Udilova, Natalia: Vergleichende Untersuchung von Methoden zum Nachweis von Superoxidradikalen in biologischen und Modellsystemen.
Vergleichende Untersuchung von Methoden zum Nachweis von Superoxidradikalen in biologischen und Modellsystemen.
Dissertation

zur Erlangung des akademischen Grades
doctor rerum naturalium
(Dr. rer. nat.)
im Fach Physik

eingereicht an der
Mathematisch-Naturwissenschaftlichen Fakultät I
der Humboldt-Universität zu Berlin

von Dipl. Ing. Natalia Udilova,
geb. am 4. Oktober 1969. in Kiev (Ukraine)

Präsident der Humboldt-Universität zu Berlin
Prof. Dr. Dr. h. c. H. Meyer

Dekan der Mathematisch-Naturwissenschaftlichen Fakultät I
Prof. Dr. J.P. Rabe

Gutachter:
Prof. Dr. Beate Röder
Prof. DDr. Hans Nohl
PD Dr. habil. Ingolf Bernhardt

Tag der mündlichen Prüfung: 26. März 1999.

Abstract

Imbalanced production of oxygen-centered radicals is generally considered to play a major role in the pathogenesis of a great number of clinical diseases. Metabolic disorders and other derangements of homeostasis affect O2-salvage in a way which may trigger O2- radical formation. Inversely, if O2- radicals are formed in excess, a great variety of functional and structural alterations are expected to occur. It follows that an evaluation of the ranking of O2- radicals in the pathophysiological cascade of the various diseases requires reliable methods allowing identification of the respective reactive oxygen species (ROS), localization of the generation site and the analysis of the conditions required for O2- radical formation. Superoxide radicals (O2-.) are of major interest in this respect as this univalent reduction product is the starting molecule of all ROS possibly occurring in biological systems.

Controversial reports on the existence, the sites and formation conditions of O2-.-radicals in the tissue may be due to the application of inadequate methods. The aim of this study was therefore to critically evaluate current O2-.-detection methods for their suitability and comparability.

O2-.-radical release from xanthine/xanthine oxidase was assessed and used as a standardized O2-.-source. Spectrophotometric (cytochrom c, epinephrin, nitroblue tetrazolium), chemiluminescence (luminol, lucigenin) and ESR-spin trapping (DMPO, DEPMPO) detection methods were exposed to this O2-.-radical generating system and analyzed with respect to their selectivity and quantitative yield.

In a second step the influence of the biological O2-.-generating systems such as submitochondrial particles, mitochondria and polymorphnuclear neutrophils on the available detection methods was tested.

The results revealed great variations between the detection methods used both with respect to their selectivity for O2-.-registration and the quantitative analysis of the rates formed. All conventional O2-.-detection methods were found to be directly affected by the biological systems studied, spin trapping with DEPMPO being the most reliable method for qualitative O2-.-detection. Quantitative O2-.-detection requires knowledge about the stability of the respective adduct.

A mathematical model for the calculation of O2-.-formation rate in various detection systems is worked out.

Keywords:
superoxide radical, chemiluminescence, spin trapping, reactive oxygen species

Zusammenfassung

Heute kennt man weit über 100 klinische Erkrankungen, bei denen Sauerstoffradikale am pathogenetischen Mechanismus beteiligt sind. Sauerstoffradikalbildung wird als Initiator oder Promotor des Alterungsprozesses, der Arteriosklerose, der postischemischen Organschäden, des Diabetes mellitus oder verschiedener neurologischer sowie dermatologischer Erkrankungen diskutiert. Besonderes Interesse gilt hierbei den Superoxidradikalen (O2-.), da ihre Bildung den Initialschritt des oxidativen Stresses, nämlich die Übertragung eines Elektrons auf das Sauerstoffmolekül, darstellt.

Obwohl für den Nachweis der Superoxidradikalbildung eine Vielzahl verschiedener Methoden angewendet wird, gibt es zunehmend quantitative und qualitative Widersprüche bezüglich O2-. -Radikale in biologischen Systemen. Dies ist auf die mangelnde Vergleichbarkeit der unterschiedlichen Nachweismethoden zurückzuführen. Die vorliegende Untersuchung wurde zur Überprüfung der Eignung in der Praxis angewandter Superoxid-Nachweismethoden wie Photometrie (Cytochrom c , Epinephrin, Nitrotetrazolium blau), Chemilumineszenz (Luminol, Lucigenin) und ESR-Spintrapping (DMPO, DEPMPO) für biologische Fragestellungen unternommen. Als biologische O2-.-Quellen wurden submitochondriale Partikeln, Mitochondrien und polymorphkernige Neutrophile untersucht.

Es wurde gezeigt, daß bei Anwendung eines standardisierten O2-. -generierenden Enzymsystems (Xanthin/Xantinoxidase) je nach Methode Wiederfidungsraten erhalten werden, die weniger bis sehr stark von den realen O2-. -Bildungsraten abweichen.

Der Nachweis der Superoxidbildung über die Chemilumineszenz des Luminols und des Lucigenins hat gezeigt, daß die Intensität des ausgestrahlten Lichtes nicht nur durch die Bildungsrate der O2-.-Radikale bestimmt wird, sondern auch durch unspezifische Wechselwirkungen der Nachweissysteme mit den zu untersuchenden Objekten.

Da vielen Nachweismethoden die Oxidation oder Reduktion der jeweiligen Nachweissubstanz durch Superoxidradikale zugrundeliegt, können die Nachweisreaktionen auch durch andere reduzierende oder oxidierende biologische Komponenten in Gang gesetzt werden. Eine Überprüfung der Selektivität einer Nachweismethode durch die Zugabe des O2-.-eliminierenden Enzyms SOD ist nicht immer möglich, da Superoxidradikale oft auch als Zwischenprodukte der Nachweisreaktionen auftreten und/oder SOD nicht immer den Zugang zur O2-.-Bildungsquelle hat. Spintrapping der Superoxidradikale mit DEPMPO kann hingegen als sicherer Beweis der Superoxidbildung betrachtet werden. Für einen quantitativen Nachweis der Superoxidradikale mittels Spintrapping sind jedoch Kenntnisse über die Stabilität des Spinadduktes in jedem konkreten System erforderlich.

Ein mathematisches Modell für die Berechnung der Superoxidbildung in verschiedenen Nachweisystemen wurde erarbeitet.

Schlagwörter:
Superoxidradikal, Chemilumineszenz, Spintrapping, reaktive Sauerstoff Species


Seiten: [6] [7] [8] [9] [10] [11] [12] [13] [14] [15] [16] [17] [18] [19] [20] [21] [22] [23] [24] [25] [26] [27] [28] [29] [30] [31] [32] [33] [34] [35] [36] [37] [38] [39] [40] [41] [42] [43] [44] [45] [46] [47] [48] [49] [50] [51] [52] [53] [54] [55] [56] [57] [58] [60] [61] [62] [63] [64] [65] [66] [67] [68] [69] [70] [71] [72] [73] [74] [75] [76] [77] [78] [79] [80] [81] [82] [83] [84] [85] [86] [87] [88] [89] [90] [91] [92] [93] [94] [95] [96] [97] [98] [99] [100] [102] [103] [108] [110] [111] [112] [113] [114] [115] [116]

Inhaltsverzeichnis

TitelseiteVergleichende Untersuchung von Methoden zum Nachweis von Superoxidradikalen in biologischen und Modellsystemen.
Widmung
Abkürzungsverzeichnis Liste der verwendeten Abkürzungen
1 Einleitung.
2 Material und Methoden.
2.1 Photometrische Analyse.
2.2Elektronenspinresonanz (ESR).
2.3 Chemilumineszenz.
2.4 Dünnschichtchromatographie.
2.5 Vorbereitung und Untersuchung des biologischen Materials.
2.5.1 Polymorphkernige Neutrophile (PMN).
2.5.1.1 Gewinnung der PMN-reichen Leukozyten-Fraktion.
2.5.1.2 Vitalitätstest
2.5.1.3Aktivierung von PMN.
2.5.1.3.1 Opsonisierung von Zymosan.
2.5.1.3.2 PMA.
2.5.1.4 Sauerstoffverbrauch.
2.5.2 Rattenherz- und Rattenlebermitochondrien (RHM und RLM)
2.5.2.1 Präparation von RHM und RLM.
2.5.2.2 Präparation von submitochondrialen Partikeln (SMP).
2.5.2.3 Atmungsparameter.
2.5.2.4 Proteinbestimmung.
2.5.2.5 Hemmstoffe der mitochondrialen Atmung.
2.6 Chemikalien.
3 Ergebnisse
3.1Xanthin/Xanthinoxidase als Modellsystem für Superoxidbildung.
3.2Überprüfung der qualitativen Selektivität einer Nachweismethode.
3.3 Mögliche Ursachen der quanitativen Störung des Superoxid-Nachweises.
3.3.1Spontandismutation.
3.3.2 Reaktion des Superoxidradikals mit Übergangsmetallen.
3.4 Photometrische Nachweismethoden von O2-.-Radikale.
3.4.1 Reduktion von Cytochrom c.
3.4.2Reduktion von Nitroblau Tetrazolium (NBT).
3.4.3 Oxidation von Epinephrin.
3.5 Chemilumineszenz - Methoden zum O2-.-Nachweis im Xanthin/Xanthinoxidase-System.
3.5.2 Untersuchungen zur Chemilumineszenz des Luminols.
3.5.3Chemilumineszenz des Lucigenins.
3.6 ESR-Spintrapping zum Nachweis der O2-.-Radikale.
3.6.2 DMPO.
3.6.3Phosphoryliertes DMPO (DEPMPO).
3.7 Anwendbarkeit der O2-.-Detektionsmethoden zum Nachweis von O2-.-Radikale in komplexen biologischen Systemen.
3.7.1 Polymorphkernige Neutrophile.
3.7.1.1Zunahme des Sauerstoffverbrauchs als Maß der Superoxidbildung.
3.7.1.2 Anwendung der photometrischen Methoden.
3.7.1.2.1 Probleme bei der Anwendung des Nitroblau Tetrazoliums zum Superoxidnachweis an stimulierten PMN.
3.7.1.2.2Die Reduktion von Cytochrom c durch Superoxidradikale von stimulierten PMN.
3.7.1.2.3 Anwendung des Epinephrins zum Nachweis der Superoxidradikalbildung an stimulierten PMN.
3.7.1.3 Chemilumineszenz-Methoden
3.7.1.3.1Chemilumineszenz des Lucigenins als Maß der Superoxidbildung an PMN.
3.7.1.3.2 Luminol-Chemilumineszenz und die Radikalbildung an PMN.
3.7.1.4 ESR-Nachweis der O2-.-Bildung an stimulierten PMN.
3.7.2 Mitochondrien.
3.7.2.1 Anwendung von Farbstoffen zum Nachweis der O2-.-Bildung an Mitochondrien.
3.7.2.2 Chemilumineszenz-Untersuchungen der O2-.-Bildung an Mitochondrien.
3.7.2.3 Spintrapping-Technik zum Nachweis von O2-.Bildung an Mitochondrien.
4 Diskussion.
4.1Vor- und Nachteile des Xanthin/Xanthinoxidase Systems als O2-.-Bildungsquelle.
4.2Anwendbarkeit der photometrischen Methoden.
4.2.1 Cytochrom c.
4.2.1.1Qualitative Selektivität.
4.2.1.2 Quantitative Ausbeute.
4.2.2 Nitroblau Tetrazolium (NBT).
4.2.2.1 Qualiative Selektivität.
4.2.2.2 Quantitative Ausbeute.
4.2.3 Epinephrin (Adrenalin).
4.2.3.1 Qualiative Selektivität.
4.2.3.2 Quantitative Ausbeute.
4.3 Chemilumineszenz - Methoden.
4.3.1 Luminol.
4.3.2 Lucigenin.
4.4Spintrapping-Technik im ESR-Nachweis der O2-.-Bildung.
4.4.1 DMPO und DEPMPO als Spintraps für O2-.-Nachweis.
5 Schlußfolgerungen.
5.1 Qualitative Beurteilung der O2-.-Nachweissystemen.
5.2 Quantitative Beurteilung der O2-.-Nachweissystemen.
Bibliographie Literaturliste.
Danksagung
Lebenslauf
Anhang A Publikationsliste

Tabellenverzeichnis

Tabelle 1. Einfluß der Katalase auf die Aktivität der Xanthinoxidase.
Tabelle 2. Farbstoffe für den photometrischen O2 - -Nachweis.
Tabelle 3. Nachweis der Superoxidbildung im Xanthin/Xanthinoxidase System mit acetyliertem Cytochrom c.
Tabelle 4. Die Reaktivität des Proteinteils von Cytochrom c mit Superoxidradikalen.
Tabelle 5. Intensität der Lucigenin-Chemilumineszenz bei der Superoxidbildung an PMN.
Tabelle 6. Einfluß des Spintraps DEPMPO auf die Atmungsparameter von Mitochondrien.
Tabelle 7. Eignung verschiedener Superoxidbildungquellen für die quantitative Bewertung der Nachweismethoden.

Abbildungsverzeichnis

Abb. 1. Häm-Gruppe des Cytochrom c.
Abb. 2. Spektren des oxidierten und reduzierten Cytochrom c.
Abb. 3. Detektion der Superoxidradikale mit Cytochrom c im Xanthin/Xanthinoxidase System. Die Reaktion wurde in 100mM Phosphatpuffer, pH=7.4, in Anwesenheit des Eisenchelators DTPA (1mM) und 200U/ml Katalase bei T=37°C durchgeführt. Die Konzentration des Cytochrom c war 50µM und die O2-.-Bildung wurde durch Zugabe von 100µM Xanthin gestartet.
Abb. 4. SOD-Hemmung der Reduktion von Cytochrom c im Xanthin/Xanthinoxidase System. Das Reaktionsgemisch bestand aus: 1ml 100mM Phosphatpuffer, pH=7.4, 1mMDTPA, 200U/ml Katalase, 50µM Cytochrom c. Die aus Harnsäurebildung errechnete Superoxidbildungsrate betrug 16.5µM/min. Die angegebene SOD-Menge wurde in 5µl H2O zugesetzt.
Abb. 5. SOD-Hemmung der Reduktion von acetyliertem Cytochrom c im Xanthin/Xanthinoxidase System. Das Reaktiongemisch bestand aus: 100mM Phosphatpuffer, pH=7.4, 1mM DTPA, 50µM acetyliertes Cytochrom c, 200U/ml Katalase. Die aus Harnsäurebildung errechnete Superoxidbildungsrate betrug 2.22µM/min.
Abb. 6. Abhängigkeit der Bildungsrate des reduzierten Cytochrom c von seiner Konzentration im Xanthin/Xanthinoxidase System. Reaktion erfolgte in 100mM Phosphatpuffer, pH=7.4, mit 1mM DTPA und Katalase (200U/ml). Die aus Harnsäurebildung errechnete Superoxidbildungsrate betrug 11.36µM/min.
Abb. 7. Reduktion von Nitroblau Tetrazolium zu Formazan und Diformazan. NBT2+ -Nitroblau Tetrazolium; NBT+. - Tetrazolinyl Radikal; MF+ -Monoformazan; DF - Diformazan (aus [21]).
Abb. 8. Detektion der Superoxidradikale im Xanthin-Xanthin-Oxidase System mit Nitroblau Tetrazolium. Reaktion ist in 100mM Phosphat-Puffer, pH=7.4, in Anwesenheit des Eisenchelators DTPA (1mM) und Katalase bei T=37°C durchgeführt. Die Konzentration des NBT war 100µM und die O2-.-Bildung wurde durch Zugabe von 100 µM Xanthin gestartet.
Abb. 9. SOD-Hemmung der Formazan-Bildung im Xanthin/Xanthinoxidase System. Das Reaktionsgemisch bestand aus: 100mM Phosphatpuffer, pH=7.4, 1mM DTPA, 100µM NBT, 200U/ml Katalase. Die produzierte Superoxidbildungsrate betrug 3.61µM/min.
Abb. 10. Chemische Struktur von Epinephrin und Adrenochrom.
Abb. 11. Detektion der Superoxidradikale im Xanthin/Xanthinoxidase System mit Epinephrin. Die Reaktion wurde in 100mM Phosphat-Puffer, pH=7.4, in Anwesenheit von 1mM DTPA und Katalase bei 37°C durchgeführt. Die Konzentration des Epinephrins betrug 1mM. Die O2-.-Bildung wurde durch Zugabe von 100 µM Xanthin gestartet.
Abb. 12. Abhängigkeit der Adrenochrom-Bildungsrate von der Konzentration des Adrenalins beim Nachweis der Superoxidbildung im Xanthin/Xanthinoxidase System. Die Reaktion wurde in 100mM Phosphatpuffer, pH=7.4, 1mM DTPA, 200U/ml Katalase durchgefürt. Die produzierte Superoxidbildungsrate betrug 15.85µM/min.
Abb. 13. Hemmung der Adrenochrom-Bildung mit SOD im Xanthin/Xanthinoxidase System; Reaktionsbedingungen wie bei der Abb. 14 angegeben. Die produzierte Superoxidbildungsrate betrug 11.36µM/min.
Abb. 14 Chemilumineszenz-Kinetik von Luminol (A) und Lucigenin (B) im Xanthin/Xanthinoxidase System. Die Reaktion wurde in 100mM Phosphatpuffer (4ml) mit 1mM DTPA, pH=7.4, in Anwesenheit von 200U/ml Katalase bei T=37°C durchgeführt. Die O2-.-Bildung wurde durch Zugabe von 100 µM Xanthin gestartet, wie mit den Pfeilen gekennzeichnet. Die Konzentration des Luminols sowie die des Lucigenins betrug 50 µM.
Abb. 15. SOD-Hemmbarkeit der Luminol-Chemilumineszenz im Xanthin/Xanthinoxidase System. Die Reaktionsbedingungen entsprechen den in Abb. 14 . SOD wurde in der angezeigten Konzentrationen vor Beginn der Superoxidbildung zugegeben.
Abb. 16. Einfluß von Luminol auf die Aktivität der Xanthinoxidase, die über die Reduktion von Cytochrom c gemessen wurde. (Probenzusammensetzung: 100mM Phosphatpuffer, pH=7.4, 1mM DTPA, 100µM Xanthin, XOD, 100µM Cytochrom c, 100µM Luminol. Die Reduktion des Cytochrom c wurde über die Absorption bei 550nm verfolgt.)
Abb. 17. Chemilumineszenz-Intensität im X/XOD-System bei Zugabe von Luminol. (Probenzusammensetzung: 100mM Phosphatpuffer, 1mM DTPA, 200U/ml Katalase, 100µM Xanthin, 50µM Luminol, Xanthinoxidase. Es wurden jeweils 50µM Luminol zugegeben)
Abb. 18. X/XOD-Reaktion unter Zugabe von Luminol zu verschiedenen Zeitpunkten. (Probenzusammensetzung: 100mM Phosphatpuffer, pH=7.4, 1mM DTPA, 200U/ml Katalase. 100µM Xanthin, Xanthinoxidase sowie 50µM Luminol wurden in der Reihenfolge wie mit den Pfeilen markiert zugegeben.)
Abb. 19. Einfluß der Harnsäure auf die Chemilumineszenz des Luminols im Xanthin/Xanthinoxidase System. Die Bedingungen für die Kontrolle sind wie in Abb. 14 angegeben. 12.5µM Harnsäure wurde vor dem Beginn der Superoxidbildung zu dem Reaktionsgemisch zugegeben. Die Konzentration von Uricase betrug 2mU/ml.
Abb. 20. Hemmung der Luminol-Chemilumineszenz im Xanthin/Xanthinoxidase System in Anwesenheit von 1mM DTPA im 10mM PBS. 50µM Luminol, 100µM Xanthin und Xanthinoxidase wurden in der Reihenfolge wie mit den Pfeilen gekennzeichnet zugegeben.
Abb. 21. Hemmung der Lucigenin-Chemilumineszenz mittels SOD im Xanthin/Xanthinoxidase System. Die Reaktionsbedingungen sind wie in Abb. 14 (B) angegeben. Die erzeugte O2-.-Bildungsrate betrug 3.5µM/min. Die Hemmung wurde im Bezug auf die Chemilumineszenz-Amplitude vor der SOD-Zugabe berechnet.
Abb. 22. Einfluß von SOD auf die Lucigenin-Chemilumineszenz im Xanthin/Xanthinoxidase System. Die Reaktionsbedingungen sind wie in Abb. 14 (B) angegeben. Die Reaktion wurde durch die Zugabe von Xanthin gestartet. Die SOD in der Konzentration von 1µg/ml wurde zu dem mit Pfeil angezeigten Zeitpunkt zugegeben.
Abb. 23. Intensität der Chemilumineszenz in Abhängigkeit von der Konzentration des Lucigenins im Xanthin/Xanthinoxidase Modellsystem. Die erzeugte Superoxidbildungsrate betrug 2.5µM/min.
Abb. 24. Die Chemilumineszenz-Intensität in Abhängigkeit von der Superoxidbildungsrate mit Lucigenin als Nachweissubstanz im X/XOD-System. Die Konzentration des Lucigenins betrug 50µM. Die erzeugte Superoxidbildungsrate wurde über die Harnsäurebildung bestimmt.
Abb. 25. Chemische Struktur von DMPO und von DEPMPO.
Abb. 26. ESR-Signal von DMPO im Xanthin/Xanthinoxidase System. A- 50mM DMPO, 100µM Xanthin, Xanthinoxidase; B - wie A, aber mit 10µg/ml SOD. Die Messungen erfolgten bei den folgenden Einstellungen des ESR-Spektrometers: Leistung - 2mW, Scanbreite - 60G, Verstärkungsfaktor - 105, Modulationsamplitude - 0.7G, Zeitkonstante - 0.164s, Scangeschwindigkeit - 42.91G/min, Resonatortyp - TM4103. Linien des DMPO-OH-Adduktes sind mit * markiert.
Abb. 27. ESR-Spektrum des DMPO-OH-Adduktes, das nach der SOD-Zugabe zum im Xanthin/Xanthinoxidase System gebildeten DMPO-OOH-Addukt erhalten wurde. Die Einstellungen von ESR-Spektrometer waren wie in Abb. 26 angegeben.
Abb. 28. ESR-Signal von DEPMPO im Xanthin/Xanthinoxidase System. A - 100mM Xanthin, PBS (pH=7.4), 1mM DTPA, XOD, 6.25mM DEPMPO; B - wie A, aber vor dem Reaktionsbeginn 10µg/ml SOD zugesetzt. Die Einstellungen des ESR-Spektrometers waren: Leistung - 2mW, Scanbreite - 115G, Verstärkungsfaktor - 105, Modulationsamplitude - 1G, Zeitkonstante - 0.164s, Scangeschwindigkeit - 82.25G/min, Resonatortyp - TM4103.
Abb. 29. ESR-Spektrum des DEPMPO-OH-Adduktes im Fenton-System. DEPMPO-OH-Addukt wurde durch Zugabe von 100µM Fe2+ zu 200µM Lösung von H2O2 in PBS mit 2.5mM DEPMPO. Die Einstellungen des ESR-Spektrometers waren wie in Abb. 28 angegeben.
Abb. 30. Stabilität des DEPMPO-OOH-Adduktes im X/XOD-System (PBS, pH=7.4, 1mM DTPA, T=20°C). Details siehe im Text. Die Einstellungen des ESR-Spektrometers waren wie in Abb. 28 angegeben.
Abb. 31. Kinetiken der Bildung des DEPMPO-OOH-Adduktes im X/XOD-System bei verschiedenen Superoxidbildungsraten. Details siehe im Text. Die Enstellungen des ESR-Spektrometers waren wie in Abb. 28 angegeben.
Abb. 32. Bildung der Superoxidradikale durch stimulierte Zellen (nach [100]).
Abb. 33. Kinetik des Sauerstoffverbrauchs bei dem durch PMA initiierten „respiratory burst“ an Polymorphkernigen Neutrophilen.
Abb. 34. Kinetik der Reduktion des Cytochrom c bei der PMA-Stimulierung von PMN. Effekt von SOD. Die PMN wurden in PBS mit 5mM Glucose, 1mM CaCl2, 0.5mM MgCl2 und 100µM Cytochrom c versetzt. Die Radikalbildung wurde durch Zugabe von PMA (80ng/ml) wie mit dem Pfeil angezeigt gestartet. SOD wurde vor dem Beginn der Radikalbildung in der Konzentration 10µg/ml zugegeben. Die Messungen erfolgten bei 37°C.
Abb. 35. Reduktionsrate des Cytochrom c in Abhängigkeit vom O2-Verbrauch durch Zymosan-stimulierte PMN. Die Zellen wurden in PBS mit 5mM Glucose, 1mM CaCl2, 0.5mM MgCl2 und 100µM Cytochrom c versetzt. Die Konzentration von Cytochrom c betrug 50mM Die Radikalbildung wurde durch Zugabe von 25µg/ml opsoniertem Zymosan gestartet. Der Sauerstoffverbrauch wurde mit einer Clark-Sauerstoffelektrode gemessen. Alle Messungen erfolgten bei 37°C.
Abb. 36. Abhängigkeit der Cytochrom c-Reduktionsrate vom Sauerstoffverbrauch durch die PMA-stimulierten Polymorphkernigen Neutrophile. Die Reaktionsbedingungen sind wie in Abb. 34 angegeben.
Abb. 37. Oxidation des reduzierten Cytochrom c in Anwesenheit von PMN. Reduziertes Cytochrom c in 50µM Konzentration wurde bei 37°C in PBS mit 5mM Glucose, 1mM CaCl2 und 0.5mM MgCl2 inkubiert: ohne PMN (Autoxidation); mit 106 ml-1 (+PMN); mit 106 ml-1 von PMA-stimulierten polymorphkernigen Neutrophile in Anwesenheit von 200U/ml Katalase und 10µg/ml SOD (PMN+PMA+SOD+Kat); n=2.
Abb. 38. Adrenochrom-Bildung durch die PMA-stimulierten PMN. Effekt von SOD. Die PMN wurden in PBS mit 5mM Glucose, 1mM CaCl2, 0.5mM MgCl2 200U/ml Katalase und 1mM Epinephrin versetzt. Die Radikalbildung wurde durch Zugabe von PMA (80ng/ml) wie mit dem Pfeil angezeigt gestartet. SOD wurde vor dem Beginn der Radikalbildung in der Konzentration 10µg/ml zugegeben. Die Messungen erfolgten bei 37°C.
Abb. 39. Adrenochrombildung durch die Zymosan-stimulierten PMN. Die Zellen wurden in PBS mit 5mM Glucose, 1mM CaCl2, 0.5mM MgCl2, 200U/ml Katalase und 1mM Epinephrin versetzt. Die Radikalbildung wurde bei 37°C durch Zugabe von Zymosan gestartet und der SOD-sensitive Anteil der Adrenochrombildung erfaßt.
Abb. 40. Die Anwendung des Epinephrins zum Nachweis der Superoxidbildung an PMN unter der Stimulierung mit PMA. Die Reaktionsbedingungen sind wie in Abb. 38 angegeben.
Abb. 41. Lucigenin-Chemilumineszenz von den mit PMA stimulierten Zellen. Die PMN wurden in PBS (T=37°C) mit 5mM Glucose, 1mM CaCl2, 0.5mM MgCl2 und 50µM Lucigenin versetzt. Die Radikalbildung wurde durch Zugabe von PMA (80ng/ml) wie mit dem Pfeil angezeigt gestartet. Zugabe von je 10µg/ml SOD.
Abb. 42. Hemmung der Lucigenin-Chemilumineszenz an PMA-stimulierten PMN durch Diphenyleniodoniumchlorid (DPI). Reaktionsbedingungen wie in Abb. 41 angegeben. Konzentration von DPI betrug 15µM.
Abb. 43. Einfluß der SOD und Katalase auf die Luminol-Chemilumineszenz der PMA-stimulierten polymorphkernigen Neutrophilen. Die PMN wurden in PBS (T=37°C) mit 5mM Glucose, 1mM CaCl2, 0.5mM MgCl2 und 50µM Luminol versetzt. Die Radikalbildung wurde durch Zugabe von PMA (80ng/ml) wie mit dem Pfeil angezeigt gestartet. Zugabe von 10µg/ml SOD und 200U/ml Katalase.
Abb. 44. Wirkung von Diphenyleniodoniumchlorid (DPI) und Katalase auf die Chemilumineszenz des Luminols im System mit PMA-stimulierter PMN. Reaktionsbedingungen wie in Abb. 43 angegeben. Die Konzentrationen von DPI und Katalase waren 15µM bzw. 200U/ml. Die Konzentration des Luminols betrug 50µM.
Abb. 45. ESR-Spektren von DEPMPO beim O2-.-Nachweis an den PMA-stimulierten polymorphkernigen Neutrophilen. A- 5min., B- 10min., C- 15min. nach dem Beginn der Stimulierung. D - 10µg/ml SOD vor der Stimulierung zugegeben. Die Einstellungen am ESR-Spektrometer waren: Leistung - 2mW, Scanbreite - 115G, Verstärkungsfaktor - 105, Modulationsamplitude - 0.9G, Zeitkonstante - 0.164s, Scangeschwindigkeit - 82.25G/min, Resonatortyp - TM4103. Konzentration von DEPMPO war 25mM.
Abb. 46. Stabilität des DEPMPO-OOH Adduktes in Anwesenheit von PMN. Die Amplitude des mittleren Dubletts wurde bei konstantem Magnetfeld über die Zeit gemessen. Die Einstellungen des ESR-Spktrometers waren wie in Abb. 45 angegeben.
Abb. 47. Schematische Darstellung des morphologischen Aufbaus und der Elektronentransportkette in Mitochondrien (mit Modifizierungen nach [97]). Abkürzungen: DH - Dehydrogenase, Q - Ubiquinon, FeS - Eisen-Schwefel Protein, AA - Antimycin A, MTZ - Myxothiazol, TTFA- Thenoyltrifluoroaceton. Im Schema der Atmungskette ist der Elektronenfluß mit Pfeilen gekennzeichnet.
Abb. 48. Kinetik der Adrenochrombildung an den Antimycin A (AA)-blockierten Mitochondrien mit Succinat als Atmungssubstrat. Die Mitochondrien wurden in der Konzentration 0.5mg Protein/ml im Meßpuffer (0.3M Sucrose, 20mM Triethanolamin, 500mg/l BSA 1mM EDTA) suspendiert, mit 10mM Succinat und 1mM Epinephrin versetzt und die O2-.-Bildung durch AA (2µg/ml) gestartet.
Abb. 49. Reduktion von acetyliertem Cytochrom c durch Succinat-veratmende Mitochondrien. Mitochondrien wurden in der Konzentration 0.5mg Protein/ml im Meßpuffer (0.3M Sucrose, 20mM Triethanolamin, 500mg/l BSA, 1mM EDTA) suspendiert, mit 50µM acetyliertem Cytochrom c und 10mM Succinat versetzt. Die Endkonzentrationen von SOD und Myxothiazol waren 10µg/ml bzw. 2µg/ml.
Abb. 50. Lucigenin-Chemilumineszenz an O2-.-bildenden Mitochondrien (RHM). Effekt von SOD. RHM wurden in der Konzentration 0.5mg Protein/ml im Meßpuffer suspendiert, mit 10mM Succinat versetzt und die O2-.-Bildung durch Antimycin A (AA, 2µg/ml) gestartet. Die Konzentration des Lucigenins war 50µM. Die Endkonzentration von SOD betrug 10µg/ml.
Abb. 51. Einfluß des Hemmstoffes TTFA auf den SOD-insensitiven Anteil der Lucigenin-Chemilumineszenz beim Superoxid-Nachweis an Mitochondrien (RHM). Die Induktion der O2-.-Bildung durch RHM erfolgte wie in Abb. 50 angegeben. Die Endkonzentrationen von SOD und TTFA waren 10µg/ml bzw. 1mM.
Abb. 52. Wirkung der Hemmstoffe der mitochondrialen Atmungskette (Kaliumcyanid, Myxothiazol) auf den SOD-insensitiven Anteil der Lucigenin-Chemilumineszenz beim Superoxid-Nachweis an Mitochondrien. Probenzusammensetzung: 0.5mg Protein/ml RHM, 10mM Succinat, 2µg/ml Antimycin A, 50µM Lucigenin, 10µg/ml SOD, 1mM Kaliumcyanid, 2µg/ml Myxothiazol
Abb. 53. Lucigenin-Chemilumineszenz beim Nachweis der Superoxidradikale an SMP. Antimycin A und Lucigenin wurden zu SMP zugegeben und die O2-.-Bildung wurde durch die Zugabe von Succinat gestartet. Die Endkonzentration von SOD betrug 10bzw.20µg/ml.
Abb. 54. ESR-Signal von DEPMPO an den Antimycin A-gehemmten Mitochondrien mit Succinat als Atmungssubstrat. A: die Summe von 4 Spektren; B: nach 20min Inkubation. Mit * ist das DEPMPO-OH-Addukt markiert. Die Einstellungen des ESR-Spektrometers waren: Leistung - 2mW, Scanbreite - 150G, Verstärkungsfaktor - 106, Modulationsamplitude - 1G, Zeitkonstante - 0.164s, Scangeschwindigkeit - 53.64G/min, Resonatortyp - 9403TM362. Sonstige Erläuterungen s. im Text.
Abb. 55 Schematische Darstellung der Mechanismen der Oxidation des Adrenalins zum Adrenochrom. RH4, RH3-.- Adrenalin, RH3. - Adrenalin Semichinon, RH2 - Adrenalin Chinon und Leukoadrenochrom, RH. - Leukoadrenochrom Semichinon, R -Adrenochrom.
Abb. 56 Schematische Darstellung der zur Luminol-Chemilumineszenz führenden Reaktionen (nach [88]). LH- -Luminol; LH. - Luminolradikal; L - Diazachinon; LOOH-Alpha-Hydroxy-Hydroperoxid; AP- Aminophthalat.
Abb. 57 Schematische Darstellung zur Entstehung der Lucigenin-Chemilumineszenz. LC2+ - Lucigenin; LC+. -Lucigenin-Kationradikal; LC-O2 - Dioxetan, MA- N-Methylacridon (nach [5]).

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