Udilova, Natalia: Vergleichende Untersuchung von Methoden zum Nachweis von Superoxidradikalen in biologischen und Modellsystemen.

79

Kapitel 4. Diskussion.

O2-.-Radikale sind Metabolite biologischer Prozesse. Wenn ihre Bildung aus endogener oder exogener Ursache übermäßig stimuliert wird, ist das natürliche enzymatische und nicht-enzymatische Schutzsystem nicht mehr ausreichend, um oxidative Schäden biologischer Strukturen zu verhindern. Es entwickelt sich das Bild des „oxidativen Stresses“, dem bei vielen Erkrankungen eine pathogene Bedeutung zukommt. Initiatormolekül des oxidativen Stress-Geschehens ist der univalent reduzierte Sauerstoff, das Superoxidradikal. Bestimmte biologische Funktionseinheiten sind u.U. in der Lage, dieses Initialerreignis in die Wege zu leiten, so daß es erforderlich ist, Bedingungen und Ausmaß der O2-.-Bildung an diesen biologischen Systemen zu studieren. Obwohl es eine relativ große Anzahl von Nachweismethoden für O2-.-Radikale gibt, ist die Detektion an biologischen Systemen mit einer großen Unsicherheit behaftet. Von einer zuverlässigen Methode wird erwartet:

daß die Anwesenheit des Nachweisproduktes das Auftreten der Superoxid-Radikale anzeigt (qualitativer Aspekt)

daß auch die Bildungsrate der Superoxidradikale nachgewiesen werden kann (quantitativer Aspekt)

Die quantitative Kalibrierung der Methoden erfordert eine Radikalbildungsquelle mit klar definierbarer O2-.-Bildungrate. Ein solches System ist jedoch nicht verfügbar. Annährungsweise konnte dieses Problem mit dem Xanthin/Xanthinoxidase System gelöst werden, da sich bei Kenntnis der Reaktionsstöchiometrie aus dem Sauerstoffverbrauch und dem Auftreten des oxidierten Elektron-Donators (Harnsäure) die O2-.-Bildungsraten errechnen lassen.

4.1 Vor- und Nachteile des Xanthin/Xanthinoxidase Systems als O2-.-Bildungsquelle.

Um die verschiedenen Detektionsverfahren vergleichbar zu machen, war es erforderlich, diese mit Hilfe einer definierten und reproduzierbaren O2-.-Bildungsquelle zu eichen. Um die Bewertung der Superoxid-Nachweismethoden mit Bezug auf ihre biologische Anwendbarkeit zu ermöglichen, muß die verwendete Bildungsquelle Superoxidradikale in wässerigem Medium bei physiologischem pH-Wert produzieren. Weitere zu fordernde Eigenschaften der O2-.-Bildungsquelle sind:

gut steuerbare und quantitativ nachvollziehbare O2-.-Bildungsraten;

sie sollte chemisch inert sein;

sie sollte eine homogene Verteilung der produzierten O2-.-Radikale sicherstellen.

Je nach Fragestellung werden verschiedene O2-.-Bildungsquellen in der Forschung eingesetzt ( Tabelle 7 ). Methoden der photo- und elektrochemischen, enzymatischen, radiolytischen sowie chemischen Produktion der Superoxidradikale sind in der Literatur beschrieben [2,19,24,59,60,77,146].

Da Superoxid-Radikale in wässeriger Lösung bei neutralem pH-Wert schnell dismutieren, werden sie gewönlich in einem stabilisierenden alkalischen oder aprotischen Medium erzeugt. Um eine konstante O2-.-Bildungsquelle zu erhalten, wird die elektrochemisch oder chemisch erzeugte Superoxidlösung mit konstanter Geschwindigkeit unter ständigem Rühren in die Probe infundiert. Der Nachteil dieser Methoden ist die Instabilität der Superoxid-Stammlösung sowie die quantitativ schlecht nachvollziehbare O2-.-Bildungsrate ( Tabelle 7 ).

Im Fall der photochemischen oder radiolytischen O2-.-Radikalbildung ist eine Interaktion der entsprechenden Strahlung mit dem Detektionssystem nicht auszuschließen. Die enzymatische O2-.-Bildung durch das Xanthin/Xanthinoxidase System entspricht den oben genannten Anforderungen nur teilweise, ermöglicht aber die Einstellung unterschiedlicher Bildungsraten sowie die quantitative Abschätzung der freigesetzten O2-.-Menge.


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Tabelle 7. Eignung verschiedener Superoxidbildungquellen für die quantitative Bewertung der Nachweismethoden.

Art der O2-.-Bildung

Reaktion

Bedingungen (s. oben) erfüllt?

 

 

1)

2)

3)

Chemisch

KO2 in Kronenäther, (MeN)O2

+

++

_

Photochemisch

Photolyse, Flavine, Tetrapyrrole

+

_

++

Enzymatisch

Xanthin/Xanthinoxidase

++

++

++

Elektrochemisch

O2 -Reduktion

+

_

_

Radiolytisch

beta-Strahlung

_

_

+

Die Frage, ob bei der Elektronenübertragung auf Sauerstoff durch Xanthinoxidase nur Superoxidradikale entstehen, wird in der Literatur kontrovers diskutiert [76,79,150]. Da Wassserstoffperoxid als Dismutationsprodukt der O2-.-Radikale stets im System vorhanden ist, ist es schwer zu unterscheiden, ob H2O2 auch durch direkte Xanthinoxidase-katalysierte Übertragung zweier Einzelelektronen oder nachfolgender Dismutation der primär gebildeten O2-.-Radikale oder beide zugleich entstehen.

Katalase, die dem Xanthin/Xanthinoxidase System stets zugegeben wurde, eliminiert das H2O2, so daß nur O2-.-Radikale in der Lösung weiter existierten.

Obwohl ein Teil der durch Xanthinoxidase übertragenen Elektronen in die Bildung von Wasserstoffperoxid gemäß dem genannten Mechanismus einfließen kann, wird der Anteil der in die Superoxidbildung fließenden Elektronen als konstant postuliert, wenn die Bildungsrate der Harnsäure im Bereich 1-12µM/min liegt.

Auch die Bildung von Hydroxyl-Radikalen wurde dem Xanthin/Xanthinoxidase System zugeschrieben [17,68]. Die genauere Analyse ergab jedoch, daß diese nur als sekundäres Produkt aus H2O2 in Anwesenheit von katalytischen Spuren von Übergangsmetallen (u.a. Eisen) in einer Fenton-Typ-Reaktion entstehen [30,76]. Wurde Eisen mit Hilfe von DTPA (1mM) aus dem Reaktionssystem herauscheliert sowie H2O2 durch Katalase eliminiert, dann konnte die Hydroxylradikalbildung im Xanthin/Xanthinoxidase System völlig unterdrückt werden.

Dies wurde experimentell mittels Spintrapping-Experimenten mit DEPMPO in dem Modellsystem Xanthin/Xanthinoxidase überprüft. Spintrapping mit DEPMPO ermöglicht eine Differenzierung zwischen Hydroxyl- und Superoxidradikalen, da die ensprechenden Addukte stabil sind und unterschiedliche ESR-Spektren ergeben (Kapitel 3.6). Die ESR-Experimente haben gezeigt, daß keine Hydroxylradikale neben dem Superoxid in dem Modellsystem gebildet werden, wenn dem Reaktionssystem Eisenchelatoren und Katalase zugesetzt wurden (Abb. 27).

Somit ermöglicht das erarbeitete Modellsystem aus Xanthin/Xanthinoxidase, DTPA und Katalase die Bildung der Superoxidradikale in definierten Raten, so daß verschiedene Methoden des qualitativen und quantitativen O2-.-Nachweises miteinander verglichen werden konnten.

4.2 Anwendbarkeit der photometrischen Methoden.

Die photometrischen Methoden zum Nachweis von Superoxidradikalen sind methodisch am unkompliziertesten, daher werden sie am häufigsten in der biologischen Forschung eingesetzt. Das Meßprinzip beruht darauf, daß O2-.-Radikale mit einer Nachweissubstanz reagieren, die nachfolgend in ein farbiges Reaktionsprodukt umgewandelt wird.

Um die qualitativen und quantitativen Aspekte des photometrischen O2-.-Nachweises zu analysieren, betrachten wir ein vereinfachtes Modell. Dieses besteht aus einer Superoxidradikalquelle X, welche O2-.-Radikale mit der Geschwindigkeit v produziert ( Reaktion 37 ), und aus einer Nachweissubstanz N, die mit O2-.-Radikalen reagiert, wobei ein photometrisch nachweisbares Reaktionsprodukt P entsteht ( Reaktion 39 ). Neben dieser Nachweisreaktion können O2-.-Radikale auch über die spontane Dismutationsreaktion aus dem System verschwinden ( Reaktion 38 ).


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X rarr O2-.

Reaktion 37

2 O2-. + 2H+ rarr H2O2 + O2

Reaktion 38

O2-. + N rarr P

Reaktion 39

Die Geschwindigkeitskonstante der Reaktion 38 wurde bei physiologischem pH-Wert unter der Berücksichtigung des Anteils protonierter Superoxidradikale in Kapitel 3.3.1 errechnet (k1=5.105M-1s-1).

Um die Konzentrationen aller Komponenten im Verlauf der Reaktionen zu beschreiben, müssen kinetische Differenzialgleichungen angesetzt werden:

Gleichung 12

wobei S und N - die Konzentrationen der O2-.-Radikale bzw. der Nachweissubstanz sind.

Ist die Geschwindigkeitskonstante k2 für die Nachweissubstanz groß genug, um mit der Spontandismutation zu konkurrieren, d.h. k2SN>>k1S2 , dann kann k1S2 vernachlässigt werden. Unter dieser Bedingung für den stationären Zustand gilt:

und daher

Gleichung 13

Gleichung 13 zeigt, daß die Bildungsrate des Reaktionsproduktes der Superoxidbildungsgeschwindigkeit v bei photometrischem Nachweis gleich ist, wenn das Reaktionsprodukt P stabil und die Reaktion von O2-.-Radikalen mit der Nachweissubstanz N schneller als die Dismutation ist. Wie die vorliegenden Untersuchungen zeigen, gibt es jedoch je nach dem Objekt, an welchem O2-.-Radikale nachzuweisen sind, und je nach Nachweissubstanz mehr oder weniger ausgeprägte quantitative und/oder qualitative Abweichungen von Gleichung 13 .

Da beim photometrischen Nachweis die Bildungsrate des Reaktionsproduktes über die Veränderung der optischen Dichte gemessen wird (Gleichung 1), wird die Empfindlichkeit einer photometrischen Methode (im Sinne der minimal detektierbaren Superoxidbildungsrate vmin) hauptsächlich durch den Extinktionskoeffizienten epsilonlambda des nachweisbaren Reaktionsproduktes sowie durch die Empfindlichkeit des Spektrophotometers bestimmt:


82

Gleichung 14

worin - die minimale detektierbare Veränderung der optischen Dichte ist. Je höher der Extinktionskoeffizient epsilonlambda eines Reaktionsproduktes ist, um so empfindlicher ist das Detektionssystem.

4.2.1 Cytochrom c.

4.2.1.1 Qualitative Selektivität.

Cytochrom c wird durch O2-.-Radikale reduziert, was über die Änderung der optischen Dichte bei 550nm verfolgt wurde. Der Reaktionsmechanismus der Reduktion von Cytochrom c besteht in der Übertragung eines Elektrons vom Superoxidradikal auf das Häm-Eisen des Cytochroms ( Reaktion 40 ).

Aus thermodynamischer Sicht ist die Reaktion zwischen dem Cytochrom c und Superoxid günstig. Da das Standardredoxpotential E0´ für die Reduktion von Cytochrom c +260mV beträgt [33], während das entsprechende Redoxpotential für die Reduktion des Sauerstoffs zum Superoxid E0´=-330mV ist [33], weist die gesamte Reaktion

Cyt.c-Fe3+ + O2 - rarr Cyt.c-Fe2+ + O2

Reaktion 40

ein Delta E0´ von 590mV=(260-(-330))mV auf. Damit eine chemische Reaktion spontan ablaufen kann, muß die Veränderung der Gibbs‘schen freien Energie DeltaG ( Gleichung 15 ) negativ sein.

DeltaG =-etaF Delta E

Gleichung 15

Diese Bedingung ist für die Reaktion 40 annährend erfüllt (Delta E0‘=590mV>0).

Wie die Experimente an den Superoxid-produzierenden Systemen Xanthin/Xanthinoxidase (Abb. 3) sowie stimulierten PMN (Abb. 33) bestätigt haben, wird Cytochrom c leicht durch O2-.-Radikale reduziert. Die Reduktion von Cytochrom c in biologischen Systemen ist jedoch nicht immer die Folge der Superoxidbildung. So kann Cytochrom c neben den Superoxidradikalen auch durch bestimmte zelluläre Enzyme reduziert werden [105]. Da Cytochrom c auch eine elektronenübertragende Funktion in der mitochondrialen Atmungskette hat, können Elektronen der Atmungskette das als Nachweissubstanz zugesetzte Cytochrom c auch direkt reduzieren, so daß es zu einem Anstieg der Absorption bei 550nm auch ohne Vorhandensein von Superoxidradikalen kommt [28].

Um dieses Problem zu umgehen, wurde versucht, die enzymatische Reduktion des Cytochrom c durch Derivatisierung des Moleküls zu verhindern. Succinylierung der Lysin-Reste von Cytochrom c macht dieses unempfindlicher gegenüber Redoxsystemen der mikrosomalen Elektronentransportkette [69], während Acetylierung der Lysin-Reste das Cytochrom unanfälliger gegen Oxidation oder Reduktion durch mitochondriale Enzyme macht [11].

Der Versuch, die O2-.-Bildung an intakten Mitochondrien mit acetyliertem Cytochrom c nachzuweisen, hat jedoch ergeben, daß die mitochondriale Atmungskette auch acetyliertes Cytochrom c direkt reduziert (Abb. 46), so daß der Beitrag der durch O2-.-Radikale vermittelten Reduktion mit diesem Nachweissystem nicht meßbar war.

Obwohl der Umsatz des Cytochroms durch mitochondriale Enzyme mit der Zunahme seines Acetylierungsgrades sinkt [94], ist seine Anwendbarkeit zum O2-.-Nachweis an Mitochondrien auf diese Weise nicht zu verbessern, da die reduzierte Form des Cytochroms mit Acetylierung ge60% instabil ist und autoxidiert [71].

Ob die Reduktion von Cytochrom c in einem System durch O2-.-Radikale erfolgt, läßt sich mit Hilfe des


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Enzyms Superoxid Dismutase (SOD) überprüfen. SOD katalysiert die Dismutation von Superoxidradikalen (Kapitel 3.2), so daß der über O2-.-Radikale reduzierte Anteil des Cytochrom c durch SOD voll hemmbar wird. Daher kann eine SOD-hemmbare Reduktion des Cytochom c als Beweis für die stattfindende Bildung der O2-.-Radikale in einem zu untersuchenden System gelten.

Ist die Reduktion des Cytochrom c nicht meßbar oder SOD-insensitiv, dann kann dennnoch eine Superoxidbildung in dem System nicht ausgeschlossen werden, da die am Elektronentransport beteiligten Komponenten (Enzyme) direkt mit der Nachweissubstanz (Cytochrom c) in Wechselwirkung treten können [28,91,105].

Das durch O2-.-Radikale reduzierte Cytochrom c kann enzymatisch sowie nicht-enzymatisch oxidiert werden, was zu einer Verminderung bis hin zur völligen Beseitigung des nachweisbaren Reaktionsproduktes führen kann. Wasserstoffperoxid kann beispielsweise reduziertes Cytochrom c oxidieren [48,71], die hierfür erforderliche Konzentration ist jedoch viel höher, als sie unter physiologischen Bedingungen erzeugt werden kann [142]. Hydroxylradikale, Stickstoffmonoxid und Peroxinitrit können ebenfalls zur nicht-enzymatischen Oxidation des reduzierten Häm-Eisen des Cytochroms beitragen [71,130,137]. Die Oxidation von reduziertem Cytochrom durch PMN (Abb. 36) oder durch die mitochondriale Atmungskette in Anwesenheit von Myxothiazol (Abb. 46) sind Beispiele für die Beseitigung des photometrischen Nachweisproduktes.

Somit kann die O2-.-vermittelte Reduktion von Cytochrom c durch eine gleichzeitig ablaufende Oxidation kompensiert werden, so daß trotz vorhandener Superoxidbildung kein reduziertes Cytochrom c (oder nur eine verminderte Menge, s. unten) nachweisbar ist.

4.2.1.2 Quantitative Ausbeute.

Die quantitative Ausbeute einer Nachweismethode wurde in der vorliegenden Arbeit über einen Wiederfindungskoeffizienten charakterisiert. Dieser ist ein Proportionalitätskoeffizient , der die nachgewiesene mit der produzierten O2-.-Bildungsrate ins Verhältnis setzt. Der Superoxidnachweis mit der Cytochrom c- Methode im Xanthin/Xanthinoxidase Modellsystem ergab einen Wiederfindungskoeffizienten von 0.365 (Abb. 3), d.h. 36.5% des gesamten durch Xanthinoxidase umgesetzten Sauerstoffs konnte in Form von Superoxid nachgewiesen werden. Das reduzierte Cytochrom c bleibt in dem Modellsystem stabil; daher kann das oben erarbeitete Modell für die Erklärung des Wiederfindungskoeffizienten eingesetzt werden.

Die Geschwindigkeitskonstante der Reaktion zwischen Cytochrom c und Superoxid ist mit 2.6.105 M-1s-1 groß genug, um die Dismutationsreaktion zu vernachlässigen, wenn eine ausreichende Konzentration des Cytochroms eingesetzt wird. Bei der Konzentration N von Cytochrom ge50µM ist die Bedingung k2SN>>k1S2 erfüllt. Somit kann die Spontandismutation der Superoxidradikale keinen wesentlichen Einfluß auf den Wiederfindungskoeffizienten haben. Experimentell wurden keine zusätzlichen Nebenreaktionen, weder der O2-.-Radikale noch des reduzierten Cytochrom c in dem Modellsystem, registriert, welche die nachgewiesene O2-.-Bildungsrate und folglich den Wiederfindungskoeffizienten vermindern können (Kapitel 3.4.1.).

Eine Erklärung des von 1 abweichenden Wiederfindungskoeffizienten im Modellsystem ergibt sich aus Besonderheiten der Xanthinoxidase als O2-.-Bildungsquelle. Wenn die Superoxidradikale in einer für das Cytochrom c aus sterischen Gründen unzugänglichen Niesche des Xanthinoxidase-Moleküls produziert werden, dann wird die Dismutation im Bildungsbereich durch die höhere lokale Konzentration bevorzugt. In diesem Fall wird auch Wasserstoffperoxid in die Lösung freigesetzt [50]. Eine andere Möglichkeit wäre, daß die Xanthinoxidase zwei verschiedene Arten von Aktivzentren hat, eines das Sauerstoff zum Superoxid, und ein anderes welches Sauerstoff zu Wasserstoffperoxid reduziert. Ein Teil der durch Xanthinoxidase übertragenen Elektronen kann daher direkt oder indirekt in die Bildung von Wasserstoffperoxid einfließen, was über die Cytochrom c-Methode nicht erfassbar ist und somit den beobachteten Wiederfindungskoeffizient von 0.365 erklärt.

Dieser Wert unterscheidet sich von dem Wert von 0.2, der von Fridovich für Xanthinoxidase bei pH=7.0 gefunden wurde [50]. Der Unterschied zu dem in der vorliegenden Arbeit erhaltenen Wert von 0.365 ist anscheinend darauf zurückzuführen, daß in [50] 0.1mM EDTA für die Chelatierung von Verunreinigungen der Übergangsmetalle verwendet wurde, die im eingesetzten 0.1M Phosphatpuffer enthalten sind. Die Chelatierung von Eisen mit EDTA hemmt nicht vollständig seine Interaktion mit Superoxidradikalen, wodurch die Konzentration der letzteren sinkt (Kapitel 3.3.2.). Zudem kann EDTA-komplexiertes Eisen reduziertes Cytochrom c direkt [67] oder indirekt durch Stimulierung der


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Hydroxylradikalbildung [130] oxidieren und dadurch zu einer Verminderung der Wiederfindungsrate und schließlich des Wiederfindungskoeffizienten führen.

Der Wiederfindungskoeffizient für den O2-.-Nachweis mit acetyliertem Cytochrom c (60% Acetylierung) unterscheidet sich kaum von dem des nativen Cytochroms (Tabelle 3).

Bei der Anwendung der Cytochrom c- Methode an biologischen Systemen kann ihre quantitative Ausbeute durch Nebenreaktionen beeinflußt werden, wie im Kapitel 4.2.1.1 bereits diskutiert. Für das oben erarbeitete mathematische Modell erfordert das die Einführung einer zusätzlichen Komponenten -k3P in die Gleichung 13 ( Gleichung 16 ), wenn die unerwünschte Oxidation des Cytochroms vereinfacht als Reaktion erster Ordnung dargestellt wird ( Reaktion 41 ):

P rarr weitere Produkte

Reaktion 41

Gleichung 16

Wenn die Geschwindigkeit k3P der Reaktion 41 mit der produzierten O2-.-Bildungsrate v vergleichbar ist ( Gleichung 16 ), kommt es zu einer Verminderung der nachgewiesenen Superoxidbildungsrate, da diese aus der Bildungsrate des Reaktionsproduktes errechnet wird (Gleichung 8).

Um festzustellen, ob das zu untersuchende System das durch O2-.-Radikale reduzierte Cytochrom wieder oxidieren kann, was für die quantitative Bestimmung der O2-.-Bildungsrate zu berücksichtigen wäre, muß eine Kontrollinkubation des zu untersuchenden Systems mit dem zuvor reduziertem Cytochrom c durchgeführt werden.

Die Homogenität der Verteilung der gebildeten O2-.-Radikale ist bei den quantitativen Aussagen über die produzierten O2-.-Bildungsraten ebenfalls zu beachten. Durch eine hohe lokale Konzentration der Superoxidradikale, wie es beispielsweise in dem Phagosom einer phagozytierenden Zelle der Fall ist, wird die Spontandismutation beschleunigt, was zu einem vermindertem Anteil der mit Cytochrom c reagierenden O2-.-Radikale führt. Dieser Effekt wurde im Kapitel 3.7.1.2. beschrieben, wo der Wiederfindungskoeffizient an Zymozan-stimulierten PMN viel niedriger war, als der bei Stimulierung mit PMA, da im ersten Fall die O2-.-Radikalbildung durch Phagozytose mit Phagosombildung begleitet wird. Dies gilt jedoch nicht nur für die Cytochrom c-Methode, sondern auch für die anderen Nachweismethoden.

Die Zugabe von Cytochrom c zum Zweck des O2-.-Nachweises kann das untersuchte System oxidativ schädigen und somit die Radikalbildung beeinflussen, wenn auch H2O2 in System vorhanden ist. So haben Radi et al. gezeigt [115], daß Cytochrom c in Anwesenheit von H2O2 die Lipidperoxidation an Liposomen stimulieren kann. Die Initiierung dieses Prozesses wurde von den Autoren durch die Freisetzung von Häm-Eisen aus dem oxidativ geschädigten Cytochrom sowie teilweise durch das oxidierte und denaturierte Molekül des Cytochroms erklärt. Da H2O2 oft als Dismutationsprodukt der Superoxidradikale oder als Produkt der divalenten Reduktion des Sauerstoffs vorhanden ist, sollte beim Nachweis der O2-.-Radikale über die Cytochrom c-Reduktion Katalase zugegeben werden, um H2O2-bedingte Störungen des Nachweissystems auszuschließen.

4.2.2 Nitroblau Tetrazolium (NBT).

4.2.2.1 Qualiative Selektivität.

NBT (Abb. 7) gehört zu den Tetrazoliumsalzen, die als Redoxindikatoren seit langem in der Histologie eingesetzt werden [1,36]. Sein niedriges Redoxpotential DeltaE0´=+50mV [1] zeigt, daß es leicht reduzierbar ist. Die Produkte der Reduktion von NBT, Formazane, sind dunkelblau bis schwarz gefärbt.

Neben dem Superoxidradikal sind mehrere elektronenübertragende Enzyme in der Lage, NBT direkt zu reduzieren. Dies hat auch zu einer weit verbreiteten Anwendung des NBT zur Bestimmung der


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Aktivität von Enzymen geführt. Die Aktivität der Succinat-Dehydrogenase in Gewebe wird z.B. über die Reduktion von NBT bestimmt [1,8].

Die Radikalbildung durch stimulierte Zellen wurde ebenfalls über die Reduktion von NBT durch Formazanbildung fixiert und mikroskopisch analysiert, obwohl in diesem Fall nur eine qualitative Aussage möglich ist. So wurde eine deutlich niedrigere Formazan-Bildung durch stimulierte Zellen bei Patienten mit chronischer Granulomatose im Vergleich zu gesunden beschrieben [61,86,117].

Bei physiologisch relevanten pH-Werten liegt NBT als Dikation NBT2+ vor. Die Reaktion zwischen Superoxid und NBT2+ ist aus thermodynamischer Sicht leicht möglich, da DeltaE0´=330+50=380mV >0 beträgt, so daß die Reaktion spontan ablaufen kann (DeltaG<0, s. Kapitel 4.2.1.1.).

Die Bildung der dunkelblauen Formazane wurde bei der Inkubation des NBT in dem O2-.-produzierenden Modellsystem (Xanthin/Xanthinoxidase) beobachtet (Kapitel 3.4.2.). Die Tatsache, daß die Formazanbildung nur 80%-ig SOD-sensitiv war, weist auf andere Superoxid-unabhängige Möglichkeiten der Farbstoffbildung hin.

Die Ursache einer SOD-insensitiven NBT-Reduktion besteht vermutlich in einer direkten Elektronenübertragung von Xanthin auf NBT durch die Xanthinoxidase, da die Beteiligung anderer Komponenten des Modellsystems experimentell ausgeschlossen wurde (Kapitel 3.4.2.). Hierfür sprechen auch andere Arbeiten, in welchen die Formazanbildung aus NBT im Xanthin/Xanthinoxidase System unter anaeroben Bedingungen untersucht wurde und SOD ohne Effekt war [18]. Die in der gleichen Arbeit beschriebene aerobe NBT-Reduktion war - in Übereinstimmung mit den in dieser Arbeit beschriebenen Befunden (Abb. 9) - nur bis zu 80% SOD-hemmbar. Es kann somit geschlossen werden, daß ein Anteil der NBT-Reduktion von nahezu 20% durch eine direkte Xanthinoxidase-vermittelte Elektronenübertragung auf NBT abläuft und daher durch SOD nicht hemmbar ist.

Ist die Formazanbildung SOD-sensitiv, liefert dies jedoch noch keinen eindeutigen Beweis der im System stattfindenden Superoxidbildung. So wurde beschrieben, daß NBT selbst die Bildung von O2-.-Radikalen vermitteln kann. Liochev und Fridovich [73] haben gezeigt, daß Nitroblau Tetrazolium (NBT2+ ) durch das Enzym Glukoseoxidase univalent reduziert wird:

NBT2+ +1e rarr NBT+.

Reaktion 42

Das dabei gebildete Tetrazolinyl Radikal (NBT+. ) autoxidiert, wobei das Elektron auf ein Sauerstoffmolekül übertragen wird:

NBT+. + O2 rarr NBT2+ + O2-.

Reaktion 43

Hierdurch kommt es zur Bildung von ursprünglich nicht vorhandenen Superoxidradikalen. Die auf diese Weise entstandenen Superoxidradikale können weiter Nitroblau Tetrazolium zum Tetrazolinyl-Radikal reduzieren ( Reaktion 44 ).

NBT2+ + O2-. rarr NBT+..+ O2

Reaktion 44

Das nachweisbare farbige Monoformazan wird bei der Disproportionierung von NBT+. gebildet:

NBT+. + NBT+. rarr MF + NBT2+

Reaktion 45

Wird Superoxid aus dieser Reaktionssequenz mittels SOD entfernt, dann ist ebenfalls eine Verminderung der Formazanbildung zu erwarten, obwohl das System nur eine direkte Elektronenübertagung auf NBT vermittelt und keine O2-.-Radikale ohne Zusatz von NBT produziert.

In der Arbeit von Bielski et al. [21] konnte hingegen keine wesentliche Autoxidation des Tetrazolinyl-Radikals mit der Bildung von Superoxidradikalen nachgewiesen werden. Dieser Widerspruch läßt sich lösen, wenn die Reaktionsbedingungen verglichen werden. Die Experimente mit Glukoseoxidase


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wurden bei pH=9.5 durchgeführt, während die gleiche Reaktion in [21] bei pH=7.0 untersucht wurde. Da der pK-Wert für NBT+.-Radikale 7.47 beträgt [21], ist eine Autoxidation eher im alkalischen Milieu zu erwarten. Bei physiologischem pH-Wert liegt die Hälfte der Tetrazolinyl-Radikale deprotoniert vor, wodurch die Möglichkeit der Superoxidbildung begünstigt wird.

Da Superoxidradikale auch als Zwischenprodukte der O2-.-unabhängigen NBT-Reduktion entstehen können, kann die SOD-sensitive Formazanbildung nicht ausschließlich als Folge der Superoxidbildung in dem zu untersuchenden System angesehen werden. Hieraus ergibt sich, daß die NBT-Methode nicht ausreichend selektiv für einen eindeutigen Nachweis der O2-.-Radikale ist.

4.2.2.2 Quantitative Ausbeute.

Von allen im Modellsystem Xanthin/Xanthinoxidase angewandten Farbtoffen wurde mit NBT die größte Wiederfindungsrate erhalten. Die Abhängigkeit der Bildungsrate des Reaktionsproduktes von der Superoxidbildungsrate erwies sich als linear und der Wiederfindungskoeffizient betrug 1.009. Da nur 80% der Formazan-Bildung SOD-sensitiv war (Abb. 9), muß dieser von 1.009 auf 1.009x.0.80 = 0.807 korrigiert werden.

Die Linearität der Abhängigkeit der Formazanbildungsrate von der Superoxidbildungsrate weist darauf hin, daß in der Sequenz der Reaktionen, die zur Formazanbildung führen, die Reaktion zwischen NBT und Superoxid der limitierende Schritt ist. Wäre dies anders, so hätte man eine Sättigung bei höheren O2-.-Bildungsraten finden müssen, welche durch die nachfolgende langsamere Reaktionen zu erklären wäre.

Abgesehen von der mangelnden Selektivität dieser Methode, treten auch Probleme bei der genaueren quantitativen Einschätzung der Superoxidbildungsrate auf. Die Ursache dafür liegt in verschiedenen parallel entstehenden Reduktionsstufen des NBT - Monoformazan und Diformazan. Zwei Elektronen sind für die Reduktion des NBT zum Monoformazan notwendig, während die Bildung des Diformazans die Reduktion mit 4 Elektronen erfordert (Abb. 7). Die in dieser Arbeit durchgeführte chromatographische Analyse der Reaktionsprodukte hat ergeben, daß Monoformazan und Diformazan gleichzeitig bei der Reduktion von NBT im Xanthin/Xanthinoxidase Modellsystem gebildet werden (Kapitel 3.4.2.). In den anderen biologischen Systemen werden ebenfalls beide Reduktionsprodukte gebildet, so z B. bei der Anwendung der NBT-Methode zur Untersuchung der Aktivität der Succinat Dehydrogenase im Gewebe [8].

Die Absorptionsspektren des Mono- und Diformazans überlappen sich [37]. Für die summarische optische Dichte A(lambda) zweier Farbstoffe, die gleichzeitig in den Konzentrationen c1 bzw. c2 in der Lösung vorhanden sind und die Extinktionskoeffizienten epsilon1(lambda) bzw. epsilon2(lambda) aufweisen, gilt:

A(lambda)=epsilon1(lambda) c1+ epsilon2(lambda) c2,

Gleichung 17

wobei die Konzentrationen c1 und c2 unbekannt sind. Die Messung der optischen Dichte A(lambda) bei einer Wellenlänge lambda gibt somit keine Information über den Anteil des jeweiligen Farbstoffes, was schließlich eine quantitative Bestimmung von auf NBT übertragenen Elektronen unmöglich macht.

Darüber hinaus hat die schlechte Wasserlöslichkeit der Formazane zur Folge, daß diese in wässrigen Reaktionssystemen ausfallen und dadurch eine adäquate Messung der optischen Dichte erschwert ist. Um die Ausfällung des schlecht wasserlöslichen Formazans zu verhindern, werden häufig Gelatine oder Detergentien (Triton) der Reaktionsmischung zugesetzt [1]. Ein anderer Zugang zu dem Problem der schlechten Wasserlöslichkeit der Formazane liegt in der Extraktion der Farbstoffe mit einem geeignetem Lösungsmittel (z.B. Dioxan) [118]. In diesem Fall sind jedoch keine kontinuierlichen Messungen der Radikalbildungsrate einer Probe möglich. Für die Bestimmung einer Kinetik sind dann Extraktionen aus mehreren paralell laufenden Proben erforderlich. Das Problem der genauen Quantifizierung einzelner Reaktionsprodukte wird auf diese Weise jedoch nicht gelöst.

Die unlöslichen Formazane können auch in Wechselwirkung mit dem zu untersuchenden System treten und dieses beeinflussen. Ein Beispiel dafür ist die Agglutination von stimulierten PMN in Anwesenheit von Nitroblau Tetrazolium, die in der vorliegenden Arbeit beschrieben wurde (Kapitel 3.7.1.2.1). Ein ähnlicher Effekt der toxischen Wirkung von NBT ist an unreifen Neutrophilen des Knochenmarks beobachtet worden [128]. Die Schädigung von Zellen in Anwesenheit von NBT wurde hier durch Stimulierung mit Endotoxin sowie mit Latex-Patikeln wesentlich verstärkt, was auf die


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besondere Toxizität der gebildeten Formazane hinweist.

Somit können qualitative und quantitative Aspekte des photometrischen O2-.-Nachweises mit dem Farbstoff NBT wie folgt zusammengefaßt werden. Die Bildung der Formazane in dem zu untersuchenden System reflektiert nicht ausschließlich die O2-.-Bildung, sondern kann auch durch andere, biologisch relevante Reaktionen erfolgen (enzymatische Reduktion). Die SOD-Hemmbarkeit der Formazan-Bildung kann nicht als ausreichender Beweis für die Existenz von O2-.-Radikalen betrachtet werden, da diese unter den biologisch relevanten Bedingungen als Zwischenprodukte in der Kettenreaktion der Formazanbildung entstehen können.

Die überlappenden Spektren der gleichzeitig gebildeten Di- und Monoformazane erschweren zusätzlich den quantitativen Nachweis; die schlechte Wasserlöslichkeit der Reaktionsprodukte kann unerwünschte toxische Wechselwirkungen mit dem zu untersuchenden biologischen System verursachen.

4.2.3 Epinephrin (Adrenalin).

4.2.3.1 Qualiative Selektivität.

Epinephrin (Adrenalin) (Abb. 10), das zu den Catecholaminen gehört, tritt im Organismus als Hormon und Neurotransmitter mit vielseitigen Funktionen auf. Es hat eine stimulierende Wirkung auf das Herz, verengt Blutgefäße der Haut, der Schleimhäute und der Baucheingeweide, erweitert die Gefäße der Skelettmuskeln und der Leber, verringert die Darmperistaltik und erweitert die Bronchien. Ursprünglich wurde Epinephrin zur Bestimmung der O2-.-Radikalfängereigenschaften der SOD verwendet [92]. Da die Autoxidation des Epinephrins zum Adrenochrom im alkalischen Medium durch Superoxidradikale vermittelt wird, hemmt SOD konzentrationsabhängig die Adrenochrombildung. Seitdem eine SOD-sensitive Adrenochrombildung aus Epinephrin auch bei physiologischem pH-Wert im Xanthin/Xanthinoxidase System beschrieben wurde [147], wurde dieses Indikatorsystem auch zum Nachweis der Superoxidbildung an anderen biologischen Systemen, z.B. an Mitochondrien verwendet [38,101,104]. Zum Nachweis der Superoxidbildung an isolierten Organen, z.B. bei Ischämie/Reperfusions-Schäden, ist Epinephrin wegen seiner biogenen Wirkung nicht geeignet.

Die Kooxidation des Epinephrins im Xanthin/Xanthinoxidase System führt zur Bildung von Adrenochrom, was über die Zunahme der optischen Dichte bei 480nm registriert werden kann.

Allerdings sind nicht nur O2-.-Radikale in der Lage, die Oxidation von Epinephrin zum Adrenochrom in Gang zu setzen. Im alkalischen pH-Bereich wird Adrenochrom auch durch spontane Autoxidation des Epinephrins gebildet, wobei Superoxidradikale als Zwischenprodukte auftreten ( Abb. 55 ). Die Autoxidation des Adrenalin-Anions, welche zur Bildung der O2-.-Radikale führt, wird hier als erster Schritt der Oxidationssequenz vermutet [26], da die Superoxidbildung nur bei pH-Werten über 8.5 beobachtet wurde, was mit dem pKa-Wert für Epinephrin übereinstimmt.

Hydroxylradikale können Epinephrin ebenfalls effizient oxidieren, wobei auch Adrenochrom als Reaktionsprodukt gebildet wird [27]. Übergangsmetalle beschleunigen die Autoxidation des Epinephrins bei neutralen pH-Werten, wobei wiederum Adrenochrom als Endprodukt auftritt [92]. Da die durch Übergangsmetalle katalysierte Adrenochrombildung bei neutralen pH-Werten SOD-insensitiv ist [92], kann sie von der O2-.-vermittelten Reaktion unterschieden werden. Im alkalischen Bereich ist jedoch die Fe-katalysierte Oxidation des Epinephrins zum Teil mit SOD hemmbar, was auf eine intermediäre Bildung der O2-.-Radikale in jener Reaktionssequenz hinweist, die durch andere Spezies als O2-.-Radikale (hier durch Übergangsmetalle) in Gang gesetzt wird.

Ein zusätzliches Problem der qualitativen Selektivität der Epinephrin-Methode liegt darin, daß Adrenochrom, auch wenn es durch einen O2-.-unabhängigen Prozess in einem System gebildet worden ist, in Anwesenheit von Reduktionsequivalenten direkt zur Superoxidbildung beitragen kann [22,111]. Es wurde gezeigt [22], daß Adrenochrom enzymatisch (über mitochondriale NADPH-Dehydrogenase) oder nicht-enzymatisch (durch Ascorbinsäure) zum Leukoadrenochrom reduziert werden kann, das schnell autoxidiert. Hierbei werden O2-.-Radikale und Adrenochrom gebildet, wobei letzteres erneut reduziert werden kann. Die durch Redoxzyklierung gebildeten Superoxidradikale könnten dann einen O2-.-abhängigen Mechanismus der Oxidation von Epinephrin zum Adrenochrom in die Wege leiten. Auf diese Weise kann das gebildete Adrenochrom die O2-.-Bildung auch in einem System vermitteln, in dem selbst ohne das Nachweissystem keine O2-.-Radikale gebildet werden.


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Somit kann nur eine 100%ig SOD-sensitive Adrenochrombildung bei pH-Werten unter 8 als qualitativer Beweis der im System stattfindenden Superoxidbildung angesehen werden.

In dem Xanthin/Xanthinoxidase Modellsystem war die Bildung von Adrenochrom zu 100% mit SOD hemmbar (Abb. 13), was eine systembedingte Bildung der Superoxidradikale anzeigt. Die O2-.-unabhängigen Reaktionen leisten hier keinen wesentlichen Beitrag zur Adrenochrombildung, da die Komplexierung von Übergangsmetallen mit DTPA die Realisierung ihrer Redoxaktivität für eine direkte sowie für eine OH. -vermittelte Oxidation verhindert.

4.2.3.2 Quantitative Ausbeute.

Die im Xanthin/Xanthinoxidase Modellsystem angewandte Epinephrin-Methode ergab einen Wiederfindungskoeffizienten von 0.57 (Abb. 11), der sich von den Koeffizienten, die über andere photometrische Methoden erhalten wurden, unterscheidet. Der Wert des Koeffizienten ist größer als mittels Cytochrom c-Methode, aber geringer als mitttels NBT-Methode ermittelt.

Die Geschwindigkeitskonstante der limitierenden O2-.-vermittelten Oxidation des Epinephrins zum Epinephrin-Semichinon ist mit 5.104 M-1 s-1 genügend hoch, um die Spontandismutation vernachlässigen zu können, wenn die Konzentration des Epinephrins 1mM beträgt (alpha<<1, Gleichung 9).

Abb. 55 Schematische Darstellung der Mechanismen der Oxidation des Adrenalins zum Adrenochrom. RH4, RH3-.- Adrenalin, RH3. - Adrenalin Semichinon, RH2 - Adrenalin Chinon und Leukoadrenochrom, RH. - Leukoadrenochrom Semichinon, R -Adrenochrom.

Daß in den durchgeführten Experimenten dieser Arbeit die nachgewiesene O2-.-Bildungsrate von der eingesetzten Konzentration des Epinephrins unabhängig war (Abb. 12), weist darauf hin, daß der notwendige Überschuß der Nachweissubstanz (Epinephrin) vorhanden war.

Der Kettenreaktionsmechanismus der Superoxid-vermittelten Oxidation von Epinephrin erschwert einen quantitativen Nachweis der Superoxidbildung ( Abb. 55 ). Die Oxidation zum Adrenochrom besteht in der Abgabe von insgesamt 4 Elektronen, wobei als Zwischenprodukte radikalische Semichinone (Adrenalin Semichinon RH3. und Leukoadrenochrom Semichinon RH.) auftreten [63]. Durch Autoxidation können diese zu einer zusätzlichen O2-.-Bildung beitragen ( Reaktion 47 , Reaktion 49 ). Die Autoxidation dieser vom Adrenalin abgeleiteten Semichinone ist pH-Wert-abhängig und steigt im alkalischen pH-Bereich an [92]. Da die pKa-Werte der Semichinone um 3-4 pH-Einheiten niedriger sind, als die der entsprechenden Catecholamine, ist eine effektive Autoxidation dieser Zwischenprodukte bei physiologischem pH-Wert zu erwarten. Hierdurch kann auch die Tatsache erklärt werden, daß die Anzahl gebildeter Adrenochrom-Moleküle pro nachgewiesenem Superoxidmolekül mit steigendem pH-Wert im Xanthin/Xanthinoxidase System zunimmt [92], was auf die Beteiligung der im Nachweissystem zusätzlich gebildeten O2-.-Radikale hinweist.

Als Elektronenakzeptor bei der Adrenalinoxidation kann u.a. H2O2 auftreten ( Abb. 55 ), ebenso kann


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dieses das gebildete Adrenochrom weiter oxidieren [26]. Durch Anwesenheit der Katalase im Modellsystem wurden jedoch diese unerwünschten Reaktionen unterdrückt.

Wie aus dem Schema in Abb. 55 ersichtlich, hängt die Anzahl der gebildeten Adrenochrom-Moleküle pro reagierendem Superoxidmolekül von dem Reaktionsmechanismus ab. Mindestens ein exogen gebildetes O2-.-Molekül ist nötig, um die Reaktionskette der Adrenochrombildung bei physiologischem pH-Wert in Gang zu setzen. Dieses initiiert die Abstraktion eines Elektrons von einem Adrenalin-Molekül, eine Reaktion, die bei neutralem pH-Wert in Abwesenheit von O2-.-Radikalen nur sehr langsam abläuft:

RH4 + O2-. rarr RH3. + H2O2

Reaktion 46

(die exogen zugeführten O2-.-Moleküle sind fett markiert).

Weitere Oxidationsschritte können über die Autoxidation der intermediär gebildeten Semichinone und über die nachfolgenden Reaktionen zwischen den intermediären Produkten erfolgen (Reaktion 47- 49):

RH3. +O2 rarr RH2 + O2-.

Reaktion 47

RH2 + O2-. rarr RH. +H2O2

Reaktion 48

RH. +O2 rarr R +O2-.

Reaktion 49

In dem oben angeführten Fall hätte die O2-. /Adrenochrom Stöchiometrie einen minimalen Wert von 1:1, da für die Bildung eines Adrenochrom-Moleküls nur ein O2-.-Molekül zugefürt wird ( Reaktion 46 ).

Die maximale theoretische Anzahl der eingeführten Superoxidmoleküle pro gebildetem Adrenochrom-Molekül ist 6. Diese Stöchiometrie kommt zustande, wenn die Oxidationsschritte bis hin zum Leukoadrenochrom-Semichinon ausschließlich durch exogen produzierte O2-.-Moleküle in Gang gesetzt werden ( Reaktion 50 - Reaktion 52 ) und der letzte Oxidationsschritt durch eine Disproportionierung von Leukoadrenochrom-Semichinone geschieht ( Reaktion 53 ):

RH4 + O2-. rarr RH3. + H2O2

Reaktion 50

RH3. + O2-. rarr RH2 + H2O2

Reaktion 51

RH2 + O2-. rarr RH. +H2O2

Reaktion 52

RH. +RH. rarr R +RH2 .

Reaktion 53

Der Wiederfindungskoeffizient von 0.57 wurde unter der Annahme einer 4:1 O2-. :Adrenochrom Stöchiometrie errechnet. Die nachgewiesene O2-.-Bildungsrate wurde hierbei durch Multiplikation mit 4 aus der Adrenochrombildung nach der Gleichung 10 bestimmt. Daher ist die Adrenochrombildungsrate mit dem O2-Umsatz durch einen Koeffizienten von 0.57:4=0.143 verbunden. Wird der Wiederfindungskoeffizient von 0.365, der sich beim Nachweis mit Cytochrom c ergibt, als tatsächlicher Anteil des zum O2-.-reduzierten Sauerstoffs betrachtet, dann kann die Anzahl der benötigten exogenen O2-.-Moleküle für die Bildung eines Adrenochrom-Moleküls als 0.365:0.143ap2.55 berechnet werden. Diese errechnete Stöchiometrie zeigt, daß keine der oben diskutierten Reaktionsmechanismen (weder


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1:1 noch 6:1 Stöchiometrie) das Epinephrin/Adrenochrom-System exakt beschreiben kann. Dies erklärt auch, warum trotz gleicher O2-.-Bildungsrate im X/XOD System die Adrenochrombildung 2.55mal langsamer verläuft, als die Bildung von reduziertem Cytochrom c.

Dieser Befund unterscheidet sich von früheren Untersuchungen von Cadenas et al. [38], in denen die Adrenochrombildungsrate und die Bildungsrate von reduziertem Cytochrom c im Xanthin/Xanthinoxidase System als gleich gefunden wurden. Diese Differenz ist vermutlich darauf zurückzuführen, daß Cadenas et al. in ihren Experimenten die Verunreinigungen mit Übergangsmetallen nicht berücksichtigt haben. Obwohl der in [38] eingesetzte 50mM Trispuffer ebenso wie die Xanthinoxidase Übergangsmetalle als Verunreinigungen enthalten, wurden keine Metallchelatoren und keine Katalase zugegeben. Das kann die Bildungsrate des reduzierten Cytochrom c, wie vorher diskutiert, vermindern, da die Konzentration von Superoxidradikalen wegen der Reaktionen mit Übergangsmetallen sinkt (Kapitel 3.3.2.). Zudem können Hydroxylradikale gebildet werden, die reduziertes Cytochrom c oxidieren und dadurch die über Cytochrom c -Reduktion abgeleitete O2-.-Bildungsrate niedriger erscheinen lassen, als sie tatsächlich ist. Die Adrenochrombildung wird hingegen durch Übergangsmetalle sowie durch Hydroxylradikale beschleunigt, so daß sich im Endergebnis eine 1:1 Adrenochrom:Cytochrom c Stöchiometrie ergeben kann, die jedoch, wie dargestellt, nicht nur durch O2-.-Radikale bestimmt wird.

Der Nachweis der Superoxidbildungsrate mit der Epinephrin-Methode an stimulierten Zellen ergab eine große Streuung der Meßwerte (Abb. 39), welche auf den niedrigen Extinktionskoeffizienten des Adrenochroms und auf die Schwankungen der Lichtstreuung durch suspendierte Zellen zurückzufüren ist. Die anderen Oxidantien wie Hypochlorit oder Peroxinitrit, die neben dem Superoxid durch stimulierte Zellen produziert werden, können in verschiedenem Ausmaß ebenfalls zur Oxidation des Epinephrins führen, was weiterhin die exakte Bestimmung der Superoxidbildungsrate erschwert. Die Zugabe von SOD hemmt auch die Bildung des Peroxinitrites, das ja aus NO und O2-. gebildet wird (Reaktion 32). Daher bleibt die Adrenochrombildung auch dann SOD-sensitiv, wenn O2-.-Radikale gar nicht direkt für die Kooxidation des Epinephrins zum Adrenochrom verantwortlich waren. Somit ist zu berücksichtigen, daß in den Systemen, in welchen Superoxid in die Bildung anderer oxidierender Spezies involviert ist, die Adrenochrombildung SOD-sensitiv bleibt, auch wenn der eigentliche Oxidant des Epinephrins nicht identisch mit dem gesuchten Superoxidradikal ist.

PMN können Epinephrin nicht nur zum Adrenochrom umsetzen. Die in diesem System vorhandenen Enzyme Monoaminoxidase (MAO) und Carboxy-O-Methyltranferase (COMT) können bis zu 20% des zugesetzten Epinephrins metabolisieren [81], wobei als Hauptmetabolit Vanillinmandelsäure (VMS) entsteht, deren Absorptionspektrum jedoch nicht mit dem des Adrenochroms bei 480nm interferiert. Das ist auch von Vorteil beim Nachweis der Superoxidbildung an Mitochondrien, wo Epinephrin zwar durch MAO der mitochondrialen Außenmembran [143] umgesetzt werden kann, die entstehenden Metabolite jedoch nicht zur optischen Dichte bei 480nm beitragen. Dadurch wird der O2-.-Nachweis mit der Epinephrin-Methode an Mitochondrien ermöglicht (Abb. 45).

Die qualitative Beteiligung der O2-.-Radikale an der Adrenochrombildung wird an Mitochondrien aus der hemmenden Wirkung des Enzyms SOD abgeleitet. Eine Redoxzyklierung des gebildeten Adrenochroms findet unter diesen experimentellen Bedingungen nicht statt [22]. Die quantitativen Aussagen über die Superoxidbildungsrate an Mitochondrien sind jedoch nur mit Vorbehalt möglich, da nicht feststeht, wie die tatsächliche Reaktionsstöchiometrie ist und ob die anderen O2-.-abhängigen oxidativ wirkenden Spezies zur Adrenochrombildung beitragen.

4.3 Chemilumineszenz - Methoden.

Chemilumineszenz (CL) als Nachweismethode der Radikalbildung wird häufig zur Untersuchung biologischer Objekte eingesetzt. Als eine nicht-invasive und hochempfindliche Methode hat die Chemilumineszenz eine weite Verbreitung in der Erforschung radikalischer Prozesse gefunden, obwohl die Ergebnisse nicht immer eine eindeutige Interpretation zulassen.

Um einen Nachweis der Superoxid-Bildung über Chemilumineszenz zu beschreiben, muß das kinetische Modell (s. Kapitel 4.2) modifiziert werden. Die Superoxidbildung und die Dismutation beschreibenden Reaktionen 37 bzw. 38 bleiben unverändert, während die anderen Reaktionen für die Chemilumineszenz umgeschrieben werden müssen. Bei der Reaktion einer Nachweissubstanz N mit Superoxid entsteht ein angeregtes Produkt P* ( Reaktion 54 ):


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O2-. + N rarr P* rarr P + hny

Reaktion 54

Dieses kehrt in den Grundzustand entweder mit dem Ausstrahlen eines Lichtquantes (k3) oder über einen stahlungslosen Weg (k4, Reaktion 55 ) zurück:

P* rarr nicht-lumineszierende Produkte

Reaktion 55

Erfaßt werden hier die Photonen (hny), wobei für die Intensität der Chemilumineszenz I gilt:

I = k3 P*

Gleichung 18

Das System differentieller Gleichungen muß ebenfalls modifiziert werden:

Gleichung 19

In dem stationären Zustand beträgt die Konzentration P*ss des angeregten Reaktionproduktes

Gleichung 20

wo Sss - die Konzentration der O2-.-Radikale im stationären Zustand ist. Ist die Dismutation vernachlässigbar gering, dann gilt:

Gleichung 21

Aus Gleichung 20 und Gleichung 21 ergibt sich die Chemilumineszenz-Intensität im stationärem Zustand Iss als

Gleichung 22

Aus Gleichung 22 ergibt sich, daß die Chemilumineszenz-Intensität Iss der Superoxidbildungsrate v direkt proportional ist, und zwar mit einem Koeffizienten, welcher von der Geschwindigkeitskonstanten der strahlungslosen (k4) und der emissiven (k3) Desaktivierung abhängig ist. Die Intensität der Chemilumineszenz im stationären Zustand Iss muß unabhängig von der Konzentration der Nachweissubstanz sein, wenn der O2-.-Nachweis mit dem oben ausgeführten mathematischen Modell beschrieben werden soll.

4.3.1 Luminol.

Luminol wird seit langem als lumineszente Probe zum Nachweis der Radikalbildung an stimulierten polymorphkernigen Neutrophilen eingesetzt [5]. Eine andere verbreitete Applikation der Luminol-


92

Chemilumineszenz ist die Bestimmung der antioxidativen Eigenschaften von Substanzen. Das Meßprinzip beruht darauf, daß die Radikale enzymatisch [13,119], thermolytisch [75] oder photochemich [110,144] in Anwesenheit des Luminols produziert werden, wobei die Chemilumineszenz registriert wird. Bei der Zugabe von Radikalfängern wird die Chemilumineszenz konzentrationsabhängig „gequencht“, was als Maß für die antioxidative Wirkung angesehen wird.

Der chemisch-physikalische Mechanismus, welcher der Lichtabstrahlung zu Grunde liegt, ist kompliziert. Nach neueren Erkenntnissen ist die Oxidation des Luminols (LH-) zum Luminol-Radikal (LH.) der erste Schritt in dem zur Chemilumineszenz führenden Prozeß [88] (s. Abb. 56 ). Manche Enzyme (Meerrettich Peroxidase, Laktoperoxidase) [95,138], Radikale (OH.) [88] sowie komplexierte Übergangsmetalle [129] sind in der Lage, Luminol zum Luminolradikal zu oxidieren. Da das Superoxidradikal weder ein starker Oxidant noch ein starker Reduktant ist, ist eine effektive Oxidation des Luminols durch O2-.-Radikale nicht zu erwarten [87]. Tatsächlich ist die Quantenausbeute der lumineszenten Reaktion zwischen Luminol und Superoxid mit 4.10-8 Photonen pro O2-.-Molekül zu gering, um die Superoxidradikale als effiziente Oxidantien des Luminols ansehen zu können [87].

Das im ersten Reaktionsschritt gebildete Luminol-Radikal LH. kann in anionischer Form (L-.) Sauerstoff zum Superoxid reduzieren ( Abb. 56 ). Der pKa-Wert der Luminolradikale (LH. ) beträgt 7.7 [88], so daß bei physiologischen pH-Werten ca.50% als Anionen vorliegen und diese Sauerstoff zum Superoxid reduzieren können ( Reaktion 56 ):

L-. + O2 rarr L + O2-.

Reaktion 56

Die Geschwindigkeitskonstante der Reaktion 56 wird mit 5.5.102 M-1 s-1 angegeben [88], somit kann das O2-.-Radikal als ein mögliches Zwischenprodukt bei der Oxidation des Luminols auftreten, auch wenn diese durch andere Oxidantien als Superoxid in Gang gesetzt wurde.

Unabhängig von der Protonierung, wird beim Zerfall des Luminolhydroperoxides (L-OOH oder LHOOH) das Aminophthalat AP gebildet ( Abb. 56 ). Die Chemilumineszenz entsteht jedoch nur, wenn das Monoanion L-OOH zum Aminophthalat zerfällt ( Abb. 56 ). Der beobachtete pK-Wert für das Chemilumineszenzsystem wird mit 9.2 angegeben und ist vom Mechanismus der Luminoloxidation unabhängig [88].

Wie die Experimente im Modellsystem Xanthin/Xanthinoxidase gezeigt haben, ist die Intensität der Luminol-Chemilumineszenz nicht nur von der Superoxidbildungsrate abhängig. So wurde eine konstante O2-.-Bildungsrate durch eine glockenförmige Chemilumineszenz-Kinetik begleitet (Abb. 13A), was den an eine Nachweismethode gestellten Erwartungen wiederspricht. Wie aus Gleichung 22 folgt, muß die Intensität der Chemilumineszenz der O2-.-Bildungsrate proportional sein. Qualitativ bedeutet das, daß eine konstante O2-.-Bildungsrate durch eine Chemilumineszenz konstanter Intensität begleitet werden sollte, was jedoch nicht der Fall war. Die hier beschriebenen Untersuchungen ergaben, daß die Intensität der Luminol-Chemilumineszenz auch gegenüber Spurenkonzentrationen von ungebundenen Übergangsmetallen empfindlich ist (Kapitel 3.5.1.). Trotzdem war die Chemilumineszenz vollkommen SOD-hemmbar, vermutlich aus dem Grund, daß Superoxidradikale auch als Zwischenprodukte bei der Oxidation von Luminol selbst auftreten können ( Abb. 56 ).

Die nur teilweise SOD-Hemmbarkeit der Chemilumineszenz an stimulierten Zellen (Abb. 42) weist darauf hin, daß die Chemilumineszenz des Luminols auch über einen O2-.-unabhängigen Mechanismus in diesem System ausgelöst werden kann. Hydroxylradikale konnten an der Luminol-Chemilumineszenz in diesem System kaum beteiligt sein, da die ESR-Experimente unter identischen Bedingungen keine Bildung von Hydroxyl-Addukten angezeigt haben (Abb. 45). Wasserstoffperoxid, das als Dismutationsprodukt der O2-.-Radikale gebildet wird, hat hingegen zur Chemilumineszenz des Luminols an stimuliertem PMN beigetragen, wie durch die hemmende Wirkung der Katalase gezeigt wurde (Abb. 44). Die mangelnde Selektivität des Luminols im Bezug auf den Nachweis der Superoxidradikale wird verständlich, wenn man den Mechanismus der Chemilumineszenzentwicklung mit Blick auf die anderen durch die Zellen produzierten aktiven Sauerstoffspezies analysiert.

Bei der Aktivierung der phagozytierenden Zellen werden neben den O2-.-Radikalen noch weitere oxidativ wirkende Substanzen wie z.B. Hypochlorit und Peroxinitrit gebildet. Diese können die für die Chemilumineszenz erforderlichen Schritte in Gang setzen, nämlich die Oxidation des Luminols LH- zum Luminolradikal LH. und weiter zum Diazachinon L, wobei letzteres in einer Reaktion mit Wasserstoffperoxid zur Bildung des lumineszierenden Aminophthalates führen kann ( Abb. 56 ).


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Die Chemilumineszenz des Luminols in Anwesenheit von Hypochlorit und Wasserstoffperoxid ist für in vitro-Systeme beschrieben worden [9], daher ist die Beteiligung des Hypochlorites auch an der Entwicklung der Chemilumineszenz des Luminols in biologischen Objekten nicht ausgeschlossen. Ein indirekter Beweis hierfür besteht darin, daß die Luminol-Chemilumineszenz an stimulierten Granulozyten von Patienten mit einem genetisch bedingten Mangel an Myeloperoxidase (Reaktion 27) im Vergleich zu Gesunden eine viel niedrigere Intensität aufweist [52].

Abb. 56 Schematische Darstellung der zur Luminol-Chemilumineszenz führenden Reaktionen (nach [88]). LH- -Luminol; LH. - Luminolradikal; L - Diazachinon; LOOH-Alpha-Hydroxy-Hydroperoxid; AP- Aminophthalat.

Peroxinitrit ONOO- wird aus Superoxid und Stickstoffmonoxid gebildet (Reaktion 32) [126]. Da die NO-Synthase und NADPH-Oxidase eine gemeinsame Aktivierungsstufe über die Proteinkinase C bei der PMA- Stimulierung von Zellen aufweisen [39], ist die Bildung des Peroxinitrites durch PMA-stimulierten Zellen zu erwarten. Peroxinitrit ist in der Lage, Luminol zum Luminolradikal zu oxidieren [114] und hierdurch eine zur Chemilumineszenz führende Reaktionssequenz zu starten. Die Beteiligung des Peroxinitrites an der Luminol-Chemilumineszenz von stimulierten PMN wurde über die hemmende Wirkung von Inhibitoren der zellulären NO-Synthase auf die Intensität der Chemilumineszenz abgeleitet [41]. Hydroxylradikale, deren Bildung aus der protonierten Form des Peroxinitrites ONOOH (pK=6.8 [113]) diskutiert wird [112], könnten ebenfalls zur Oxidation des Luminols über den emissiven Weg beitragen.

Die unerwünschten Nebenreaktionen, welche die Chemilumineszenz des Luminols beeinflussen können, sind jedoch nicht nur auf der Stufe der Luminolradikalbildung möglich. Die entstehenden Zwischenprodukte der von Lumineszenz begleiteten Oxidation des Luminols wie Luminolradikal und Diazachinon könnten durch Nebenreaktionen aus dem System entfernt werden. Dies würde eine Verringerung der Chemilumineszenz- Intensität mit sich bringen, ohne daß es einen Bezug zur O2-.-Bildung gäbe. So wird eine Hemmung der Luminol-Chemilumineszenz in Anwesenheit von Stickstoffmonoxid durch die Nebenreaktionen der Oxidationszwischenprodukte erklärt [40]. In der vorliegenden Untersuchung ist eine Hemmung der Chemilumineszenz des Luminols bei der Zugabe von Harnsäure registriert worden, die jedoch keine Hemmung der O2-.-Bildung widerspiegelte (Abb. 19, Kapitel 3.5.1).

Somit ist die Konzentration der O2-.-Radikale weitgehend nicht der einzige und entscheidende Faktor, welcher die Intensität der Luminol-Chemilumineszenz bestimmt. Umgekehrt kann diese nicht als Maß der Superoxidbildung dienen. Da bereits in einem relativ einfachen Modellsystem wie Xanthin/Xanthinoxidase sich deutliche störende Wechselwirkungen ergeben, ist ein selektiver O2-.-Nachweis über die Luminol-Chemilumineszenz an komplexeren biologischen Systemen nicht möglich. Die Anwendung von SOD kann hier das Problem der Selektivität nicht lösen, da O2-.-Radikale als Zwischenprodukte der Oxidation von Luminol autreten können.

4.3.2 Lucigenin.


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Im Gegensatz zum Luminol wird Lucigenin als eine O2-.-spezifische lumineszierende Probe angesehen. Am häufigsten wird diese Methode zum O2-.-Nachweis an stimulierten Zellen verwendet [5,7], obwohl Lucigenin auch zum Nachweis der Radikalbildung an Mitochondrien [116] sowie an isolierten Enzymen [70,133,139] zunehmend häufige Anwendung findet.

Mögliche Reaktionswege des Lucigenins, die zur Chemilumineszenz führen, sind in Abb. 57 dargestellt. Die Reaktion zwischen dem Lucigenin-Kationradikal LC+. und dem Superoxidradikal führt zur Bildung von Dioxetan LC-O2 . Dieses ist instabil und zerfällt in zwei Moleküle N-Methylacridon (MA), wobei eines aus dem angeregten Zustand in den Grundzustand übergeht und dabei die als Chemilumineszenz beobachtete Strahlung bedingt ( Abb. 57 ). Die primäre Reduktion des Lucigenins LC2+ zum Lucigenin-Kationradikal LC+. kann durch O2-.-Radikale sowie durch manche Enzyme erfolgen. Obwohl das Wasserstoffperoxid als divalent reduzierter Sauerstoff die stöchiometrischen Anforderungen der Chemiluminesz- Reaktion erfüllt, wird Lucigenin nur bei alkalischen pH-Werten durch H2O2 reduziert. Das divalent reduzierte Lucigenin kann auch mit Singulettsauerstoff reagieren ( Abb. 57 ).

Im Unterschied zum Luminol, stimmen die experimentellen Chemilumineszenzkinetiken des Lucigenins in den untersuchten O2-.-bildenden Systemen qualitativ mit dem theoretischen Modell des Chemilumineszenz- Nachweises überein ( Gleichung 22 ): die Chemilumineszenz konstanter Intensität entsprach einer konstanten O2-.-Bildungsrate im Xanthin/Xanthinoxidase System (Abb. 14B), während die glockenformige O2-Verbrauchsrate an stimulierten PMN durch die Chemilumineszenz von gleichartigem kinetischem Verlauf begleitet wurde (Kapitel 3.7.1.3.1).

Obwohl Lucigenin als eine O2-.-spezifische Lumineszenzprobe gilt, war seine Chemilumineszenz nur im Modellsystem (Xanthin/Xanthinoxidase) vollständig SOD-sensitiv (Abb. 22). In allen Systemen mit Lipidmembranen (stimulierte Zellen, Mitochondrien oder SMP) war die Chemilumineszenz des Lucigenins hingegen nur zum Teil mit SOD hemmbar (Abb. 41 und Abb. 50), was sich zum Teil von Ergebnissen anderer eingesetzter Methoden unterscheidet. Die SOD-insensitive Komponente der Lucigenin-Chemilumineszenz kommt anscheinend dadurch zustande, daß Lucigeninmoleküle Lipidmembranen passieren können und eine emissive Reaktion in jenen Kompartments stattfinden, zu denen die hochmolekulare SOD keinen Zugang hat. In diesem Fall ist nur eine indirekte Überprüfung der Beteiligung von O2-.-Radikalen an der Chemilumineszenz möglich.

Bei der quantitativen Interpretation der O2-.-Bildungsrate aus der Intensität der Chemilumineszenz stellte sich heraus, daß die Bildungsrate der Superoxidradikale nicht der einzige Parameter ist, welcher die Intensität der Lucigenin-Chemilumineszenz bedingt. In Analogie zur Fluoreszenz ist auch für die Chemilumineszenz zu erwarten, daß die unmittelbare Umgebung eines lumineszierenden Moleküls die Quantenausbeute und somit die Intensität der Chemilumineszenz beeinflussen kann. Wenn dies unberücksichtigt bleibt, kann es zu falschen quantitativen Schlußfolgerungen über die produzierte Superoxidbildungsrate kommen.

Die Effizienz strahlungsloser Dissipation der Energie eines angeregten Moleküls (k4 in Reaktion 55 ) ist u.a. von der Anzahl der Bewegungsfreiheitsgrade abhängig. Da sich Lucigenin auf Grund seiner positiven Ladung an bestimmten Lipidmembranen anlagert [116], kann hierdurch die Intensität der Chemilumineszenz beeinflußt werden. Die Beschränkung der Bewegungsfreiheitsgrade des Lucigeninmoleküls innerhalb der Lipidphase würde in einer Verminderung von k4 ( Gleichung 22 ) resultieren. Nach Gleichung 22 hätte dies zufolge, daß die Intensität der Chemilumineszenz Iss erhöht wird, ohne daß sich die O2-.-Bildungsrate v ändert.

Auf diesen Effekt wurde die in der vorliegenden Arbeit beschriebene Erhöhung der Chemilumineszenz -Intensität zurückgeführt, welche bei Anwendung des Lucigenins an zweiphasigen Systemen - aus Lipid- und wässerige Phase - aufgetreten ist. Die Membranen von stimulierten Zellen sowie die hydrophoben Bereiche des Albuminmoleküls mit den eventuell dort gebundenen Fettsäuren könnten einen Teil der Lucigeninmoleküle binden und dadurch die Intensität der Chemilumineszenz gemäß dem oben genannten Mechanismus vergrößern. Die Quantenausbeute und schließlich die Chemilumineszenz-Intensität würde in diesem Fall u.a. von dem Verteilungskoeffizienten der lumineszierenden Substanz (hier des Lucigenins) zwischen den beiden Phasen abhängen.


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Abb. 57 Schematische Darstellung zur Entstehung der Lucigenin-Chemilumineszenz. LC2+ - Lucigenin; LC+. -Lucigenin-Kationradikal; LC-O2 - Dioxetan, MA- N-Methylacridon (nach [5]).

Auf den Zusammenhang zwischen der Chemilumineszenz-Intensität und den Bewegungsfreiheitgraden eines Lucigeninmoleküls deuten verschiedene Literaturquellen hin, die eine Erhöhung der Chemilumineszenz-Intensität für Lucigenin dokumentieren, wenn dieses in Mizellen aus Didodecyl-Dimethylammoniumbromid (Übersicht in [138]), aus Linolensäure [70] sowie in ß-Cyclodextrin (Übersicht in [138]) eingeschlossen wurde. Die Intensität der O2-.-abhängigen Chemilumineszenz des Lucigenins an enzymatischen Superoxidbildungsquellen wurde auch in Anwesenheit hoher Konzentrationen von nicht-ionischen Detergentien (Triton X-100) erhöht, obwohl die produzierte O2-.-Bildungsrate unverändert blieb [133].

Sogar eine mit SOD hemmbare Chemilumineszenz des Lucigenins kann nicht als qualitativ endgültiger Beweis der stattfindenden O2-.-Radikalbildung dienen. So wurde berichtet, daß Lucigenin in manchen biologischen Systemen selbst die Bildung der O2-.-Radikale vermitteln kann [74,148]. Das kommt zustande, wenn Lucigenin nicht durch Superoxidradikale, sondern durch ein Enzym reduziert wird ( Reaktion 57 ), dann autoxidiert, wobei ein Elektron auf Sauerstoff übergeht und ein O2-.-Radikal gebildet wird ( Reaktion 58 ):

LC2+ + 1e rarr LC+.

Reaktion 57

LC+. + O2 rarr LC2+ + O2-. .

Reaktion 58

Das gebildete Superoxidradikal kann Lucigenin weiter reduzieren und dadurch zu einer SOD-sensitiven Chemilumineszenz in einem System führen, in dem ursprünglich keine O2-.-Radikale vorhanden waren.

In der Arbeit von Li et al. [72], welche die Redoxzyklisierung des Lucigenins beim O2-.-Nachweis an manchen biologischen Systemen bestätigt, wurde vorgeschlagen, dieses Problem durch den Einsatz niedrigerer Konzentrationen Lucigenins zu lösen. Ob Lucigenin zu einer zusätzlichen Radikalbildung beiträgt, wurde in [72] aus der Zunahme des Sauerstoffsverbrauchs in Anwesenheit des Lucigenins geschlossen. Nachdem unter einer bestimmten Konzentration des Lucigenins keine meßbare Zunahme des Sauerstoffverbrauchs registriert wurde, während die Chemilumineszenz unter den gleichen Bedingungen noch detektierbar blieb, sind die Autoren zu dem Schluß gekommen, daß die Redoxzyklisierung des Lucigenins nur bei seiner Anwendung in hohen Konzentrationen zustande kommt. Es blieb jedoch unberücksichtigt, daß die Chemilumineszenz eine viel empfindlichere Methode darstellt als die polarographische Messung des Sauerstoffverbrauchs, so daß die Redoxzyklisierung beim Einsatz niedrigerer Konzentrationen des Lucigenins unter der Nachweisgrenze der polarographischen Methode liegen kann.


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Somit ist die Anwendung der Lucigenin-Chemilumineszenz zum O2-.-Nachweis an biologischen Systemen wegen einer möglichen Redoxzyklisierung des Lucigenins, welche zu einer zusätzlichen O2-.-Bildung beitragen kann und schwer nachvollziehbar ist, beschränkt. Die Verteilung des Lucigenins zwischen Lipid- und wässriger Phase kann die Quantenausbeute der Chemilumineszenz beeinflussen und somit einen quantitativen Nachweis der Superoxidbildung zusätzlich erschweren.

4.4 Spintrapping-Technik im ESR-Nachweis der O2-.-Bildung.

Da O2-.-Radikale direkt nur bei Tieftemperaturen über die ESR-Spektroskopie nachgewiesen werden können, wird die Spintrapping-Technik für den ESR-Nachweis der Superoxidradikale bei Raumtemperaturen eingesetzt. Beim Nachweis der O2-.-Bildung mittels Spintrapping-Technik reagiert ein geeignetes Spintrap N mit O2-.-Radikalen und das gebildete Addukt P wird durch die ESR-Spektroskopie nachgewiesen:

O2-. + N rarr P

Reaktion 59

Im Unterschied zu den photometrischen und chemiluminometrischen Methoden, wo das nachweisbare Produkt stabil ist bzw. sofort zerfällt, stellt der ESR-Nachweis eine mittlere Situation zwischen den beiden genannten Extremen dar. Die entsprechenden O2-.-Spintrap-Addukte sind meist instabil, die Halbwertzeit ist jedoch mit der gesamten Meßdauer vergleichbar. Diese Besonderheit erfordert eine spezielle mathematische Betrachtung, um die Möglichkeit eines quantitativen Nachweises von O2-.-Radikalen mittels Spintrapping zu analysieren.

Hier wird das vereinfachte Modell betrachtet, nämlich wenn der Zerfall eines Spinadduktes annähernd mit einer Reaktion erster Ordnung beschrieben werden kann:

P rarr Produkte

Reaktion 60

Dies muß auch im Gleichungssystem berücksichtigt werden:

Gleichung 23

Dieses Differential-Gleichungssytem ist in analytischer Form nicht lösbar, kann jedoch vereinfacht werden, wenn die tatsächlichen Konstanten miteinbezogen werden. Lassen die Konzentration des Spintraps N und die Geschwindigkeitskonstante k2 die Bedingung k2SN>>k1S2 gelten, dann kann die Komponente der O2-.- Dismutation k1S2 in der kinetischen Betrachtung vernachlässigt werden. In diesem Fall ist die charakteristische Zeit bis zum Erreichen der stationären Konzentration der O2-.-Radikale annährungsweise als anzunehmen. Um den quantitativen Wert für <sup> </sup> zu erhalten, wurde die experimentelle Konzentration des Spintraps N im Bereich 2.5-100mM und die Reaktionskonstante k2 von der Größenordnung 10 M-1 s-1 [46,49] eingesetzt. Daraus kann mit berechnet werden. Im Vergleich zu der gesamten Meßzeit (ca.15 min) ist vernachlässigbar gering. Das bedeutet, daß die stationäre Konzentration der Superoxidradikale Sss schon nach maximal 40 s erreicht wird und mit ausreichend guter Genauigkeit für alle weiteren Berechnungen anstatt S(t) eingesetzt werden kann. Die Sss wird aus der Bedingung des stationären Zustandes errechnet:


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, und .

Gleichung 24

Da <<t ist, läuft die Akkumulation des Adduktes P bei der stationären Konzentration der O2-.-Radikale Sss ab. Daher kann die Konzentration S=S(t) in Gleichung 23 mit Sss ( Gleichung 24 ) ersetzt werden:

Gleichung 25

Die aus der Vereinfachung des System erhaltene Gleichung 25 hat eine analytische Lösung, welche die Konzentration des gebildeten Spinadduktes P beim Nachweis einer konstanten O2-.-Bildungsrate v beschreibt, wenn das Addukt eine Halbwertszeit aufweist:

Gleichung 26

Wie aus Gleichung 26 ersichtlich, wird die Konzentration des Adduktes P(t) und schließlich die Amplitude des ESR-Signals nich nur durch die produzierte O2-.-Bildungsrate v bestimmt, sondern hängt auch von der Halbwertzeit tau des Adduktes ab. Wenn die Bedingung tau<<t erfüllt ist, dann ist die stationäre Konzentration des Adduktes erreicht.

Die Empfindlichkeit einer Spintrapping-Methode in Sinne der minimalen detektierbaren Superoxidbildungsrate hängt somit ebenfalls von der Halbwertszeit des O2-.-Adduktes ab. Da die untere Grenze der mittels ESR detektierbaren Konzentrationen im nanomolaren Bereich liegt, ergibt sich die minimale nachweisbare O2-.- Bildungsrate vmin aus der Formel:

; und

wo Pmin 10nM - die minimale mittels ESR detektierbare Konzentration paramagnetischer Produkte ist.

Für DMPO (k3=0.02 M-1s-1) läßt sich die minimale nachweisbare O2-.-Bildungsrate vmin=2nMs-1 =0.12µM min-1 berechnen, während für DEPMPO (k3=0.7.10-3 M-1 s-1 ) diese vmin= 0.07 nM s-1 =4.2nM min-1 beträgt. Der Vergleich der minimalen nachweisbaren O2-.-Bildungsraten für die beiden Spintraps ergibt, daß mit DEPMPO eine 30-mal geringere O2-.-Bildungsrate nachweisbar ist, als mit DMPO.

4.4.1 DMPO und DEPMPO als Spintraps für O2-.-Nachweis.

Beide Spintraps - DMPO und DEPMPO - reagieren mit O2-.-Radikalen überwiegend in der wässrigen Phase [15,49], wobei Addukte mit charakteristischen ESR-Spektren entstehen. Wenn ein Superoxid-Addukt eines der beiden Spintraps detektiert wird, zeigt dies das Auftreten der O2-.-Radikale eindeutig an. Die Instabilität des Superoxid-Adduktes von DMPO läßt die vorteilhafte Selektivität des ESR-Nachweises mit diesem Spintrap jedoch nicht entfalten. Das Problem liegt darin, daß das gebildete DMPO- Superoxid-Addukt (DMPO-OOH-Addukt) in DMPO-Hydroxyl-Addukt (DMPO-OH-Addukt) sowie in diamagnetische Produkte zerfällt [32,46,96]. Das Auftreten des DMPO-OH-Adduktes in den O2-.-produzierenden biologischen Systemen hat oft zu den Schlußfolgerungen geführt, daß diese


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Systeme neben O2-.-Radikalen auch Hydroxyl-Radikale produzieren, was jedoch nicht immer der Fall ist [30,68,121,145].

Da das DMPO-OH-Addukt auch direkt über Spintrapping von Hydroxylradikalen gebildet werden kann, sind zusätzliche Experimente notwendig, um den Ursprung von DMPO-OH-Addukten zu klären. Hierfür werden Ethanol oder DMSO der Reaktionsmischung zugegeben, die mit OH-Radikalen reagieren und Kohlenstoff-zentrierte Radikal-Addukte mit DMPO bilden können [103]. Diese sind an den charakteristischen ESR-Spektren zu erkennen. Ist die Bildung von DMPO-OH-Addukten tatsächlich über die Reaktion mit Hydroxylradikalen verlaufen, dann wird statt eines DMPO-OH-Adduktes in ein Kohlenstoff-zentriertes DMPO-Radikal-Addukt in Anwesenheit des Lösungsmittels nachgewiesen. Dieser Zugang zur Klärung des Ursprungs von DMPO-OH-Addukt ist jedoch nicht immer an biologischen Systemen realisierbar, da DMSO und Ethanol diese Systeme beeinflussen können.

Die Selektivität der Spintrapping-Methode für den O2-.-Nachweis wurde mit Anwendung des phosphorylierten DMPO (DEPMPO) wesentlich verbessert. Das DEPMPO-OOH-Addukt ist ca.15mal stabiler als das DMPO-OOH-Addukt (Abb. 30, [49]) und zerfällt mit Bildung diamagnetischer Produkte. Die ESR-Spektren von DEPMPO-OH- und DEPMPO-OOH-Addukten sind - genauso wie im Falle von DMPO - verschieden (Kapitel 3.6.2), was eine genauere Identifizierung sowie einen gleichzeitigen Nachweis der Radikalspezies ermöglicht. Mit DEPMPO konnte in der vorliegenden Untersuchung gezeigt werden, daß das eingesetzte Modellsystem Xanthin/Xanthinoxidase hauptsächlich O2-.- und nicht Hydroxyl-Radikale produziert (Abb. 28). Das Spintrapping mit DMPO in demselben Xanthin/Xanthinoxidase System hat außerdem das Signal vom DMPO-OH-Addukt angezeigt (Abb. 26), welches dem Zerfall des DMPO-OOH-Adduktes zugeordnet wurde.

Die publizierten Daten über die Sauerstoffspezies, die an stimulierten Zellen gebildet werden, sind kontrovers. Das Spitrapping mit DMPO hat in disem System die Bildung von entweder Superoxid- oder Hydroxyl-Addukten oder von beiden gleichzeitig angezeigt [121,145,152]. Eisen, das an bei Zellaktivierung freigesetzte Protein Lactoferrin gebunden ist, wurde als Katalysator der Hydroxyl-Radikalbildung aus Wasserstoffperoxid vermutet [14,66].

Wenn die Hydroxylradikale, deren Bildung über das Spintrapping mit DMPO an stimulierten PMN registriert wurde, tatsächlich in diesem System entstehen, dann sollten sie ebenfalls mit DEPMPO nachweisbar sein, was jedoch nicht der Fall war. Mit DEPMPO wurde in der vorliegenden Arbeit die Bildung von ausschließlich Superoxidradikalen an PMA-stimulierten PMN nachgewiesen (Abb. 45). Die Geschwindigkeitskonstanten der Reaktionen beider Spintraps mit Hydroxylradikalen sind groß genug (cong 109M-1 s-1 [46,49]), um bei den eingesetzten Konzentrationen des Spintraps eine stattfindende Hydroxylradikalbildung anzuzeigen.

Für eine qualitative Bestimmung gebildeter Sauerstoffspezies mittels Spintrapping muß berücksichtigt werden, daß die Reaktion zwischen Superoxidradikal und zugesetztem Spintrap mit der O2-.-Dismutation konkurriert und die Bildung von Wasserstoffperoxid konzentrationsabhängig verringert [31]. Hierdurch kann die H2O2-abhängige Bildung von Hydroxyl-Radikalen in einem zu untersuchenden System unterdrückt werden. Die in den Experimenten an stimulierten Zellen eingesetzte DEPMPO-Konzentration von 25mM hat die O2-.-Dismutation nicht völlig verhindert, so daß die eventuell gebildeten Hydroxyl-Radikale immer noch nachgewiesen werden konnten.

Da DMPO mit O2-.-Radikalen relativ langsam reagiert [46], muß zum Superoxid-Nachweis eine Spintrap-Konzentration von 0.05-0.1M eingesetzt werden, was für biologische Objekte, u.a. für die Zellen, toxisch ist und die Auswirkung auf die Radikalbildung hat [145]. Zudem können zytosolische Enzyme der geschädigten Zellen das DMPO-OOH-Addukt in ein DMPO-OH-Addukt umwandeln und somit die Selektivität des Spintrappings mit DMPO weiter reduzieren [145]. Das phosphorylierte Derivat DEPMPO kann hingegen wegen besserer Stabilität seines Superoxid-Adduktes in niedrigeren Konzentrationen eingesetzt werden, die noch keine toxische Wirkung auf biologische Systeme zeigen (Tabelle 6),[108].

Aber auch DEPMPO ist von Wechselwirkungen mit den zu untersuchenden Systemen nicht immer frei. So hat das Spintrapping mit DEPMPO zum Nachweis der Superoxidbildung an den mit Antimycin A gehemmten Mitochondrien ergeben, daß in diesem System hauptsächlich das DEPMPO-OH-Addukt gebildet wird, dieses jedoch eine deutlich geringere Stabilität als in dem Modellsystem hat (Abb. 54). Dieser Befund ist vermutlich auf die Wechselwirkungen des Adduktes mit der mitochondrialen Atmungskette zurückzuführen, womit auch das Fehlen des weniger stabilen DEPMPO-OOH-Adduktes erklärt werden kann.


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Da die Spintrapping-Technik vor allem mit DEPMPO eine gute Selektivität des O2-.-Nachweises aufzeigt, ist es wichtig, die Möglichkeiten eines quantitativen Nachweises mit diese Methode zu analysieren. Wie Gleichung 26 zeigt, ist die Konzentration des gebildeten Superoxidadduktes P mit der Superoxidbildungsrate v verbunden. Um die O2-.-Bildungsrate v aus der Konzentration P zu ermitteln, muß ein zusätzlicher Parameter, die Halbwertszeit des Adduktes tau in dem zu untersuchenden System, bekannt sein. Je nach System kann die Halbwertszeit des Superoxidadduktes verschieden sein und läßt sich annährend aus der Zerfallskinetik bestimmen. Der tatsächliche Wert für tau kann in Anwesenheit von Superoxidradikalen geringer sein, da Superoxid-abhängige Oxidantionsreaktionen diese weiter verringern können.
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