Udilova, Natalia: Vergleichende Untersuchung von Methoden zum Nachweis von Superoxidradikalen in biologischen und Modellsystemen.

Kapitel 2. Material und Methoden.

2.1 Photometrische Analyse.

Die Absorptionsmessungen wurden an einem Hitachi U-3300 Spektrophotometer (Japan) in Quarzküvetten (d =1cm) durchgeführt. Das Gerät ermöglicht das Rühren sowie die Thermostatierung der Proben.

Für die Bestimmung der Aktivität von Xanthinoxidase wurde die Harnsäurebildung über die Zunahme der Absorption bei 290nm verfolgt (epsilon290nm=12.6mM-1 cm-1 ).

Bei dem photometrischen Nachweis der Superoxidbildung im Xanthin/Xanthinoxidase System wurde die Bildungsgeschwindigkeit des Reaktionproduktes aus der Zunahme der optischen Dichte bei der entsprechenden Wellenlänge lambda errechnet:

,

und

Gleichung 1

wobei ODlambda - optische Dichte bei der Wellenlänge lambda,

c - Konzentration des Reaktionproduktes,

l - optischer Weg und

epsilonlambda - Extinktionskoeffizient des Reaktionsproduktes bei der Wellenlänge lambda sind (für Cytochrom c epsilon550nm=21 mM-1 cm-1, für Formazan epsilon540nm=7.2 mM-1 cm-1, für Adrenochrom epsilon480nm=2.86 mM-1cm-1).

Bei der Auswertung von spektrophotometrischen Messungen, welche in einem Medium mit starker Streuung erfolgten (Zellen, Mitochondrien), wurde die Extinktion bei einer Referenzwellenlänge (585nm) von der Extinktion in dem für den Farbstoff entsprechenden Maximum substragiert.

Falls nicht anders angegeben, erfolgten alle spektrophotometrischen Untersuchungen bei 37°C.

2.2 Elektronenspinresonanz (ESR).

Die ESR ist eine Methode zum Nachweis paramagnetischer Spezies. Der Meßprinzip beruht auf der Absorption von Mikrowellenenergie aus einem hochfrequenten elektromagnetischen Feld bei Erfüllung der Resonanzbedingung:

hny=H

Gleichung 2

wobei h - das Planksche Wirkungsquantum, ny - die Frequenz des elektromagnetischen Feldes, g- der Aufspaltungsfaktor oder einfach g-Faktor, ß- das Bohrsche Magneton und H- die magnetische Feldstärke sind. Bei Erfüllung der Resonanzbedingung ( Gleichung 2 ) erfolgen Übergänge der ungepaarten Elektronnen zwischen den Energieniveaus. Aus meßtechnischen Gründen wird die Absorption der Mikrowellenenergie meist als erste Ableitung registriert. Das entstandene Spektrum wird im wesentlichen durch den g-Faktor und durch die Hyperfeinaufspaltung bestimmt.

Für ein freies Elektron hat g einen Wert von ge=2,00232. Im allgemeinem ist der g-Wert von ge verschieden und hängt von der Orientierung des Moleküls, an dem sich das ungepaarte Elektron befindet, im äußeren Magnetfeld ab. Für freie Radikale unterscheidet sich der g-Faktor jedoch nur gering von ge.


8

Die Hyperfeinaufspaltung reflektiert die Wechselwirkung des Magnetfeldes des ungepaarten Elektrons (Spin) mit dem benachbarten Kernspin (I). Die Anzahl der Spektrumslinien (2I+1) und die Aufspaltungskonstanten sind von Kernspin, von der Art sowie von der Position des Kerns in einem Molekül abhängig.

Die ESR-Messungen erfolgten mit einem ER 200 D-SRC 9/SRC Elektronenspinresonanz-Spektrometer der Firma Brucker (Rheinstetten, Deutschland) bei einer Mikrowellenfrequenz von ca. 9.6 GHz und einer Modulationsfrequenz von 100 kHz. Es wurden Hohlraumresonatoren vom Typ TE102 und TM110 verwendet. Für die Datenerfassung der ESR-Spektren wurde das OS/9-Datensystem ESR 1600 der Firma Brucker verwendet. Die Datenbearbeitung sowie Computersimulationen erfolgten mit dem von Dr. L.Gille geschriebenen Programm ESR-SIMU sowie mit den Programmen „WinEPR SimFonia“ (Version 1.2) und „Win-EPR“ (Version 921201) der Firma Brucker.

Die Messungen wurden entweder bei Raumtemperatur oder bei 37°C durchgeführt.

Für die Thermostatierung der Küvette bei 37°C wurde eine variable Temperiereinheit B-VT1000/ER4111VT eingesetzt, die mit einem Heizelement und mit einem Stickstoffverdampfer arbeitet. Die Temperatur wurde mit einer Thermopaar (Chrom-Aluminium) kontrolliert, wobei die Genauigkeit +1K betrug.

Als interner Standard diente 2,2,6,6-Tetramethylpiperidin-N-oxyl (TEMPO, g = 2.0055).

Alle Messungen erfolgten grundsätzlich in sogenannten Flachzellen, d.h. Quarzküvetten von extrem geringer Dicke (0.2-0.3 mm) und einer Breite von entweder 8mm (TE102) oder 15mm (TM110), um dielektrische Verluste durch das stark polare Medium Wasser zu minimieren.

2.3 Chemilumineszenz.

Die Lichtemission wurde mit einem rotempfindlichen Photomultiplier, Modell EMI 9658 AM, der Firma Thorn EMI Electron Tubes Inc. (Fairfield, NJ/USA) nachgewiesen. Zur Reduktion des Grundrauschens bis auf ca. 250cps wurde der Photomultiplier auf -25°C gekühlt. Die Empfindlichkeit des Photomultipliers wurde mit 213.7 µA/lum angegeben; die Quanteneffizienz wies eine breite Verteilung in sichtbaren Bereich mit einem Maximum von 18.3% bei 440nm auf. Die Hochspannung von 1325V wurde zur Versorgung des Photomultipliers angelegt. Die zeitlichen Charakteristiken des Photomultipliers sind: Anstiegszeit tr=10ns, Durchgangszeit tt=65ns, Vollbreite am Halbmaximum tvbhm=22ns.

Die Verstärkung des Ausgangssignals erfolgte mit einem Diskriminator/Verstärkersystem (Modell 1121) der Firma Princeton Applied Research (Prinston, NJ/USA), das mit einem Adapter (Modell 1109) für Einzelphotonenzählung versehen war. Die Erfassung von Meßdaten erfolgte mit dem Programm Turbo-MCS A67-BI von EG&G ORTEG (Tennessee/USA), wobei die Integrationszeit der Photonenzählung auf 1s eingestellt wurde. Die Ausstattung der Meßzelle mit einem Wasserthermostat ermöglichte, die Chemilumineszenz-Messungen entweder bei Raumtemperatur oder bei 37°C durchzuführen.

2.4 Dünnschichtchromatographie.

Zur Trennung der Reduktionsprodukte von Nitroblau Tetrazolium wurde die Dünnschichtchromatographie eingesetzt. Die zu untersuchende Mischung wurde auf die Kieselgel-beschichteten Glasplatten (Kieselgel 60 DC-Platten, Merck) aufgetragen und in eine vertikale Trennkamer gebracht. Die Trennung erfolgte mit dem Laufmittel Butanol:Essigsäure:Wasser=80:20:20 (v/v). Die Auswertung der Ergebnisse erfolgte mit dem Dünnschichtchromatographiescanner „TLC Scanner 3 1.12.00“ und der Software „Cats 4.03“ Firma CAMAG (Muttenz, Schweiz). Als Maß der Wanderungsgescheindigkeit einer Verbindung diente der Rf-Wert: Rf=

2.5 Vorbereitung und Untersuchung des biologischen Materials.

2.5.1 Polymorphkernige Neutrophile (PMN).


9

2.5.1.1 Gewinnung der PMN-reichen Leukozyten-Fraktion.

Polymorphkernige Neutrophile wurden aus Schweineblut isoliert. Für die Sedimentation der Erythrozyten wurden 30ml Citrat-Blut (20mM Natriumcitrat) mit 5ml 6% iger (Gewicht/Volumen) Dextran-Lösung (MW 70 000) vermischt und 1 Stunde bei Raumtemperatur inkubiert. Das an Leukozyten reiche Plasma wurde abgenommen und bei 200g 10 min zentrifugiert (T=4°C). Der Überstand wurde verworfen und die Zellen in 2ml Phosphatpuffer (PBS) durch vorsichtiges Vortexen resuspendiert.

Zur hypotonischen Lysis der restlichen Erythrozyten wurden 10 ml des kalten Phosphat-Puffers (10mM P.i., pH=7.4) zugegeben. Nach 20 s Inkubationszeit wurde die Osmolarität durch die Zugabe von 5 ml einer 2.7%igen NaCl-Lösung in 10 mM Phosphat-Puffer (pH=7.4) wiederhergestellt.

Die Zellen wurden zweimal mit PBS gewaschen (5min, 200g ), anschließend in 5ml PBS resuspendiert und maximal 6 Stunden bis zur Messung auf Eis aufbewahrt.

Um die vorzeitige Aktivierung von PMN zu vermeiden, wurden sie ausschließlich in Plastikgefäßen aufbewahrt.

2.5.1.2 Vitalitätstest

Nach der Isolierung wurde die Vitalität der Zellen über die Färbung mit Trypanblau überprüft. Da die intakten Zellen diesen Farbstoff ausschließen, kann man deren Anteil in jeder Präparation mikroskopisch bestimmen.

Trypanblau wurde in 0.1%-iger Konzentration in PBS gelöst. 200µl frisch isolierter PMN wurden mit 10µl dieser Lösung 5min inkubiert und anschließend mikroskopiert. Alle weiteren Versuche wurden an solchen Präparationen durchgeführt, in denen der Anteil intakter Zellen über 95% betrug.

2.5.1.3 Aktivierung von PMN.

Zur Aktivierung der NADPH-Oxidase an PMN wurden entweder opsoniertes Zymosan oder Phorbolmyristatacetat (PMA) eingesetzt. Alle Messungen der Radikalbildung durch PMN erfolgten bei 37°C. Die Zellen wurden 5min bei dieser Meßtemperatur in PBS mit 5mM Glucose in Anwesenheit der Nachweissubstanz äquilibriert, danach wurden 10µl der 100mM CaCl2 - und 10µl der 50mM MgCl2 - Lösungen zu 1ml PBS zugegeben, so daß die Endkonzentration von Ca2+ und Mg2+ 1mM bzw. 0.5mM betrug. Um die Chelatierung der für die Aktivierung erforderlichen Ca2+ - und Mg2+ -Ionen zu vermeiden, wurde zum Meßpuffer kein DTPA zugesetzt.

2.5.1.3.1 Opsonisierung von Zymosan.

Die Opsonisierung des Zymosans wurde, wie in [5] beschrieben, durchgeführt. Zymosan A, eine Präparation aus der Zellwand von Saccharomyces cerevisiae, wurde in physiologischer Kochsalzlösung (0.85% V/V) suspendiert, so daß die Konzentration 250mg/dl betrug. Die Suspension wurde auf einem kochenden Wasserbad 20 min lang erwärmt und anschließend auf Zimmertemperatur abgekühlt. Nach einem 10 minütigen Zentrifugieren bei 300g wurde der Supernatant verworfen und das Pellet in 200ml frisch gefrorenem und kurz vorher aufgetautem Plasma resuspendiert. Nach 20 min Inkubation unter ständigem Rühren bei Raumtemperatur wurde die Suspension noch einmal - wie oben beschrieben - zentrifugiert. Das Pellet wurde in frischem Plasma (200 ml) suspendiert, nachdem die Inkubations- und Zenrifugationsschritte wiederholt wurden. Danach wurde die Suspension zweimal mit 500ml physiologischer Kochsalzlösung gewaschen und wie oben beschrieben abzentrifugiert. Der Supernatant wurde verworfen. Das opsonisierte Zymosan wurde auf die ursprüngliche Konzentration verdünnt und bis zur Messung bei -20°C eingefroren. Die auf diese Weise hergestellte Suspension enthält 600+200 Zymosanpartikeln pro Mikroliter. Für die Stimulierung wurden 10µl Zymosan zu 1ml Probe zugesetzt.

2.5.1.3.2 PMA.

Phorbol-12-Myristat-13-Acetat (PMA, Sigma) wurde in Dimethylsulphoxid (DMSO) in einer Konzentration von 1mg/ml gelöst. Diese Stammlösung wurde bei -20°C aufbewahrt und mehrfach aufgetaut und eingefroren. Die Arbeitslösung in der Konzentration 8µg/ml wurde täglich aus der Stammlösung frisch vorbereitet. Dafür wurden 8µl der Stammlösung zuerst mit 92µl DMSO und anschließend mit 900µl bidestilliertem H2O verdünnt. Für die Stimulierung wurde 10µl der


10

Arbeitslösung pro 1ml Probe zugesetzt, so daß die Endkonzentration 80ng/ml betrug.

2.5.1.4 Sauerstoffverbrauch.

Der Sauerstoffverbrauch wurde mit Hilfe einer Clark-Sauerstoffelektrode MI-730 der Firma Microelectrodes Inc. (Londonderry/USA), gemessen. Das Meßprinzip beruht darauf, daß Sauerstoff auf der Elektrode reduziert wird, wobei der entstehende Diffusionsstrom der O2-Konzentration proportional ist.

Die Kalibrierung der Sauerstoffelektrode erfolgte anhand einer mit Luftsauerstoff gesättigten wässrigen Meßlösung, deren Sauerstoffgehalt 240µM bei 20°C bzw. 212µM bei 37°C beträgt. Durch Zugabe von Natriumdithionit (Na2S2O4) erfolgt eine 100% ige Reduktion des gelösten Sauerstoffes, so daß der Nullpunkt des Meßbereiches erreicht wird. Die Berechnung des absoluten Sauerstoffverbrauchs wurde unter der Annahme der linearen Abhängigkeit des Elektrodenpotentials von der Sauerstoffkonzentration durchgeführt.

Die Messungen an den stimulierten Zellen erfolgten in einer thermostatierbaren Küvette, wobei die Temperatur auf 37°C eingestellt war.

2.5.2 Rattenherz- und Rattenlebermitochondrien (RHM und RLM)

2.5.2.1 Präparation von RHM und RLM.

Die Isolierung von Rattenherz- bzw. Rattenlebermitochondrien erfolgte nach der Methode von Szarkowska und Klingenberg [136].

Die entnommenen Rattenherzen bzw. Rattenlebern wurden zweimal mit Präparationspuffer aus 0.3M oder 0.25M Sucrose für RHM bzw. RLM, 20mM Triethanolamin (TRAP) und 1mM EDTA gewaschen. Nach der Zerkleinerung und Homogenisierung erfolgte eine 10 minütige Zentrifugation bei 2500 U/min (570g) und 4°C. Das Pellet wurde verworfen, und der Überstand wurde 10min bei 9000 U/min und 4°C zentrifugiert. Das Pellet (Mitochondrien) wurde im Präparationspuffer suspendiert und erneut 10min bei 9000U/min und 4°C abzentrifugiert. Dieser Waschvorgang wurde wiederholt, und die Mitochondrien anschließend im Präparationspuffer (300µl für RHM bzw. in 500-1000µl für RLM) resuspendiert. Der Proteingehalt der Mitochondrien-Suspension wurde wie in Kapitel 0 beschrieben bestimmt. Die Mitochondrien wurden bis zur Messung maximal 8 Stunden auf Eis aufbewahrt.

Für die Messungen wurde der Präparationspuffer mit 500mg/l fettsäurefreiem Albumin (BSA, Firma „Sigma“) versetzt.

2.5.2.2 Präparation von submitochondrialen Partikeln (SMP).

Herzmitochondrien (6 Ratten) wurden wie oben beschrieben isoliert, nur daß der Präparationspuffer eine andere Zusammensetzung aufweist: 0.25M Sucrose, 50mM HEPES, pH=7.5. Die präparierten Mitochondrien wurden in 5ml einer Lösung mit 0.25M Sucrose, 50mM HEPES, 2mM EDTA (pH=9.0) suspendiert und 8mal für 5s mit Ultraschall behandelt (40 W). Zwischen den Beschallungen wurde die Suspension ca.30s im Eisbad abgekühlt. Anschließend wurde die behandelte Suspension 10min bei 8200upm (Rotor SS-34) zentrifugiert. Der die SMP enthaltende Überstand wurde abgenommen und 30min bei 32000upm (Rotor SW50L) und 4°C zentrifugiert. Das Pellet (SMP) wurde in 500µl des Meßpuffers (0.25M Sucrose, 50mM HEPES, 0.5mM EDTA, pH=7.5) resuspendiert und der Proteingehalt, wie in Kapitel 0 beschrieben, bestimmt.

2.5.2.3 Atmungsparameter.

Zur Qualitätskontrolle der isolierten Mitochondrien wurden die Effizienz der Phosphorylierung (P/O) sowie die Atmungskontrollwerte RC („respiratory control“) bestimmt. Dies erfolgte mit einer Clark- Sauerstoffelektrode bei 25°C in dem mit BSA versetzten Präparationspuffer. Die Konzentration der Mitochondrien betrug 0.5mg Protein/ml. Die Effizienz der Phosphorylierung, die sogenannte Kopplungskonstante, wurde über das Verhältnis zwischen den molaren Äquivalenten des Phosphates (P) und des verbrauchten Sauerstoffes (O) unter dem Atmungszustand 3 bestimmt. Die RC-Werte wurden aus dem Verhältnis des mitochondrialen Sauerstoffverbrauchs mit und ohne ADP+Phosphat


11

berechnet.

2.5.2.4 Proteinbestimmung.

Die Proteinbestimmung erfolgte nach der modifizierten Biuret-Methode [23]. Das Prinzip dieses Verfahrens ist die Bildung eines Farbkomplexes des Kupferreagenz mit Peptidbindungen, dessen Intensität photometrisch gemessen werden kann. Die Extinktion des Farbkomplexes ist der Konzentration über einen relativ großen Bereich proportional.

Eine Fällung des Proteins wurde stets vor der Messung durchgeführt. Hierfür wurden 10µl Probe (Mitochondrien/SMP) zu 1ml Milli-Q-Wasser pipettiert und 200µl 3M Trichloressigsäure zugegeben. Nach Schütteln wurde die Probe 10 min bei Raumtemperatur inkubiert und anschließend 10 min bei 2500g zentrifugiert. Der klare Überstand wurde verworfen und der Niederschlag in 2.5 ml der Biuret-Reagenzlösung (0.2N NaOH; 3g/l CuSO4.5H2O; 9g/l Na-K-Tartrat-Tetrahydrat NaKC4H4O6.4H2O; 5g/l KJ) aufgelöst. Nach 10 Minuten Reaktionszeit wurde die optische Dichte A1 bei 546 nm gemessen. Eine kleine Menge (Spatelspitze) KCN wurde in die Küvette gegeben; nach Entfärbung der Lösung wurde die optische Dichte A2 gemessen und DeltaA=A1-A2 berechnet. Der Blindwert DeltaA0 wurde mit Wasser statt der Probe erhalten.

Die Berechnung der Proteinkonzentration C erfolgte nach der Formel:

,

wobei alpha- Verdünnungsfaktor ( µl Gesamtvolumen/µl Probevolumen), d- Schichtdicke der Küvette und epsilon- Extinktionskoeffizient epsilon=0.2243 mg-1 ml cm-1 sind. Der Exitnktionskoeffizient wurde aus der Eichkurve mit dem fettsäurefreien BSA (Fraktion V, ge96% Proteingehalt) ermittelt.

Wenn nicht anders angegeben, wurden die Mitochondrien/SMP bei Experimenten auf die Konzentration von 0.5mg Protein/ml verdünnt.

2.5.2.5 Hemmstoffe der mitochondrialen Atmung.

Zur Induktion der Radikalbildung wurden Mitochondrien/SMP (0.5mg Protein/ml) in dem entsprechenden Meßpuffer (0.3M bzw. 0.25M Sucrose, 20mM TRAP, 1mM EDTA, 0.5mg/ml Albumin) mit Succinat versetzt (Endkonzentration 10mM) und der in Acetonitril gelöste Hemmstoff Antimycin A zugegeben, so daß seine Endkonzentration 2µg/ml betrug. Weitere Hemmstoffe der mitochondrialen Atmung wie Myxothiazol und Rotenon wurden ebenfalls in Acetonitril gelöst und zu der mitochondrialen Suspension zugegeben (Konzentration 2µg/ml im Test). Die Konzentrationen von TTFA (Thenoyltrifluoroacetat) und Kaliumcyanid (in DMSO bzw. in H2O gelöst) betrugen 1mM im Test.

Für die ESR-Experimente wurden höhere Konzentrationen von Mitochondrien verwendet und die Konzentration der Hemmstoffe entsprechend erhöht, so daß das Verhältnis Hemmstoff/mg Protein konstant blieb.

In allen Experimenten an Mitochondrien war der Volumenanteil von dem mit Hemmstoff zugegebenen Lösungsmittel le0.5% und hatte keine Auswirkung auf die Atmungsparameter.

2.6 Chemikalien.

Käuflich erworben wurden die folgenden in der Arbeit verwendeten Lösungsmittel und Reagenzien:

1-Butanol

zur Analyse

Merck

2,2,6,6-Tetramethylpiperidin-N-oxyl (TEMPO)

95-98%

Sigma

2,4-Dinitrophenol (90-95%)

 

Sigma

5,5-Dimethy-1-Pyrrolin-N-Oxid (DMPO)

 

Sigma

5-Amino-2,3-dihydro-1,4-phthalazinedion; (Luminol)

95-97%

Sigma

Acetonitril

zur Analyse

Merck


12

Adenosin-5'-diphosphat Monokaliumsalz; ADP

 

Boehringer Mannheim

Adrenochrom

 

Sigma

Aktivkohle

reinst

Merck

Antimycin A

 

Boehringer Mannheim

Bernsteinsäure Dinatriumsalz; Succinat

zur Synthese

Merck

Bis-N-Methylacridinium (Lucigenin)

 

Sigma

Calciumchlorid-Dihydrat

 

Merck

Cytochrom c

 

Sigma

Cytochrom c, teilweise acetyliert

 

Sigma

D(+)-Glucose-Monohydrat

f.biochem. Zwecke

Merck

Dextran ( MW ca. 69000)

med. rein

Sigma

Diethylentriaminpentaessigsäure (DTPA)

zur Analyse

Merck

Dimethylsulphoxid (DMSO)

zur Analyse

Merck

Dinatriumhydrogenphosphat

zur Analyse

Merck

Diphenyleniodoniumchlorid (DPI) (>98%)

 

Sigma

Eisen(II)-chlorid-Tetrahydrat

zur Analyse

Merck

Epinephrinhydrogentartrat

 

Sigma

Essigsäure (98-100 %)

zur Analyse

Merck

Ethylendiamintetraessigsäure, Dinatriumsalz (EDTA)

zur Analyse

Merck

Harnsäure, Natriumsalz

 

Sigma

Kaliumcyanid

zur Analyse

Merck

Kaliumhydrogenphosphat

zur Analyse

Merck

Kaliumjodid

zur Analyse

Merck

Kaliumnatriumtartrat-Tetrahydrat

zur Analyse

Merck

Katalase EC 1.11.1.6; (Pulver)

 

Sigma

Kupfer(II)-sulfat-Pentahydrat

zur Analyse

Merck

Magnesiumchlorid-Hexahydrat

zur Analyse

Merck

Myxothiazol

 

Boehringer Mannheim

Natriumchlorid

zur Analyse

Merck

Natriumdithionit

 

Merck

Natriumhydroxid

zur Analyse

Merck

Nitroblau Tetrazolium (NBT)

Grade III

Sigma

Phorbolmyristatacetat (PMA)

>99%

Sigma

Rinderserumalbumin, fettsäurenfrei (FraktionV)

 

Sigma


13

Rotenon

 

Sigma

Sucrose

f.d.Mikrobiologie

Merck

Superoxid Dismutase (SOD), EC 1.15.1.1

 

Sigma

Thenoyltrifluoroaceton (TTFA)

 

Sigma

tri-Natriumcitrat-2-Hydrat

zur Analyse

Merck

Trichloressigsäure

zur Analyse

Merck

Triethanolaminhydrochlorid (TRAP)

zur Analyse

Fluka

Trypanblau

f.d. Mikroskopie

Merck

Uricase (Uratoxidase); EC 1.7.3.3

 

Sigma

Wasserstoffperoxid 30%

med. rein

Merck

Xanthin, Natriumsalz

Grad III

Sigma

Xanthinoxidase (XOD), EC 1.2.3.2

Grad I

Sigma

Zymosan A (aus Saccharomyces cerevisiae)

 

Sigma

Reduziertes Cytochrom c wurde durch die Reaktion des oxidierten Cytochrom c mit Natriumdithionit erzeugt. Zur wässerigen Lösung des Cytochroms c (10-20mg/ml) wurde eine Spatelspitze des Natriumdithionites (Na2S2O4) zugegeben, 1-2 min inkubiert und mit einer Entsalzungssäule Sephadex G-25 vom Überschuß des Dithionites abgetrennt. Die Endkonzentration des reduzierten Cytochrom c wurde spektrophotometrisch bestimmt (epsilon=21mM-1 cm-1).

Phosphoryliertes DMPO (DEPMPO) wurde freundlicherweise von Prof. A.Tomasi (Modena, Italien) zur Verfügung gestellt.

DMPO sowie phosphoryliertes DMPO wurden unmittelbar vor der Anwendung mit Aktivkohle gereinigt. Dafür wurde zu ca.1ml wässerigen Lösung des Spintraps ( 0.5-1M Konzentration ) eine Spatelspitze Aktivkohle zugesetzt und 10 min mit Ultraschall im Wasserbad bei Raumtemperatur behandelt. Anschließend wurde die Aktivkohle durch 5min Zentrifugieren bei 200g sedimentiert, der Überstand vorsichtig abgenommen und die Konzentration des Spintraps spektrophotometrisch unter Verwendung der folgenden Extinktionskoeffizienten bestimmt:

für DEPMPO epsilon240nm= 6900 M-1 cm-1 (Methanol) [49];

für DMPO epsilon228nm=7800 M-1 cm-1 (Wasser) [49].


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