Udilova, Natalia: Vergleichende Untersuchung von Methoden zum Nachweis von Superoxidradikalen in biologischen und Modellsystemen.

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Kapitel 3. Ergebnisse

3.1 Xanthin/Xanthinoxidase als Modellsystem für Superoxidbildung.

Um die verschiedenen Detektionssysteme hinsichtlich ihrer Selektivität und quantitativen Ausbeute vergleichbar zu machen, war es erforderlich, eine geeignete O2-.-Radikalbildungsquelle zu finden.

Als potentielle Superoxidradikal-Bildner ist eine Gruppe von Enzymen anzusehen, die auf Sauerstoff Elektronen übertragen (Oxidasen). Diese Klasse von Enzymen katalysiert die Übertragung eines Einzelelektrons auf das O2 -Molekül, wodurch eine Spinumkehr umgangen werden kann.

Eine für die Superoxid-Bildung in biologischen Systemen wichtige Oxidase ist die Xanthinoxidase (XOD). In vivo wird Xanthinoxidase vermehrt durch die Oxidation von SH-Gruppen aus Xanthindehydrogenase gebildet. Endothelzellen aller Gefäße besitzen eine hohe Xanthinoxidase-Aktivität. Nach Ischämie (Mangelversorgung mit Sauerstoff) und anschließender Reoxygenierung beobachtet man eine starke Zunahme der Xanthinoxidase-Aktivität durch die Umwandlung aus Xanthindehydrogenase.

Xanthinoxidase ist ein Eisen-Molibdän Flavoprotein, das FAD enthält. Sie katalysiert die Oxidation von Xanthin bzw. Hypoxanthin, wobei jeweils zwei Einzelelektronen auf Sauerstoff übertragen werden und Harnsäure als Oxidationsprodukt gebildet wird:

Hypoxanthin + H2O + 2O2 rarr Xanthin + 2O2-. + 2H+

Reaktion 1

Xanthin + H2O + 2O2 rarr Harnsäure + 2O2-. + 2H+

Reaktion 2

Xanthinoxidase ist nicht besonders substratspezifisch; außer Hypoxanthin und Xanthin können auch verschiedene Purine und Pterine sowie Aldehyde als Substrate dienen. Mit Xanthin als Substrat beträgt die Michaelis-Menten Konstante KM=1.7.10-6M (pH=7.4, Phosphat-Puffer, 25°C) [1].

In der vorliegenden Arbeit wurde der enzymatische Umsatz des Xanthins zur Harnsäure spektrophotometrisch verfolgt. Die Harnsäurebildungsrate wurde über die Zunahme der optischen Dichte bei 290nm unter Berücksichtigung des Extinktionskoeffizienten epsilon290nm=12.6mM-1 cm-1 berechnet. Aus der Reaktionsgleichung ( Reaktion 2 ) kann die theoretische O2-.-Bildungsrate ermittelt werden, wenn die Bildungsrate von Harnsäure bekannt ist und die 2:1 Superoxid : Harnsäure Stöchiometrie berücksichtigt wird:

= 2 ,

Gleichung 3

worin [O2-.] und [HS] die Konzentrationen der Superoxidradikale bzw. der Harnsäure bezeichnen.

Diese Gleichung wurde unter der Annahme ausgestellt, daß Sauerstoff durch Xanthinoxidase ausschließlich zum Superoxid reduziert wird.

In wässrigem Medium bei physiologischen pH-Werten sind die produziertenen O2-.-Radikale instabil und dismutieren, wobei Wasserstoffperoxid gebildet wird. Die Dismutationsreaktion wird detailliert in Kapitel 0 betrachtet, die Reaktion kann jedoch allgemein wie folgt geschrieben werden:

2O2-. + 2H+ rarr H2O2 + O2

Reaktion 3


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Das gebildete Wasserstoffperoxid kann die enzymatische Bildung der O2-.-Radikale beeinflussen. Es gibt Hinweise, daß Wasserstoffperoxid die Aktivität der Xanthinoxidase hemmt [79]. Zudem fördert Wasserstoffperoxid in Anwesenheit von Übergangsmetallen die Bildung von hochreaktiven Hydroxyl-Radikalen, die mit Xanthinoxidase reagieren und dabei ihre Struktur sowie ihre Aktivität verändern können. Um diese Einflüsse auszuschließen, wurde das H2O2-eliminierende Enzym Katalase zu der Reaktionsmischung zugesetzt. Die Eliminierung von H2O2 durch Katalase erfolgt gemäß Reaktion 4 :

2H2O2 rarr 2H2O + O2

Reaktion 4

Die Ergebnisse der Überprüfung, ob eine Hemmung der Xanthinoxidase-Aktivität durch H2O2 bei den ausgewählten Substrat/Enzym-Konzentrationen stattfindet, sind in Tabelle 1 dargestellt.

Tabelle 1. Einfluß der Katalase auf die Aktivität der Xanthinoxidase.

System

Harnsäurebildung, µM/min

X/XOD ohne Katalase

5,89+0,68 (n=2)

X/XOD mit Katalase

5,68+0,70 (n=2)

Da keine signifikante Veränderung der Harnsäurebildung in Anwesenheit von Katalase beobachtet wurde, kann geschlossen werden, daß die Aktivität der Xanthinoxidase durch die gebildete Menge von Wasserstoffperoxid bei den gewählten Konzentrationen von Substrat und Enzym nicht beeinflußt wird.

Zu den Vorteilen des Xanthin/Xanthinoxidase Modellsystems für die Superoxidbildung gehört, daß die O2-.-Bildungsrate über einen längeren Zeitraum (ca. 5 Min.) konstant bleibt und je nach dem Substrat/Enzym-Verhältnis auf einen beliebigen, biologisch relevanten Wert einstellbar ist. In der vorliegenden Untersuchung wurde dieses Verhältnis so gewählt, daß die O2-.-Bildungsraten den vermuteten Raten in vivo entsprechen. Die in den Experimenten verwendete Konzentration des Xanthins war mit 100µM so gewählt, daß es als Substrat im Überschuß vorliegt und die gewünschte O2-.-Bildungsrate durch Variation des Xanthinoxidase-Gehaltes eingestellt wurde.

3.2 Überprüfung der qualitativen Selektivität einer Nachweismethode.

Um sicherzustellen, daß die Bildung eines Nachweisproduktes ausschließlich durch eine Interaktion mit O2-.-Radikalen zustande gekommen ist, wurden die jeweiligen Nachweisreaktionen in Ab- und Anwesenheit des Enzyms Superoxid-Dismutase (SOD) durchgeführt. SOD katalysiert die Dismutation von Superoxidradikalen, wobei die Reaktionsgeschwindigkeit diffusionslimitiert ist:

2 O2-. + 2H+ rarr H2O2 + O2 ; k=109 M-1 s-1

Reaktion 5

Die Eliminationsrate der durch SOD-katalysierten O2-.-Dismutation muß deutlich höher sein als die Reaktionsgeschwindigkeit der O2-.-Radikale mit dem Nachweissystem. Ist diese Bedingung erfüllt, was meistens der Fall ist, dann ist davon auszugehen, daß die Bildung des Nachweisproduktes in Anwesenheit der SOD zu 100% gehemmt wird. Mit Hilfe der SOD ist somit eine Überprüfung der Selektivität der angewandten Nachweismethode für O2-.-Radikale möglich.

Der topographische Aufbau mancher biologischer Funktionseinheiten, in denen eine O2-.-Bildungsquelle vermutet wird, versperrt dem großmolekularen SOD-Enzym jedoch häufig den Zugang (z.B. Mitochondrien). Dies kann die Identifizierung der Spezies, die für eine mögliche Reaktion mit dem Nachweissystem verantwortlich sind, erschweren.

3.3 Mögliche Ursachen der quanitativen Störung des Superoxid-Nachweises.

Wenn der Superoxid-Nachweis potentieller biologischer Bildungsquellen untersucht werden soll, ist mit


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verschiedenen Nebenreaktionen zu rechnen, welche das Nachweissystem quantitativ oder qualitativ verfälschen können.

3.3.1 Spontandismutation.

Eine quantitative Verfälschung des O2-.-Radikalnachweises kann durch Spontandismutation der O2-.-Radikale auftreten. Der pK-Wert für O2-.-Radikale liegt bei 4.8, so daß die Dismutation pH-Wert-abhängig abläuft. Sie kann mit den zum O2-.-Nachweis eingesetzten Substanzen konkurrieren und dadurch die nachweisbare O2-.-Menge vermindern. Der Anteil der protonierten O2-.-Radikale ist hierbei zu berücksichtigen, weil die Geschwindigkeitskonstanten für die jeweiligen Dismutationsreaktionen unterschiedlich sind:

2O2-. + 2H+ rarr H2O2 + O2 , k6=0.3 M-1 s-1

Reaktion 6

HO2 + HO2 rarr H2O2 + O2 , k7=8.3.105 M-1 s-1

Reaktion 7

HO2 + O2-. +H+ rarr H2O2 + O2 , k8=9.7.107 M-1 s-1

Reaktion 8

Bei dem physiologisch relevanten pH-Wert 7.4, bei dem die Nachweissysteme getestet wurden, liegt der größte Teil der O2-.-Radikale als Anionradikal vor. Das errechnete Verhältnis [HO2]/[O2-.] liegt bei 1/400. Die hierbei zu erwartenden O2-.-Disproportionsraten ergeben sich aus den oben aufgelisteten Reaktionsgleichungen:

Gleichung 4

Gleichung 5

Gleichung 6

Hieraus ergibt sich, daß die spontane Superoxid-Dismutation bei physiologischem pH - Wert hauptsächlich über die Reaktion 8 gemäß Gleichung 6 abläuft.

Beim O2-.- Nachweis läuft eine Nachweisreaktion parallel zur Dismutation ab:

O2-. + N rarr Nachweisprodukt

Reaktion 9

Der Anteil alpha spontan dismutierter und deswegen über die Reaktion 9 nicht erfaßter O2-.-Radikale wird als Verhältnis der Geschwindigkeiten von Reaktion 8 und Reaktion 9 berechnet:

Gleichung 7


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wobei [N] - die Konzentration der Nachweissubstanz ist.

Die obere Grenze der Konzentration von Superoxidradikalen [O2-. ] kann mit der Gleichgewichtskonzentration [O2-. ]ss eingeschätzt werden, welche in einem System aus O2-.-Bildungsquelle (Bildungsgeschwindigkeit v) zustande kommt, wenn Superoxidradikale über die spontane Dismutation verschwinden:

Gleichung 8

Somit ergibt sich der Anteil nicht erfaßter O2-.-Radikale als:

Gleichung 9

Die Geschwindigkeit, mit der Superoxidradikale dismutieren, stellt bestimmte Anforderungen an die Geschwindigkeit der Reaktion 9 , wenn eine Methode den Anspruch auf quantitativen O2-.- Nachweis erhebt. Wenn der Anteil dismutierter O2-.-Radikale vernachlässigbar gering sein soll im Vergleich zu denen, die mit der Nachweissubstanz reagieren, muß die Nachweisreaktion schneller als die Dismutation ablaufen (alpha<<1).

3.3.2 Reaktion des Superoxidradikals mit Übergangsmetallen.

Spurenmengen an Übergangsmetallen in der Probe können die stationäre Konzentration von Superoxidradikalen durch Katalyse einer Reaktion vom Fenton-Typ wesentlich erniedrigen. Hierbei reagiert das O2-.-Radikal mit Metallen veränderlicher Wertigkeit nach Reaktion 10:

O2-. + Men+ rarr Me(n-1)+ + O2

Reaktion 10

wo Men+ für z.B. Fe3+, Cu2+ oder Mn3+ steht.

Das Wasserstoffperoxid ist als Dismutationsprodukt von O2-.-Radikalen in protischem Medium stets vorhanden und kann Übergangsmetalle von der reduzierten Form auf die nächste Oxidationsstufe oxidieren. Bei dieser Reaktion entstehen hochreaktive Hydroxylradikale ( Reaktion 11 ), die das biologische Untersuchungsmaterial oxidativ zerstören sowie den O2-.- Nachweis beeinflussen können.

Me(n-1)+ + H2O2 rarr Men+ +OH. + OH-

Reaktion 11

Da die Übergangsmetalle durch die Redoxzyklierung ( Reaktion 10 und Reaktion 11 ) nicht verbraucht werden und nur eine katalytische Rolle spielen, kann die Gesamtreaktion wie folgt beschrieben werden:

O2-. + H2O2 rarr OH-+ O2 +OH.

Reaktion 12

Die Anwendung von Metall-Chelatoren kann diese Reaktion nicht immer sicher verhindern, da komplexiertes Eisen, z.B. mit EDTA, die Hydroxyl-Radikalbildung sogar noch deutlich beschleunigen kann [56-58,83].

Die Pufferreagenzien, z.B. Phosphat-Salze, enthalten vor allem Eisen und andere Übergangsmetalle als Verunreinigungen. Um deren möglichen Einfluß auf den Superoxidnachweis auszuschließen, wurde Eisen durch jeweils 1mM DTPA im Puffer komplexiert und so aus der Reaktionen herausgehalten.


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3.4 Photometrische Nachweismethoden von O2-.-Radikale.

Photometrische Methoden zum Nachweis der Superoxidbildung in biologischen Systemen werden am häufigsten verwendet.

Da Superoxidradikale im UV-Bereich absorbieren ( epsilon240nm=2343 M-1 cm-1, pH=7.5 [20]), ist ein direkter spektrophotometrischer Nachweis theoretisch möglich. Praktisch wird jedoch der direkte Nachweis durch den niedrigen Extinktionskoeffizienten sowie durch die starke UV-Absorption anderer organischer Verbindungen erschwert, so daß diese Methode für biochemische bzw. biologische Fragestellungen nicht anwendbar ist [20]. Aus diesen Gründen werden Superoxidradikale indirekt über chemische Reaktionen mit verschiedenen Farbstoffen nachgewiesen.

Das Meßprinzip der Methoden beruht darauf, daß die verwendeten Indikator-Substanzen durch O2-.-Radikale oxidiert oder reduziert werden, wobei ein farbiges Reaktionsprodukt entsteht. Dieses Reaktionsprodukt wird spektrophotometrisch erfaßt. Die am häufigsten für den O2-.-Nachweis verwendeten Farbstoffe sind in der Tabelle 2 zusammengefaßt.

Tabelle 2. Farbstoffe für den photometrischen O2 - -Nachweis.

Farbstoff

Gesamtreaktion

epsilonlambda

Cytochrom c

Cyt.c-Fe3+ + O2 - rarr Cyt.c-Fe2+ + O2

epsilon550nm=21 mM-1 cm-1

Acetyliertes Cytochrom c

Ac-Cyt.c-Fe3+ + O2 - rarr Ac-Cyt.c-Fe2++O2

epsilon550nm=21 mM-1 cm-1

Nitroblau Tetrazolium (NBT)

2NBT2+ + 2O2 - rarrFormazan

epsilon540nm=7.2 mM-1 cm-1

Epinephrine (Adrenalin)

Adrenalin + 4O2-.rarrAdrenochrom + 4H2O2

epsilon480nm=2.86 mM-1 cm-1

In diesem Kapitel werden die verschiedenen photometrischen Methoden für den qualitativen und quantitativen Superoxidnachweis eingesetzt. Als reproduzierbare Superoxidbildungsquelle diente die enzymatische Oxidation des Xanthins durch Xanthinoxidase, wobei die produzierte O2-.- Bildungsrate jedes mal über die Harnsäurebildung quantifiziert wurde ( Gleichung 3 ).

Die Farbstoffe wurden in Kontakt mit einer vorher quantifizierten O2-. - Bildungsquelle gebracht. Beim Nachweis reagieren sie mit Superoxidradikalen und die Reaktionsprodukte werden spektrophotometrisch erfaßt. Aus der Veränderung der optischen Dichte , die durch eine O2-.-abhängige Bildung des bei der Wellenlänge lambda absorbierenden Reaktionsproduktes zustande kommt, läßt sich bei Kenntnis des jeweiligen Extinktionskoeffizienten die Bildungsrate dieses Reaktionsproduktes verfolgen (Kapitel 2.1, Gleichung 1).

Die nachgewiesene Superoxid-Bildungsrate wurde aus der Bildungsrate des Reaktionsproduktes unter Berücksichtigung der formellen Stöchiometrie ( Tabelle 2 ) von Superoxid/Reaktionsprodukt für den jeweiligen Farbstoff errechnet:

Gleichung 10

( n - Anzahl der Superoxidmoleküle, die zur Bildung eines Moleküls des Reaktionsproduktes notwendig sind).

Weiter wird die nach Gleichung 10 berechnete nachgewiesene O2-.-Bildungsrate auch als die O2-.-


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Wiederfindungsrate bezeichnet.

Wird die im Modellsystem (Xanthin/Xanthinoxidase) produzierte O2-.- Bildungsrate variiert, so sollte sich die nachgewiesene O2-.-Bildungsrate (O2-.-Wiederfindungsrate) ebenfalls dementsprechend ändern. Die Abhängigkeit der nachgewiesenen von der produzierten Superoxidbildungsrate wird in diesem Kapitel für jeden Farbstoff aufgenommen.

Folgende Reaktionssysteme wurden hinsichtlich ihrer O2-.-Detektionseigenschaften untersucht:

3.4.1 Reduktion von Cytochrom c.

Cytochrom c ist ein Hämprotein und kommt in Organismus als Bestandteil der mitochondrialen Elektrontransportkette vor. Das dreiwertige Häm-Eisen ( Abb. 1 ) kann

univalent reduziert werden, wobei im Spektrum eine Absorptionsbande bei 550nm entsteht ( Abb. 2 ). Als Reduktant des Cytochrom c kann auch das Superoxidradikal auftreten.

Ferricytochrom c wird durch Superoxidradikale zum Ferrocytochrom c reduziert:

Fe3+ -Cyt.c +O2-. rarr Fe2+ -Cyt.c + O2

Reaktion 13

Abb. 1. Häm-Gruppe des Cytochrom c.

Die experimentell bestimmte Geschwindigkeitskonstante der Reaktion 13 wird bei physiologischen pH-Werten im Bereich zwischen 2.6 105 M-1 s-1 und 8 105 M-1 s-1 angegeben [20]. Die gute Wasserlöslichkeit, ein hoher Extinktionskoeffizient (epsilon550nm = 21mM-1 cm-1 [71]) sowie die große Reaktionsgeschwindigkeit, mit der Cytochrom c durch Superoxidradikale reduziert wird, haben zu seiner weitverbreiteten Anwendung für den Superoxidnachweis an verschiedenen biologischen Systemen geführt, zu denen vor allem stimulierte Zellen [42,62,82,149] sowie isolierte Enzyme [50,55,62,80] zählen.

Die Bildung des reduzierten Cytochrom c wurde bei der Wellenlänge 550nm verfolgt, wenn Fe3+ -Cyt.c mit dem O2-.-produzierenden Modellsystem (Xanthin/Xanthinoxidase) inkubiert wurde.

Der Nachweis der Superoxidradikale erfolgte bei verschiedenen Superoxid-Bildungsraten, die zuvor in Kontrollexperimenten (d.h. ohne Zusatz von Farbstoff) aus der Harnsäurebildung spektrophotometrisch bestimmt wurden (s. Kapitel 0 , Gleichung 3 ).

Bei Berechnung der nachgewiesenen Superoxidbildungsrate aus der Bildungsrate des Reaktionsproduktes (reduzierten Cytochrom c) wurden sie gleich gesetzt, da die Reaktionstöchiometrie 1:1 ist (n=1 in Gleichung 10 ).

Die Ergebnisse dieser Untersuchungen sind in Abb. 3 dargestellt. Die Abhängigkeit der O2-.-


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Wiederfindungsrate von der produzierten O2-.-Bildungsrate (im Xanthin/Xanthinoxidase System) konnte mit hoher Genauigkeit (r=0.99) linear approximiert werden, wobei sich ein Steigungskoeffizient von 0.365 ergab ( Abb. 3 ).

Um die Beteiligung der Superoxidradikale an der Reduktion von Cytochrom c klarzustellen, wurde der Einfluß von SOD auf diese Reaktion untersucht (s. Kapitel 0 ). Hierfür wurde die O2-.- Bildung in Anwesenheit von Cytochrom c gestartet, die Bildungsrate des reduzierten Cytochrom c ca. 2min. lang gemessen und SOD zugegeben. Die Bildungsrate des reduzierten Cytochrom c wurde nach der SOD-Zugabe erneut gemessen und die Ergebnisse in der prozentualen Hemmung im Bezug auf die Reduktionsrate vor der SOD-Zugabe dargestellt ( Abb. 4 ).

Da die Reduktion von Cytochrom c im Xanthin/Xanthinoxidase System bis zu 98% SOD-hemmbar war ( Abb. 4 ), kann sie hauptsächlich auf die Reaktion mit Superoxidradikalen zurückgeführt werden. Der über die Cytochrom-c-Methode nachgewiesene Anteil der Superoxidradikale von 0.365 muß somit auf 0.365x0.98=0.358 korrigiert werden.

Abb. 2. Spektren des oxidierten und reduzierten Cytochrom c.

Acetyliertes Cytochrom c, das zum O2-.-Nachweis an den Cytochrom-Oxidoreduktasen enthaltenden biologischen Systemen eingesetzt wird [11,62,93], wurde ebenfalls im Xanthin/Xanthinoxidase Modellsystem getestet. Die experimentellen Bedingungen für den O2-.-Nachweis waren wie in der Legende zu Abb. 3 angegeben. Die Konzentration des acetylierten Cytochrom c betrug ebenfalls 50µM. Mit diesem Farbstoff ergibt sich der nachgewiesene Anteil von 0.321+0.022 ( Tabelle 3 ). Der Unterschied zwischen diesem Wert und dem des nicht-derivatisierten Cytochrom c ist nicht signifikant.

Tabelle 3. Nachweis der Superoxidbildung im Xanthin/Xanthinoxidase System mit acetyliertem Cytochrom c.

Produzierte O2-.-Bildungsrate, µM/min

Nachgewiesene O2-.-Bildungsrate, µM/min

Nachgewiesener Anteil

(MW+SD)

2.22+0.11 (n=4)

0.714+0.051 (n=7)

0.321+0.022

Die Reduktion des acetylierten Cytochrom c, die unter identischen Bedingungen wie die des nicht-derivatisierten Cytochrom c untersucht wurde, war vollkommen mit SOD hemmbar ( Abb. 5 ).

Die unerwartet niedrige Wiederfindungsrate könnte die Folge von störenden Nebenreaktionen zwischen Cytochrom c und anderen Komponenten im System sein. So konnte beispielsweise die nachfolgende Oxidation des reduzierten Cytochrom c durch Xanthinoxidase, durch Superoxidradikale, durch Wasserstoffperoxid oder durch Harnsäure hierbei eine Rolle spielen.


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Abb. 3. Detektion der Superoxidradikale mit Cytochrom c im Xanthin/Xanthinoxidase System. Die Reaktion wurde in 100mM Phosphatpuffer, pH=7.4, in Anwesenheit des Eisenchelators DTPA (1mM) und 200U/ml Katalase bei T=37°C durchgeführt. Die Konzentration des Cytochrom c war 50µM und die O2-.-Bildung wurde durch Zugabe von 100µM Xanthin gestartet.

Die Reaktionen zwischen reduziertem Cytochrom c und Harnsäure sowie Wasserstoffperoxid sind thermodynamisch möglich. So betragen die Standard-Reduktionspotentiale +590mV für die Harnsäure, +320mV für Wasserstoffperoxid und -260mV für die Oxidation des Ferrocytochrom c [33]. Daraus errechnet sich ein DeltaE=(590-260)mV=330mV für die Reaktion zwischen der Harnsäure und reduziertem Cytochrom c, bzw. DeltaE=(320-260)mV=60mV für die Reaktion mit H2O2.

Um zu überprüfen, ob diese Nebenreaktionen unter physiologisch relevanten Bedingungen tatsächlich ablaufen, wurde das durch Dithionit reduzierte Cytochrom c mit Xanthinoxidase, Wasserstoffperoxid oder mit Harnsäure inkubiert und die möglichen Veränderungen der optischen Dichte bei 550nm verfolgt. Keine Abnahme der optischen Dichte bei 550 nm, die für eine Oxidation des reduzierten Cytochrom c charakteristisch ist, wurde in Anwesenheit dieser Komponenten beobachtet.

Zusammengenommen weisen diese Ergebnisse darauf hin, daß die vermutete Oxidation des reduzierten Cytochrom c durch andere Komponenten des Systems nicht stattfindet.


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Abb. 4. SOD-Hemmung der Reduktion von Cytochrom c im Xanthin/Xanthinoxidase System. Das Reaktionsgemisch bestand aus: 1ml 100mM Phosphatpuffer, pH=7.4, 1mMDTPA, 200U/ml Katalase, 50µM Cytochrom c. Die aus Harnsäurebildung errechnete Superoxidbildungsrate betrug 16.5µM/min. Die angegebene SOD-Menge wurde in 5µl H2O zugesetzt.

Abb. 5. SOD-Hemmung der Reduktion von acetyliertem Cytochrom c im Xanthin/Xanthinoxidase System. Das Reaktiongemisch bestand aus: 100mM Phosphatpuffer, pH=7.4, 1mM DTPA, 50µM acetyliertes Cytochrom c, 200U/ml Katalase. Die aus Harnsäurebildung errechnete Superoxidbildungsrate betrug 2.22µM/min.

Die experimentellen Befunde sprechen dafür, daß die Superoxidradikale hauptsächlich über eine Reaktion mit Cytochrom c und nicht über spontane Dismutation eliminiert werden. Wäre dies anders, dann sollten die höheren Konzentrationen des Cytochrom c mit der Spontandismutation effizienter konkurrieren und so die Reduktionsgeschwindigkeit des Cytochrom c vergrößern. Die Abb. 6 zeigt aber, daß es zu keiner Erhöhung der Reduktionsrate kommt, wenn größere Konzentrationen des Cytochrom c eingesetzt werden. Es ist daher davon auszugehen, daß die Reduktionsgeschwindigkeit des Cytochrom c den O2-.-Nachweis unter diesen Bedingungen nicht limitiert.

Eine zusätzliche Information, ob der geringe nachgewiesene Anteil von O2-.-Radikalen in diesem


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System auf die spontane Dismutation zurückzuführen ist, kann die mathematische Modellrechnung geben. Gemäß Gleichung 9 beträgt der nicht detektierbare Anteil von dismutierten Superoxidradikalen alphacong0.001<<1, wenn die Superoxidbildungsrate mit v=106 M s-1 angenommen wurde, die Konzentration von Cytochrom c N=100µM war und die Reaktionskonstante k8=2.6.105 M-1s-1 beträgt.

Eine Reaktion des Cytochrom c mit Superoxidradikalen, in welcher ein Elektron nicht auf das Häm-Eisen sondern auf die Aminosäuren des Proteinteils übertragen und daher über die Messungen der optischen Dichte bei 550nm nicht erfaßt wird, wäre noch eine weitere denkbare Ursache, die zu einer verminderten Wiederfindungsrate beiträgt.

Ob diese Reaktion tatsächlich einen Einfluß auf den Superoxidnachweis hat, wurde über den Einfluß des reduzierten Cytochrom c auf einen anderen spektrophotometrischen Superoxidnachweis überprüft. Hierbei wurde die durch Superoxid vermittelte Reduktion von Nitroblau Tetrazolium (NBT) zum farbigen Produkt Formazan (lambda=560nm) (s. Kapitel 0 ), in An- und Abwesenheit von reduzierten Cytochrom c untersucht. Die vorhergehende Reduktion des Häm-Eisens des Cytochrom durch Dithionit war erforderlich, um die schon bekannte Reaktion zwischen Superoxidradikalen und Häm-Eisen auszuschließen.

Abb. 6. Abhängigkeit der Bildungsrate des reduzierten Cytochrom c von seiner Konzentration im Xanthin/Xanthinoxidase System. Reaktion erfolgte in 100mM Phosphatpuffer, pH=7.4, mit 1mM DTPA und Katalase (200U/ml). Die aus Harnsäurebildung errechnete Superoxidbildungsrate betrug 11.36µM/min.

Nitroblau Tetrazolium reagiert mit Superoxidradikalen ca.10mal langsamer als Cytochrom c, so daß das NBT-System mögliche Konkurrenzreaktionen durch die verminderte Formazanbildung anzeigen sollte, während die Cytochrom c -Reduktion weniger beeinflußt wäre. Unter der Annahme, daß Superoxidradikale mit dem Proteinanteil des Cytochrom c reagierten, wäre eine Abnahme der Formazanbildungsrate in Anwesenheit des reduzierten Cytochrom feststellbar. Die in Tabelle 4 zusammengefaßten experimentellen Daten zeigen aber, daß die Reaktion zwischen den Superoxidradikalen und dem Proteinanteil des Cytochrom vernachlässigbar gering ist, da die Reduktionsrate von NBT durch Zugabe des reduzierten Cytochrom c nicht beeinflußt wird.

Tabelle 4. Die Reaktivität des Proteinteils von Cytochrom c mit Superoxidradikalen.

Reduktionsrate von NBT im X/XOD System, µM/min

ohne red. Cyt.c.

+50µM red. Cyt.c

7,64+0,14 (n=3)

7,22+0,30 (n=3)


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Bei der Untersuchung der Effizienz des quantitativen O2-.-Nachweises mit der Cytochrom c -Methode in dem Modellsystem (Xanthin/Xanthinoxidase) hat sich ein nachgewiesener Anteil von 0.357 ergeben. Wurde acetyliertes Cytochrom c als Reaktionspartner für den O2-.-Nachweis eingesetzt, dann ergab dies keine Veränderung der O2-.-Wiederfindungsrate. Da keine von den oben untersuchten Nebenreaktionen die beobachtete Diskrepanz von 1-0.357=0.643 zwischen der errechneten und der nachgewiesenen Superoxidbildungsrate erklären kann, muß sie als eine Eigenschaft des enzymatischen Modellsystems betrachtet werden.

3.4.2 Reduktion von Nitroblau Tetrazolium (NBT).

Nitroblau Tetrazolium (NBT) ist ein gelb gefärbter wasserlöslicher Farbstoff, der zu den Tetrazolium Salzen gehört. Nachdem Beauchamp und Fridovich Nitroblau Tetrazolium zur Bestimmung der SOD-Aktivität verwendet haben [18], versuchten mehrere Forscher das NBT auch für den Superoxidnachweis an verschiedenen biologischen Systemen anzuwenden.

NBT reagiert mit Superoxid, wobei Formazane, dunkelblaue Reaktionsprodukte entstehen. Zwei O2-.- Moleküle sind für die Bildung eines Moleküls Monoformazan erforderlich, der Mechanismus dieser Reaktion ist jedoch komplex ( Abb. 7 ).

NBT liegt bei physiologischen pH-Werten als Dikation NBT2+ vor. NBT2+ wird durch Superoxid zum NBT+.-Radikal reduziert ( Reaktion 14 ), wobei die Geschwindigkeitskonstante (5.88+0.12).104 M-1 s-1 beträgt[21]. Letzteres reagiert über Disproportionierung, wobei Monoformazan und NBT2+ gebildet werden ( Reaktion 15 ).

NBT2+ + O2-. rarr NBT+. +O2 , k=(5.88+0.12).104 M-1 s-1

Reaktion 14

NBT+. + NBT + rarr MF+ + NBT2+ , kobs =1.5.109 M-1 s-1

Reaktion 15

Das dunkelblaue Reaktionsprodukt Monoformazan (MF+ ) hat bei 530nm ein Absorptionsmaximum (epsilon530nm = 17 mM-1 cm-1 [21]). Die weitere Reduktion des Monoformazans führt zur Bildung von Diformazan, das ein Absorptionmaximum bei 560nm hat:

MF+ + O2-. rarr MF+. + O2

Reaktion 16

MF+. + MF+. rarr DF + MF+

Reaktion 17

Im Unterschied zum O2-.-Radikal, reagiert das Perhydroxylradikal HO2., die konjugierte Säure von O2-., kaum mit NBT2+ [21]. Da der pKa Wert für O2-./HO2. bei 4.8 liegt, läuft die Nachweisreaktion problemlos im physiologischen pH-Bereich ab.


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Abb. 7. Reduktion von Nitroblau Tetrazolium zu Formazan und Diformazan. NBT2+ -Nitroblau Tetrazolium; NBT+. - Tetrazolinyl Radikal; MF+ -Monoformazan; DF - Diformazan (aus [21]).

Da Formazan schwer wasserlöslich ist und leicht ausfällt, kann NBT prinzipiell nur für den Nachweis niedriger O2-.- Bildungsraten verwendet werden (bis zu 6µM/min in den hier dargestellten Experimenten). Auf einen Zusatz von Gelatine, welches ausfallendes Formazan in der Lösung suspendiert, wurde wegen der möglichen zusätzlichen Verunreinigungen und Wechselwirkungen mit dem Superoxid- Bildungs- und Nachweis- System in den im folgenden beschriebenen Experimenten


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verzichtet.

Abb. 8. Detektion der Superoxidradikale im Xanthin-Xanthin-Oxidase System mit Nitroblau Tetrazolium. Reaktion ist in 100mM Phosphat-Puffer, pH=7.4, in Anwesenheit des Eisenchelators DTPA (1mM) und Katalase bei T=37°C durchgeführt. Die Konzentration des NBT war 100µM und die O2-.-Bildung wurde durch Zugabe von 100 µM Xanthin gestartet.

Um die Effizienz des Superoxidnachweises mit diesem Farbstoff zu bestimmen, wurde - in Analogie zum Cytochrom c - die Abhängigkeit der nachgewiesenen O2-.-Bildungsrate von der produzierten O2-.-Bildungsrate untersucht. Die letztere wurde aus der Harnsäurebildungsrate errechnet. Für die formelle Umrechnung der nachgewiesenen Superoxidbildungsrate aus der Formazanbildung wurde der Koeffizient n in Gleichung 10 n=2 gesetzt, da die Reaktionsstöchiometrie Superoxid/(Mono)Formazan 2:1 ist.

Die in Abb. 8 dargestellten Ergebnisse dieser Untersuchung zeigen, daß die O2-.-Wiederfindungsrate mit NBT als Nachweissubstanz eine lineare Abhängigkeit von der Superoxidbildungsrate aufweist. Der aus der linearen Approximierung errechnete Steigungskoeffizient betrug 1.009, d.h. daß die nachgewiesene O2-.-Bildungsrate mit der produzierten O2-.-Bildungsrate quantitativ identisch ist, wenn NBT für den Superoxidnachweis eingesetzt wird.

Ob die Reduktion von NBT ausschließlich durch Superoxidradikale erfolgt (qualitative Selektivität), wurde aus dem Einfluß der SOD auf die Bildungsrate des Reaktionsproduktes (Formazan) abgeleitet (Kapitel 0 ). Um dies zu untersuchen, wurde die O2-.-Bildung in Anwesenheit von NBT im Modellsystem gestartet, die Bildungsrate des Reaktionsproduktes ca. 2min lang verfolgt und SOD zugegeben. Die resultierende Abnahme der Formazanbildungsrate wurde in Prozenten der ungehemmten Bildungsrate des Reaktionsproduktes berechnet.

Bei dieser Überprüfung der qualitativen Selektivität der Methode wurde festgestellt, daß nur maximal 80% der NBT-Reduktion mit SOD hemmbar waren ( Abb. 9 ). Aus dem Grund muß der nachgewiesene Anteil von 1.009 mit einem Faktor von 0.8 multipliziert werden (1.009x0.8=0.81), damit nur die gegen SOD sensitive Komponente der Bildung des Reaktionsproduktes berücksichtigt wird. Somit beziffert sich der mit NBT nachgewiesene korrigierte Anteil von Superoxidradikalen auf 0.81.


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Abb. 9. SOD-Hemmung der Formazan-Bildung im Xanthin/Xanthinoxidase System. Das Reaktionsgemisch bestand aus: 100mM Phosphatpuffer, pH=7.4, 1mM DTPA, 100µM NBT, 200U/ml Katalase. Die produzierte Superoxidbildungsrate betrug 3.61µM/min.

Um herauszufinden, ob der durch SOD nicht zu hemmende Anteil der NBT-Reduktion auf eine Reaktion mit anderen Komponenten des O2-.-Bildungssystem zurückzuführen ist, wurde NBT einzeln mit Harnsäure, Xanthin und H2O2 inkubiert. Keine von diesen einzelnen Verbindungen konnte NBT direkt reduzieren, was jedoch die Möglichkeit einer direkten Elektronenübertragung von Xanthin durch Xanthinoxidase auf NBT offen läßt [18].

Der Anteil spontan dismutierter O2-.-Radikale läßt sich nach Gleichung 9 abschätzen. Für die O2-.-Bildungsgeschwindigkeit von v=10-6 M s-1 und für die eingesetzte Farbstoffkonzentration von N=100µM beträgt der errechnete Anteil alpha spontan dismutierter Superoxidradikale( Gleichung 9 ) weniger als 0.01 und kann demzufolge keinen wesentlichen Beitrag zur Verminderung der nachweisbaren O2-.-Bildungsrate leisten.

Die Berechnungen des nachgewiesenen Anteils der Superoxidradikale wurden unter der Annahme durchgeführt, daß hauptsächlich Monoformazan als 2-Elektronen-Reduktionsprodukt beim O2-.-Nachweis im Xanthin/Xanthinoxidase System gebildet wird. Die Möglichkeit einer 4-Elektronen-Reduktion von NBT, die in einer Diformazanbildung resultiert ( Abb. 7 ), ist theoretisch nicht ausgeschlossen. Die Spektren von Monoformazan und Diformazan überlappen sich [37], so daß das letztere, wenn es gebildet wird, ebenfalls zu der bei 540nm registrierten optischen Dichte beitragen kann.

Für die Untersuchung der im Xanthin/Xanthinoxidase System entstandenen Reduktionsprodukte von NBT wurde die Dünnschichtchromatographie eingesetzt. Die Superoxidbildung wurde in Anwesenheit von NBT gestartet, die Proben für die chromatographische Analyse mit einem Zeitabstand von 2min abgenommen und auf die chromatographische Platte aufgetragen. Nach der Trennung wurden drei Flecke mit den folgenden Rf-Werten erhalten: Rf1=0.01; Rf2=0.43; Rf3=0.65. Die Analyse der Spektren ergab, daß es sich bei dem Fleck 2 (Rf2=0.43) um nicht-reduziertes gelb gefärbtes NBT handelt, während Fleck 1 und Fleck 3 zu den zwei verschiedenen blau gefärbten Reduktionsprodukten gehören, welche dem Diformazan bzw. dem Monoformazan zugeschrieben werden können. Dabei ist zu bemerken, daß die Flecken der beiden Reduktionsprodukte in allen zu verschiedenen Zeitpunkten entnommenen Proben zu sehen waren, d.h. daß die beiden Reaktionsprodukte, Mono- und Diformazan, gleichzeitig bei der Reduktion von NBT im Modellsystem gebildet werden.

Der mit der NBT-Methode im Modellsystem wiedergefundene Anteil der O2-.-Radikale beziffert sich auf 0.81, wenn nur die SOD-sensitive Komponente der NBT-Reduktion berücksichtigt und Monoformazan als hauptsächliches Reaktionsprodukt angenommen wird. Da aber das zur Absorption beitragende Diformazan neben dem Monoformazan gebildet wird, ist eine genaue Quantifizierung der


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Superoxidbildung nur über die Veränderung der optischen Dichte bei einer Wellenlänge nicht möglich.


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3.4.3 Oxidation von Epinephrin.

Epinephrin (Adrenalin, Abb. 10 ) gehört zu den Cathecholaminen und ist ein Hormon mit vielseitigen regulatorischen Funktionen. Im Unterschied zu NBT und Cytochrom c, die durch O2-.-Radikale reduziert werden, wird Epinephrin durch Superoxid oxidiert [92].

Die Oxidation von Epinephrin (Adrenalin) durch O2-.-Radikale führt zur Bildung des Adrenochroms ( Abb. 10 , Absorptionmaximum bei 480 nm) und des Wasserstoffperoxides. Die Reaktion läuft nach einem komplexen Mechanismus ab. Der erste Schritt der Oxidation von Adrenalin zum Adrenalin-Semichinon (SQ) ist die limitierende Stufe der Adrenochrombildung [25].

Adrenalin + O2-. rarr Adrenalin-SQ + H2O2,

Reaktion 18

Für die Reaktion 18 ist die Geschwindigkeitskonstante mit k=5.6.104 M-1 s-1, pH=7.8, in der Literatur angegeben [25].

Bei der Abgabe von insgesamt 4 Elektronen durch Epinephrin wird ein gefärbtes Oxidationsprodukt, das Adrenochrom, gebildet:

Adrenalin rarr Adrenalin-Semichinon rarr Adrenalin-Chinon - rarr (Zyklisierung) - rarr Leukoadrenochrom rarr Leukoadrenochrom-Semichinon rarr Adrenochrom.

Der genaue Oxidationsmechanismus des Epinephrins zum Adrenochrom hängt vom pH-Wert des Systems ab. Das Absorptionsmaximum des Adrenochroms liegt bei 480nm und der Extinktionskoeffizient ist mit epsilon480nm=2.86 mM-1 cm-1 (pH=7.4) relativ niedrig.

Die in dem Modellsystem (Xanthin/Xanthinoxidase) vorhandene Katalase hat bei dieser Nachweismethode noch eine zusätzliche Funktion. Sie verhindert eine Verlangsamung der limitierenden Reaktion 18 , indem sie das Reaktionsprodukt H2O2 umsetzt ( Reaktion 4 ).

Abb. 10. Chemische Struktur von Epinephrin und Adrenochrom.

Wird die Superoxidradikalbildung durch das Xanthin/Xanthinoxidase System in Anwesenheit von Epinephrin gestartet, kann die Adrenochrombildung spektrophotometrisch registriert werden. Vor dem Beginn der O2-.-Bildung, die durch Zugabe von Xanthin erfolgte, wurde keine Autoxidation von Adrenalin zu Adrenochrom in dem System beobachtet. Wie beim O2-.-Nachweis mit den anderen Farbstoffen, wurde die produzierte Superoxidbildungsrate (aus der Harnsäurebildungsrate nach Gleichung 10 errechnet) variiert und die Adrenochrombildungsrate gemessen.

Für die Umrechnung der nachgewiesenen O2-.-Bildungsrate aus der Adrenochrombildungsrate wurde die Reaktionsstöchiometrie mit einbezogen. Da ein Adrenalinmolekül für die Bildung eines Adrenochrommoleküls 4 Elektronen abgeben muß, wurden 4 Superoxidmoleküle als Elektronenakzeptoren angenommen. Unter dieser Zugrundelegung ergibt sich eine 4:1 Superoxid : Adrenochrom - Reaktionsstöchiometrie und die nachgewiesene O2-.-Bildungsrate wurde mit dem Faktor 4 aus der Adrenochrombildung ermittelt (n=4 in Gleichung 10 ).


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Abb. 11. Detektion der Superoxidradikale im Xanthin/Xanthinoxidase System mit Epinephrin. Die Reaktion wurde in 100mM Phosphat-Puffer, pH=7.4, in Anwesenheit von 1mM DTPA und Katalase bei 37°C durchgeführt. Die Konzentration des Epinephrins betrug 1mM. Die O2-.-Bildung wurde durch Zugabe von 100 µM Xanthin gestartet.

Abb. 12. Abhängigkeit der Adrenochrom-Bildungsrate von der Konzentration des Adrenalins beim Nachweis der Superoxidbildung im Xanthin/Xanthinoxidase System. Die Reaktion wurde in 100mM Phosphatpuffer, pH=7.4, 1mM DTPA, 200U/ml Katalase durchgefürt. Die produzierte Superoxidbildungsrate betrug 15.85µM/min.

Die Ergebnisse dieser Untersuchung sind in Abb. 11 dargestellt. Beim quantitativen Nachweis der Superoxidbildung im X/XOD-System lag der mit Epinephrin nachgewiesene Anteil der Superoxidradikale bei 0.569. Dies wurde aus dem Steigungskoeffizienten der linearen Approximierung der Abhängigkeit nachgewiesener von produzierter O2-.-Bildungsrate bestimmt ( Abb. 11 ).

Die in den oben beschriebenen Experimenten eingesetzte Konzentration des Adrenalins von 1mM war ausreichend, um mit O2-.-Radikalen effizient zu reagieren. Dies folgt aus den Experimenten, wenn die Konzentration des Adrenalin zwischen 0.5 und 4 mM bei einer konstanten Superoxidbildungsrate variiert wurde. Wie Abb. 12 zeigt, wurde keinen Anstieg der Adrenochrombildungsrate mit Erhöhung


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der Adrenalinkonzentration festgestellt.

Die Adrenochrombildung war vollkommen mit SOD zu hemmen ( Abb. 13 ), was auf die Beteiligung der Superoxidradikale in dieser Reaktion hinweist.

Die Anwendung der Adrenalin-Methode ist wegen des geringen Extinktionskoeffizienten des gebildeten Adrenochroms nur sinnvoll, wenn Superoxidbildungsraten größer als 5µM min-1 erwartet werden, da die Änderungen der optischen Dichte sonst nur schlecht quantifizierbar sind (wenn die Bestimmung in einer 1cm-Standardküvette erfolgt).

Der Anteil der spontan dismutierten und deswegen nicht erfaßten O2-.-Radikale muß ebenfalls berücksichtigt werden. Wie nach Gleichung 9 berechnet, eliminieren die Superoxidradikale mindestens 200 mal schneller über die Reaktion mit Epinephrin als über die Spontandismutation, wenn die Konzentration des Epinephrins 1mM beträgt und die O2-.-Radikale mit der Geschwindigkeit v von 10-6 M s-1 produziert werden (alpha<<1).

Somit wurde mit der Epinephrin-Methode ein Anteil von 0.569 der im Modellsystem produzierten Superoxidbildungsrate nachgewiesen. Der Kettenreaktionsmechanismus der Adrenochrombildung muß jedoch bei der Interpretation dieses Wertes in Betracht gezogen werden.

Abb. 13. Hemmung der Adrenochrom-Bildung mit SOD im Xanthin/Xanthinoxidase System; Reaktionsbedingungen wie bei der Abb. 14 angegeben. Die produzierte Superoxidbildungsrate betrug 11.36µM/min.


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3.5 Chemilumineszenz - Methoden zum O2-.-Nachweis im Xanthin/Xanthinoxidase-System.

Die Anwendung von Chemilumineszenz-Methoden zum Radikalnachweis ist weit verbreitet. Das Meßprinzip nutzt die Tatsache, daß bei chemischen Reaktionen bestimmter Verbindungen mit Radikalen angeregte Reaktionsprodukte, meist im Triplettzustand, gebildet werden. Bei Dissipation der angeregten Reaktionsprodukte in den Grundzustand wird ein Teil der Energie in Form von Lichtquanten abgegeben, die mit photoempfindlichen Elementen (z.B. Photomultiplier) meßbar ist. Moderne Photomultiplier besitzen eine hohe Empfindlichkeit und ermöglichen damit einen sehr sensitiven Nachweis der Chemilumineszenz.

Abb. 14 Chemilumineszenz-Kinetik von Luminol (A) und Lucigenin (B) im Xanthin/Xanthinoxidase System. Die Reaktion wurde in 100mM Phosphatpuffer (4ml) mit 1mM DTPA, pH=7.4, in Anwesenheit von 200U/ml Katalase bei T=37°C durchgeführt. Die O2-.-Bildung wurde durch Zugabe von 100 µM Xanthin gestartet, wie mit den Pfeilen gekennzeichnet. Die Konzentration des Luminols sowie die des Lucigenins betrug 50 µM.

A

B

Luminol und Lucigenin werden häufig für den O2-.-Nachweis mittels Chemilumineszenz an komplexen biologischen Systemen eingesetzt [4,5,85]. Der genauere der Chemilumineszenz zugrunde liegende Reaktionsmechanismus weist für beide Indikatoren komplexe chemische Abläufe auf. Im Falle des Lucigenins ist als erster Schritt eine univalente Reduktion erforderlich, um den komplexen Reaktionsmechanismus, der zur Chemilumineszenz führt, auszulösen [5]. Hingegen erfordert die durch Luminol verursachte Chemilumineszenz zunächst eine univalente Oxidation zum Luminol-Radikal, der eine univalente Reduktion folgen muß [88]. In diesem Fall muß das Radikal sowohl die univalente Oxidation als auch die nachfolgende Reduktion vermitteln können, um die Chemilumineszenz auszulösen.

In diesem Teil der Arbeit wurde die durch Luminol und Lucigenin vermittelte Chemilumineszenz hinsichtlich der quantitativen und qualitativen O2-.-Bestimmung untersucht. Die Reaktion der enzymatischen Oxidation des Xanthins durch Xanthinoxidase diente wiederum als Superoxidbildungsquelle, wobei die produzierte O2-.-Bildungsrate über die Harnsäurebildung kontrolliert wurde (Kapitel 3.1, Gleichung 8).

Wurde die Superoxidbildung im Modellsystem (Xanthin/Xanthinoxidase) in Anwesenheit des Luminols oder des Lucigenins gestartet, so wurde eine die O2-.-Bildung begleitende Chemilumineszenz registriert ( Abb. 14 ). Die Chemilumineszenzkinetik des Luminols unterscheidet sich deutlich von der des Lucigenins. Im Fall des Luminols steigt die Intensität der Chemilumineszenz sofort mit der Bildung der O2-.-Radikale an, nach Erreichen eines Maximums fällt sie trotz weiter anhaltender O2-.-Bildung jedoch innerhalb weniger Minuten ab ( Abb. 14 , A). Hingegen verbleibt die Intensität der Chemilumineszenz im Falle des Lucigenins nach Erreichen eines Maximums auf einem stationären Niveau ( Abb. 14 , B).

Da die in Chemilumineszenz-Reaktionen entstehenden angeregten Moleküle kurzlebig sind, ist die


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Akkumulation eines Reaktionsproduktes - wie beim Nachweis über die photometrischen Methoden - nicht möglich. Deshalb wird von einer Chemilumineszenz-Methode erwartet, daß die Intensität der Lichtemission unter stationären Bedingungen der Bildungsrate nachweisbarer Radikale direkt proportional ist (Kapitel 4.3, Gleichung 23). So würde man im Xanthin/Xanthinoxidase System mit konstanter O2-.-Bildungsrate eine Chemilumineszenz konstanter Intensität erwarten. Im Falle des Lucigenins ist diese Erwartung erfüllt, während die Chemilumineszenzkinetik des Luminols auf nachfolgende Reaktionsschritte oder auf unerwünschte Wechselwirkungen hinweist, die eine quantitative Bestimmung der O2-.-Bildungsrate mit der Luminol-Methode erschweren können.

Die genauere Analytik der Chemilumineszenzkinetik des Luminols und des Lucigenins hinsichtlich ihrer Aussage für die quantitative sowie qualitative Beurteilung des O2-.-Nachweises in dem Modellsystem (Xanthin/Xanthinoxidase) hat zu folgenden Resultaten geführt.

3.5.2 Untersuchungen zur Chemilumineszenz des Luminols.

Die Reaktion des Luminols, welche von Chemilumineszenz begleitet wird, ist eine Oxidation. Das angeregte Reaktionsprodukt Aminophthalat ist für die Chemilumineszenz verantwortlich. Abgesehen von dem genauen Mechanismus des Chemilumineszenz-Prozesses, das eine Ein-Elektronen-Oxidation sowie eine Ein-Elektronen -Reduktion erfordert, kann die Gesamtreaktion wie folgt geschrieben werden:

Reaktion 19

Die Chemilumineszenz des Luminols wurde bei Superoxidbildung im Xanthin/Xanthinoxidase System registriert. Ihre abnehmende Intensität widerspricht jedoch der konstanten O2-.-Bildungsrate, von der eine Chemilumineszenz ebenfalls konstanter Intensität erwartet wird. Nachdem keine Veränderungen der charakteristischen pulsartigen Form der Chemilumineszenzkinetik des Luminols bei unterschiedlichen O2-.-Bildungsraten festgestellt wurde, wurden die Ursachen dieser Kinetik analysiert.

Zunächst wurde überprüft, ob die beobachtete Chemilumineszenz O2-.-abhängig ist.

Dies läßt sich aus der Wirkung von SOD (Kapitel 3.2) auf die Chemilumineszenz-Intensität ableiten. In den angegebenen Konzentrationen ( Abb. 15 ) wurde SOD zum Reaktionsgemisch mit Luminol zugegeben und anschließend die Superoxidbildung durch die Zugabe von Xanthin gestartet. Wie Abb. 15 zeigt, vermag SOD in der Konzentration von 20µg/ml die Chemilumineszenz des Luminols zum größten Teil zu hemmen, was auf die Beteiligung von Superoxidradikalen an der Chemilumineszenz hinweist.

Nach positiver Beantwortung der Frage nach der O2-.-Abhängigkeit der Luminol-Chemilumineszenz, wurden die ihre Kinetik beeinflussenden Faktoren untersucht.

Eine mögliche Erklärung für die registrierte Kinetik wäre, daß die zugesetzte Menge an Luminol nicht ausreichend für den Nachweis der produzierten O2-.-Bildungsrate ist und schon innerhalb der ersten Minuten verbraucht wird. Daß das nicht der Fall ist, zeigt die Abb. 17 . Man sieht, daß die Zugabe von Luminol zum Reaktionsgemisch nach Abklingen der Chemilumineszenz keine weitere Erhöhung der Chemilumineszenz-Intensität hervorruft. Die Zugabe von weiteren 100µM Xanthin brachte ebenso keinen Effekt. Daraus kann geschlossen werden, daß die beobachtete Kinetik der Chemilumineszenz nicht durch den Luminol- oder Xanthinverbrauch bedingt ist.


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Abb. 15. SOD-Hemmbarkeit der Luminol-Chemilumineszenz im Xanthin/Xanthinoxidase System. Die Reaktionsbedingungen entsprechen den in Abb. 14 . SOD wurde in der angezeigten Konzentrationen vor Beginn der Superoxidbildung zugegeben.

Abb. 16. Einfluß von Luminol auf die Aktivität der Xanthinoxidase, die über die Reduktion von Cytochrom c gemessen wurde. (Probenzusammensetzung: 100mM Phosphatpuffer, pH=7.4, 1mM DTPA, 100µM Xanthin, XOD, 100µM Cytochrom c, 100µM Luminol. Die Reduktion des Cytochrom c wurde über die Absorption bei 550nm verfolgt.)

Eine andere Begründung der pulsartigen Kinetik der Chemilumineszenz wäre, daß Luminol oder seine Oxidationsprodukte in eine Wechselwirkung mit dem O2-.-Bildungssystem treten, indem sie die Aktivität der Xanthinoxidase hemmen.

Angenommen, die Intensität der Luminol-Chemilumineszenz widerspiegelt die Bildungsrate der O2-.-Radikale im Xanthin/Xanthinoxidase System. In diesem Fall sollte nach 3min. Reaktionszeit nur noch ca.15% von der Anfangsaktivität der Xanthinoxidase (im Sinne der O2-.-Bildung) nachweisbar sein, da die Intensität der Chemilumineszenz nach 3min Superoxidbildung nur noch 15% vom anfänglichen Intensitätsmaximum beträgt ( Abb. 14 B). Wenn Luminol für die beobachtete Hemmung verantwortlich wäre, dann wäre die Superoxidbildung durch Xanthinoxidase nach 3min zu 85% gehemmt.


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Um zu überprüfen, ob Luminol tatsächlich die Aktivität der Xanthinoxidase erheblich beeinflußt, wurde ein Versuch unternommen, ihre Aktivität spektrophotometrisch über die Harnsäurebildung in An- und Abwesenheit von Luminol zu bestimmen.

Abb. 17. Chemilumineszenz-Intensität im X/XOD-System bei Zugabe von Luminol. (Probenzusammensetzung: 100mM Phosphatpuffer, 1mM DTPA, 200U/ml Katalase, 100µM Xanthin, 50µM Luminol, Xanthinoxidase. Es wurden jeweils 50µM Luminol zugegeben)

Wurden die Messungen bei dem für Harnsäure charakteristischen Absorptionsmaximum bei 290nm durchgeführt, konnte eine langsamere Zunahme der optischen Dichte bei dieser Wellenlänge in Anwesenheit von Luminol festgestellt werden. Die genauere Analyse der Spektren jedoch ergab, daß diese Verlangsamung nicht wegen einer verminderten Harnsäurebildung (durch gehemmte Xanthinoxidase) zustande kommt. Das Spektrum des Luminols überlagert sich im UV-Bereich mit dem Spektrum der Harnsäure, so daß die Oxidation des Luminols und die damit verbundenen Veränderungen seines Spektrums zu einer Verminderung des Anstieges der optischen Dichte bei 290 nm führen und somit eine Abnahme der Harnsäurebildungsrate vortäuschen.

Da eine direkte spektrophotometrische Messung der Xanthinoxidase-Aktivität über die Harnsäurebildung in Anwesenheit des Luminols nicht möglich war, wurde sein Einfluß auf die Superoxidbildung im Xanthin/Xanthinoxidase System indirekt über die Reduktion von Cytochrom c untersucht. Würde Luminol die Xanthinoxidase hemmen, dann wären die Superoxidradikale in einer geringeren Rate produziert worden, was über eine verminderte Reduktionsrate des Cytochrom c in Anwesenheit des Luminols nachweisbar wäre.

Wie man aber aus Abb. 16 sieht, hat Luminol in der für die Chemilumineszenz-Messungen verwendeten Konzentration nur eine geringe hemmende Wirkung auf die Reduktionsrate des Cytochrom c im Xanthin/Xanthinoxidase System. Diese kann auf eine Konkurrenzreaktion zwischen Cytochrom c und Luminol um die Superoxidradikale zurückgeführt werden, was als Begründung für die Abnahme der Chemilumineszenz-Intensität von 85% jedoch nicht ausreichend ist.

Abb. 18. X/XOD-Reaktion unter Zugabe von Luminol zu verschiedenen Zeitpunkten. (Probenzusammensetzung: 100mM Phosphatpuffer, pH=7.4, 1mM DTPA, 200U/ml Katalase. 100µM Xanthin, Xanthinoxidase sowie 50µM Luminol wurden in der Reihenfolge wie mit den Pfeilen markiert zugegeben.)

Einen zusätzlichen Beweis, daß Xanthinoxidase durch Luminol nicht gehemmt wird, liefern die kinetischen Untersuchungen. Wird die Oxidation des Xanthins durch Xanthinoxidase zunächst in Abwesenheit des Luminols ermöglicht und Luminol erst später zugegeben, dann beobachtet man die


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Fortsetzung jener Kinetik, die beim Zusatz des Luminols vor Beginn der Reaktion abgelaufen ist ( Abb. 18 ). Somit erweist sich die beobachtete Kinetik der Chemilumineszenz als eine Eigenschaft des Modellsystems selbst, die sich unabhängig von der Anwesenheit des Luminols im Laufe der enzymatischen Reaktion entwickelt.

Die Wechselwirkungen mit dem Modellsystems könnten in der Auslöschung der Chemilumineszenz durch eine Reaktion zwischen Luminol bzw. seinen intermediären Oxidationsprodukten und der Harnsäure bestehen, welche im X/XOD-System als Oxidationsprodukt von Xanthin parallel zu Superoxid gebildet wird (Kapitel 3.1).

Um zu überprüfen, ob die Harnsäure tatsächlich die Intensität der Luminol-Chemilumineszenz beeinflußt, wurde sie vor Beginn der Superoxidbildung zum Modellsystem zugegeben. Die Konzentration der Harnsäure wurde so gewählt, daß diese der nach 5 Minuten durch Xanthin/Xanthinoxidase gebildeten Harnsäure entsprach.

Wie Abb. 19 zeigt, ist die Luminol-Chemilumineszenz tatsächlich durch die Harnsäure bis zu dem Niveau gehemmt worden, welches nach 5 Minuten Reaktionszeit im Xanthin/Xanthinoxidase System beobachtet wurde. Die Abnahme der Chemilumineszenz-Intensität, die bei Zugabe der Harnsäure beobachtet wurde, konnte jedoch nicht durch den Zusatz des Enzyms Uricase, welche Harnsäure oxidiert ( Gleichung 11 ), verhindert werden ( Abb. 19 ).

Urat + 2H2O + O2 rarr Allantoin + H2O2 + CO2

Gleichung 11

Ebenso konnte Uricase - unabhängig davon, ob sie vor oder während der Reaktion zugegeben wurde, die abrupte Abnahme der Lichtintensität im Xanthin/Xanthinoxidase System nicht beeinflussen.

Die mangelnde Beseitigung des beobachteten Hemmeffektes der Harnsäure auf die Chemilumineszenz des Luminols durch Uricase kann durch eine Wechselwirkung des Enzyms mit dem Xanthin/Xanthinoxidase System bedingt sein. Xanthin, das im Reaktionsgemisch vorhanden ist, kann Uricase nach einem Konkurrenzmechanismus hemmen und seine Konzentration von 100µM ist ausreichend, um die Aktivität dieses Enzyms erheblich zu reduzieren, da die Inhibitorkonstante der Uricase mit Xanthin 23µM beträgt [1].

Somit wurde die im Xanthin/Xanthinoxidase System gebildete Harnsäure als verantwortlich für die Löschung der Chemilumineszenz des Luminols betrachtet. Welche Eigenschaften der Harnsäure den beobachteten Effekt bedingen, wird weiter in diesem Kapitel untersucht.


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Abb. 19. Einfluß der Harnsäure auf die Chemilumineszenz des Luminols im Xanthin/Xanthinoxidase System. Die Bedingungen für die Kontrolle sind wie in Abb. 14 angegeben. 12.5µM Harnsäure wurde vor dem Beginn der Superoxidbildung zu dem Reaktionsgemisch zugegeben. Die Konzentration von Uricase betrug 2mU/ml.

Da die Harnsäure mit Superoxidradikalen äußerst langsam reagiert , kann hier der Hemmeffekt durch eine Desaktivierung von O2-.-Radikalen nicht erklärt werden. Die Komplexierung von Übergangsmetallen, vor allem von Eisen, sowie das Abfangen von Hydroxylradikalen sind hingegen die allgemein akzeptierten Mechanismen der antioxidativen Wirkung von Harnsäure. Da die Bildung von Hydroxylradikalen in einem O2-.-produzierenden System ebenfalls durch Übergangsmetalle katalysiert wird (Reaktion 12), entsteht die Frage, ob die hemmende Wirkung der Harnsäure auf die Luminol-Chemilumineszenz aus ihrer Eigenschaft, Übergangsmetalle zu komplexieren, resultiert.

Obwohl freies Eisen im Modellsystem durch DTPA (1mM) komplexiert ist, bleibt ein Teil des Eisens als Folge des dynamischen Gleichgewichtes zwischen komplexierter und freier Form ungebunden. Die bei der Oxidation des Xanthins gebildete Harnsäure kann zur Komplexierung des ungebundenen Eisens beitragen und dadurch die Konzentration der freien Form weiter senken. Wenn die hemmende Wirkung der Harnsäure auf die Intensität der Chemilumineszenz durch eine Verminderung der Konzentration ungebundener Übergangsmetalle geschieht, dann sollten auch die anderen Vorgänge, die diese Verminderung beinhalten, dieselbe Auswirkung auf die Chemilumineszenz haben.

Die Hauptquelle möglicher Eisenverunreinigungen in unserem Modellsystem sind die in den Puffern eingesetzten Phosphatsalze. Mit der Senkung der Puffermolarität sinkt auch die Konzentration möglicher Verunreinigungen an Übergangsmetallen. Bei der gleichen Konzentration von DTPA wird dadurch das Verhältnis DTPA/Fe erhöht, so daß der Anteil von ungebundenem Eisen geringer wird, was nach der oben entwickelten Hypothese eine Luminol-Chemilumineszenz geringerer Intensität zur Folge haben muß.

Abb. 20. Hemmung der Luminol-Chemilumineszenz im Xanthin/Xanthinoxidase System in Anwesenheit von 1mM DTPA im 10mM PBS. 50µM Luminol, 100µM Xanthin und Xanthinoxidase wurden in der Reihenfolge wie mit den Pfeilen gekennzeichnet zugegeben.

Ob die Konzentration des ungebundenen Eisens tatsächlich einen Einfluß auf die Chemilumineszenz des Luminols im Xanthin/Xanthinoxidase System hat, wurde in den folgenden Experimenten überprüft. Um einen stabilen pH-Wert zu gewährleisten, wurden die bisher beschriebenen Chemilumineszenz-Messungen mit Luminol in 100mM Phosphatpuffer mit 1mM DTPA durchgeführt. Die Chemilumineszenz des Luminols konnte in diesem Puffer unabhängig davon registriert werden, ob DTPA in der Probe vorhanden war oder nicht.


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Um die Konzentration des freien Eisens zu senken, wurde die Puffermolarität von 100mM auf 10mM Phosphat (PBS) reduziert, die Konzentration von DTPA (1mM) sowie der pH-Wert (pH=7.4) blieben hierbei unverändert. Wie in Abb. 20 deutlich wird, konnte die Chemilumineszenz des Luminols im 10mM Phosphatpuffer (PBS) durch Anwesenheit von 1mM DTPA gehemmt werden. Dies bestätigt die Hypothese der Beteiligung von ungebundenen Übergangsmetallen in sehr geringen Konzentrationen an der Entwicklung der Chemilumineszenz des Luminols.

Die Untersuchungen zur Chemilumineszenz des Luminols im Modellsystem (Xanthin/Xanthinoxidase) ergaben, daß obwohl diese mit SOD hemmbar ist, sie nicht ausschließlich durch die Bildungsrate der Superoxidradikale bestimmt ist. Die Chemilumineszenz wird durch Spurenkonzentrationen von Übergangsmetallen wesentlich beeinflußt, so daß ein quantitativer Nachweis von Superoxidradikalen mit dieser Methode unmöglich erscheint.

3.5.3 Chemilumineszenz des Lucigenins.

Lucigenin, bis-N-Methylacridiniumnitrat, wird als eine O2-.-spezifische Lumineszenzprobe angesehen. Die Reaktion des Lucigenins, die durch Chemilumineszenz begleitet wird, ist eine reduktive Oxygenierung ( Reaktion 20 ). Außer einem Sauerstoffmolekül werden noch zwei Elektronen für die Bildung des lumineszierenden Produktes N-Methylacridon benötigt, so daß die Gesamtreaktion wie folgt geschrieben werden kann [5]:

Reaktion 20

Wurde die O2-.-Bildung im Xanthin/Xanthinoxidase System in Anwesenheit von Lucigenin in Gang gesetzt, dann konnte eine Chemilumineszenz registriert werden. Eine typische Chemilumineszenzkinetik ist in Abb. 22 dargestellt.


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Abb. 21. Hemmung der Lucigenin-Chemilumineszenz mittels SOD im Xanthin/Xanthinoxidase System. Die Reaktionsbedingungen sind wie in Abb. 14 (B) angegeben. Die erzeugte O2-.-Bildungsrate betrug 3.5µM/min. Die Hemmung wurde im Bezug auf die Chemilumineszenz-Amplitude vor der SOD-Zugabe berechnet.

Um den Beitrag von Superoxidradikalen zur Chemilumineszenz des Lucigenins zu klären, wurde die Löschung mittels SOD untersucht (Kapitel 3.2).

Wie in Abb. 22 dargestellt, nimmt die Intensität der Chemilumineszenz nach Zugabe von SOD drastisch ab. Kurz nach der Zugabe von SOD wird ein neues stationäres Niveau der Chemilumineszenz erreicht, das für die Berechnung der Hemmung durch unterschiedliche Konzentrationen von SOD diente. Die Amplitude der Chemilumineszenz nach Zugabe von SOD wurde bei einer konstanten Superoxid-Bildungsrate in Abhängigkeit von der SOD-Konzentration untersucht.

Abb. 22. Einfluß von SOD auf die Lucigenin-Chemilumineszenz im Xanthin/Xanthinoxidase System. Die Reaktionsbedingungen sind wie in Abb. 14 (B) angegeben. Die Reaktion wurde durch die Zugabe von Xanthin gestartet. Die SOD in der Konzentration von 1µg/ml wurde zu dem mit Pfeil angezeigten Zeitpunkt zugegeben.

Die Ergebnisse dieser Untersuchung sind in


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Bezug auf die Amplitude ungehemmter Chemilumineszenz berechnet. Wie aus Abb. 21 ersichtlich, strebt die SOD-Hemmung der Lucigenin-Chemilumineszenz asymptotisch auf den 100%-Wert zu, was auf die Beteiligung von Superoxidradikalen in dieser Chemilumineszenz-Reaktion hinweist.

Für die weiteren Untersuchungen sollte die optimale Konzentration des Lucigenins ermittelt werden, welche die maximale Intensität gewährleistet. Hierfür wurde die Superoxidbildungsrate konstant gehalten, die Konzentration des Lucigenins variiert und die Chemilumineszenz gemessen.

Die Veränderung der Konzentration von Lucigenin zwischen 1 und 200µM bei einer konstanten Superoxidbildungsrate hatte keinen Einfluß auf die Kinetik der registrierten Chemilumineszenzkurve, die Amplitude des stationären Niveaus wies jedoch eine glockenförmige Abhängigkeit von der Konzentration des Lucigenins auf ( Abb. 23 ).

Bei niedrigeren Konzentrationen des Lucigenins (unter 50µM) nimmt die Intensität der Chemilumineszenz mit der Erhöhung der Konzentration zu. Ab 100µM Lucigenin tritt jedoch eine Hemmung der Chemilumineszenz auf, die durch Reabsorption des emittierten Lichtes erklärt werden kann, da die Lösung bei der Konzentration des Lucigenins ab 100µM intensiv gelb gefärbt ist. Daher wurde die Konzentration des Lucigenins im Bereich zwischen 50 und 100µM als optimal für die Chemilumineszenz-Messungen gefunden.

Nach der Feststellung der Wirksamkeit von SOD sowie der optimalen Konzentration des Lucigenins für den Superoxidnachweis wurde die Abhängigkeit der Chemilumineszenz-Intensität von der Superoxidbildungsrate untersucht. Die produzierte O2-.-Bildungsrate wurde spektrophotometrisch über die Harnsäurebildung unter den gleichen Bedingungen, aber ohne Lucigenin, bestimmt (Kapitel 3.1, Gleichung 3).

Wie in Abb. 24 dargestellt, weist die Chemilumineszenz-Intensität in dem untersuchten Bereich eine Abhängigkeit von der O2-.-Bildungsrate auf, die mit guter Genauigkeit linear approximiert werden konnte (r=0.98). Die Approximation geht nicht durch den Nullpunkt. Der Schnittpunkt mit der Ordinate gibt das Grundrauschen des Photomultipliers an.

Abb. 23. Intensität der Chemilumineszenz in Abhängigkeit von der Konzentration des Lucigenins im Xanthin/Xanthinoxidase Modellsystem. Die erzeugte Superoxidbildungsrate betrug 2.5µM/min.


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Abb. 24. Die Chemilumineszenz-Intensität in Abhängigkeit von der Superoxidbildungsrate mit Lucigenin als Nachweissubstanz im X/XOD-System. Die Konzentration des Lucigenins betrug 50µM. Die erzeugte Superoxidbildungsrate wurde über die Harnsäurebildung bestimmt.

Interessanterweise konnte die Amplitude der Lucigenin-Chemilumineszenz im Xanthin/Xanthinoxidase System auch durch eine Zugabe von Albumin (Endkonzentrationen 0.25 und 0.5 mg/ml) um 58% bzw. 86% erhöht werden (bei einer Superoxidbildungsrate von 5.7µM/min). Der Zusatz von Albumin hatte keinen Einfluß auf die Hemmbarkeit der Chemilumineszenz durch SOD, was auf die immer noch bestehende Superoxidabhängigkeit der zur Chemilumineszenz führenden Reaktion hinweist. Die beobachtete Erhöhung der Intensität konnte nicht durch eine Zunahme der Aktivität der Xanthinoxidase zurückgeführt werden, wenn diese über die Reduktion von Cytochrom c kontrolliert wurde. Daher scheint Albumin die Quantenausbeute der Chemilumineszenzreaktion zu beeinflussen, indem es Lucigenin bindet und dadurch die strahlungslose Dissipation von Energie reduziert. Da Albumin bei der Untersuchung biologischer Objekte häufig als ein Bestandteil des Puffers vorhanden ist, kann es leicht zu verfälschten quantitativen Aussagen über die Superoxidbildungsrate kommen.

Die Analyse der Chemilumineszenz des Lucigenins im Xanthin/Xanthinoxidase Modellsystem ergab, daß die Intensität der Chemilumineszenz unter bestimmten Bedingungen als Maß der O2-.-Bildungsrate dienen kann. Eine erhöhte Intensität muß jedoch nicht unbedingt eine höhere Superoxidbildungsrate anzeigen, vor allem dann nicht, wenn die Quantenausbeute der Chemilumineszenz des Lucigenins durch andere Faktoren, wie oben diskutiert, beeinflußt wird.


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3.6 ESR-Spintrapping zum Nachweis der O2-.-Radikale.

Elektronenspinresonanz ist eine Methode zum Nachweis paramagnetischer Spezies (Meßprinzip s. Kapitel 2.2). Da das Superoxidradikal ein ungepaartes Elektron besitzt, läßt sich das Signal des paramagnetischen Superoxides mit Hilfe der ESR-Methode unter bestimmten Bedingungen direkt nachweisen. Dies erfordert jedoch Bedingungen, unter denen die O2-.-Radikale stabilisiert sind. Eine Stabilisierung ist beispielsweise durch eine Kombination des alkalischen pH-Wertes mit der Phasenstabilisierung bei Tieftemperaturen (77 K) möglich [51], da hierdurch die Disproportionierung von Superoxidradikalen zurückgedrängt wird. Praktisch sind diese Voraussetzungen in biologischen Systemen schwer zu verwirklichen, so daß ein direkter paramagnetischer Nachweis der O2-.-Radikale nur begrenzt möglich ist.

Mit der Anwendung von Spintraps, d.h. Verbindungen, die mit Radikalen unter Bildung von mit ESR nachweisbaren Addukten reagieren, ist es hingegen möglich, auch bei Raumtemperatur den Nachweis der Existenz von O2-.-Radikalen zu führen [35,49]. Durch Bildung eines Superoxid-Adduktes mit einem geeigneten O2-.-Radikalfänger wie DMPO wurde die O2-.-Produktion an biologischen Objekten nachgewiesen [145,152]. Von Nachteil ist meist die geringe Stabilität des gebildeten Adduktes sowie eine niedrige Geschwindigkeitskonstante der Reaktion zwischen dem Spintrap und Superoxidradikal. Dies erfordert den Einsatz hoher Konzentrationen des Spintraps, was in biologischen Systemen zu unerwünschten toxischen Wirkungen führen kann [145].

Abb. 25. Chemische Struktur von DMPO und von DEPMPO.

Zwei Spintrapps, das am häufigten eingesetztes DMPO und sein neues Derivat, DEPMPO, werden in diesem Kapitel hinsichtlich ihrer Möglichkeiten des quantitativen und qualitativen O2-.-Nachweises in dem Modellsystem Xanthin/Xanthinoxidase untersucht.

3.6.2 DMPO.

5,5-Dimethylpyrrolin-N-oxid (DMPO, Abb. 25 ) ist ein Spintrap, der mit Superoxid - sowie mit Hydroxyl - Radikalen reagiert ( Reaktion 21 bzw. Reaktion 22 ):

DMPO + HO2. rarr DMPO-HO2. ; k=10 M-1 s-1 [46]

Reaktion 21

DMPO + .OH rarr DMPO-OH; k=3.4.109.M-1 s-1 [46]

Reaktion 22

Der 1-Oktanol/Wasser-Verteilungskoeffizient von DMPO beträgt 0.093 [120], so daß in biologischen Systemen DMPO hauptsächlich in polarer Umgebung (wäßrige Phase) konzentriert ist. Die niedrige Geschwindigkeitskonstante des Spintrap mit O2-.-Radikalen bei physiologisch relevantem pH=7.4 (k=10 M-1 s-1, [46] ) erfordert den Einsatz von hohen DMPO-Konzentrationen, wenn die konkurrierende Dismutationsreaktion vernachlässigbar werden soll.

Die gebildeten DMPO-OH bzw. DMPO-OOH Addukte lassen sich über ihre charakteristischen ESR-Spektren identifizieren. Die Halbwertszeit des DMPO-OOH Adduktes beträgt ca.50 s (pH=7.4, 25°C), wobei das Produkt entweder weiter mit O2-.-Radikalen reagiert (Reaktion 23) [32] oder zum DMPO-OH


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-Addukt zerfällt (Reaktion 24) [46,47]:

DMPO-OOH + O2-. rarr Diamagnetische Produkte; kobsap5.106 M-1 s-1

Reaktion 23

DMPO-OOH rarr DMPO-OH + ½ O2

Reaktion 24

Das gebildete DMPO-OH-Addukt kann ebenfalls durch eine Reaktion mit O2-.-Radikalen in diamagnetische Produkte umgewandelt werden [123].

Für den Nachweis der über das Xanthin/Xanthinoxidase System gebildeten Superoxidradikale ist eine DMPO-Konzentration von mindestens 50mM erforderlich, um die Spontandismutation vernachlässigen zu können, wie es sich aus Gleichung 9 errechnen läßt (alpha<<1). Aus diesem Grund wurden alle ESR-Messungen beim Einsatz von DMPO-Konzentration ge50mM durchgeführt.

Abb. 26. ESR-Signal von DMPO im Xanthin/Xanthinoxidase System. A- 50mM DMPO, 100µM Xanthin, Xanthinoxidase; B - wie A, aber mit 10µg/ml SOD. Die Messungen erfolgten bei den folgenden Einstellungen des ESR-Spektrometers: Leistung - 2mW, Scanbreite - 60G, Verstärkungsfaktor - 105, Modulationsamplitude - 0.7G, Zeitkonstante - 0.164s, Scangeschwindigkeit - 42.91G/min, Resonatortyp - TM4103. Linien des DMPO-OH-Adduktes sind mit * markiert.

Wurde die Superoxidbildung in Anwesenheit von DMPO in Gang gesetzt, dann wurde ein charakteristisches ESR-Signal beobachtet.


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Abb. 27. ESR-Spektrum des DMPO-OH-Adduktes, das nach der SOD-Zugabe zum im Xanthin/Xanthinoxidase System gebildeten DMPO-OOH-Addukt erhalten wurde. Die Einstellungen von ESR-Spektrometer waren wie in Abb. 26 angegeben.

In Abb. 26 A ist das ESR-Spektrum dargestellt, das in Anwesenheit des Radikalfängers DMPO erhalten wurde, wenn Xanthin/Xanthinoxidase als O2-.-Generierungssystem eingesetzt wurde. Die im System produzierte O2-.-Bildungsrate wurde aus der Harnsäurebildungsrate errechnet (Kapitel 3.1, Gleichung 3).

Die Analyse des Spektrums ergab, daß es sich um ein Mischspektrum aus DMPO-OOH und DMPO-OH-Addukten handelt ( Abb. 26 A).

Wenn das O2-.-dismutierende Enzym SOD vor dem Beginn der Superoxidbildung unter den identischen Bedingungen wie für das Spektrum A ( Abb. 26 ) zu der Reaktionsmischung zugegeben wurde, konnten keine ESR-Signale registriert werden ( Abb. 26 B). Dies kann als Beweis dafür gelten, daß die zuvor erhaltenen Signale des DMPO-OOH sowie des DMPO-OH -Adduktes durch O2-.-Radikale bedingt waren.

Der Effekt von SOD-Zugabe auf die Mischung der im Laufe der Reaktion gebildeten Addukte wurde ebenfalls untersucht. Dies war für einen Vergleich der Stabilität des DMPO-OOH -Adduktes unter den experimentellen Reaktionsbedingungen mit den publizierten Daten notwendig. Wenn SOD während der Reaktion zugegeben wurde, sollte sie die weitere Bildung des DMPO-OOH-Adduktes im Xanthin/Xanthinoxidase System verhindern, so daß die Zerfallskinetik des Adduktes aufgenommen werden kann.

Hierzu wurde das DMPO-OOH -Addukt im Xanthin/Xanthinoxidase System in den sicher detektierbaren Mengen produziert. Nach Aufnahme der ESR-Spektren wurde die Reaktionsmischung aus der Meßzelle herausgenommen, SOD in der Konzentration 10µg/ml zugesetzt und die Probe erneut der ESR-Messung zugeführt. Das Signal, das auf diese Weise erhalten wurde ( Abb. 27 ), hatte die Charakteristik eines DMPO-OH-Adduktes, ohne daß die Absorptionslinien des Superoxid-Adduktes detektierbar waren. Da die für die SOD-Zugabe notwendige Zeit 2min betrug, wird die Halbwertszeit des Superoxid-Adduktes in unserem Modellsystem mit le1min eingeschätzt.

Das am Computer simulierte Spektrum des nach der SOD-Zugabe erhaltenen Adduktes ist in guter Übereinstimmung mit dem experimentellen Signal, wenn folgende Parameter gewählt werden: aN=15.01G, aH=14.78G, Linienbreite 1.20G. Die Simulation erfolgte wie in Kapitel 2.2 angegeben. Das DMPO-OH- Signal mit den gleichen Aufspaltungskonstanten wurde in dem experimentellen Puffer erhalten, wenn DMPO in Kontakt mit einem Hydroxylradikale generierenden System (Fenton-System) gebracht wurde.

Das nach der Zugabe von SOD gebildete DMPO-OH-Addukt blieb innerhalb der Meßzeit (20min.) stabil. Das im Modellsystem vorhandene DMPO-OH-Addukt ist mit Beteiligung der O2-.-Radikale gebildet worden, da SOD die Bildung von beiden Addukten verhindern konnte.


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Abb. 28. ESR-Signal von DEPMPO im Xanthin/Xanthinoxidase System. A - 100mM Xanthin, PBS (pH=7.4), 1mM DTPA, XOD, 6.25mM DEPMPO; B - wie A, aber vor dem Reaktionsbeginn 10µg/ml SOD zugesetzt. Die Einstellungen des ESR-Spektrometers waren: Leistung - 2mW, Scanbreite - 115G, Verstärkungsfaktor - 105, Modulationsamplitude - 1G, Zeitkonstante - 0.164s, Scangeschwindigkeit - 82.25G/min, Resonatortyp - TM4103.

Die kinetischen Untersuchungen der DMPO-OOH-Adduktbildung ergaben, daß das O2-.-bezogene ESR-Signal mit dem Start der O2-.-Bildung durch das Xanthin/Xanthinoxidase entsteht und auf einem stationären Niveau bleibt, während die Superoxidradikale mit einer konstanten Geschwindigkeit weiter produziert werden. Größeren Superoxidbildungsraten entsprachen jeweils höhere (Anfangs)Amplituden der Signale. Eine quantitative Auswertung von ESR-Signalen wurde wegen der Überlagerung von ESR-Spektren der Hydroxyl- und Superoxid-Addukte erschwert.

Ein Vorteil der Spintrapping-Methode mit DMPO für den Nachweis von O2-.-Radikalen besteht darin, daß ein DMPO-OOH-Addukt mit charakteristischem ESR-Spektrum gebildet wird, welches sich deutlich von den anderen DMPO-Addukten unterscheidet. Da aber das DMPO-Superoxid-Addukt in das DMPO-Hydroxyl- Addukt zerfällt, ist es schwer zu beurteilen, ob das zu untersuchende System selbst Hydroxylradikale bildet oder ob das Hydroxyladdukt nur als Zerfallsprodukt des Superoxidadduktes anzusehen ist. Eine Akkumulation des DMPO-OOH-Adduktes ist wegen der kurzen Halbwertszeit bei physiologisch relevanten Superoxidbildungsraten nicht zu erwarten. Kinetische Aspekte, die im Kapitel 4.4 diskutiert werden, tragen ebenso zu den Problemen des quantitativen Nachweises bei.

3.6.3 Phosphoryliertes DMPO (DEPMPO).

Zahlreiche Versuche wurden unternommen, durch Derivatisierung von DMPO seine Anwendbarkeit zum O2-.-Nachweis zu verbessern. Die Positionen 2-, 3-, 4- und 5- wurden durch verschiedene funktionale Gruppen substituiert. Derivate wie 2-phenyl-5,5-dimethyl-1-pyrrolin-N-oxid, 3-methyl- , 4-hydroxymethyl-DMPO sowie 5-methyl-5-phenylpyrrolin-1-oxid [124] sind in der Literatur beschrieben worden.

Dem Ziel, O2-.-Radikale quantitativ nachzuweisen, kommen phosphorylierte DMPO-Derivate deutlich näher. So hat phosphoryliertes DMPO, 5-(Diethoxyphosphryl)-5-methyl-1pyrrolin-N-oxid, ( Abb. 25 ) eine Geschwindigkeitskonstante der Adduktbildung mit O2-.-Radikalen von gleicher Größenordnung wie DMPO, die Stabilität des entsprechenden Adduktes ist allerdings ca.15mal größer [49]. Der 1-


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Oktanol/Wasser-Verteilungskoeffizient für DEPMPO ist mit 0.06 [49] dem des DMPO sehr ähnlich und bedingt somit den Radikalnachweis hauptsächlich in wässeriger Phase.

Wurde die Oxidation des Xanthins durch Xanthinoxidase in Anwesenheit des phosphorylierten DMPO (DEPMPO) durchgeführt, dann konnte man das in Abb. 28 A dargestellte ESR-Signal beobachten. Das Signal war vollkommen mit SOD hemmbar ( Abb. 28 B) und stimmte mit den publizierten ESR-Spektren des DEPMPO-OOH Adduktes überein [49].

Da das DEPMPO-OOH-Addukt eine höhere Stabilität im Vergleich zum DMPO-OOH-Addukt aufweist, läßt sich das ESR-Signal auch bei einer ca.10-fach geringeren DEPMPO-Konzentration erfassen (50mM DMPO gegen 6.25mM DEPMPO im Test).

Abb. 29. ESR-Spektrum des DEPMPO-OH-Adduktes im Fenton-System. DEPMPO-OH-Addukt wurde durch Zugabe von 100µM Fe2+ zu 200µM Lösung von H2O2 in PBS mit 2.5mM DEPMPO. Die Einstellungen des ESR-Spektrometers waren wie in Abb. 28 angegeben.

In Analogie zum DMPO wurde auch mit DEPMPO neben dem Superoxid-Addukt die Bildung eines Hydroxyl-Adduktes im Xanthin/Xanthinoxidase System nicht ausgeschlossen. Das Vergleichsspektrum des letzteren wurde nach der Inkubation von DEPMPO mit Fenton-Reagenzien aufgenommen ( Abb. 29 ). Das Spektrum des DEPMPO-OH-Adduktes unterscheidet sich deutlich von dem des DEPMPO-OOH, was eine Differenzierung zwischen beiden Sauerstoffspezies mit diesem neuen Spintrap ermöglicht.

Wie aus Abb. 28 ersichtlich, wurde keine signifikante Menge an DEPMPO-OH-Addukt beim DEPMPO-Spintrapping im Xanthin/Xanthinoxidase System registriert.

Das ESR-Signal des DEPMPO-OH-Adduktes läßt sich über ein Computerprogramm simulieren (Kapitel 2.2), wenn die folgenden Parameter berücksichtigt werden: Aufspaltungskonstanten aH=13.34G, aN=14.02G, aP=47.15G; Linienbreite 1.2G.

Die Stabilität des gebildeten DEPMPO-OOH-Adduktes in dem Modellsystem wurde wie folgt untersucht. Die Superoxidbildung wurde über das Xanthin/Xanthinoxidase System unter Zugabe von DEPMPO gestartet. Nachdem eine sicher detektierbare Menge des Adduktes gebildet war, wurde das Reaktionsgemisch aus der ESR-Meßzelle herausgenommen und SOD in der Konzentration 10µg/ml zugesetzt, um die weitere Bildung des DEPMPO-OOH- Adduktes zu blockieren. Anschließend wurde das Reaktionsgemisch zurück in die Meßzelle gegeben und die Zerfallskinetik des Adduktes aufgenommen ( Abb. 30 ).

Nach Zugabe von SOD nimmt die Signalintensität des DEPMPO-OOH-Adduktes ab, ohne daß es dabei zur Bildung von detektierbaren Mengen anderer paramagnetischer Produkte kommt. Für die Bestimmung der Halbwertszeit des DEPMPO-OOH-Adduktes wurde das Magnetfeld auf ein Maximum des mittleren Duplets (mit dem Pfeil auf der Abb. 28 markiert) eingestellt und die Amplitude des Signals verfolgt ( Abb. 30 ).

Wird die Zerfallskinetik einfach exponentiell als Reaktion pseudo-erster Ordnung approximiert, so


47

ergibt sich für die Halbwertszeit des DEPMPO-OOH-Adduktes tau ein Wert von 1280+355s. Dieser liegt im Bereich publizierter Werte der Halbwertszeit von DEPMPO-OOH-Addukt in anderen wäßrigen Systemen [49,122].

Im Unterschied zu dem Superoxid-Addukt des DMPO zerfällt das DEPMPO-OOH-Addukt viel langsamer und bildet dabei diamagnetische, mit ESR nicht nachweisbare Produkte.

Die Kinetik der DEPMPO-OOH-Adduktbildung wurde bei verschiedenen Superoxidbildungsraten im Xanthin/Xanthinoxidase System untersucht. Die Harnsäurebildung als Maß der Superoxidbildung wurde über die Absorption bei 290nm für jede Konzentration der Xanthinoxidase spektrophotometrisch kontrolliert (Kapitel 3.1).

Abb. 30. Stabilität des DEPMPO-OOH-Adduktes im X/XOD-System (PBS, pH=7.4, 1mM DTPA, T=20°C). Details siehe im Text. Die Einstellungen des ESR-Spektrometers waren wie in Abb. 28 angegeben.

Die ESR-Spektren wurden im Intervall von 2 min. aufgenommen. Bei der Auswertung diente die Amplitude des mittleren Duplets als Maß der Adduktbildung. Die Ergebnisse dieser Messungen sind in Abb. 31 dargestellt. Aus diesen Daten wird ersichtlich, daß bei höheren Superoxidbildungsraten (die obere Graphik auf Abb. 31 ) die Intensität der ESR-Amplitude solange monoton ansteigt, wie die Superoxidbildung andauert. Das Ende der Harnsäurebildung nach ca.1100 sek ist durch den Verbrauch von Xanthin bedingt. Die etwas längere Zeit der DEPMPO-OOH-Adduktbildung kann auf die sich entwickelten anaeroben Bedingungen in der ESR-Meßzelle zurückzuführen sein. Es kann zu der beobachteten Verlangsamung der Superoxidbildung kommen, wenn die Konzentration des im Puffer gelösten Sauerstoffes im Laufe der Reaktion auf einen so niedrigen Wert absinkt, daß Sauerstoff nicht mehr im Überschuß vorhanden ist und die Reaktionsgeschwindigkeit limitiert ist. Die O2-Diffusion kann den Verbrauch wegen der geringen Kontaktoberfläche mit der Luft nicht ausreichend kompensieren. Abgesehen von diesem Effekt ist die Bildung des DEPMPO-OOH-Adduktes - vor allem am Anfang der Reaktion - der Superoxidbildungsrate proportional.


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Abb. 31. Kinetiken der Bildung des DEPMPO-OOH-Adduktes im X/XOD-System bei verschiedenen Superoxidbildungsraten. Details siehe im Text. Die Enstellungen des ESR-Spektrometers waren wie in Abb. 28 angegeben.

Versucht man mit dieser Methode niedrigere Superoxidbildungsraten nachzuweisen, bekommt man ein anderes kinetisches Bild (die untere Graphik auf Abb. 31 ). Die niedrigere Konzentration der Xanthinoxidase bedingt eine langsamere Superoxidbildungsrate, so daß Xanthin innerhalb der beobachteten Reaktionszeit nicht verbraucht wird. Die Zunahme der Amplitude des Signals vom DEPMPO-OOH-Addukt wurde auch in diesem Fall registriert. Die Bildungsrate des Superoxid-Adduktes war hier entsprechend niedriger.

Die Eigenschaften des Superoxidnachweises mit dem neuen Spintrap DEPMPO können somit wie folgt zusammengefaßt werden. Qualitativ erfolgt der Nachweis der O2-.-Bildung über ein ensprechendes Addukt mit charakteristischem ESR-Spektrum. Das Addukt weist eine höhere Stabilität als das DMPO-OOH-Addukt auf und zerfällt in diamagnetische Produkte. Das ESR-Spektrum des DEPMPO-Hydroxyl-Adduktes ist von dem des Superoxid-Adduktes verschieden. Dadurch wird eine genauere Identifizierung der Sauerstoff-Spezies ermöglicht.

So haben die Experimente mit DEPMPO deutlich demonstriert, daß in der als Modellsystem gewählten Reaktion des Xanthins mit Xanthinoxidase unter den erarbeiteten experimentellen Bedingungen keine Hydroxylradikale gebildet werden. Dies ist auch für die Analyse der mit den anderen


49

Nachweismethoden erhaltenen Ergebnissen erforderlich.

Beim quantitativen Nachweis der O2-.-Bildungsraten ergab sich eine Proportionalität mit der Addukt-Bildungsrate. Die Möglichkeit genauer quantitativer Aussagen über die O2-. -Bildungsraten über Spintrapping mit DEPMPO wird in Kapitel 4.4 analysiert.

3.7 Anwendbarkeit der O2-.-Detektionsmethoden zum Nachweis von O2-.-Radikale in komplexen biologischen Systemen.

Das Auftreten freier Radikale in biologischen Systemen ist seit Jahrzehnten bekannt, besondere Aufmerksamkeit gilt dabei den aktivierten Sauerstoffspezies. Mit dem Fortschritt der wissenschaftlichen Erkenntnis wurde ihre Beteiligung an den wichtigsten regulatorischen und metabolischen Prozessen lebender Organismen entdeckt. Die Beispiele für solche Prozesse sind Proliferation und Apoptosis von Zellen [125,134,135], Regulation des vaskulären Tonus und der Aggregation von Thrombozyten [98] sowie die Phagozytose [3,6,12].

Ebenso können aktivierte Sauerstoffspezies bei verschiedensten pathologischen Prozessen als Initiatoren sowie als Schrittmacher in Erscheinung treten. Hier sind die epidemiologisch am häufigsten auftretenden Prozesse wie Carzinogenese [16,45,140,141,151], Arteriosklerose [107,127] und Autoimmunerkrankungen [59,89] zu erwähnen.

Die initialle Bildung des Superoxidradikals durch eine univalente Reduktion des Sauerstoffs kann eine Reaktionskette im biologischen System in Gang setzen, die zur Bildung anderer Sauerstoffmetaboliten wie Wasserstoffperoxid, Hydroxyl-, Alkoxy- und Peroxylradikale sowie Singulettsauerstoff führt [100]. Daher ist der Nachweis von Superoxidradikal als Initiator dieser Reaktionskette von besonderer Interesse.

Als potentielle biologische Quellen der Bildung von Superoxidradikalen in vivo gelten vor allem die elektronen-übertragenden Enzyme. Diese sind in den zellulären oder subzellulären Membranen eingebunden (NADPH-Oxidase von Immunzellen) sowie in freier Form vorhanden (Xanthinoxidase). Die nicht-enzymatische Komponenten von Zellen vermögen ebenfalls unter bestimmten Bedingungen Superoxidradikale zu bilden. Autoxidationsreaktionen von Hämoglobin und Myoglobin [29,59], von Ascorbinsäure und Catecholaminen in Anwesenheit von Fe-Spuren [34,90,92] sind Beispiele nicht-enzymatischer biologischer Quellen der Superoxidbildung.

In dem vorliegenden Kapitel werden die zuvor im Modellsystem untersuchten Methoden für den Superoxidnachweis auf biologische Objekten unterschiedlicher Komplexität übertragen. Die Oxidation des Xanthins durch Xanthinoxidase, die auch als Modellsystem diente, ist gleichzeitig ein Beispiel von der einfachsten biologisch relevanten O2-.-Bildungsquelle. Die Mitochondrien stellen als Zellorganellen ein biologisches System nächster Komplexitätsstufe dar, während die stimulierten Zellen, polymorphkernige Neutrophile, das komplexeste untersuchte O2-.-bildende System repräsentieren.

Die Ergebnisse der Anwendung der O2-.-Nachweismethoden auf Superoxid- produzierende Mitochondrien und polymorphkernige Neutrophilen sind im weiteren beschrieben.

3.7.1 Polymorphkernige Neutrophile.

Bestimmte zelluläre Blutbestandteile (Polymorphkernige Neutrophile, Leukozyten) haben die Aufgabe, bei Entzündungsvorgängen Bakterien sowie Proteinfragmente durch Aufnahme in die Zelle und anschließender oxidativer Zerstörung zu eliminieren (Phagozytose). Radikalbildung durch Immunzellen spielt auch bei allen Autoimmunerkrankungen wie etwa rheumatischen Erkrankungen eine wesentliche Rolle.

Die Produktion von Superoxid-Radikalen ist ein essentieller Teilschritt bei der von polymorphkernigen Neutrophilen (PMN) ausgeführten Phagozytose. Dies erfolgt über ein Enzym, die NADPH-Oxidase, welches Elektronen von endogenem NADPH einzeln auf Sauerstoff überträgt:

®

NADPH + 2O2 rarr NADP+ + H+ + 2 O2-.

Reaktion 25

Die Reduktionsäquivalente werden in Form des NADPH über den Hexosemonophosphat-Weg zur Verfügung gestellt ( Abb. 32 ).


50

In einer nicht aktivierten Zelle liegt die NADPH-Oxidase in Einzelkomponenten vor, die sich im Zytoplasma sowie in der Zellmembran befinden. Nach der Bindung von körperfremden Proteinen (Bakterien) an den Membranrezeptoren wird das Enzym NADPH-Oxidase "zusammengebaut" und die Superoxid-Radikalbildung wird gestartet. Dabei verbrauchen die PMN durch die O2-.-Bildung mehr Sauerstoff, als für die normale Atmung notwendig ist. Dieses Phänomen wird in Literatur als "respiratory burst" bezeichnet.

Die Radikalbildung durch PMN kann in vitro durch phagozytierbare Partikeln (Latex, Zymosan), Kalziumabhängige Stimuli (N-formyl-methionyl-leucyl-phenylalanin) oder durch die Aktivatoren der Proteinkinase C (Phorbolmyristatacetat) stimuliert werden.

3.7.1.1 Zunahme des Sauerstoffverbrauchs als Maß der Superoxidbildung.

Abb. 32. Bildung der Superoxidradikale durch stimulierte Zellen (nach [100]).

Die Superoxidbildung durch PMN wurde mit verschiedenen Nachweismethoden untersucht und verglichen. Opsoniertes Zymosan und Phorbolmyristatacetat wurden zur Stimulierung des „respiratory burst“ verwendet. Um die Nachweismethoden miteinander quantitativ vergleichen zu können, wurde ein zusätzlicher Bezugsparameter ausgewählt, der als Maß der Superoxidradikalbildung dienen sollte.

Die Voruntersuchungen ergaben, daß die gleiche Anzahl von Zellen, die aus verschiedenen Präparationen stammen, eine starke Streuung in ihrer radikalbildenden Aktivität aufweisen. Dies ergab sich aus dem Vergleich des Sauerstoffverbrauchs und der Reduktionrate des Cytochrom c. Die beobachtete Streuung ist auf Unterschiede in der Immunabwehr der Spendertiere zurückzuführen. Somit konnte die Zellzahl allein nicht als Maß der Radikalbildung dienen.


51

Abb. 33. Kinetik des Sauerstoffverbrauchs bei dem durch PMA initiierten „respiratory burst“ an Polymorphkernigen Neutrophilen.

Die Bildung von Superoxidradikalen an aktivierten Zellen erfolgt durch ein Enzym NADPH-Oxidase, wobei NADPH zum NADP oxidiert und Sauerstoff zum Superoxid reduziert wird ( Reaktion 25 ). Diese Reaktion wird von einem Sauerstoffverbrauch begleitet, der mit Hilfe einer Clark-Elektrode registriert werden kann.

Ein typischer Verlauf des Aktivierungsprozesses ist in Abb. 33 dargestellt. Da die Zellen den Sauerstoff auch ohne Stimulierung durch die metabolischen Prozesse verbrauchen, wurde zuerst diese sogenannte Basisatmung gemessen. Kurz nach der Zugabe von Stimuli (PMA im Experiment in der Abb. 33 ) nimmt der Sauerstoffverbrauch drastisch zu. Opsoniertes Zymosan zur Stimulierung der Radikalbildung hatte einen qualitativ identischen Effekt auf den Sauerstoffverbrauch. Da weder 2,4-Dinitrophenol, ein Entkoppler der oxidativen Phosphorilierung der Mitochondrien, der zu einem Anstieg des Sauerstoffsverbrauchs führen sollte, noch Cyanid, das die mitochondriale Atmung vollkommen hemmt, die Zunahme des zellulären Saurstoffverbrauchs beeinflussen konnten, wurde diese als von der mitochondrialen Atmung unabhängig angesehen. Hingegen konnte durch Diphenyleniodoniumchlorid (DPI), ein Inhibitor der Superoxidradikale produzierenden NADPH-Oxidase, der Sauerstoffverbrauch vollkommen gehemmt werden. Daher wurde der erhöhte Sauerstoffverbrauch bei der Aktivierung von PMN als Folge der Bildung von Superoxidradikalen interpretiert. Die Basisatmung wurde von dem Sauerstoffverbrauch während des „respiratory burst“ subtrahiert und die so errechnete Differenz als Maß der Superoxidbildung betrachtet.

Die tatsächliche O2-.-Bildungsrate kann jedoch aus dem Sauerstoffverbrauch nur annähernd abgeleitet werden. Die Ursache hierfür ist die Möglichkeit der spontanen O2-.-Dismutation. Bei der ausschließlichen Eliminierung der O2-.-Radikale durch Dismutation entspricht 1Mol des verbrauchten Sauerstoffs der Bildung von 2 Mol Superoxid:

2O2 rarr 2O2-.

2O2-. + 2H+ rarr H2O2 +O2

O2 +2H+ rarr H2O2 .

Reaktion 26

Diese 2:1 O2-. /O2 -Stöchiometrie gilt nur unter der Bedingung, daß bei den weiteren Reaktionen des Superoxides kein Sauerstoff mehr freigesetzt wird. Die Bedingung ist z. B. erfüllt, wenn das O2-.-Dismutationsprodukt H2O2 ausschließlich durch Myeloperoxidase (MPO) umgesetzt wird:


52

H2O2 +Cl- rarr H2O + OCl-

Reaktion 27

und Hypochlorit (OCl-) nur mit Lipid- und Proteinmolekülen reagiert, wobei kein Sauerstoff freigesetzt wird.

Wenn aber H2O2 mit Hypochlorit weiter reagiert, dann kommt es zu einer zusätzlichen Freisetzung des Sauerstoffs, der bei der Rückkehr des Singulettsauerstoffs in den Triplettzustand gebildet wird:

OCl- + H2O2 rarr 1O2 + Cl- + H2O

Reaktion 28

1O2 rarr 3O2 + DeltaE.

Reaktion 29

In dieser Sequenz der Reaktionen entspricht 1 Mol des verbrauchten Sauerstoffs den 4 Mol des gebildeten Superoxides.

Wie oben gezeigt wurde, liegt die tatsächliche O2-. /O2 -Stöchiometrie (Sauerstoffverbrauch/Superoxidbildung) im Bereich zwischen 2 und 4. In folgenden Untersuchungen wurde angenommen, daß sie - von ihrem genauen Wert abgesehen - konstant bleibt, so daß die Zunahme im Sauerstoffverbrauch als Maß der Superoxidbildung dienen kann.


53

3.7.1.2 Anwendung der photometrischen Methoden.

Bei der Anwendung der Farbstoffe zum Nachweis der Radikalbildung an Zellen muß berücksichtigt werden, daß die suspendierten Zellen durch Lichtstreuung die optische Dichte beeinflussen. Das Erfassen des Indikatorfarbstoffes erfordert daher die Anwendung einer Messung bei zwei Wellenlängen.

Die zur Stimulierung der O2-.-Radikalbildung an PMN verwendeten Induktoren (Zymosan und PMA) wurden zunächst auf eine mögliche direkte Interaktion mit den Nachweissystemen untersucht, um falsch positive (negative) Ergebnisse auszuschließen. Hierzu wurden diese mit Cytochrom c, Epinephrin und NBT einzeln inkubiert und die optische Dichte bei den entsprechenden Wellenlängen verfolgt. Weder PMA noch Zymosan waren in der Lage, die für die Reaktionsprodukte charakteristischen Veränderungen der optischen Dichte im Meßpuffer direkt hervorzurufen, solange keine PMN zugesetzt wurden.

Die Aktivierung der Superoxidbildung an PMN mit PMA oder mit Zymosan erfolgte wie in Kapitel 2.5.1.3 beschrieben. Die Konzentration der Zellen von ca. 106 ml-1 wurde so gewählt, daß die Zunahme im Sauerstoffverbrauch unter der Stimulierung sich im Bereich von 2.5-25µM/min bewegte. Die gewünschte O2-.-Bildungsrate wurde durch die Konzentration von Zellen eingestellt. Zur Abschätzung der produzierten Superoxidbildungsrate dienten die Messungen des Sauerstoffverbrauchs durch die eingesetzte Konzentration der Zellen, die in parallel gestellten Experimenten erfolgten, wie in Kapitel 3.7.1.1 diskutiert.

3.7.1.2.1 Probleme bei der Anwendung des Nitroblau Tetrazoliums zum Superoxidnachweis an stimulierten PMN.

Um die Bildung von Superoxidradikalen an PMN zu initiieren, wurden diese in dem entsprechenden Meßpuffer (s. Kapitel 2.5.1.3) in der Konzentration von ca. 106 ml-1 suspendiert und mit den Stimuli wie PMA oder Zymosan versetzt. Die resultierende O2-.-Radikalbildung wurde durch den Sauerstoffverbrauch kontrolliert, der mit einer Clark-Sauerstoffelektrode gemessen wurde.

Die Inkubation von PMN mit 100µM Nitroblau Tetrazolium ohne Zugabe von Stimuli hatte keine wesentliche Formazanbildung zu Folge. Wurden die Zellen unter Zugabe von NBT mit PMA oder Zymosan stimuliert, so kam es zur Bildung des dunkelblauen Reaktionsproduktes (Formazan), das bei der Reduktion von NBT erhalten wird. Qualitativ hatte SOD eine hemmende Wirkung auf die Formazanbildung, eine Quantifizierung des Reaktionsproduktes über die Veränderung der optischen Dichte bei 540nm war jedoch sehr schwierig.

Das Problem lag darin, daß das Reduktionsprodukt des NBT, Formazan, eine wasserunlösliche Substanz ist und die Zellen beeinflußt. Das hat zur folge, daß die Zellen in Anwesenheit von NBT agglutinieren und sedimentieren. Zu berücksichtigen ist dabei auch, daß die Fähigkeit der Zellen, Superoxidradikale zu produzieren durch die Veränderung der Membranstruktur mit unlöslichen Formazanen gestört werden kann. Da Formazane eine toxische Wirkung auf die PMN haben, erwies sich die NBT-Methode zum Superoxidnachweis an stimulierten Zellen als ungeeignet.

3.7.1.2.2 Die Reduktion von Cytochrom c durch Superoxidradikale von stimulierten PMN.

Die zweite photometrische Methode, die zum Nachweis der Superoxidradikale an PMN eingesetzt wurde, beruht auf der Reduktion von Cytochrom c. Die Radikalbildung an PMN wurde durch den Zusatz von Stimuli (Zymosan oder PMA) gestartet, wobei die Zunahme an Sauerstoffverbrauch, welche in Kontrollexperimenten unter den gleichen Bedingungen, jedoch ohne Cytochrom c, gemessen wurde, als Maß der Superoxidbildung diente (s. Kapitel 3.7.1.1).

In Experimenten mit den durch Zymosan oder durch PMA stimulierten polymorphkernigen Neutrophilen wurde eine mit SOD vollkommen hemmbare Reduktion des Cytochrom c beobachtet. Eine typische Kinetik dieser Reduktion unter der PMA-Stimulierung ist in Abb. 34 dargestellt. Die Zunahme der optischen Dichte bei 550nm zeigte die Bildung des reduzierten Cytochrom c an. Bei der Aktivierung von Zellen mit Zymosan wurde eine qualitativ gleiche Kinetik registriert. Vor der Zugabe von PMA oder Zymosan wurde keine Reduktion des Cytochrom durch PMN beobachtet.

Unter Berücksichtigung des Reaktionsmechanismes weist die Hemmbarkeit mit SOD auf eine ausschließliche Beteiligung der Superoxidradikale an der Reduktion des Cytochroms durch stimulierte PMN hin.


54

Nachdem die Cytochrom c-Methode beim Nachweis der O2-.-Bildung an PMN eine gute Selektivität für Superoxidradikale aufgezeigt hat, wurde der quantitative Aspekt des O2-.-Nachweises analysiert. Hierfür wurde die mit der Cytochrom c-Methode nachgewiesene O2-.-Bildungsrate (O2-.-Wiederfindungsrate) in Abhängigkeit von der durch PMN produzierten O2-.-Bildungsrate untersucht.

Die O2-.-Wiederfindungsrate wurde aus der Kinetik der Bildung von reduziertem Cytochrom c wie folgt errechnet. Eine Tangente wurde an dem Wendepunkt der kinetischen Kurve der Cytochrom c-Bildung angelegt (punktierte Linie in Abb. 34 ). Die O2-.-Wiederfindungsrate wurde aus dem Steigungswinkel unter der Berücksichtigung des Extinktionskoeffizienten und des stöchiometrischen Koeffizienten n=1 nach der Gleichung 10 berechnet.

Die Bildungsraten des reduzierten Cytochrom c wurden gegen den unter den gleichen Bedingungen gemessenen Sauerstoffverbrauch bei der PMA- sowie Zymosan-Stimulierung aufgetragen und linear approximiert ( Abb. 35 und Abb. 36 ).

Abb. 34. Kinetik der Reduktion des Cytochrom c bei der PMA-Stimulierung von PMN. Effekt von SOD. Die PMN wurden in PBS mit 5mM Glucose, 1mM CaCl2, 0.5mM MgCl2 und 100µM Cytochrom c versetzt. Die Radikalbildung wurde durch Zugabe von PMA (80ng/ml) wie mit dem Pfeil angezeigt gestartet. SOD wurde vor dem Beginn der Radikalbildung in der Konzentration 10µg/ml zugegeben. Die Messungen erfolgten bei 37°C.

Im Falle des Zymosans wurde aus dem Steigungskoeffizienten der linearen Approximierung ersichtlich, daß nur 8% von dem insgesamt verbrauchten Sauerstoff in Form von Superoxidradikalen mit der Cytochrom c-Methode wiedergefunden werden konnten ( Abb. 35 ), da der Wiederfindungskoeffizient hier 0.08 beträgt.

Werden die Zellen anstelle des Zymosans mit PMA aktiviert, steigt die mit der Cytochrom c-Methode nachgewiesene Superoxidbildungsrate. Der Sauerstoffverbrauch - und die hierdurch abgeschätzte O2-.-Bildungsrate - bleibt auf dem gleichen Niveau, wie bei der Zymosan-Stimulierung, während die Reduktionsrate des Cytochrom c - und somit die O2-.-Wiederfindungsrate - zunimmt. Der Steigungskoeffizient der linearen Approximierung im Falle der PMA-Stimulierung ergibt den Wiederfindungskoeffizient von 1.27 ( Abb. 36 ).

Bei der Stimulierung mit PMA wird die Abhängigkeit der O2-.-Wiederfindungsrate mit guter Genauigkeit ( Abb. 36 , r=0.99) durch eine lineare Approximierung beschrieben. Die Stimulierung mit Zymosan ergibt jedoch eine Abhängigkeit, die bei hohem Sauerstoffverbrauch von der Linearität abweicht ( Abb. 35 , r=0.81) und eine niedrigere Wiederfindungsrate ergibt.

Abb. 35. Reduktionsrate des Cytochrom c in Abhängigkeit vom O2-Verbrauch durch Zymosan-stimulierte PMN. Die Zellen wurden in PBS mit 5mM Glucose, 1mM CaCl2, 0.5mM MgCl2 und 100µM Cytochrom c versetzt. Die Konzentration von Cytochrom c betrug 50mM Die Radikalbildung wurde durch Zugabe von 25µg/ml opsoniertem Zymosan gestartet. Der Sauerstoffverbrauch wurde mit einer Clark-Sauerstoffelektrode gemessen. Alle Messungen erfolgten bei 37°C.

Ob die verminderte Wiederfindungsrate der Superoxidradikalbildung im Falle des Zymosans auf seine


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(bzw. dessen eventuellen Verunreinigungen) Radikalfänger-Eigenschaften zurückzuführen ist, wurde experimentell überprüft. Hierfür wurde die Reduktionsrate des Cytochrom c im Xanthin/Xanthinoxidase System in An- und Abwesenheit des Zymosans gemessen. Wenn Zymosan bzw. seine Verunreinigungen die Superoxidradikale effektiv abfangen könnten, dann wäre die Reduktionsrate des Cytochrom c durch Zugabe von Zymosan gehemmt.

Experimentell wurde jedoch festgestellt, daß Zymosan in der gleichen Konzentration wie für die Stimulierung von PMN keinen Einfluß auf die Reduktionsrate des Cytochroms hat und somit kein wirksamer O2-.-Radikalfänger ist.

Eine andere Erklärung für diese je nach Aktivierungsart unterschiedlichen Wiederfindungsraten könnte sich aus der Tatsache ergeben, daß die verschiedenen Initiatoren über unterschiedliche Wege die O2-.-Bildung in Gang setzen.

Im Unterschied zur PMA-Aktivierung, wird die Aktivierung durch Zymosan über Phagozytose eingeleitet. Das bedeutet, daß die Superoxidradikale hauptsächlich in einem das Zymosan-Partikelchen umhüllenden Phagosom gebildet werden, was zu einer erhöhten lokalen O2-.-Konzentration im Phagosom führt. Dies hat zur Folge, daß die Geschwindigkeit der Spontandismutation zum Wasserstoffperoxid (H2O2 ) steigt und die vorhandene Konzentration von Cytochrom c nicht mehr ausreichend ist, um mit der Dismutation effizient zu konkurrieren. Außerdem wird das Enzym Myeloperoxidase (MPO) in millimolaren Konzentrationen in das Phagosom ausgeschüttet, so daß die Reaktion zwischen O2-.-Radikalen und MPO [43,65] ebenfalls mit der Spontandismutation konkurriert und somit den Anteil der mit Cytochrom c reagierenden O2-.-Radikale verringert.

Abb. 36. Abhängigkeit der Cytochrom c-Reduktionsrate vom Sauerstoffverbrauch durch die PMA-stimulierten Polymorphkernigen Neutrophile. Die Reaktionsbedingungen sind wie in Abb. 34 angegeben.


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Abb. 37. Oxidation des reduzierten Cytochrom c in Anwesenheit von PMN. Reduziertes Cytochrom c in 50µM Konzentration wurde bei 37°C in PBS mit 5mM Glucose, 1mM CaCl2 und 0.5mM MgCl2 inkubiert: ohne PMN (Autoxidation); mit 106 ml-1 (+PMN); mit 106 ml-1 von PMA-stimulierten polymorphkernigen Neutrophile in Anwesenheit von 200U/ml Katalase und 10µg/ml SOD (PMN+PMA+SOD+Kat); n=2.

Für die Hypothese, daß die lokal unterschiedliche Konzentration der O2-.-Radikale die Wiederfindungsrate beeinflussen kann, sprechen auch die in der Literatur beschriebenen Experimente. So wurde u.a. gezeigt [54], daß die Behandlung der PMN mit Cytochalasin B, welches die Bildung von Phagosomen verhindert, zur Erhöhung der nachgewiesenen O2-.-Bildungsrate führt. Die Tatsache, daß die nachgewiesene O2-.-Bildungsrate unter der Stimulierung mit Latex-Partikeln vom Verhältnis Stimuli/Zellzahl abhängig ist [149], unterstützt die Hypothese ebenfalls.

Die Cytochrom c-Methode kann erhöhte Werte der Wiederfindungsraten liefern, wenn Cytochrom durch andere Komponenten des Systems als Superoxidradikale reduziert wird. Ob das der Fall ist, läßt sich durch die Untersuchung der SOD-Hemmbarkeit der Cytochrom c - Reduktion überprüfen. Um auszuschließen, daß die Bildung des Indikatorsystems (des reduzierten Cytochrom c) auch unabhängig von O2-.-Radikalen über Komponenten des biologischen Systems selbst zustande kommt, wurde der O2-.-Nachweis stets in An- und Abwesenheit von SOD durchgeführt. In den Zymosan- oder PMA-stimulierten Zellen wurde eine 100% ige Hemmung der Cytochrom c - Reduktion in Anwesenheit von SOD (die Endkonzentration 10µg/ml) beobachtet. Somit kann eine zusätzliche unspezifische Reduktion des Cytochrom c durch die PMA- oder Zymosan- stimulierten Zellen ausgeschlossen werden.

Eine Rückreaktion, nämlich eine Oxidation des gebildeten reduzierten Cytochrom c durch die Komponenten des Meßsystems ( Reaktion 30 ), kann hingegen die mit der Cytochrom c-Methode nachgewiesene O2-.-Wiederfindungsrate erniedrigen:

Fe2+ -Cyt.c + Oxidant rarr Fe3+ -Cyt.c + Produkte

Reaktion 30

Um festzustellen, ob die Reaktion 30 den quantitativen O2-.-Nachweis an stimulierten PMN beeinflußt, wurde die Oxidationsrate des zuvor reduzierten Cytochrom c in An- und Abwesenheit von Zellen gemessen.

Hierbei wurde festgestellt, daß die Oxidation des reduzierten Cytochrom c in Anwesenheit von Zellen schneller abläuft, als dessen Autoxidation unter den gleichen Bedingungen. Ein repräsentatives Experiment ist in Abb. 37 dargestellt. Die maximale Rate der Oxidation des reduzierten Cytochrom c in Anwesenheit von Zellen betrug - je nach Präparation - 0.5-1.5µM/min. Vergleicht man diesen Wert mit der Reduktionsrate des Cytochroms durch die mit Zymosan stimulierten Zellen ( Abb. 35 ), dann wird


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ersichtlich, daß die Oxidation des reduzierten Cytochroms einen wesentlichen Beitrag zur scheinbaren Verminderung der Reduktionsrate in diesem System leisten kann.

Die beobachtete Oxidation des reduzierten Cytochrom c in Anwesenheit von PMN kann sich sowohl nach einem enzymatischen wie auch einem nicht-enzymatischen Mechanismus entwickeln.

Obwohl alle Versuche an Zellpräparationen durchgeführt wurden, in welchen der Anteil intakter Zellen über 95% lag, ist ein geringer Anteil der Zellen immer geschädigt. Da die Membranintegrität dieser Zellen gestört ist, werden intrazelluläre Enzyme, u.a. die redox-zyklierende Cytochrom c-Oxidase, auch für das extrazelluläre Cytochrom c zugänglich. Diese könnten die Oxidation des reduzierten Cytochrom c verursachen. Diese Nebenreaktionen sind bekannt. Um sie zu unterdrücken, setzt man acetyliertes Cytochrom c, dessen enzymatischer Umsatz erschwert ist, für die Untersuchung der Superoxidradikalbildung an subzellulären Fraktionen ein [62].

Auch andere Oxidantien, die neben dem Superoxid in diesem biologischen System gebildet werden, sind in der Lage, reduziertes Cytochrom c zu oxidieren. Die Oxidation des reduzierten Cytochrom c konnte z.B. durch einen starken Oxidanten Peroxynitrit (ONOO-) erfolgen, der aus dem unter der Stimulierung freigesetzten Stickstoffmonoxid (NO) und Superoxid gebildet wird.

Bei der Stimulierung von PMN wird u.a. ein Enzym, die induzierte NO-Synthase (NOS) aktiviert. Das Enzym katalysiert die NADPH- und O2-abhängige Oxidation des L-Arginins zu Citrullin und Stickstoffmonoxid (NO):

L-Arginin +O2 + NADPH rarr Citrullin + NO + NADP

Reaktion 31

Stickstoffmonoxid reagiert mit Superoxid (k=(4.3÷6.7).109M-1 s-1), wobei ein starker Prooxidant, das Peroxinitrit (ONOO- ), gebildet wird:

O2-. + NO rarr ONOO-

Reaktion 32

Da nur die protonierte Form des Peroxinitrites mit reduziertem Cytochrom c reagiert und ONOOH einen pK-Wert von 6.8 aufweist [137], ist eine Oxidation des reduzierten Cytochrom c durch Peroxynitrit bei physiologischen pH-Werten nicht zu erwarten. Außerdem zerfällt die protonierte Form des Peroxinitrites ONOOH bei pH=7.4 mit der charakteristischen Zeit tau~1sek [64]. Im geschlossenen Phagosom sinkt jedoch der pH-Wert bis auf 5.0, so daß eine Oxidation des reduzierten Cytochroms durch Peroxinitrit begünstigt wird. Die Geschwindigkeitskonstante dieser Reaktion ( Reaktion 33 )

Fe2+-Cyt.c + ONOOH rarr Fe3+-Cyt.c + Produkte

Reaktion 33

wird mit 105 M-1 s-1 (pH=6.5) bzw. 2.105 M-1 s-1 (pH=5.0) angegeben [137].

Die Dismutationsreaktion wird ebenfalls durch die pH-Senkung in dem Phagosom beschleunigt. Das wäre eine mögliche Erklärung der viel zu niedrigen Reduktionsrate des Cytochroms im Falle des phagozytierbaren Zymosans im Vergleich zu PMA, wenn keine Phagosomen gebildet werden.

Da jedoch die Oxidationsrate von reduziertem Cytochrom c in Anwesenheit von SOD, welche durch Dismutation der Superoxidradikale die Bildung von Peroxynitrit ebenfalls hemmt, nicht beeinflußt wurde ( Abb. 37 ), wurde der Beitrag von Peroxynitrit zur Oxidation von reduziertem Cytochrom c unter diesen experimentellen Bedingungen (Stimulierung mit PMA) als unwesentlich angesehen.

Die Anwendung der Cytochrom c -Methode zum Nachweis der O2-.-Bildung an PMN erbrachte somit folgende Ergebnisse. Die stimulierten PMN reduzieren Cytochrom c ausschließlich nach einem O2-.-abhängigen Mechanismus. Die erheblichen quantitativen Unterschiede im Nachweis der Superoxidbildungsrate bei Anwendung verschiedener Stimuli (PMA und Zymosan) wurden auf die nicht-homogene räumliche Verteilung produzierter O2-.-Radikale sowie auf mögliche Nebenreaktionen zurückgeführt. Im Falle der Stimulierung mit Zymosan werden Phagosomen mit hoher lokaler O2-.-Konzentration gebildet, was die Superoxiddismutation oder die Reaktion mit anderen, ins Phagosom


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ausgeschütteten Komponenten beschleunigt und die nachgewiesene O2-.-Bildungsrate hierdurch vermindert. Die nachgewiesene O2-.-Bildungsrate an stimulierten PMN kann auch durch eine enzymatische Oxidation des reduzierten Cytochrom c verringert werden, die durch aus beschädigten Zellen freigesetzte Cytochromoxidasen zustande kommt.

Dadurch kann die Cytochrom c -Methode erniedrigte Werte beim Nachweis der O2-.-Bildungsrate an stimulierten PMN erbringen.

3.7.1.2.3 Anwendung des Epinephrins zum Nachweis der Superoxidradikalbildung an stimulierten PMN.

In folgendem Kapitel werden qualitative und quantitative Aspekte des O2-.-Nachweises mit der Epinephrin-Methode an stimulierten PMN untersucht. Der Phorbolester PMA und opsoniertes Zymosan wurden zur Stimulierung eingesetzt, wobei die Zunahme an Sauerstoffverbrauch wiederum als Maß der Superoxidbildung diente (s. Kapitel 3.7.1.1).

Abb. 38. Adrenochrom-Bildung durch die PMA-stimulierten PMN. Effekt von SOD. Die PMN wurden in PBS mit 5mM Glucose, 1mM CaCl2, 0.5mM MgCl2 200U/ml Katalase und 1mM Epinephrin versetzt. Die Radikalbildung wurde durch Zugabe von PMA (80ng/ml) wie mit dem Pfeil angezeigt gestartet. SOD wurde vor dem Beginn der Radikalbildung in der Konzentration 10µg/ml zugegeben. Die Messungen erfolgten bei 37°C.

Die Konzentration der Zellen wurde so gewählt (ca. 106 ml-1 ), daß die eingeschätzte Superoxidbildungsrate in dem Bereich liegt, der für das Modellsystem mit diese Methode untersucht wurde (2.5-25µM/min). Die nachzuweisende O2-.-Bildungsrate wurde durch die Konzentration von Zellen eingestellt. Die Konzentration des Epinephrins von 1mM für den O2-.-Nachweis an PMN wurde aus dem Modellsystem (Xanthin/Xanthinoxidase) übernommen.

Da die O2-.-Bildung in Zellsuspensionen bei 37°C und im Meßpuffer ohne Zusatz des Metallchelators DTPA erfolgte, kann man mit einer Autoxidation von Epinephrin rechnen, welche ebenfalls in einer Adrenochrombildung resultiert. Der Beitrag der Autoxidation des Epinephrins zur Adrenochrombildung wurde unter experimentellen Bedingungen untersucht.

Wenn die Konzentration des Epinephrins, wie in den nachfolgenden Experimenten, 1mM betrug, dann wurde eine Adrenochrombildungsrate von 0.23µM/min bei 37°C in dem Meßpuffer (mit Glucose, Ca2+ , Mg2+ und Katalase, s. Kapitel 2.5.1.3) ohne Zellen registriert.

Bei der Stimulierung von PMN in Anwesenheit von Epinephrin konnte eine für die Adrenochrombildung charakteristische Zunahme der optischen Dichte bei 480nm registriert werden. Eine typische Kinetik der Adrenochrombildung ist in Abb. 38 gezeigt. In diesem Experiment wurden die Zellen durch PMA aktiviert. Die Form des kinetischen Ablaufs ändert sich nicht, wenn statt PMA opsoniertes Zymosan zur Aktivierung eingesetzt wird.

Der größte Teil der Adrenochrombildung war mit SOD hemmbar, ein geringer Anteil jedoch nicht ( Abb. 38 ). Dies zeigt, daß auch andere Komponenten als Superoxidradikale bei der Stimulierung von Zellen gebildet werden, die ebenfalls Epinephrin zum Adrenochrom oxidieren können.

Um nur den Beitrag von O2-.-abhängigen Reaktionen zur Adrenochrombildung selektiv anzurechnen, wurden die nachfolgenden Messungen stets gegen eine Referenzküvette mit Inhalt gleicher Zusammensetzung plus SOD durchgeführt. Der Anteil der Autoxidation an der Adrenochrombildung läßt sich auf diese Weise ebenfalls bestimmen, da diese Reaktion bei neutralem pH-Wert mit SOD nicht hemmbar ist.

Abb. 39. Adrenochrombildung durch die Zymosan-stimulierten PMN. Die Zellen wurden in PBS mit 5mM Glucose, 1mM CaCl2, 0.5mM MgCl2, 200U/ml Katalase und 1mM Epinephrin versetzt. Die Radikalbildung wurde bei 37°C durch Zugabe von Zymosan gestartet und der SOD-sensitive Anteil der Adrenochrombildung erfaßt.

Zur Beurteilung des quantitativen Aspektes der Epinephrin-Methode in Anwendung auf den O2-.-Nachweis bei der Stimulierung von PMN wurde die Abhängigkeit der nachgewiesenen von der produzierten O2-.-Bildungsrate aufgenommen.

Die produzierte O2-.-Bildungsrate, welche die aktivierten PMN erbringen, wurde aus dem Sauerstoffverbrauch in parallel laufenden Experimenten - wie in Kapitel 3.7.1.1 beschrieben - abgeleitet. Die nachgewiesene O2-.-Bildungsrate wurde mit dem Koeffizienten n=4 aus der Adrenochrombildungsrate nach der Gleichung 10 kalkuliert. Die Adrenochrombildungsrate wurde aus dem Steigungswinkel der am Wendepunkt angelegten Tangente (die punktierte Linie in Abb. 38 ) errechnet.

Die Ergebnisse der Anwendung der Epinephrin-Methode für die Bestimmung der Superoxidbildungsrate an den mit Zymosan stimulierten PMN sind in Abb. 39 dargestellt. Der aus der linearen Approximierung bestimmte Wiederfindungskoeffizient lag bei 1.05, wenn die 4:1 Superoxid:Adrenochrom Stöchiometrie für die Berechnung zugrunde gelegt wurde. Die lineare Abhängigkeit ist nur annähernd an die Beschreibung experimenteller Daten angepaßt (r=0.84). Aus Abb. 39 wird ersichtlich, daß die O2-.-Wiederfindungsrate zu einer Sättigung bei höherem Sauerstoffverbrauch tendiert.

Wurden die Zellen mit PMA stimuliert, dann lag der für die Epinephrin-Methode bestimmte Wiederfindungskoeffizient bei 1.48+0.49 ( Abb. 40 ), wenn dieser unter den gleichen Annahmen, wie für die Zymosan-Stimulierung beschrieben, berechnet wurde. Somit sind die Wiederfindungskoeffiziente, die mit der Epinephrin-Methode erhalten wurden, für PMA- und Zymosan-stimulierte Zellen verschieden. Wie im Kapitel 0 diskutiert, reflektiert der niedrigere Wiedefindungskoeffizient im Falle der Stimulierung mit Zymosan die Bildung von Phagosomen, die bei der Stimulierung mit PMA nicht gebildet werden. Die hohe lokale Konzentration der O2-.-Radikale, die im Phagosom entsteht,


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begünstigt die Dismutation und die Nebenreaktionen (z.B. mit Myeloperoxidase), wodurch der Anteil von mit Epinephrin reagierenden Superoxidradikalen vermindert wird.

Da Epinephrin einen ca. 10mal geringeren Extinktionskoeffizienten als Cytochrom c hat, ist die Zunahme der optischen Dichte bei gleichen physiologisch relevanten Radikalbildungsraten um eine Größenordnung geringer. Darauf ist die große Streuung (r=0.67) der O2-.-Wiederfindungsraten bei Anwendung der Epinephrin-Methode zum Nachweis der niedrigen, physiologisch relevanten O2-.-Bildungsraten zurückzuführen.

Eine zusätzliche Erklärung der großen Streuung wäre, daß die SOD-sensitive Komponente der Adrenochrombildung an stimulierten PMN auch durch andere Faktoren, als nur die Superoxidradikale, beeinflußt wird.

Ein starker Oxidant wie Peroxinitrit, der bei der Stimulierung von Zellen gebildet werden kann (s. Kapitel 0 , Reaktion 32 ), könnte z. B. zur Oxidation von Epinephrin beitragen und somit die Bildung von Adrenochrom fördern. SOD hemmt die Entstehung von Peroxinitrit über die Desaktivierung von O2-.-Radikalen, so daß die Peroxinitrit-vermittelte Oxidation des Epinephrins zu der SOD-sensitiven Komponente der Adrenochrombildung gehören würde. Die Adrenochrombildungsrate würde in diesem Fall nicht nur durch die Bildungsrate von Superoxidradikalen bestimmt, sondern wäre auch durch Produktion des Stickstoffmonoxides (NO) und somit des Peroxinitrites bedingt.

Ob bestimmte Nebenreaktionen, die bei stimulierten PMN zu erwarten sind, die registrierte Adrenochrombildung beeinflussen können, wurde in den folgenden Experimenten untersucht. Wenn das gebildete Adrenochrom mit den Oxidanten, die neben den O2-.-Radikalen durch stimulierte Zellen produziert werden, weiter reagiert, so daß die optische Dichte bei 480nm sich verändert, dann könnte dies die nachgewiesene O2-.-Bildungsrate verfälschen.

Experimentell wurde jedoch festgestellt, daß das gebildete Adrenochrom innerhalb der Meßzeit (20min) in dem System stabil bleibt, wie aus den unveränderten Spektren dieses Farbstoffes bei der Inkubation mit den PMA- sowie Zymosan-stimulierten PMN in Anwesenheit von SOD (10µg/ml) und Katalase (200U/ml) folgt. Die nicht-stimulierten Zellen konnten ebenfalls keine Veränderungen der optischen Dichte bei 480nm hervorrufen.

Die Anwendung der Epinephrin-Methode zum Superoxidnachweis an stimulierten PMN hat zu folgenden qualitativen und quantitativen Ergebnissen geführt. Es wurde festgestellt, daß Bildung von Adrenochrom in diesem biologischen System nicht unbedingt durch eine O2-.-abhängige Reaktion erfolgt. Daher ist es für den Superoxidnachweis erforderlich, nur die mit SOD hemmbare Komponente der Adrenochrombildung anzurechnen.


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Abb. 40. Die Anwendung des Epinephrins zum Nachweis der Superoxidbildung an PMN unter der Stimulierung mit PMA. Die Reaktionsbedingungen sind wie in Abb. 38 angegeben.

Die mit der Epinephrin-Methode nachgewiesene O2-.-Bildungsrate ist von der Art der Stimulierung abhängig, da hier die inhomogene Verteilung der durch PMN produzierten Superoxidradikale die nachgewiesene O2-.-Bildungsrate beeinflußt. Die Wiederfindungskoeffizienten für die Berechnung der O2-.-Bildungsrate aus dem Sauerstoffverbrauch bei Zymosan- und PMA-Stimulierung wurden als 1.05 bzw. 1.49 bestimmt. Die große Streuung der Meßwerte ist auf den geringen Extinktionskoeffizienten des Adrenochroms sowie auf mögliche andere Wechselwirkungen im System zurückzuführen.

3.7.1.3 Chemilumineszenz-Methoden

3.7.1.3.1 Chemilumineszenz des Lucigenins als Maß der Superoxidbildung an PMN.

Bei der Anwendung der Chemilumineszez des Lucigenins als Nachweismethode der O2-.-Radikalbildung durch stimulierte PMN wurden die Zellen in der Konzentration von ca. 106 ml-1 im Meßpuffer suspendiert. Die Stimulation mit PMA erfolgte wie im Kapitel 2.5.1.3 beschrieben. Die zu erwartende O2-.-Bildungsrate wurde durch die Konzentration von Zellen so eingestellt, daß diese in der Größenordnung den im Xanthin/Xanthinoxidase System untersuchten Bildungsraten entsprach (Kapitel 3.5.2). Daher wurde die im Modellsystem als optimal bestimmte Konzentration des Lucigenins von 50µM auch auf das System mit stimulierten Zellen übertragen.

Der Sauerstoffverbrauch durch die Zellen wurde vor und nach der Stimulierung unter den gleichen Bedingungen (jedoch ohne Lucigenin) in Kontrollexperimenten als Maß der produzierten O2-.-Bildungsrate gemessen (s. Kapitel 3.7.1.1).

Wenn die Produktion der Superoxidradikale durch die mit PMA stimulierten polymorphkernigen Neutrophilen in Anwesenheit von Lucigenin gestartet wird, kann eine diesen Prozeß begleitende Chemilumineszenz beobachtet werden.

Qualitativ entspricht die Amplitude der Lucigenin-Chemilumineszenz der O2-.-Bildungsrate, wenn diese aus der Kinetik des Sauerstoffverbrauchs bestimmt wurde.

Die Abb. 41 zeigt, daß die Intensität der Lucigenin-Chemilumineszenz unter PMA-Stimulierung der Zellen deutlich zunimmt. Während einiger Minuten Äquilibrierungszeit, die für die Erwärmung von Zellen auf die Meßtemperatur von 37°C notwendig ist, wurde ebenfalls eine Chemilumineszenz in Anwesenheit von Lucigenin beobachtet, jedoch von viel geringerer Intensität ( Abb. 41 ).


62

Ob die O2-.-unabhängigen Reaktionen des Lucigenins zu der beobachteten Chemilumineszenz an stimulierten Zellen beitragen, wurde aus dem Effekt des die O2-.-Dismutation katalysierenden Enzyms Superoxid Dismutase (SOD) abgeleitet. Wäre die registrierte Chemilumineszenz zum größten Teil durch die Reaktionen des Lucigenins mit anderen Komponenten als O2-.-Radikalen bedingt, dann würde die Zugabe von SOD nur eine geringe Hemmung der Intensität hervorrufen. Wäre die Chemilumineszenz hingegen ausschließlich durch die Reaktion mit O2-.-Radikalen zustande gekommen, dann würde SOD eine 100%-ige Hemmung der Intensität erbringen.

Wie aus Abb. 41 ersichtlich, nimmt die Chemilumineszenz des Lucigenins bei der Zugabe von SOD ab, eine 100%-ige Hemmung der Intensität konnte jedoch nicht erreicht werden (auch nicht bei Verdopplung der SOD- Konzentration ( Abb. 41 )). Ein Anteil der Chemilumineszenz von 20%, bezogen auf das Amplitudenmaximum erzielt ohne SOD-Zugabe, blieb SOD-insensitiv. Die Zugabe von Katalase (200U/ml) hatte keinen Einfluß, weder auf die Chemilumineszenz-Intensität noch auf die SOD-Hemmbarkeit. Daraus folgt, daß dies nicht die O2-.-unabhängigen Reaktionen des Lucigenins, die zur SOD-insensitiven Komponente beitragen, sind.

Dieses Ergebnis zeigt, daß der größere Teil der Chemilumineszenz ( 80%) an stimulierten PMN von O2-.-Radikalen abhängig ist. Der Beitrag von Superoxid-unabhängigen Reaktionen zur Chemilumineszenz des Lucigenins in diesem System kann mit einem Wert von höchstens 20% eingeschätzt werden, da die SOD-insensitive Komponente der Chemilumineszenz auch eine andere Ursache haben kann. Lucigenin als positiv geladenes, relativ kleines Molekül erfüllt die formellen Voraussetzungen einer itrazellulären Lumineszenzprobe und kann die äußere Zellmembran passieren. Das in die Zelle aufgenommene Lucigenin läßt sich mittels Fluoreszenzmikroskopie visualisieren [116]. Hingegen ist die Zellmembran für SOD, die im Experiment in Abb. 41 zugegeben wurde, undurchlässig. Somit wäre auch die O2-.-abhängige Chemilumineszenz von intrazellulären Lucigenin-Molekülen mit SOD nicht hemmbar, da SOD keinen Zugang zu dem itrazellulären Raum hat.

Abb. 41. Lucigenin-Chemilumineszenz von den mit PMA stimulierten Zellen. Die PMN wurden in PBS (T=37°C) mit 5mM Glucose, 1mM CaCl2, 0.5mM MgCl2 und 50µM Lucigenin versetzt. Die Radikalbildung wurde durch Zugabe von PMA (80ng/ml) wie mit dem Pfeil angezeigt gestartet. Zugabe von je 10µg/ml SOD.

Es ist wichtig zu bemerken, daß obwohl die stimulierten Zellen quantitativ vergleichbare O2-.-Bildungsraten produzieren, die für X/XOD System bereits untersucht worden sind (Kapitel 3.5.2), die Intensität der Chemilumineszenz an stimulierten PMN wesentlich höher ist, als aus der entsprechenden Chemilumineszenz-Intensität im Modellsystem zu erwarten ist (vgl. Abb.14B mit Abb. 41 ). In Kapitel 3.5.2 wurde die Abhängigkeit der Intensität der Lucigenin-Chemilumineszenz von der Superoxidbildungsrate im Xanthin/Xanthinoxidase System dargestellt (Abb. 23). Diese kann als eine Kalibrierung herangezogen werden, welche auf Grund der produzierten Superoxidbildungsrate die zu erwartende Chemilumineszenz-Intensität voraussagen läßt.

Da die Superoxidbildungsrate durch die stimulierten PMN über die Zunahme des Sauerstoffverbrauchs


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abgeschätzt werden kann (Spalte „O2-.-Bildung“ in der Tabelle 5 ), ist es möglich, die theoretisch zu erwartende Amplitude der Lucigenin-Chemilumneszenz nach der Kalibrierung zu berechnen. Die Ergebnisse dieser Berechnungen sind in der Spalte „Theoretische Luc-CL“ ( Tabelle 5 ) dargestellt. Werden die experimentell erhaltenen Werte der Chemiluminszenz-Intensität mit den theoretischen verglichen, dann sind die letzteren fast zwei Größenordnungen niedriger ( Tabelle 5 ).

Tabelle 5. Intensität der Lucigenin-Chemilumineszenz bei der Superoxidbildung an PMN.

O2-.-Bildung [µM/min]

Theor.Luc-CL [cps]

Tatsächliche Luc-CL [cps]

 

 

ohne SOD

mit SOD

2,30+0,15 (n=2)

1 479+360

59 000+8 000 (n=2)

14 000+500 (n=2)

6,54+0,15 (n=2)

3 684+360

114 000+4 000 (n=2)

22 500+1 000 (n=2)

Auch wenn nur der SOD-sensitive Anteil der Chemilumineszenz berücksichtigt wird, ist die Intensität immer noch 30mal größer, als auf Grund der Kalibrierung zu erwarten ist ( Tabelle 5 ).

Der 20%ige Beitrag von O2-. -unabhängigen Reaktionen an der Chemilumineszenz des Lucigenins ist nicht ausreichend, um die mehrfache Erhöhung der Intensität in dem System mit PMN im Vergleich zu dem Modellsystem zu begründen. Andere Faktoren, welche zur hohen Intensität der Chemilumineszenz des Lucigenins an stimulierten PMN beitragen könnten, werden weiter unten betrachtet.

Ob diese höhere Chemilumineszenz-Intensität über eine zusätzliche durch Lucigenin stimulierte Radikalproduktion durch Zellen zu erklären ist, wurde über die zuvor als zuverlässig identifizierte Cytochrom c- Methode überprüft.

Erstens könnte Lucigenin als körperfremde Substanz eine direkte Stimulierung der PMN auslösen. Wäre das zutreffend, dann könnte die Superoxidbildung an Zellen auch durch die Zugabe von Lucigenin gestartet werden. Da es aber zu keiner Reduktion des Cytochrom c kam, wenn 50µM Lucigenin in Kontakt mit den Zellen gebracht wurde, kann die Möglichkeit einer stimulierenden Wirkung des Lucigenins auf PMN ausgeschlossen werden.

Zweitens könnte Lucigenin (LC2+) die Superoxidbildung an stimulierten PMN vergrößern, indem es die enzymatisch übertragenen Elektronen aufnimmt ( Reaktion 34 ) und dann autoxidiert ( Reaktion 35 ), wobei die zusätzlichen Superoxidradikale gebildet werden können:

LC2+ + 1e rarr LC+.

Reaktion 34

LC+. + O2 rarr LC2+ + O2-.

Reaktion 35

Unter der Stimulierung von PMN wird nicht nur die NADPH-Oxidase, sondern auch eine Reihe von Enzymen aktiviert, welche Elektronen auf Lucigenin übertragen und dadurch eine zusätzliche (zur NADPH-Oxidase) Superoxidbildung vermitteln könnten.

Die intrazelluläre NO-Synthase ist potentiell in der Lage, Lucigenin direkt zu reduzieren. Einerseits ist die Aktivierung dieses Enzyms an den PMA-stimulierten polymorphkernigen Neutrophilen bekannt [39]. Andererseits ist ein gleichartiges Enzym, die endotheliale NO-Synthase, in der Lage, Elektronen auf Lucigenin direkt zu übertragen und dadurch zur Bildung der ohne Lucigenin nicht vorhandenen Superoxidradikale nach dem oben beschriebenen Mechanismus zu führen [148]. Daher ist es nicht auszuschließen, daß auch die intrazelluläre NO-Synthase ebenfalls Elektronen auf Lucigenin, wie Reaktion 34 beschreibt, überträgt. Die O2-. -Bildungsrate wäre dadurch vergrößert und die Intensität der Chemilumineszenz somit erhöht.

Ob dieser Prozeß für die erhöhte Lucigenin-Chemilumineszenz im PMN-System verantwortlich ist, wurde experimentell überprüft. Hierfür wurden die PMN in An- und Abwesenheit von 50µM Lucigenin


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mit PMA stimuliert und in beiden Fällen die Reduktion von Cytochrom c (100µM) gemessen. Da keine signifikanten Veränderungen der Reduktionsrate von Cytochrom c in Anwesenheit von Lucigenin festgestellt wurden, konnte auch diese mögliche Erklärung für die hohe Chemilumineszenz- Amplitude abgelehnt werden.

Die Gesamtreaktion der Chemilumineszenz des Lucigenins (Reaktion 20) weist darauf hin, daß für die Bildung eines lumineszierenden Moleküls Methylacridon insgesamt zwei Elektronen und ein Sauerstoffmolekül benötigt werden. Ein Superoxidradikal kann jedoch nur eine univalente Reduktion vermitteln, so daß für die Bildung eines Methylacridon- Moleküls zwei nacheinander folgenden Reduktionen durch Superoxidradikale erforderlich sind.

Wenn andere Komponenten des Systems ein Elektron auf Lucigenin übertragen und somit einen von zwei notwendigen Reduktionsschritten durchführen, verändern sich die Reaktionstöchiometrie und der kinetische Ablauf. So könnte die Reaktion zwischen dem in der Reaktion 34 enzymatisch reduzierten Lucigenin (LC+.) und dem Superoxidradikal

LC+. + O2-. rarr 2 MA + hny

Reaktion 36

die Intensität der Chemilumineszenz dadurch erhöhen, daß in der Reaktionssequenz Reaktion 34 + Reaktion 36 statt zwei nur ein O2-.-Molekül für die Bildung eines lumineszierenden Moleküls Methylacridon (MA) benötigt wird (vgl. Reaktion 20). Außerdem kann die Reduktion des Lucigenins LC2+ zum Lucigenin-Kationradikal LC+. schneller durch ein Enzym ( Reaktion 34 ) ablaufen, als durch Superoxidradikale. Dadurch steigt die limitierende Geschwindigkeit der Reaktion 34 , die Bildungsrate des Methylacridons und somit die Intensität der Chemilumineszenz. Da in dem oben betrachteten Schema ein von zwei Reduktionschritten durch das Superoxidradikal erfolgt, bleibt die Chemilumineszenz des Lucigenins auch in diesem Fall SOD-sensitiv.

Die enzymatische Übertragung von Elektronen auf Lucigenin kann durch Diphenyleniodoniumchlorid (DPI), einen irreversiblen Inhibitor von Flavoprotein-Reduktasen und somit von Superoxid generierender NADPH-Oxidase sowie NO-Synthase, verhindert werden. Die Lucigenin-Chemilumineszenz, einschließlich des SOD-insensitiven Anteils, konnte durch DPI vollständig gehemmt werden ( Abb. 42 ).

Um einen möglichen Einfluß von DPI auf den Chemilumineszenz-Mechanismus des Lucigenins ausschließen zu können, wurde seine Wirkung auf die Chemilumineszenz im Xanthin/Xanthinoxidase System überprüft, wo die O2-.-Produktion mit DPI nicht gehemmt wird. Hier hatte DPI keinen Einfluß auf die Chemilumineszenz, so daß eine Wechselwirkung von DPI mit einer Komponente des Nachweisystems auszuschließen ist.

Die Lebensdauer der Moleküle im angeregtem Zustand sowie die Quantenausbeute von Lumineszenzreaktionen kann auch durch die Eigenschaften des Mediums beeinflußt werden. Das Lösungsmittel kann eine Verschiebung des Chemilumineszenzspektrums hervorrufen. Das Emissionsspektrum des Methylacridons, des lumineszierenden Reaktionproduktes reduktiver Oxygenierung von Lucigenin (s. Reaktion 20), liegt im sichtbaren Bereich (400-500nm), wo die Empfindlichkeit des hier verwendeten Photomultipliers von der Wellenlänge praktisch unabhängig ist. Aus diesem Grund kann die spektrale Verschiebung der Emission von ca. 24nm [131], die bei Änderung der Polarität des Mediums von der wässrigen zur Lipidphase zu erwarten ist, nicht die Ursache der hohen registrierten Intensität der Chemilumineszenz im System mit PMN sein.

Wie die oben beschriebenen Experimente gezeigt haben, wird die Intensität der Lucigenin-Chemilumineszenz beim Nachweis der Superoxidbildung an stimulierten PMN nicht nur durch die Superoxidbildungsrate bestimmt. Die Verteilung des Lucigenins zwischen intra- und extrazellulärem Raum, Wechselwirkungen mit den Lipidmembranen und mit den elektronübertragenden Enzymen stellen die möglichen für dieses System spezifischen Einflüsse auf die Chemilumineszenz-Intensität dar. Dies kann zu falschen Schlußfolgerungen über die durch PMN produzierte O2-.-Bildungsrate führen.


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Abb. 42. Hemmung der Lucigenin-Chemilumineszenz an PMA-stimulierten PMN durch Diphenyleniodoniumchlorid (DPI). Reaktionsbedingungen wie in Abb. 41 angegeben. Konzentration von DPI betrug 15µM.

3.7.1.3.2 Luminol-Chemilumineszenz und die Radikalbildung an PMN.

Die nächste Methode, die für den Nachweis der Superoxidbildung an stimulierten PMN angewendet wurde, war die Chemilumineszenz des Luminols. Die PMN wurden im Meßpuffer in der gleichen Konzentration, wie in den Experimenten mit Lucigenin, suspendiert (s. Kapitel 0 ). Die Superoxidbildungsrate, die über den Sauerstoffverbrauch unter der PMA-Stimulierung bestimmt wurde, lag in dem Bereich, der für das Xanthin/Xanthinoxidase System mit der Luminol-Methode untersucht wurde. Die Konzentration des Luminols von 50µM wurde vom Modellsystem auf stimulierte Zellen übertragen.

Abb. 43. Einfluß der SOD und Katalase auf die Luminol-Chemilumineszenz der PMA-stimulierten polymorphkernigen Neutrophilen. Die PMN wurden in PBS (T=37°C) mit 5mM Glucose, 1mM CaCl2, 0.5mM MgCl2 und 50µM Luminol versetzt. Die Radikalbildung wurde durch Zugabe von PMA (80ng/ml) wie mit dem Pfeil angezeigt gestartet. Zugabe von 10µg/ml SOD und 200U/ml Katalase.

Wenn polymorphkernige Neutrophile in Anwesenheit des Luminols mit PMA stimuliert werden, kommt es zur Entstehung eines Chemilumineszenzsignals. Die Intensität der Luminol-Chemilumineszenz im Falle stimulierter PMN war ca.300mal höher, als die im Xanthin/Xanthinoxidase System, und ca.10mal höher als in Experimenten mit Lucigenin, obwohl in allen Fällen die realen Superoxidbildungsraten


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vergleichbar waren. Die Chemilumineszenz war nur teilweise mit SOD hemmbar ( Abb. 43 ). Die nachfolgende Zugabe von Katalase trug zu einer weiteren Hemmung bei, obwohl eine völlige Hemmung nicht erreicht werden konnte ( Abb. 43 ).

Diphenyleniodoniumchlorid, ein Hemmstoff der NADPH-Oxidase an PMN, hatte ebenfalls eine hemmende Wirkung ( Abb. 44 ), was für die Beteiligung an der Chemilumineszenz dieses O2-.-produzierenden Enzyms spricht. In diesem Fall erbrachte die nachfolgende Zugabe von Katalase eine 100%-ige Hemmung der Chemilumineszenz ( Abb. 44 ).

Die 300fache Erhöhung der Amplitude der Chemilumineszenz im System mit stimulierten PMN im Vergleich zu dem Modellsystem bei der gleichen O2-.-Bildungsrate weist auf Reaktionen des Luminols mit anderen Oxidantien als Superoxidradikale hin. Die unvollständige Hemmbarkeit mit SOD ist ein zusätzlicher Beweis hierfür. Die weitere Hemmung der Intensität mit Katalase zeigt die Beteiligung von Wasserstoffperoxid an der Chemilumineszenzreaktion an.

Wasserstoffperoxid kann entweder über die Bildung von Hydroxylradikalen oder über die Myeloperoxidase (MPO) zur Chemilumineszenz beitragen. Für letztere dient es als Substrat und fördert somit die Bildung des starkem Oxidationsmittels Hypochlorit (Reaktion 27). Die Chemilumineszenz des Luminols bei Reaktionen mit Hydroxylradikalen [88] sowie mit Hypochlorit in Anwesenheit von H2O2 [9,10] ist bekannt. Aus dem Experiment mit Diphenyleniodoniumchlorid ( Abb. 44 ) wird deutlich, daß der Chemilumineszenzsignal nicht vollkommen verschwindet, wenn die Superoxidbildung an stimulierten PMN mit DPI gehemmt wurde. Der verbliebene DPI-insensitive Anteil der Chemilumineszenz ist auf die von Wasserstoffperoxid abhängigen Reaktionen zurückzuführen, weil dieser mit Katalase vollkommen hemmbar war.

Abb. 44. Wirkung von Diphenyleniodoniumchlorid (DPI) und Katalase auf die Chemilumineszenz des Luminols im System mit PMA-stimulierter PMN. Reaktionsbedingungen wie in Abb. 43 angegeben. Die Konzentrationen von DPI und Katalase waren 15µM bzw. 200U/ml. Die Konzentration des Luminols betrug 50µM.

Die Untersuchungen der Superoxidbildung an den mit PMA stimulierten polymorphkernigen Neutrophilen über die Chemilumineszenz des Luminols haben erwiesen, daß die Intensität hauptsächlich durch andere Reaktionen als die mit O2-.-Radikalen bestimmt wurde. Wasserstoffperoxid ist an der Entwicklung der Chemilumineszenz wesentlich beteiligt. Somit kann die Chemilumineszenz des Luminols nicht als eine Methode für den selektiven O2-.-Nachweis an PMN betrachtet werden.

3.7.1.4 ESR-Nachweis der O2-.-Bildung an stimulierten PMN.


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Abb. 45. ESR-Spektren von DEPMPO beim O2-.-Nachweis an den PMA-stimulierten polymorphkernigen Neutrophilen. A- 5min., B- 10min., C- 15min. nach dem Beginn der Stimulierung. D - 10µg/ml SOD vor der Stimulierung zugegeben. Die Einstellungen am ESR-Spektrometer waren: Leistung - 2mW, Scanbreite - 115G, Verstärkungsfaktor - 105, Modulationsamplitude - 0.9G, Zeitkonstante - 0.164s, Scangeschwindigkeit - 82.25G/min, Resonatortyp - TM4103. Konzentration von DEPMPO war 25mM.

Für die Untersuchung der Radikalbildung an PMN wurden die Zellen in Anwesenheit des für den O2-. -Nachweis geeigneten Spintraps DEPMPO durch die Zugabe von PMA stimuliert. Um die optimale Temperatur für die Aktivität der NADPH-Oxidase zu gewährleisten, wurde die ESR-Meßzelle während der Messung bei 37°C thermostatiert.

Wie die Abb. 45 zeigt, wurde hauptsächlich ein für das DEPMPO-OOH-Addukt charakteristisches Signal in Anwesenheit stimulierter Zellen beobachtet. Die Amplitude des Signals nahm solange zu, wie die Bildung von O2-.-Radikalen durch PMN andauerte.

Mit Zugabe von SOD vor dem Beginn der Stimulation konnte die Bildung des Adduktes vollkommen


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gehemmt werden (Spektrum D auf der Abb. 45 ).

Die Radikalbildung durch stimulierte Zellen ist zeitlich begrenzt. Die Dauer dieses Prozesses wurde aus der Messung des Sauerstoffverbrauchs und der Cytochrom c-Reduktion abgeleitet und beträgt ca. 15min (vgl. Abb. 34). Diese Tatsache wurde für die Einschätzung der Stabilität des DEPMPO-Adduktes in diesem System genutzt.

Die PMN wurden über 15min nach der Stimulierung in der ESR-Meßzelle inkubiert, bis die Radikalbildung aufhörte. Von diesem Moment an wurde keine weitere Zunahme der Signalintensität des DEPMPO-OOH-Adduktes registriert und die Zerfallskinetik über die Amplitude des mittleren Dubletts aufgenommen ( Abb. 46 ). Die Aufnahme des ESR-Spektrums nach Ablauf der kinetischen Messung ergab, daß nur die Intensität des Signals abnimmt, ohne daß das Spektrum sich verändert.

Wurde die Zerfallskinetik als Reaktion pseudo-erster Ordnung modelliert, dann ergab die Halbwertszeit tau des DEPMPO-OOH-Adduktes einen Wert von 1389+166 s. Vergleicht man diesen Wert mit dem tau=1280+355 s, der im enzymatischen Modellsystem Xanthin/Xanthinoxidase erhalten wurde (Kapitel 3.6.2), dann wird ersichtlich, daß die Stabilität des Adduktes sich in Anwesenheit der PMN kaum verändert. Somit hatte auch die Erhöhung der Meßtemparatur auf 37°C, bei der alle ESR-Spektren von stimulierten Zellen aufgenommen wurden, keinen wesentlichen Einfluß auf die Zerfallgeschwindigkeit.

Die Untersuchungen der Radikalbildung an stimulierten PMN mit Hilfe des neuen Spintraps DEPMPO zeigen, daß hauptsächlich Superoxid- und nicht Hydroxylradikale in diesem System gebildet werden.

Die genaue Identifizierung der produzierten Radikalspezies mit dem bisher für diese Fragestellung angewandten Spintrap DMPO war problematisch, da das DMPO-OH-Addukt nicht nur über die Reaktion mit OH-Radikalen, sondern auch als Zerfallsprodukt des DMPO-OOH-Adduktes gebildet wird (Reaktion 24).

Abb. 46. Stabilität des DEPMPO-OOH Adduktes in Anwesenheit von PMN. Die Amplitude des mittleren Dubletts wurde bei konstantem Magnetfeld über die Zeit gemessen. Die Einstellungen des ESR-Spktrometers waren wie in Abb. 45 angegeben.

Da Wasserstoffperoxid als Dismutationsprodukt der O2-.-Radikale entsteht, kann die Reaktion zwischen Superoxid und einem Spintrap mit der Dismutationsreaktion konkurrieren und die Bildung von Wasserstoffperoxid und schließlich von Hydroxylradikalen vermindern. Die höhere Stabilität des DEPMPO-OOH-Adduktes ermöglicht die Anwendung einer niedrigeren Konzentration von DEPMPO als von DMPO. Bei einer fast gleichen Geschwindigkeitskonstanten der Reaktion von DMPO und DEPMPO mit Superoxidradikalen beeinflußt das letztere die Bildung des Wasserstoffperoxides und daher die Bildung der OH-Radikale weniger.

Die Anwendung des Spintrap DEPMPO zum Nachweis von Superoxidradikalen an stimulierten PMN ist vielversprechend. Das charakteristische ESR-Spektrum ermöglicht eine eindeutige Zuordnung des Signals und somit die Identifikation des Superoxides. Die Stabilität des DEPMPO-OOH-Adduktes wird durch die Meßtemperatur von 37°C kaum beeinflußt, so daß die geringeren Konzentrationen des


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Spintraps für ein detektierbares ESR-Signal ausreichend sind.


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3.7.2 Mitochondrien.

Abb. 47. Schematische Darstellung des morphologischen Aufbaus und der Elektronentransportkette in Mitochondrien (mit Modifizierungen nach [97]). Abkürzungen: DH - Dehydrogenase, Q - Ubiquinon, FeS - Eisen-Schwefel Protein, AA - Antimycin A, MTZ - Myxothiazol, TTFA- Thenoyltrifluoroaceton. Im Schema der Atmungskette ist der Elektronenfluß mit Pfeilen gekennzeichnet.

Die Radikalbildung durch Mitochondrien wird in Zusammenhang mit den Ischämie-Reperfusionsschäden [84,109], mit dem Alterungsprozeß [96,102], mit der Toxizität verschiedener Pharmaka [53] sowie im Zusammenhang mit bestimmten Erbkrankheiten [44] untersucht. Die besondere Aufmerksamkeit der Forscher gilt speziell diesen Zellorganellen, da Mitochondrien den weitaus größten Teil des zellulären Sauerstoffes verbrauchen. Je nach Zelltyp fließen mehr als 90% des gesamten in der Zelle vorhandenen Sauerstoffes in die mitochondriale Atmungskette ein.

Mitochondrien kommen in allen pflanzlichen und tierischen Zellen vor. Es sind von einer äußeren und inneren Membran umschlossene Funktionseinheiten, die der Bildung biologischer Energieträger (ATP) dienen. Die äußere einfach gebaute Membran ist nur für Moleküle mit einer Größe unter 5000 Dalton frei permeabel. Die innere Membran kann nur mit Hilfe von speziellen Transportproteinen für einen Stoffaustausch zwischen dem inneren Raum (Matrix), in dem der Stoffwechsel stattfindet, und dem mit


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dem Cytoplasma der Zelle kommunizierenden Intermembranraum überwunden werden (s. Abb. 47 ). Die hierfür sowie für alle biologischen Leistungen erforderliche Energie wird durch die mit der inneren Membran assoziierten Komponenten der Atmungskette bereitgestellt. Die Energieträger hierfür sind verschiedene Metabolite des Zitronensäurezyklus (Succinat, NADH, FADH). Diese werden über die Komponenten der Atmungskette schrittweise oxidiert, wobei molekularer Sauerstoff als terminaler Elektronenakzeptor dient. Die stufenweise freigesetzte Energie wird in Form einer energiereichen Phosphatbindung im ATP-Molekül fixiert (oxidative Phosphorylierung).

Die ATP-Bildung ist somit an die Oxidation des Substrates gebunden (oder gekoppelt).

Die Voraussetzung für eine möglichst effiziente Umsetzung der bei der Oxidation frei werdenden Energie in den biologischen Energieträger ATP ist der kontrollierte Elektronen-Transport über die Transportmoleküle der Atmungskette. Der Elektronen-Transfer erfolgt durch Einzelelektronenschritte bis hin zur Cytochromoxidase, wo der Sauerstoff solange fest gebunden bleibt, bis nacheinander 4 Elektronen übertragen worden sind. Nach der Protonierung wird der reduzierte Sauerstoff in Form von Wasser in den Zellkörper (Zytoplasma) freigesetzt. Da Sauerstoff wegen seiner Elektronenkonfiguration Elektronen nur einzeln aufnehmen kann, ist schon lange vermutet worden, daß auf der Reduktionsseite der Cytochromoxidase Elektronen durch andere Komponenten der Atmungskette direkt auf das O2-Molekül übertragen werden können, wodurch O2-.-Radikale entstehen.

Die O2-.-Bildung in der mitochondrialen Atmungskette wurde erstmals bei der Hemmung von Atmung an Cytochrom b durch Antimycin A (AA) nachgewiesen [78] (siehe Abb. 47 ). Unter diesen Bedingungen akkumulieren die Elektronen auf der Reduktionsseite des Cytochrom b, so daß sich in diesem Abschnitt der Atmungskette alle Elektronen-Carrier in voll reduziertem Zustand befinden. Thermodynamisch sind in Anwesenheit von Antimycin A die Elektronen-Carrier in der Lage, O2-Moleküle univalent zu reduzieren.

Abb. 48. Kinetik der Adrenochrombildung an den Antimycin A (AA)-blockierten Mitochondrien mit Succinat als Atmungssubstrat. Die Mitochondrien wurden in der Konzentration 0.5mg Protein/ml im Meßpuffer (0.3M Sucrose, 20mM Triethanolamin, 500mg/l BSA 1mM EDTA) suspendiert, mit 10mM Succinat und 1mM Epinephrin versetzt und die O2-.-Bildung durch AA (2µg/ml) gestartet.

Die spontane oder pathophysiologisch induzierte O2-.-Bildung über die mitochondriale Atmungskette wird in der Literatur widersprüchlich diskutiert [99,101,106,132], während einheitlich von allen Autoren die AA-iduzierte O2-.-Bildung bestätigt wird. Daher wurde diese Bedingung der mitochondrialen O2-.-Bildung als Standard für die Beurteilung der Eignung der in der Literatur verwendeten Nachweismethoden gewählt.


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3.7.2.1 Anwendung von Farbstoffen zum Nachweis der O2-.-Bildung an Mitochondrien.

Von drei im Modellsystem getesteten Farbstoffen - Cytochrom c, Epinephrin und Nitroblau Tetrazolium - kommen prinzipiell nur Cytochrom c und Epinephrin in Betracht, wenn die Superoxidradikalbildung an Mitochondrien untersucht werden soll.

NBT ist für den Nachweis der O2-. -Radikalbildung an Mitochondrien ungeeignet, da ein Enzymkomplex (Succinat-Dehydrogenase) bekannt ist, der Elektronen direkt auf NBT überträgt [1,8,37]. Die Geschwindigkeitskonstante der enzymatischen Reduktion übersteigt die Reduktion durch mitochondrial gebildete O2-. -Radikale um den Faktor 100 oder mehr. Außerdem können sich die wasserunlöslichen Reaktionprodukte (Formazane) in der mitochondrialen Membran anlagern und dadurch die Superoxidbildung beeinflussen. Im weiteren wurde der Nachweis der Superoxidbildung mit den beiden erwähnten Farbstoffen, Cytochrom c und Epinephrin, an Mitochondrien durchgeführt.

Die Superoxidbildung an Mitochondrien wurde durch die Zugabe von Antimycin A während der Succinatatmung in Gang gesetzt (nach [78]). In den parallel durchgeführten Experimenten wurden stets die Atmungsparameter und die Kopplungskonstante der Mitochondrien kontrolliert (s. Kapitel 2.5.2.2).

Abb. 49. Reduktion von acetyliertem Cytochrom c durch Succinat-veratmende Mitochondrien. Mitochondrien wurden in der Konzentration 0.5mg Protein/ml im Meßpuffer (0.3M Sucrose, 20mM Triethanolamin, 500mg/l BSA, 1mM EDTA) suspendiert, mit 50µM acetyliertem Cytochrom c und 10mM Succinat versetzt. Die Endkonzentrationen von SOD und Myxothiazol waren 10µg/ml bzw. 2µg/ml.

Ein typischer kinetischer Verlauf der O2-.-abhängigen Adrenochrombildung an Mitochondrien bei Anwendung von Epinephrin zeigt Abb. 48 . Mitochondrien (RHM) wurden in der Konzentration von 0.5mg Protein/ml in dem Meßpuffer suspendiert, mit 10mM Succinat und 1mM Epinephrin versetzt. Die das Succinat veratmenden Mitochondrien verursachten vor dem Zusatz von Antimycin A keine wesentlichen Veränderungen der optischen Dichte bei 480 nm. Erst wenn Antimycin A zugegeben wurde, konnte die für Adrenochrom charakteristische Zunahme der optischen Dichte bei 480nm beobachtet werden. Mit Zugabe von SOD konnte die Adrenochrombildung vollkommen gehemmt werden.


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Abb. 50. Lucigenin-Chemilumineszenz an O2-.-bildenden Mitochondrien (RHM). Effekt von SOD. RHM wurden in der Konzentration 0.5mg Protein/ml im Meßpuffer suspendiert, mit 10mM Succinat versetzt und die O2-.-Bildung durch Antimycin A (AA, 2µg/ml) gestartet. Die Konzentration des Lucigenins war 50µM. Die Endkonzentration von SOD betrug 10µg/ml.

Eine andere Kinetik ergibt sich, wenn acetyliertes Cytochrom c zum Superoxidnachweis an Mitochondrien eingesetzt wurde. Die Acetylierung des Cytochroms erschwert seinen Umsatz durch mitochondriale Enzyme, läßt aber seine Reaktivität mit Superoxidradikalen praktisch unverändert.

Abb. 51. Einfluß des Hemmstoffes TTFA auf den SOD-insensitiven Anteil der Lucigenin-Chemilumineszenz beim Superoxid-Nachweis an Mitochondrien (RHM). Die Induktion der O2-.-Bildung durch RHM erfolgte wie in Abb. 50 angegeben. Die Endkonzentrationen von SOD und TTFA waren 10µg/ml bzw. 1mM.

Wie die Abb. 49 jedoch zeigt, wurde eine Zunahme der optischen Dichte bei 550nm, die für Cytochrom c-Reduktion charakteristisch ist, beobachtet noch bevor die Superoxidbildung an RHM gestartet wurde ( Abb. 49 ). Die Reduktion des Cytochroms erfolgte bei der Succinat-Atmung der Mitochondrien und war unabhängig davon, ob Antimycin A zugegeben wurde oder nicht. Da SOD keinen Einfluß auf die Reduktionsrate hatte ( Abb. 49 ), muß die Reaktion ohne Beteiligung von Superoxidradikalen ablaufen. Einen weiteren Beweis dafür, daß acetyliertes Cytochrom c direkt durch die Komponenten der Atmungskette reduziert wird, ergibt sich aus der Tatsache, daß Myxothiazol, ein Hemmstoff der


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mitochondrialen Atmung (s. Abb. 47 ), die weitere Reduktion verhindern konnte. Außerdem wurde eine Oxidation des vorher reduzierten Cytochrom c nach der Zugabe von Myxothiazol beobachtet.

Diese Wechselwirkung zwischen den Mitochondrien und dem Nachweisfarbstoff läßt sich interpretieren, wenn der Aufbau der mitochondrialen Atmungskette einbezogen wird.

Cytochrom c ist eine natürliche Komponente der Atmungskette (s. Abb. 47 ). Während der Succinat-Atmung fließen Elektronen entlang der Atmungskette und werden durch die entsprechende Reduktase auf mitochondriales Cytochrom c übertragen, von dem sie weiter durch Cytochrom-Oxidase auf Sauerstoff übertragen werden ( Abb. 47 ). Wenn jedoch Cytochrom c als Nachweissubstanz extra zugegeben wird, dann können die Elektronen aus der Atmungskette nicht nur auf mitochondriales, sondern auch auf exogen zugegebenes Cytochrom c übergehen. Dies entspricht der beobachteten, gegenüber SOD insensitiven Reduktion von Cytochrom c in Anwesenheit von Succinat.

Wird der Elektronentransport entlang der Atmungskette durch Myxothiazol blockiert (s. Abb. 47 ), bleibt mitochondriales Cytochrom c oxidiert. In diesem Fall können die stark oxidierten Cytochromoxidasen der Atmungskette auch exogenes reduziertes Cytochrom c als Substrat nutzen, wobei exogenes reduziertes Cytochrom c oxidiert wird. Dies erklärt die Abnahme der optischen Dichte bei 550nm nach der Zugabe von Myxothiazol.

Obwohl die Acetylierung des Cytochroms den enzymatischen Umsatz verhindern soll, ist eine 100%-ige Acetylierung praktisch nicht erreichbar. In den kommerziell erworbenen Reagenzien sind nur ca. 60% der Lysinreste des Cytochroms acetyliert.

Auf Grund der hier dargestellten Untersuchungen kann geschlossen werden, daß der Beitrag der enzymatisch bedingten Reduktion des Cytochroms über die superoxidabhängige Reduktion dominiert, so daß letztere nicht erfaßt werden kann.

3.7.2.2 Chemilumineszenz-Untersuchungen der O2-.-Bildung an Mitochondrien.

Für Chemilumineszenzuntersuchungen der Superoxidbildung an RHM wurden diese in der Konzentration von 0.5mg Protein/ml in dem Meßpuffer (s. Kapitel 2.5.2.1) suspendiert und mit dem Atmungssubstrat Succinat (10mM) versetzt. Die im Kapitel 3.5.2 bestimmte optimale Konzentration des Lucigenins von 50µM wurde auch in diesem System eingesetzt. Die Bildung von O2-.-Radikalen an Mitochondrien wurde durch Zugabe des Hemmstoffes Antimycin A in Gang gesetzt (Abb. 47 und Erläuterungen im Kapitel 3.7.2)

Wenn die Superoxid-Bildung an Mitochondrien in Anwesenheit des Lucigenins gestartet wurde, konnte eine Chemilumineszenz beobachtet werden ( Abb. 50 ). Die Succinat-Atmung ohne Antimycin A wurde nicht durch erhöhte Chemilumineszenz begleitet. Obwohl Lucigenin als spezifische Probe für Superoxidradikale angesehen wird, war seine Chemilumineszenz in diesem System nur zum Teil mit SOD hemmbar ( Abb. 50 ). Der Einsatz höherer Konzentrationen von SOD führte zu keiner weiteren Hemmung.

Um den Ursprung der gegenüber SOD insensitiven Komponente zu klären, wurde der Einfluß verschiedener Hemmstoffe der Atmung auf die Chemilumineszenz untersucht. Da die Bildung des lumineszierenden Produktes bei der Lucigenin-Chemilumineszenz die Aufnahme zweier Elektronen und eines O2-Moleküls erfordert, besteht die Möglichkeit einer direkten Elektronenübertragung von der Atmungskette auf Lucigenin und anschließender Reaktion mit Superoxid.


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Abb. 52. Wirkung der Hemmstoffe der mitochondrialen Atmungskette (Kaliumcyanid, Myxothiazol) auf den SOD-insensitiven Anteil der Lucigenin-Chemilumineszenz beim Superoxid-Nachweis an Mitochondrien. Probenzusammensetzung: 0.5mg Protein/ml RHM, 10mM Succinat, 2µg/ml Antimycin A, 50µM Lucigenin, 10µg/ml SOD, 1mM Kaliumcyanid, 2µg/ml Myxothiazol

Wie in Abb. 51 dargestellt, konnte der Hemmstoff Thenoyltrifluoroaceton (TTFA), der den Elektronenfluß von der Succinat-Dehydrogenase zu den nachfolgenden Komponenten der Atmungskette blockiert (Abb. 47), die gegen SOD insensitive Komponente der Lucigenin-Chemilumineszenz hemmen. Zur Überprüfung, ob TTFA durch einen atmungsunabhängigen hemmenden Effekt auf die Lucigenin-Chemilumineszenz wirkt, wurden die Kontrollexperimente im Xanthin/Xanthinoxidase System durchgeführt. Diese ergaben, daß TTFA keine ausgeprägte hemmende Wirkung auf die Lucigenin-Chemilumineszenz in diesem Modellsystem hat. Daher wurde die an Mitochondrien beobachtete Hemmung durch TTFA ausschließlich der Blockierung der Atmungskette zugeordnet.

Kaliumcyanid (KCN), ein Hemmstoff der Atmungskette an der Stelle der Cytochromoxidase (Abb. 47), trug ebenfalls zu einer weiteren Hemmung der gegen SOD insensitiven Komponente der Lucigenin-Chemilumineszenz an den Superoxid produzierenden Mitochondrien bei ( Abb. 52 ). Eine 100%-ige Hemmung wurde mit diesem Hemmstoff jedoch nicht erreicht (maximale Konzentration 4mM). Die restliche SOD- und KCN-unabhängige Chemilumineszenz des Lucigenins konnte durch die Zugabe von Myxothiazol eliminiert werden.

Ob die beiden Hemmstoffe eine unspezifische Auswirkung auf die Intensität der Lucigenin-Chemilumineszenz haben, wurde durch die Experimente im Xanthin/Xanthinoxidase System untersucht. Weder Kaliumcyanid (1mM) noch Myxothiazol (2µg/ml) in den Konzentrationen, wie für die Experimente an Mitochondrien eingesetzt, konnten die Intensität der Chemilumineszenz im Modellsystem beeinflussen. Dies beweist, daß die Wirkung von Kaliumcyanid und Myxothiazol auf die Hemmung des Elektronentransportes zurückzuführen ist.

Der komplizierte morphologische Aufbau der Mitochondrien ermöglicht keine eindeutige Interpretation dieser Ergebnisse. Die teilweise SOD-Hemmbarkeit der Lucigenin-Chemilumineszenz kann verschiedene Ursachen haben. Erstens kann die Chemilumineszenz nicht ausschließlich durch Wechselwirkung des Lucigenins mit Superoxidradikalen zustande kommen. Eine direkte Übertragung zweier Elektronen aus der Atmungskette auf das Lucigenin-Molekül mit radikalischer Addition eines Sauerstoffmoleküls würde die formellen stöchiometrischen Anforderungen einer von Chemiluminesz begleiteten Lucigenin-Reaktion erfüllen. Zweitens könnten die produzierten Superoxidradikale mit Lucigenin im Intermembranraum reagieren, zu dem ein großes SOD-Molekül jedoch keinen Zugang hat. Die exogen zugegebene SOD könnte in diesem Fall nur den Teil der Lucigenin-Chemilumineszenz löschen, der den aus den Mitochondrien freigesetzten O2-.-Radikalen zugeordnet werden kann, während die Chemilumineszenz aus dem Zwischenmembranraum unbeeinflußt bliebe.


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Um diese Probleme zu klären, wurden Experimente zur Superoxidbildung an submitochondrialen Partikeln (SMP) durchgeführt. Die SMP bestehen aus geschlossenen Fragmenten der Innenmembran, besitzen keine Außenmembran und verfügen deshalb über keine Restriktion für den Zugang von SOD zu dem Intermembranraum. Der Elektronentransport der Atmungskette bleibt in den SMP ungestört erhalten und die O2-.-Bildung kann - genauso wie an Mitochondrien - durch Antimycin A und Succinat in Gang gesetzt werden.

Abb. 53. Lucigenin-Chemilumineszenz beim Nachweis der Superoxidradikale an SMP. Antimycin A und Lucigenin wurden zu SMP zugegeben und die O2-.-Bildung wurde durch die Zugabe von Succinat gestartet. Die Endkonzentration von SOD betrug 10bzw.20µg/ml.

Wäre der morphologische Aufbau der Mitochondrien der einzige Grund für die Existenz der gegen SOD insensitiven Komponente, dann sollte die Lucigenin-Chemilumineszenz beim Superoxid-Nachweis an SMP vollkommen mit SOD hemmbar sein. Wie Abb. 53 jedoch zeigt, ist die Lucigenin-Chemilumineszenz auch beim Nachweis der O2-.-Radikale an SMP nur teilweise mit SOD hemmbar. Myxothiazol konnte hingegen die gegen SOD insensitive Komponente hemmen, so daß ein Teil der Chemilumineszenz auf eine direkte Reduktion des Lucigenins durch die Atmungskette zurückgeführt werden kann.

Somit kann die Intensität der Lucigenin-Chemilumineszenz nicht zur Beurteilung der O2-.-Radikalbildung an Rattenherzmitochondrien dienen, da vermutlich eine direkte Reduktion durch die Komponenten der Atmungskette zur Chemilumineszenz beiträgt.

3.7.2.3 Spintrapping-Technik zum Nachweis von O2-.Bildung an Mitochondrien.

Der neue Spintrap DEPMPO wurde zum Nachweis der Superoxidradikalbildung an RHM unter der klassischen Bedingung - Succinat-Atmung an den durch Antimycin A gehemmten Mitochondrien [78] - angewendet. In den Kontrollexperimenten wurde untersucht, ob DEPMPO in der für die ESR-Messungen eingesetzten Konzentration einen Einfluß auf die Atmungsparameter der Mitochondrien (s. Kapitel 2.5.2.2) hat. Die Ergebnisse dieser Experimente sind in der Tabelle 6 dargestellt.

Tabelle 6. Einfluß des Spintraps DEPMPO auf die Atmungsparameter von Mitochondrien.

Parameter

Kontrolle

+2mM DEPMPO

Atmungszustand 4, nmol O/min/mg

21,10

19,73

Atmungszustand 3, nmol O/min/mg

162,39

143,59

RC

7,70

7,28

P/O

2,40

2,46


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Wie die Atmungsparameter zeigen ( Tabelle 6 ), hat DEPMPO in millimolarer Konzentration keine toxische Wirkung auf die Mitochondrien und beeinflußt nicht die Effizienz der Phosphorylierung.

Um die Superoxidbildung an RHM zu initiieren, wurden die Mitochondrien (5.55mg Protein/ml) mit Succinat (100mM) versetzt und der Hemmstoff der mitochondrialen Atmung, Antimycin A (20µg/ml), zugegeben. Nach 5min Inkubation dieser Mischung mit 25mM DEPMPO unter Sauerstoffbegasung wurde sie in die ESR-Meßzelle umgefüllt und die ESR-Spektren aufgenommen. Eine Sättigung des Meßpuffers mit Sauerstoff war notwendig, um eine für die Identifizierung der Addukte ausreichende Intensität des ESR-Signals zu erhalten.

Abb. 54. ESR-Signal von DEPMPO an den Antimycin A-gehemmten Mitochondrien mit Succinat als Atmungssubstrat. A: die Summe von 4 Spektren; B: nach 20min Inkubation. Mit * ist das DEPMPO-OH-Addukt markiert. Die Einstellungen des ESR-Spektrometers waren: Leistung - 2mW, Scanbreite - 150G, Verstärkungsfaktor - 106, Modulationsamplitude - 1G, Zeitkonstante - 0.164s, Scangeschwindigkeit - 53.64G/min, Resonatortyp - 9403TM362. Sonstige Erläuterungen s. im Text.

Das in Abb. 54 dargestellte ESR-Signal stellt das Ergebnis der Summierung von vier nacheinander aufgenommenen Spektren dar. Das ESR-Spektrum kann einer Mischung verschiedener Addukte zugeschrieben werden, von denen das dominante die Aufspaltungskonstanten des DEPMPO-OH-Adduktes aufweist (aH=13.24G, aN=14.02G, aP=47.15G). Das Differenz-Spektrum konnte wegen der geringeren Signalintensität nicht eindeutig identifiziert werden, könnte aber auch dem DEPMPO-OOH-Addukt zuzuschreiben sein.

Das DEPMPO-OH-Addukt ist jedoch in Anwesenheit von RHM instabil. Wie Abb. 54 B zeigt, nimmt die Intensität des ESR-Signals von diesem Addukt nach 20min deutlich ab, obwohl im Modellsystem Xanthin/Xanthinoxidase das gleiche Addukt stabil blieb (s. Kapitel 3.6.2). Vermutlich wird die Stabilität des DEPMPO-OH-Adduktes durch die Wechselwirkungen mit den Komponenten der mitochondrialen Atmungskette beeinflußt. Das Fehlen eines deutlichen Signals des DEPMPO-OOH-Adduktes an O2-.-produzierenden Mitochondrien ist eventuell auf dieselben Wechselwirkungen zurückzuführen.

Die Applikation des neuen Spintraps DEPMPO zum O2-.-Radikalnachweis an Mitochondrien hat folgende Ergebnisse gebracht. Die Konzentrationen von DEPMPO, die für ein detektierbares ESR-


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Signal eingesetzt werden müssen, sind für Mitochondrien nicht toxisch. Das ESR-Signal des DEPMPO-OH-Adduktes konnte sicher identifiziert werden, wenn RHM durch Hemmung mit Antimycin A zur O2-.-Bildung gebracht wurden. Der Mangel an detektierbarem DEPMPO-OOH-Addukt sowie die Instabilität des DEPMPO-OH-Adduktes sind vermutlich auf die Wechselwirkung mit der mitochondrialen Atmungskette zurückzuführen.


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Mon Nov 20 13:03:05 2000