Unger , Christian: Analyse funktioneller Domänen von SEC71 und SEC72 im posttranslationalen Translokationsprozeß Saccharomyces cerevisiae

Inst. für Biologie der Humboldt-Universität zu Berlin


Dissertation
Analyse funktioneller Domänen
von SEC71 und SEC72 im posttranslationalen Translokationsprozeß Saccharomyces cerevisiae

zur Erlangung des akademischen Grades
D o c t o r r e r u m n a t u r a l i u m
(Dr. rer. nat.)
im Fach Biologie

eingereicht an der Mathematisch-Naturwissenschaftlichen Fakultät I
der Humboldt-Universität zu Berlin

von Diplom-Biochemiker Christian Unger ,
geboren am 3. April 1970 in Berlin

Präsident der Humboldt-Universität zu Berlin

Prof. Dr. Dr. h.c. H. Meyer

Dekan der Mathematisch-Naturwissenschaftlichen Fakultät I
Prof. Dr. J. P. Rabe

Gutachter:
1. Prof. Dr. S. Prehn
2. Prof. Dr. W. Lockau
3. Prof. Dr. R. Erdmann

eingereicht: 10. Januar 2000

Datum der Promotion: 29. März 2000

Zusammenfassung

Die hier vorgelegte Arbeit analysiert funktionelle Domänen von Sec71p und Sec72p, zwei Komponenten des posttranslationalen Transports in das ER von Saccharomyces cerevisiae.

Die Kombination von Nullmutanten von SEC71, SEC72 und SBH1 führte zu den letalen Doppeldeletionsmutanten Deltasec71/Deltasbh1 und Deltasec72/Deltasbh1. Beide Hefestämme zeigen starke Akkumulation von Präkursoren verschiedener Transportsubstrate in vivo und in vitro.

Ausgehend von den letalen Doppeldeletionsstämmen war es möglich, für die Funktion von Sec71p und Sec72p wesentliche Domänen zu bestimmen. Der cytosolische Bereich von Position 120-160 des Sec71p ist ausreichend für die Assoziation mit Sec62p und bildet außerdem einen Teil der Sec72p-Bindungsdomäne. Der sich anschließende C-terminale Bereich von 46 Aminosäuren ist ebenfalls ein Teil der Sec72p-Bindungsdomäne. Jede Teildomäne für sich kann Sec72p eingeschränkt anlagern, zusammen binden sie Sec72p Hochsalz-resistent und Alkali-beständig.

Sowohl eine C-terminale Verkürzung von Sec71p bis Position 160, als auch eine Sec71p-Variante ohne Membrananker und luminalen Teil können Sec71p funktionell ersetzen. Fusionsproteine von cytosolischen Bereichen des Sec71p und dem Membrananker des P450 aus Candida maltosa können es nicht. Der Membrananker von Sec71p ist somit nicht essentiell, kann aber auch nicht durch einen beliebigen Membrananker ersetzt werden.

Eine Sequenzanalyse von Sec72p identifizierte im C-Terminus von Sec72p eine potentielle TPR-Domäne. TPR-Domänen sind Bestanteile von Protein-Interaktionen, unter anderem auch im Protein-Targetingmechanismus von Mitochondrien und Peroxisomen. Es lag daher nahe, nach cytosolischen Interaktionspartnern von Sec72p zu suchen, die Teil eines posttranslationalen Targetingmechanismus sein könnten. Die Ergebnisse photochemischer Quervernetzungsexperimente werden genauso vorgestellt, wie die eines Screens zur Identifizierung synthetisch letaler Mutanten.

Durch Coimmunpräzipitationen wurde gezeigt, daß in Abwesenheit von Sec71p, Sec72p und Sbh1p die Assoziation von Sec61p mit Sec62p nicht beeinträchtigt wird.

Die hier präsentierten Daten in Kombination mit anderen Ergebnissen führen zu der Hypothese, daß Sec71p/Sec72p zusammen mit Sbh1p eine essentielle Funktion während eines frühen Schrittes der posttranslationalen Translokation ausüben. Wegen der möglichen gegenseitigen Komplementation wurden die drei Proteine bisher in genetischen Screens jedoch nie als essentiell für den posttranslationalen Transportprozeß gefunden.

Abstract

This work is focused on the functional domains of Sec71p and Sec72p. These proteins are components of the posttranslational transport complex of the ER in the yeast Saccharomyces cerevisiae.

Deletion mutants of SEC71, SEC72 or SBH1 are viable. However the deletion of two genes - either SEC71 and SBH1 or SEC72 and SBH1 resulted in a lethal phenotyp. Both double deletion strains accumulate different transport substrats in vivo and in vitro.

Exploiting the lethal strains it was possible to investigate the function of special domains of Sec71p and Sec72p in detail. The cytosolic part of Sec71p from amino acid (aa) 120 to 160 is sufficient for the association of Sec71p with Sec62p. It is also part of the Sec72p binding domain since it binds Sec72p weakly. A tight association (resistant to high salt and alkaline pH) is achived by the additional interaction of Sec72p with the C-terminal aa 160-206 of Sec71p.

The C-terminal truncation of Sec71p up to aa 160 is able to rescue a Deltasec71/Deltasbh1 deletion strain. Even a Sec71p-variation without the luminal part and membrane anchor can functionaly replace the wt-protein whereas fussion proteins of different cytosolic parts of Sec71p with a transmembrane domain of P450 of Candida maltosa are not able to do it. The transmembrane domain of Sec71p seems not to be essential for proteins function. A membrane anchor of a different protein abolishes the correct interaction of Sec71p with its partners of the translocon.

A sequence analysis of SEC72 identified a C-terminal domain with similarity to a TPR-domain. TPR-domains mediat protein interactions and they participate for instance in the targeting of proteins to the mitochondria or peroxisomes. Therefore we searched for cytosolic interaction partners of Sec72p. The results of photoreactive crosslinking studies and of a screen for synthetic lethality are presented in this work.

By co-immunoprecipitation we showed that the association between Sec61p and Sec62p is not altered in the abscence of Sec71p, Sec72p and Sbh1p.

The results presented herein combined with other data gave rise to the hypothesis that Sec71p/Sec72p together with Sbh1p are essential for an early step of the posttranslational translocation. Because of their overlapping functions neither one of them was found to be essential for the posttranslational transport in former genetic screens.

Schlagwörter:
Posttranslationaler Transport, Saccharomyces cerevisiae, SEC71, SEC72

Keywords:
Posttranslational transport, Saccharomyces cerevisiae, SEC71, SEC72


Seiten: [9] [12] [13] [14] [15] [16] [17] [18] [19] [20] [21] [22] [23] [24] [25] [26] [27] [28] [29] [30] [31] [32] [33] [34] [35] [36] [37] [38] [39] [40] [41] [42] [43] [44] [45] [46] [47] [48] [49] [50] [51] [52] [53] [54] [55] [56] [57] [58] [59] [60] [61] [62] [63] [64] [65] [66] [67] [68] [69] [70] [71] [72] [73] [74] [75] [76] [77] [78] [79] [81] [80] [82] [83] [84] [85] [86] [87] [88] [89] [90] [91]

Inhaltsverzeichnis

TitelseiteAnalyse funktioneller Domänen von SEC71 und SEC72 im posttranslationalen Translokationsprozeß Saccharomyces cerevisiae
Abkürzungsverzeichnis Abkürzungsverzeichnis
1 Einleitung
1.1Das Targeting zum Endoplasmatischen Retikulum
1.2Der Transport in das Endoplasmatische Retikulum
1.3Die Hefe Saccharomyces cerevisiae besitzt drei unabhängige Proteinkomplexe zur Translokation in das ER
1.4Die Translocase in Escherichia coli
1.5Zielsetzung
2 Material und Methoden
2.1Material
2.1.1Verwendete Hefestämme
2.1.2Verwendete Plasmide
2.1.3Verwendete Oligonukleotide
2.1.4Verwendete Antikörper
2.1.5Puffer und Lösungen
2.2Methoden
2.2.1Allgemeine molekularbiologische Methoden
2.2.2Biochemische Methoden
2.2.2.1In vitro Transkription und in vitro Translation
2.2.2.2Protein-Quervernetzung unter Verwendung von photoreaktivem TDBA-Lys
2.2.2.3Immunpräzipitation
2.2.2.4Puls-Markierung von Transportproteinen
2.2.2.5Bestimmung der Lokalisierung von Membranproteinen
2.2.3Methoden zum Arbeiten mit S. cerevisiae (Bäckerhefe)
2.2.3.1Transformation von Hefen mit Plasmid-DNA
2.2.3.1.1Lithiumacetat-Methode
2.2.3.1.2Hefetransformation mittels Elektroporation
2.2.3.2Isolierung von Plasmid-DNA aus Hefen
2.2.3.3Kreuzung, Sporulation und Tetradenanalyse
2.2.3.4Durchführung eines genetischen Screens zur Identifizierung synthetisch letaler Mutanten
2.2.3.5Präparation von Hefemembranen
2.2.3.5.1Präparation von Hefemembranen aus kleinen Kulturen
2.2.3.5.2Präparation von Hefemembranen aus großen Kulturen
3 Ergebnisse
3.1Analyse der Funktion von SEC71
3.1.1Coletalität von SEC71 in Kombination mit Deltasbh1.
3.1.2Die N-terminalen 160 Aminosäuren des Sec71p sind in vivo in Abwesenheit von Sbh1p essentiell.
3.1.3Der C-Terminus von Sec71p ist notwendig für die Bindung von Sec72p, sowohl in vivo als auch in vitro.
3.1.4Ein 160-mer von Sec71p ist erforderlich für die Assoziation mit dem SEC-Komplex
3.1.5Die 46 C-terminalen Aminosäuren von Sec71p sind ausreichend, um Sec72p zu binden.
3.1.6Der P450Cm1-Membrananker aus Candida maltosa ist nicht in der Lage den Sec71-Membrananker zu ersetzen.
3.2Untersuchungen zur Rolle von SEC72
3.2.1Coletalität von SEC72 in Kombination mit Deltasbh1
3.2.2Eine C-terminale TPR-Domäne des Sec72p ist essentiell für seine Funktion.
3.2.3Die Deletion der TPR-Domäne ändert nicht die Lokalisierung von Sec72DeltaTPRp.
3.3Quervernetzungstudien zur Identifizierung von Interaktions-partnern von Sec72p.
3.4Screen zur Identifizierung synthetisch letaler Mutanten in Kombination mit Deltasec72.
3.5Ursachen für die synthetische Letalität von Deltasec71/Deltasbh1 und Deltasec72/Deltasbh1
3.5.1Die Stämme Deltasec71/Deltasbh1/Deltasbh2 und Deltasec72/Deltasbh1/Deltasbh2 zeigen deutliche Transportdefekte.
3.5.2Untersuchungen zur Stabilität des posttranslationalen Komplexes
4 Diskussion
4.1Die verschiedenen Domänen des Sec71p und ihre Funktionen
4.2Sec72p besitzt eine potentielle Interaktionsstelle für cytosolische Proteine
4.3Synthetische Letalität als Indikator für Interaktionen und ergänzende Funktionen
4.4Sind Sec71p/Sec72p und die Beta-Untereinheit des Translokons analoge Proteine ?
Bibliographie Literaturverzeichnis
Danksagung
Lebenslauf
Selbständigkeitserklärung

Abbildungsverzeichnis

Abb. 1: Die Hefe S. cerevisiae hat drei verschiedene Translokationskomplexe für den ER-Import. Der trimere Sec61-Komplex (rötlich eingefärbt) spielt eine zentrale Rolle. Als eigenständiger Komplex ist er essentiell für den cotranslationalen Transport. Zusammen mit dem Sec62/63-Subkomplex (bläulich eingefärbt) bildet er den zur posttranslationalen Translokation fähigen SEC-Komplex. Das luminale Hsp70-Homologe Kar2p (gelb) ist ebenfalls ein wichtiger Bestandteil des posttranslationalen Transportmechanismus. Der Ssh1-Komplex (grünlich/rötlich eingefärbt) ist nicht essentiell. Er assoziiert nicht mit dem Sec62/63-Subkomplex und hat vermutlich eine Rolle bei der Regulation der Proteinsekretion in das ER.
Abb. 2: Vergleich der wichtigsten Komponenten für den Proteintransport durch die eukaryontische ER-Membran (Säuger; S.cerevisiae) bzw. prokaryontische Plasmamembran (E.coli; Archaea).
Abb. 3: Genetische Interaktion von SEC71 und SBH1. Hefestämme wie angegeben, wurden über Nacht in YPD angezogen, ausgestrichen und bei den angegebenen Temperaturen 2-3 Tage inkubiert.
Abb. 4: Versuch zur Komplementation des Hefestamms Deltasec71/Deltasbh1. Hefezellen der Deltasec71/Deltasbh1-Doppelmutante, die ein SBH1-codierendes URA-Plasmid (pCU 051) enthielten, wurden mit 2µ-Plasmiden für SBH2 (pCU 049), Säuger SEC61ß (Klon 7/11) oder SEC72 (pCU 033) transformiert. Die Transformanten wurden über Nacht in YPD angezogen, auf SD-Platten mit bzw. ohne 5´FOA ausgestrichen und bei den angegebenen Temperaturen 2-4 Tage inkubiert.
Abb. 5: Coimmunpräzipitation zur Analyse der Komplexumgebung von Sbh2p in Abwesenheit von Ssh1p. 300 eq Membranen des Wildtyps (YTX57) und des YUC 4 (Deltasec71/Deltasbh1/Deltassh1) wurden in Digitonin solubilisiert, und das Solubilisat über Nacht mit Antikörper gegen Sec62p sowie mit ProteinG Sepharose inkubiert. Die an ProteinG Sepharose gebundenen Fraktionen wurden im SDS-PAGE aufgetrennt und im Western Blot mit Antikörpern gegen Sec62p und gegen Sbh2p getestet.
Abb.6: Schematische Darstellung der C-terminalen Verkürzungen von SEC71. Das Konstrukt SEC71-206 entspricht dem Wildtyp. Alle Zahlenangaben beziehen sich auf Aminosäuren. Die Transmembrandomäne zwischen Aminosäuren 28 und 51 ist gemustert dargestellt.
Abb. 7: Versuch zur Komplementation des Hefestamms Deltasec71/Deltasbh1 mit C-terminalen Verkürzungen von SEC71. Zellen des Hefestamms Deltasec71/Deltasbh1, pSBH1URA wurden mit Plasmiden transformiert, die für das Wildtyp-Protein (SEC71-206), sowie C-terminale Verkürzungen von Sec71p codierten. Die Transformanten wurden über Nacht in YPD angezogen, auf Selektionsplatten mit bzw. ohne 5´FOA ausgestrichen und bei 30°C drei Tage inkubiert. Alle Positionsangaben sind Aminosäureangaben.
Abb. 8: Anlagerungsverhalten von Sec72p an C-terminale Verkürzungen von Sec71p. Transformanten des Deltasec71-Stamms mit Plasmiden, die für Sec71p-Verkürzungen wie angegeben codierten, wurden in Selektions-medium angezogen. Aus kleinen Kulturen wurden Membranen präpariert, je 2 OD600 der Membranen im SDS-PAGE aufgetrennt und im Western Blot mit Antikörpern gegen Sec72p getestet. Die kreuzreaktive Bande (-x) bestätigt das Auftragen gleicher Mengen.
Abb. 9: Untersuchung zur in vitro Anlagerung von Sec72p an verschiedene Sec71p-Varianten. Jeweils 5 eq der angegebenen Membranen wurden mit frischem, in vitro synthetisiertem Sec72p 20 min bei 30°C inkubiert. Die Membranen wurden sedimentiert, gewaschen und in Probenpuffer aufgenommen. Die Proteine aus den Überständen wurden mit TCA gefällt und in gleichen Mengen Probenpuffer resuspendiert. Mittels SDS-PAGE und Radiographie wurde die Verteilung von Sec72p zwischen Membranpellet und Überstand und daraus die Anlagerungseffizienz in vitro bestimmt. Mehrere Experimente bestätigten die hier gezeigten Ergebnisse. Der relativ hohe Hintergrund von ca. 30% Sec72p, der sich auch ohne Sec71p und vor allem auch ohne Membranen im Pellet findet, ist vermutlich auf Aggregate zurückzuführen.
Abb. 10: Western Blot und Coimmunpräzipitationen der verkürzten Sec71p-myc Fusionsproteine. A) Der Hefestamm YUC 11 (Deltasec71) wurde mit Plasmiden für verkürzte Sec71p-Varianten mit N-terminalen 3x myc-Epitopen transformiert. 0,4 OD600 entsprechender Membranpräpartionen wurden im SDS-PAGE aufgetrennt und mit einem Antikörper gegen c-myc im Western Blot getestet. Die N-terminale Fusion des 3x myc-Epitops führt vermutlich zu Beeinträchtigungen der Glykosylierung von Sec71p. Mit * markierte Banden zeigen glykosylierte Formen der Sec71p-Varianten. B) Je 300 eq der jeweiligen Membranen wurden in eine Coimmunpräzipitation mit Antikörpern gegen Sec62p eingesetzt und und im Western Blot auf die Anwesenheit der c-myc-markierten Sec71p-Verkürzungen getestet.
Abb. 11: Schematische Darstellung der Fusionsproteine von P450 Cm1-Membrananker aus Candida maltosa (P450 Cm11-44) und verschiedenen cytosolischen Fragmenten von S.c. Sec71p. Jedes Konstrukt existiert sowohl als Fusion mit einem 3x myc-Epitop sowie auch ohne. Alle Positionsangaben beziehen sich auf Aminosäuren.
Abb. 12: Untersuchung zur Expression von P450-Sec71p-Fusionsproteinen und dem Anlagerungsverhalten von Sec72p an diese Fusionsproteine. A) Expressionsnachweis der P450-Sec71p-Fusionsproteine im Western Blot. Je 2 eq Membranen der angegebenen Hefestämme wurden in einer SDS-PAGE aufgetrennt und im Western Blot auf das c-myc-Epitop getestet. An der Übergangsstelle zwischen c-myc-Epitop und P450-Membrananker ist eine neue Glykosylierungsstelle entstanden. Durch unvollständige Glykosylierung kommt es zum Auftreten der Doppelbanden bei P450-7180-206p-myc und P450-71160-206p-myc. B) In vivo Anlagerung von Sec72p an Membranen, die P450-Sec71p-Fusionsproteine enthalten. Membranen wie in A) sowie Membranen eines Deltasec71-Stamms wurden im Western Blot mit Antikörpern gegen Sec72p getestet.
Abb. 13: Coimmunpräzipitation der P450-Sec71p-Fusionsproteine mit Antikörpern gegen Sec62p. Der Hefestamm YUC 11 (Deltasec71) wurde mit den Plasmiden pCU 109, pCU 110 und pCU 111 transformiert. Je 200 eq Membranen der Transformanten wurden in eine Coimmun-präzipitation mit Antikörpern gegen Sec62p eingesetzt. Die an Protein A Sepharose gebundenen Fraktionen wurden im SDS-PAGE aufgetrennt und im Western Blot mit einem Antikörper gegen das c-myc Epitop auf die Anwesenheit von c-myc-markierten P450-Sec71-Fusionsproteinen getestet.
Abb. 14: Genetische Interaktion von SEC72 und SBH1. Hefestämme wie im Schema links angegeben wurden über Nacht in Vollmedium angezogen, auf SD- bzw. SD + 5´FOA-Platten ausgestrichen und für 2-3 Tage bei 30°C inkubiert.
Abb. 15: Aminosäuresequenz von S.c. SEC72. Die Tetratricopeptide Domäne (TPR-Domäne) ist grau unterlegt, die Lsyine sind f ett dargestellt.
Abb. 16: Genetische Untersuchung zur Rolle der TPR-Domäne des Sec72p in Abwesenheit von SBH1. Transformanten von YUC15 + pSEC72URA (Deltasec72/Deltasbh1 + pSEC72URA) mit pSEC72, mit pSEC72DeltaTPR und mit pRS415 (Ausgangsvektor) wurden über Nacht in Vollmedium angezogen, auf SD- bzw. SD + 5´FOA-Platten ausgestrichen und 2-3 Tage bei 30°C inkubiert.
Abb. 17: Untersuchung zur Lokalisierung von Sec72DeltaTPRp. Plasmide, die für SEC72 bzw. SEC72DeltaTPR kodieren wurden in den Stamm YUC 6 (Deltasec72) transformiert. Transformanten sowie ein Wildtyp als Kontrolle wurden in Minimalmedium angezogen und geerntet, Membranen wurden nach einem Standardprotokoll präpariert und entweder mit 500 mM NaCl oder mit 100 mM Na2CO3, pH 11 für 20 min inkubiert. Die Membranen wurden sedimentiert und die Verteilung von Sec72p bzw. Sec72DeltaTPRp zwischen Membranen und Überstand durch eine Western Blot Analyse mit Antikörpern gegen Sec72p durchgeführt.
Abb. 18: Photoreaktive Quervernetzung von Sec72p zu seiner Membranumgebung. Sec72p wurde in vitro translatiert und dabei durch Einbau von 35S-Methionin radioaktiv markiert. Das Lysin des Standard-Aminosäuremixes wurde bei der Translation durch photoreaktives TBDA-Lys ersetzt. Das in vitro translatierte Sec72p wurde mit Sec72p-freien Membranen 20 min auf Eis inkubiert. Durch hochtourige Zentrifugation wurden die Membranen und assoziiertes Sec72p sedimentiert. Das Membranpellet wurde in 20 µl Membranpuffer resuspendiert, der Ansatz halbiert und die eine Hälfte UV-bestrahlt. Beide Proben wurden im SDS-PAGE aufgetrennt und die radioaktiven Proteinbanden mit Hilfe eines Phosphorimagers sichtbar gemacht.
Abb. 19: Immunpräzipitation des Sec72p-Quervernetzungsproduktes mit Antikörpern gegen verschiedene Proteine des SEC-Komplexes. Membranen mit in vitro translatiertem Sec72p (35S, TBDA-Lys) wurden UV-bestrahlt und anschließend in Immun-präzipitationen mit Antikörpern gegen Sec61p, Sec62p, Sec72p, Sbh1p sowie mit ConA Sepharose eingesetzt. Sowohl die an Protein A Sepharose bzw. ConA Sepharose gebundenen Fraktionen als auch die TCA-gefällten Überstände wurden im SDS-PAGE aufgetrennt. Die Verteilung des radioaktiven Quervernetzungsproduktes wurde durch Auflegen und Auswerten einer Phosphorimagerplatte analysiert.
Abb. 20: In vivo System zur Untersuchung der letalen Hefestämme durch Repremierung des Methionin-Promotors. A) Flüssigkulturen der angegebenen Hefestämme wurden aus Methionin-freien Vorkulturen in Minimalmedium +/- 4 mM Methionin mit einer OD600 = 0,1 angeimpft. Durch Verdünnen der Kulturen wurde gewährleistet, das die OD600 über die gesamte Versuchszeit unter 1,0 lag. Die Bestimmung der OD600 erfolgte zu den angegebenen Zeitpunkten, entsprechende Verdünnungsfaktoren wurden bei der Berechnung der Gesamtzelldichte berücksichtigt. B) Zu den angegebenen Zeitpunkten wurden 10 OD600 Zellen der Kulturen aus A) geerntet, aufgeschlossen und im Western Blot mit Antikörpern gegen Sec62p und Sbh1p getestet. Hier werden die Ergebnisse für den Deltasec72/Deltasbh1/Deltasbh2, pMET-SBH1-Stamm in Abwesenheit bzw. Gegenwart von 4 mM Methionin gezeigt. Die Daten für den Wildtyp (wt) und den Deltasec71/Deltasbh1/Deltasbh2, pMET-SBH1-Stamm decken sich mit den gezeigten.
Abb. 21: Untersuchung zur Akkumulation von ppCPY im steady state in verschiedenen letalen Stammhintergründen. Hefestämme, wie angegeben, wurden in Minimalmedium mit bzw. ohne 4 mM Methionin angezogen. Nach 18 Stunden Wachstum bei 4 mM Methionin ist der Gehalt an Sbh1p im Western Blot nicht mehr nachweisbar. Zu den angegebenen Zeitpunkten wurden je 50 OD600 Zellen geerntet und aufgeschlossen. Die Zelllysate wurden in eine Immunpräzipitation mit Antikörpern gegen CPY eingesetzt. Anschließend wurden die an ProteinA Sepharose gebundene mCPY/ppCPY-Fraktionen mit Endo H deglykosyliert. Die Deglykosylierung dient der Unterscheidung zwischen mCPY und ppCPY, die ansonsten im SDS-PAGE das gleiche Laufverhalten zeigen. mCPY-Gluc = deglykosylierte mCPY.
Abb. 22: Pulse-Markierung zur Detektion von CPY Präkursor-Akkumulation. Hefen der angegebenen Stämme wurden in SGal-Medium angezogen und für 18 Std. in SD-Medium umgesetzt. Durch Repremierung des GAL-Promotors entstehen die angegebenen Phänotypen. Die Zellen wurden wie im Abschnitt 3.2.2.3 beschrieben 4 min pulse-markiert, aufgeschlossen und in eine Immunpräzipitation mit Antikörpern gegen CPY eingesetzt. Präzipitiertes CPY wurde im SDS-PAGE aufgetrennt und mit Hilfe eines Phosphorimagers ausgewertet. Zu sehen sind die unprozessierte präpro-Form des CPY (ppCPY), sowie die einfach bzw. zweifach glykosylierten Golgi-Formen der CPY (p1 bzw. p2).
Abb. 23: Präkursor-Akkumulation von pre-Invertase im steady state. Hefestämme, wie angegeben, wurden aus Vorkulturen in SGal für 18 Std. in SD-Medium angezogen. Um eine konstitutive Expression der Invertase auch in Glucose-haltigem Medium zu erreichen, wurde das SUC2-Gen unter Kontrolle des PGK-Promotors auf einem 2µ-Plasmid in die Hefen transformiert. Die Zellen wurden geerntet, aufgeschlossen und die Lysate in eine Immunpräzipitation mit Antikörpern gegen Invertase eingesetzt. Die Auswertung erfolgte durch SDS-PAGE und Western Blot Analyse.
Abb. 24: Der SEC-Restkomplex ist in Abwesenheit von Sec71p, Sec72p und Sbh1p stabil. Membranen der angegebenen Stämme wurden zu den Zeitpunkten 0 bzw. 18 Std. geerntet. 90 eq entsprechender Membranpräparationen wurden unter 1% Digitonin im Hochsalzpuffer (siehe 3.2.2.2) solubilisiert und mit einem Antikörper gegen Sec62p gefällt. Präzipitate entsprechend 25 eq wurden im SDS-PAGE aufgetrennt und im Western Blot auf die Anwesenheit von Sec61p und Sec62p getestet. Gefragt wurde, ob im SEC-Restkomplex in Abwesenheit von Sec71p, Sec72p und Sbh1p immer noch eine Sec61p x Sec62p Interaktion nachweisbar ist.

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