtigsten Substrate dafür sind Sauerstoff und Glukose.

Fragestellung: Bei schweren Erkrankungen oder in Entzündungsgebieten ist die zelluläre Energieversorgung stark beeinträchtigt, weil in der Mikroumgebung der Zelle Sauerstoff und Nährstoffe inadäquat bereitgestellt werden. Ziel war herauszufinden, ob und wie humane Immunzellen ihre Lebensfähigkeit und funktionellen Aktivitäten unter solchen Umständen aufrechterhalten.

Methoden: Humane CD4+ T-Zellen und CD14+ Monozyten wurden durch MACS aus peripherem Blut gesunder Spender isoliert. Die Sauerstoffverbrauchsmessung mittels Clark-Elektrode war Maß der oxidativen Energiebildung, die mit Myxothiazol und Glukoseentzug gehemmt wurde. Die CD3/CD28-stimulierte T-Zell-Proliferation wurde durchflußzytometrisch mittels CFDA SE analysiert. Basierend auf dem Paraformaldehyd-Saponin-Prozedere wurde die Zytokinsynthese ebenfalls am FACS bewertet, nachdem die T-Zellen in Anwesenheit von Brefeldin A mit PMA/Ionomycin stimuliert wurden. Mit einem käuflichen Testsystem (FACS-Technik) wurde die monozytäre Phagozytose untersucht. Die HIF-1α-Expression wurde nach PMA-Ionomycin-Stimulation von Myxothiazol-behandelten T-Zellen auf mRNA- und Proteinebene gemessen.

Ergebnisse: Bei Glukoseanwesenheit waren alle untersuchten Immunfunktionen trotz vollständig gehemmter OXPHOS unbeeinträchtigt. Erst bei gleichzeitigem Glukoseentzug, der per séProliferation und Phagozytose signifikant beeinträchtigte,waren sie signifikant vermindert. Es wird vermutet, daß T-Zellen die Energieverluste mit einem überschießenden Effekt ihres Sauerstoffverbrauchs und stark angetriebener Glykolyse kompensieren. HIF-1α ist dabei nicht entscheidend für die Umschaltung auf anaerobe Energiesynthese.

Schlußfolgerung: Die Daten quantifizieren die Energieanforderungen der funktionellen Aktivität in hochgereinigten humanen Immunzellfraktionen. Es wurde nachgewiesen, daß sich Immunzellen unerwartet lange an eine massiv beeinträchtigte Energetik adaptieren können und ihre spezifischen Funktionen aufrechterhalten.

Abstract

Background: The function of immune cells is dependent upon a constant and adequate supply of energy. Energy is formed via OXPHOS in the mitochondria and via cytosolic glycolysis. Oxygen and glucose are the main substrates for energy synthesis.

Objective: In severe diseases or in inflamed areas cellular energy supply is significantly impaired due to inadequate supply of cellular microenvironment with oxygen and nutrients. The aim of this study was to answer the question, whether and how human immune cells maintain viability and functional activity under these circumstances.

Methods: Human CD4+ T cells and CD14+ monocytes were isolated by MACS from peripheral blood of healthy donors. The extent of oxidative energy formation was determined via measurement of oxygen consumption using a Clark type electrode. Energy production was restricted in glucose-free cell culture medium and by gradually inhibited OXPHOS using myxothiazol. T cell proliferation was flow-cytometrically analysed using CFDA SE after stimulation with CD3 and CD28 antibodies. Cytokine synthesis was assessed by flow-cytometrical immunofluorescence and the paraformaldehyde-saponin procedure after stimulation of T cells with PMA/ionomycin in the presence of brefeldin A. Phagocytosis of monocytes was measured using a commercial test system (FACS technique). HIF-1α expression was assessed by semiquantitative PCR and immunoblot after the stimulation of myxothiazol treated T cells with PMA/ionomycin.

Results: In glucose-containing medium all investigated immune functions were unaffected even under complete suppression of OXPHOS. Only when OXPHOS and glycolysis were simultaneously and almost completely suppressed a significant decrease was found. Glucose deprivation per se caused both a significantly reduced proliferation and phagocytosis. It is supposed, that T cells are able to compensate for an energy deficit by an excess of oxygen consumption and strongly induced glycolysis. However, HIF-1α was found to be not crucial for switching to anaerobic energy synthesis.

Conclusion: These data quantify the energy requirement of functional activity in highly purified human immune cell fractions. An unexpectedly high adaptive potential of immune cells to maintain specific functions even under massively impaired energetic conditions could be demonstrated.

Eigene Schlagworte: CD4+ T-Zellen, CD14+ Monozyten, zellulärer Energiestoffwechsel, simulierter Sauerstoffmangel, Glukoseentzug, intrazelluläre Zytokinsynthese, T-Zell-Proliferation, Phagozytoseaktivität, HIF-1α

Keywords: CD4+ T cells, CD14+ monocytes, cellular energy metabolism, mimicked oxygen deficiency, glucose deprivation, intracellular cytokine synthesis, T cell proliferation, phagocytotic activity, HIF-1α

Inhaltsverzeichnis

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06.06.2005