25

Kapitel 2. Material und Methoden

2.1 Material

2.1.1 Verwendete Hefestämme

Stamm	Genotyp	Parental-Stamm	Referenz
YTX 57	mat , his3-11,-15, leu2-3,-112, trp1-1, ura3-1, ade2-1, can1-100	YTX 69, Tetradenanalyse	T. Sommer C. Volkwein
YTX 58	mat a, his3-11,-15, leu2-3,-112, trp1-1, ura3-1, ade2-1, can1-100	YTX 69, Tetradenanalyse	T. Sommer C. Volkwein
YTX 69	mat a/, his3-11,-15/his3-11,-15, leu2-3,-112/leu2-3,-112, trp1-1/trp1-1, ura3-1/ura3-1, ade2-1/ade2-1, can1-100/ can1-100		Hartmann et al., 1994
YUC 1	mat a/, sbh1::HIS3/his3-11,-15, sec71::LEU2/ leu2-3,-112, trp1-1/trp1-1, ura3-1/ura3-1, ade2-1/ade2-1, can1-100/can1-100	YTX 69	Diese Arbeit
YUC 2	mat , sbh1::HIS3/his3-11,-15, sec71::LEU2/ leu2-3,-112, trp1-1,/ura3-1, ade2-1, can1-100	YUC 1 + pSBH1 und Tetradenanalyse	Diese Arbeit
YUC 3	mat a/, sbh2::ADE2/ade2-1, sec71::LEU2/ leu2-3,-112, his3-11,-15/his3-11,-15, trp1-1/trp1-1, ura3-1/ura3-1, can1-100/can1-100	YTX 69	Diese Arbeit
YUC 4	mat , sbh1::HIS3/his3-11,-15, sec71::LEU2/ leu2-3,-112, trp1-1, ura3-1, ssh1::ADE2/ade2-1, can1-100	YUC2/pSBH1::URA3, ssh1-Transfornation und 5´FOA-Selektion	Diese Arbeit
YUC 6	mat a, sec72::TRP1/trp1-1, his3-11,-15, leu2-3,-112, ura3-1, ade2-1, can1-100, ssd1-d	K 699	Diese Arbeit
YUC 7	mat , sec72::TRP1/trp1-1, his3-11,-15, leu2-3,-112, ura3-1, ade2-1, can1-100, ssd1-d	K 700	Diese Arbeit
YUC 8	mat , sbh2::HIS3/his3-11,-15, leu2-3,-112, sec72::TRP1/trp1-1, ura3-1, ade2-1, can1-100	YKF 11 + sec72-Transformat.	Diese Arbeit
YUC 9	mat , sbh1::HIS3/his3-11,-15, sec72::TRP1/trp1-1, sbh2::ADE2/ade2-1, ura3-1, leu2-3,-112, can1-100	YKF16/pSBH1::URA3 + sec72-Transformat.	Diese Arbeit
YUC 10	mat , sbh1::HIS3/his3-11,-15, sbh2::ADE2/ade2-1, sec71::LEU2/leu2-3,-112, ura3-1, trp1-1, can1-100	YKF16/pSBH1::URA3 + sec71-Transformat.	Diese Arbeit
YUC 11	mat a, sec71::LEU2/leu2-3,-112, his3-11,-15, trp1-1, ura3-1, ade2-1, can1-100	YUC 1, Tetradenanalyse	Diese Arbeit

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YUC 12	mat , sec71::LEU2/leu2-3,-112, his3-11,-15, trp1-1, ura3-1, ade2-1, can1-100	YUC 1, Tetradenanalyse	Diese Arbeit
YUC 13	mat a, sec71::LEU2/leu2-3,-112, sec72::TRP1/trp1-1, his3-11,-15, ura3-1, ade2-1, can1-100	YUC 6 + sec71-Transformation	Diese Arbeit
YUC 14	mat a, sec71::LEU2/leu2-3,-112, sbh2::ADE2/ade2-1, his3-11,-15, trp1-1, ura3-1, can1-100	YTX 69, Tetradenanalyse	Diese Arbeit
YUC 15	mat a, sec72:: TRP1/trp1-1, sbh1::HIS3/his3-11,-15, leu2-3,-112, ade2-1, ura3-1, can1-100	Kreuzung YUC 6 x YKF8, Tetradenanalyse	Diese Arbeit
YUC 16	mat , sbh2::HIS3/his3-11,-15, sec72::TRP1/trp1-1, ade3, ade2-1, leu2-3,-112, ura3-1, can1-100	YUC 8 + ade3-Transformation	Diese Arbeit
YKF 8	mat , sbh1::HIS3/his3-11,-15, leu2-3,-112, trp1-1, ura3-1, ade2-1, can1-100	YKF 7	K. Finke et al., 1996
YKF 9	mat , sbh2::ADE2/ade2-1, his3-11,-15, leu2-3,-112, trp1-1, ura3-1, can1-100	YKF 7	K. Finke et al., 1996
YKF 11	Mat a, sbh2::HIS3/his3-11,-15, leu2-3,-112, trp1-1, ura3-1, ade2-1, can1-100	YTX 69, Tetradenanalyse	K. Finke et al., 1996

2.1.2 Verwendete Plasmide

Name	Beschreibung	Wirts-stamm	Klon, Datum
pYPGE2	Hefe-Expressionsvektor, 2µ, TRP1-Marker, Amp, Phosphorglyceratkinase-Promotor, Multi-cloning-site	TOP 10	Brunelli u. Pall, 1993
pYPGE2- LEU	Hefe-Expressionsvektor, 2µ, LEU2-Marker, Amp, Phosphorglyceratkinase-Promotor, Multi-cloning-site	TOP 10	v. 5/96
pYPGE2- URA	Hefe-Expressionsvektor, 2µ, URA3-Marker, Amp, Phosphorglyceratkinase-Promotor, Multi-cloning-site	TOP 10	v. 5/96
pCU 012	SEC61ß im pBS	XL1-blue	Klon B-17 v. 18.8.94
pCU 025	SEC72 im pBS	XL1-blue	Klon M5-4 v. 26.1.96
pCU 028	SEC71 im pBS	XL1-blue	Klon M8-7 v. 26.1.96
pCU 029	SEC71 im pYPGE2	TOP 10	Klon 29-14 v. 2.4.96
pCU 033	SEC72 im pYPGE2	TOP 10	M15-21 v. 15.2.96

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pCU 045	SEC71 im pYPGE2-LEU	TOP 10	M 9-1 v. 28.6.96
pCU 046	SEC72 im pYPGE2-LEU	TOP 10	M 3-1 v. 28.6.96
pCU 047	SBH1 im pYPGE2	TOP 10	Klon 47-4 v. 25.6.96
pCU 049	SBH2 im pYPGE2	TOP 10	Klon 3-1 v. 17.7.96
pCU 050	SBH2 im pRS426-MET	TOP 10	Klon 1-2 v. 18.7.96
pCU 051	SBH1 im pRS426-MET	TOP 10	Klon 5-12 v. 18.7.96
pCU 056	SBH1 im pRS426-Met mit TRP-Marker	TOP 10	Klon 7-34 v. 18.7.96
pCU 057	SBH2 im pRS426-Met mit TRP-Marker	TOP 10	Klon 8-15 v. 18.7.96
pCU 060	sec71-Konstrukt im pGEM-T	XL-I blue	Klon #20 v. 22.10.96
pCU 061	Endogenes SEC72 full-lenght im pRS415	TOP 10	Klon SS2 v. 23.9.96
pCU 062	Hintere Flanke des SEC72-TPR-Konstruktes im pRS415	TOP 10	Klon SB4 v. 23.9.96
pCU 063 neu	SEC61ß im pRS426-GAL10	TOP 10	Klon 4-1 v. 9.10.96
pCU 065	SEC72-TPR-Konstrukt im pRS415	TOP 10	Klon 2-1 v. 9.10.96
pCU 066	SEC72-HIS6 im pQE60	BL21	Klon 63 v. 12/96
pCU 073	SEC72 im Vektor für in vitro Transkription	TOP 10	Klon 73-3 v. 27.1.97
pCU 085	Synth. Letaler Screen: SEC72 im pJF14 (Mutationsplasmid)	TOP 10	Klon 85-4 v. 17.12.98
pCU 088	Synthetisch letaler Screen: SEC72 im pJF 14 (Testplasmid)	TOP 10	Klon E3 v. 7.7.98
pCU 093	3x myc-tag im pYPGE2-Ura	TOP10	Klon 8-1 v. 8.10.98
pCU 098	SBH1 im pRS414-GAL unter Kontrolle des GAL10-Promotors.	TOP 10	Klon 2 v. 15.3.99
PCU 099	SBH1 im pRS415-GAL unter Kontrolle des GAL10-Promotors.	TOP 10	Klon R18 v. 8.6.99

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pCU 100	SEC71-120 + 3x myc-Epitop N-terminal im pYPGE2- Ura	TOP10	Klon 120-2 v. 4.12.98
pCU 101	SEC71-160 + 3x myc-Epitop N-terminal im pYPGE2- Ura	TOP10	Klon 160-2 v. 4.12.98
pCU 102	SEC71-170 + 3x myc-Epitop N-terminal im pYPGE2- Ura	TOP10	Klon 170-2 v. 4.12.98
pCU 103	SEC71-180 + 3x myc-Epitop N-terminal im pYPGE2- Ura	TOP10	Klon 180-2 v. 4.12.98
pCU 104	SEC71-206 + 3x myc-Epitop N-terminal im pYPGE2- Ura	TOP 10	Klon 206-2 v. 4.12.98
pCU 105	SUC2 (Invertase) im pYPGE2-Ura, konstitutiv expremiert	TOP 10	Klon 17 v. 21.8.99
pCU 106	Fusionskonstrukt aus P450Cm1 (1-132bp) + SEC71(241-618bp) im pYPGE2-URA	TOP 10	Klon A105 v. 21.9.99
pCU 107	Fusionskonstrukt aus P450Cm1 (1-132bp) + SEC71(361-618bp) im pYPGE2-URA	TOP 10	Klon B88 v. 21.9.99
pCU 108	Fusionskonstrukt aus P450Cm1 (1-132bp) + SEC71(481-618bp) im pYPGE2-URA	TOP 10	Klon C6 v. 21.9.99
pCU 109	Fusionskonstrukt aus 3x myc-tag + P450Cm1 (1-132bp) + SEC71(241-618bp) im pYPGE2-URA	TOP 10	Klon +D4 v. 19.10.99
pCU 110	Fusionskonstrukt aus 3x myc-tag + P450Cm1 (1-132bp) + SEC71(361-618bp) im pYPGE2-URA	TOP 10	Klon E29 v. 19.10.99
pCU 111	Fusionskonstrukt aus 3x myc-tag + P450Cm1 (1-132bp) + SEC71(481-618bp) im pYPGE2-URA	TOP 10	Klon F71 v. 19.10.99
P450 Cm1j	Cm1(1-44)/Invc Konstrukt im Yep51, PCR-Template für den Membrananker von P450 aus Candida maltosa	DH5C	R. Menzel et al., 1996

2.1.3 Verwendete Oligonukleotide

Name	Sequenz	Verwendung
71-120	CCG GTA CCC TAT AGA AGG TTT ATC TGA GGA G	C-term. verkürztes SEC71-120
71-160	ATG GTA CCC TAA ACC CAG CCC GGT TGC AAT C	C-term. verkürztes SEC71-160
71-170	CCG GTA CCC TAA ATT TCT TTA CAA ACC ATA ACG	C-term. verkürztes SEC71-170
71-180	CCG GTA CCC TAA TAA CGT CTA GAG AGA GC	C-term. verkürztes SEC71-180

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CMU 016 neu	GCA GGA TCC CGG CCA TGG TTA CCC TTG AAT AC	Amplifikation von SEC72 (s)
CMU 017 neu	CCG CTC GAG GGT TAT GCA CCT TAT TCA CCG	Amplifikation von SEC72 (as)
CMU 023	GGA TCC CTT GAG TTT ACC AAT ATG TCC G	Amplifikation von SEC71 (s)
CMU 024	GGT ACC GTA GTG AGC AAG AAG AAG GGT AG	Amplifikation von SEC71 (as)
CMU 025	GTA TAT CGA TAT CAG TAG TAT AGG G	Oligo zur Herstellung des sec71
CMU 026	CGA GAA GGT GTT GAA GGC CGC	Sequenz-Oligo für SEC71
CMU 029	ACA TGA GCT CCT AGG ATC CGA CAA ATA CGT CTG GTT GG	Oligo zur Herstellung von SEC72TPR (as)
CMU 030	GGG GAT CCG AAA CTG CAA GAA ATA TGG C	Oligo zur Herstellung von SEC72TPR (s)
CMU 054	ggt aag ggg cgc aaa gc	PCR von genomischem SBH2 (s)
CMU 055	gga cgc gga gca cca cc	PCR von genomischem SBH2 (as)
CMU 056	CGC GGA TCC ATG GAA CAA AAG CTC ATT TCT GAA GAG G	3-myc tag (s)
CMU 057	ccg gaa ttc aga tct att aag gtc ctc ctc gga tat ta	3-myc tag (as)
CMU 058	GAG AGA TCT GAG TTC AAT GAA ACA AAA TTC TCC AAC	PCR BglII-SEC71 (s)
CMU 059	ggg gta ccg gca cta att gac taa	PCR BglII-SEC71 (as)
Inv-for	GGA AGA TCT ATG ATG CTT TTG CAA GCT TTC C	PCR von SUC2 für pYPGE2-Ura
Inv-rev	GCC GAA TTC CTA TTT TAC TTC CCT TAC TTG G	PCR von SUC2 für pYPGE2-Ura
Sbh1-anti	cgg aat tcg ttt tgt caa ata ggg tgg	PCR von SBH1 für pRS414 GAL anti
SBH1-sense	aaa ctg cag cca taa tgt caa gcc caa ctc c	PCR von SBH1 für pRS414 GAL anti
P450-Cm1 (s)	CG GGA TCC ATG GCT ATA GAA CAA ATT ATT G	PCR des Membranankers von P450 aus Candida maltosa
P450-Cm1 (as)	CG GAA TTC CTT TCA ACT TAT ATT CGT AAA ATT TAT TTC	PCR des Membranankers von P450 aus Candida maltosa
SEC 71 (80-206)	cg gaa ttc tta tga gtg aaa atg aaa aaa ttc	PCR des cytosolischen Teils von SEC71 , Pos. 80-206aa
SEC 71 (120-206)	CG GAA TTC TTT ATA AAA ATG GCT CTA TTG GGG	PCR des cytosolischen Teils von SEC71 , Pos. 120-206aa
SEC 71 (160-206)	CG GAA TTC TTC AAT TGT TCG TTA TGG TTT G	PCR des cytosolischen Teils von SEC71 , Pos. 160-206aa

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2.1.4 Verwendete Antikörper

Antigen	Antigene Sequenz	Herkunft	Verdünnung
Sbh1p	NH2- CPTPPGGQRTLQKRK-CONH2	E. Hartmann	1 : 50.000
Sbh2p	NH2-CKEKQAKQTP-CONH2	E. Hartmann	1 : 1.000
Sec61p	cys-LVPGFSDLM-COOH	E. Hartmann	1 : 5.000
Sec72p	Rekombinantes Protein	Diese Arbeit	1 : 1.000
Sec62p	CNKKKAINEKAEQN-COOH	E. Hartmann	1 : 20.000
CPY	Rekombinantes Protein Monoklonaler Antikörper 10A5-B5	<1>	1 : 5.000
c-myc Epitop	c-myc menschlichen Ursprungs, 9E19 Myc-tag	Santa Cruz sc-789-G	1 : 5.000
-Faktor	Rekombinantes Protein	K. Plath, Boston	1 : 5.000
Invertase	Rekombinantes Protein	L. Lehle, Regensburg	1 : 5.000
Anti Rabbit IgG	Zweiter Antikörper gekoppelt mit Meerrettich-Peroxidase	Amersham NA 934	1 : 5.000
Protein A POD	Zweiter Antikörper gekoppelt mit Meerrettich-Peroxidase gegen natives IgG	Sigma P-8561	1 : 5.000

2.1.5 Puffer und Lösungen

Membranpuffer:

50 mM HEPES, pH 7,5

130 mM KOAc

10 % Glycerin

2 mM DTT

1:1000 PI

SDS-Probenpuffer:

2 %SDS

10 % Glycerin

60 mM Tris-Base

50 mM DTT

0,02 % Bromphenolblau

Proteaseinhibitoren-Mix (PI):

10 mg/ml Leupeptin

5 mg/ml Chymostatin in DMSO

5 mg/ml Pepstatin in DMSO

Denaturierender Lysis-Puffer:

1 % SDS

50 mM Tris, pH 7,5

1 mM PMSF

Lysis-Puffer (Membranpräparation):

50 mM Tris, pH 7,5

10 mM EDTA

1 mM MgCl₂

1:1000 PI

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250 mM HEPES, pH 7,5

50 % Glycerin

25 mM KOAc

5 mM Magnesiumacetat

5 mM EDTA

25 mM DTT

10 mM PMSF

1:200 PI

IP-Verdünnungspuffer:

1,1% Triton X100

165 mM NaCl

50 mM Tris, pH 7,5

5,5 mM EDTA

1 mM PMSF

1:1000 PI

1,1x IP-Puffer (Puls-Markierung):

1,1 % Triton X100

165 mM NaCl

55 mM Tris, pH 7,5

5,5 mM EDTA

1 mM PMSF

Hochsalz-Digitonin-Puffer (HD):

1 % Digitonin

1,2 M KOAc

50 mMHEPES, pH 7,6

5 mM ß-Mercaptoethanol

15 % Glycerin

TEST-Puffer:

10 mM Tris, pH 8,0

1 mM EDTA

100 mM NaCl

1 % SDS

2 % Triton X100

Puffer G:

0,1 M Sorbitol

50 mM HEPES, pH 7,5

mM KOAc

2 mM EDTA

1 mM DTT

1:1000 PI

Prä-Sporulationsmedium (PSPO):

0,8 % Bacto-Yeast-Extract

0,3 % Bacto-Peptone

10 % Glucose

Sporulationsmedium (SPO):

1 % KOAc

0,1 % Bacto-Yeast-Extract

0,05 % Glucose

SED-Puffer:

1 M Sorbitol

25 mM EDTA

50 mM DTT

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2.2 Methoden

2.2.1 Allgemeine molekularbiologische Methoden

Molekularbiologische Methoden und genetische Experimente wurden wie in Sambrook et al. (1989) beschrieben durchgeführt. Plasmide wurden nach alkalischer Lyse unter Zuhilfenahme von Qiagen-DNA-Isolierungskits nach Anleitung des Herstellers präpariert. Die Aufreinigung von DNA-Fragmenten aus Agarosegelen erfolgte unter Verwendung des QUIAquick-Isolationskits laut Beschreibung. Restriktionsenzyme, Ligasen, Alkalische Phosphatase, RNAse und Polynukleotidkinase wurden von den Firmen New England Biolabs, Promega oder Boehringer Mannheim bezogen. PCR-DNA-Polymerasen (Taq-Polymerasen) stammten von den Firmen Perkin Elmer, Amersham oder Roche. Pfu-DNA-Polymerase wurde von Stratagene geliefert, die dNTPs von Pharmacia. Sequenzierungen erfolgten mit unterschiedlichen Systemen, vorwiegend mit dem “fmol-PCR-Sequenzierungskit“ von Promega, später mit dem „Thermo Sequenase Fluoreszenzkit“ von Amersham. Bakterien wurden durch Elektroporation mit Plasmid-DNA transformiert.

2.2.2 Biochemische Methoden

2.2.2.1 In vitro Transkription und in vitro Translation

Die in vitro Transkription erfolgte mit dem RiboMAX Large Scale RNA Kit von Promega nach Angaben des Herstellers. Die erhaltene mRNA wurde in kleinen Aliquots bei -80^oC gelagert.

Die in vitro Translation erfolgte im Reticulocytenlysat von Promega. Das Reticulocytenlysat wurde 10 min bei 4°C und 14.000 rpm in der Tischzentrifuge zentrifugiert, um eventuell enthaltene Membranen zu sedimentieren. Ein 100 µl Ansatz enthielt 70 µl Reticulocytenlysat, 2 µl Aminosäurenmix ohne Methionin, 5 µl ³⁵S-Methionin (370 MBq/ml, Amersham SJ123) und mRNA entsprechend dem titrierten Optimum. Die Translation erfolgte bei 30°C für ca. 30 min und wurde durch Zugabe von 2 µl 50 mM Cycloheximid und Inkubation für 10 min auf Eis gestoppt. Zur Abtrennung der Ribosomen wurde 10 min bei 100.000 rpm im TL100.2 Rotor (Beckman) bei 4°C zentrifugiert.

Der Einbau von photoreaktiven Quervernetzern (TDBA-Lys, Trifluoromethyl-diazirino-benzoic-acid-lysin) während der Translation erfolgte durch Verwendung eines Aminosäuren

33

2.2.2.2 Protein-Quervernetzung unter Verwendung von photoreaktivem TDBA-Lys

Wegen der Photoreaktivität des TDBA-Lys erfolgten alle Schritte bei gedämpftem Licht.

Die in vitro Translation eines TDBA-Lys markierten Sec72p erfolgte wie unter 2..2.2.1 beschrieben. 5 eq Sec72p-freie Membranen wurden in 10 µl Membranpuffer (siehe 2.1.5) resuspendiert. 9 µl Translationsansatz wurden hinzugefügt und der Ansatz für 30 min auf Eis inkubiert. Nach Zugabe von 90 µl Membranpuffer wurden die Membranen und das assoziierte Sec72p durch 20 min Zentrifugation bei 100.000 rpm und 4°C im TL100 sedimentiert. Das Pellet wurde je nach Fragestellung in 20 µl Membranpuffer bzw. Hefecytosol resuspendiert und der Ansatz halbiert. Die eine Hälfte wurde 15 min auf Eis mit einer UV-Lampe (Fa. Black Ray, Modell B100 AP) bestrahlt, während die andere Hälfte als Negativkontrolle diente. Zu beiden Ansätzen wurden jeweils 10 µl SDS-Probenpuffer (siehe 2.1.5) hinzugefügt. Die Proben wurden 10 min bei 65°C inkubiert und im SDS-PAGE aufgetrennt. Das Gel wurde fixiert, getrocknet und mittels eines Phosphorimagers (Fuji BAS 1000) ausgewertet.

2.2.2.3 Immunpräzipitation

Je nach Aufgabenstellung wurden zur Solubilisierung unterschiedliche Detergenzien verwandt.

Bei einer Coimmunpräzipitation wurden die Membranen in Hochsalz-Digitonin-Puffer (HD) (siehe 2.1.5) 30 min auf Eis oder im Überkopfschüttler bei 6°C solubilisiert. Nach 20 min Zentrifugation bei 70.000 rpm und 4°C im TL100.4 Rotor (Beckman) wurde der Überstand abgenommen und mit einem gleichen Teil H₂O verdünnt. Dem Ansatz wurden 1-5 µl Antikörper zugegeben und er wurde über Nacht im Überkopfschüttler bei 6 °C inkubiert. Am nächsten Tag wurden 20 µl Protein A Sepharose, die zuvor in 0,5x HD-Puffer äquilibriert wurden, für mindestens 1 Stunde hinzugegeben und ebenfalls im Überkopfschüttler inkubiert. Anschließend wurde 1 min bei 6.000 rpm zentrifugiert, der Überstand abgenommen und aufgearbeitet. Die Protein A Sepharose wurde dreimal mit 0,5x HD-Puffer gewaschen und in 50 µl SDS-Probenpuffer (siehe 2.1.5) resuspendiert. Nach einer Inkubation für 20 min bei

34

Bei einer Immunpräzipitation wurden die Proteine 30 min in denaturierendem Lysis-Puffer (siehe 2.1.5) solubilisiert und nach der Zentrifugation mit 9 Volumen IP-Verdünnungspuffer (siehe 2.1.5) vermischt. Analog zum oben beschriebenen Ablauf erfolgten dann Zugabe von Antikörpern, Inkubation über Nacht, Bindung der Antikörper an äquilibrierte Protein A Sepharose und Probenaufarbeitung.

2.2.2.4 Puls-Markierung von Transportproteinen

Um die Akkumulation von CPY-Präkursoren in einem letalen Genotyp zu untersuchen, wurden Hefen, die das Plasmid pCU 098 oder pCU 099 trugen, sowie Kontrollstämme in Galaktose-haltigem Selektionsmedium angezogen und für 18 h in Glukose-haltiges Selektionsmedium überimpft. 6 OD₆₀₀ jedes Hefestamms wurden bei einer OD₆₀₀ @ 0,5 geerntet, in 350 µl Glukose-haltigem Minimalmedium resuspendiert und 5 min bei 30°C leicht geschüttelt. Dann wurden jeweils 10 µl Promix (³⁵S-Methionin und ³⁵S-Cystein, 530 MBq/ml, Amersham SJQ0079) zugegeben und durchmischt. Nach exakt 4 min wurden 180 µl kaltes 30 mM NaN₃ hinzugegeben, gut durchmischt und auf Eis gestellt. Die Zellen wurden 1 min bei 10.000 rpm und RT sedimentiert, das Pellet in 100 µl denaturierendem Lysispuffer (siehe 2.1.5) aufgenommen und mit kleinen Glaskügelchen (425-600 µm, Sigma) bis kurz unter die Wasseroberfläche vermengt. Die Zellen wurden durch starkes Schütteln für 2 min aufgebrochen und mit 900 µl 1,1x IP-Puffer (siehe 2.1.5) verdünnt. Nach 15 min Inkubation auf Eis wurden die Ansätze für 10 min bei 14.000 rpm und 4°C zentrifugiert. Die Überstände wurden abgenommen und wie im zweiten Teil von 3.2.2.2 beschrieben in eine IP eingesetzt. Die Detektion der radioaktiv markierten Proteine erfolgte nach der SDS-PAGE mittels Radiographie und einem Phosphorimager (Fuji BAS 1000).

2.2.2.5 Bestimmung der Lokalisierung von Membranproteinen

Zur Unterscheidung von peripheren und integralen Membranproteinen nutzt man ihr unterschiedliches Verhalten bei 0,5 M NaCl oder 0,1 M Na₂CO₃, pH 11. Während sich periphere Membranproteine unter diesen Bedingungen ablösen, bleiben integrale Membranproteine verankert.

300 eq Membranen wurden in 400 µl Puffer G (siehe 2.1.5) resuspendiert. Zu je 90 µl der

35

2.2.3 Methoden zum Arbeiten mit S. cerevisiae (Bäckerhefe)

2.2.3.1 Transformation von Hefen mit Plasmid-DNA

2.2.3.1.1 Lithiumacetat-Methode

Die Plasmid-Transformation erfolgte in Anlehnung an Gietz et al. (1995).

Aus einer Übernachtkultur in YPD oder Selektionsmedium wurden 10 ml einer frischen Kultur angeimpft. Bei einer OD₆₀₀ 1,0 wurden die Zellen sedimentiert, einmal mit dest. H₂O gewaschen und in 1,5 ml 0,1 M LiOAc / 1x TE resuspendiert und in ein Eppendorfgefäß überführt. Nach einer weiteren Zentrifugation wurden sie in 0,2 ml 0,1 M LiOAc / 1x TE resuspendiert. Zu der Zellsuspension wurden bis zu 8 µl Plasmid-DNA und 10 µl Lachssperm-DNA (10mg/ml) gegeben und durchmischt. Es wurde 1 ml 40% PEG 6000 / 0,1 LiOAc / 1x TE hinzugefügt, gemischt und 30 min bei 30°C inkubiert. Es folgte ein 15-minütiger Hitzeschock bei 42°C. Die Zellen wurden bei 1500 g sedimentiert, in 0,5 ml H₂O resupendiert und 0,1 - 0,2 ml des Ansatzes auf Selektionsmedium ausplattiert.

Die beiden LiOAc-haltigen Lösungen wurden jeweils frisch aus Stammlösungen angesetzt.

2.2.3.1.2 Hefetransformation mittels Elektroporation

500 ml einer YPD-Kultur wurden bei einer OD₆₀₀ von 0,7 - 1,5 durch Zentrifugation bei 4000 g und 4°C für 5 min geerntet. Das Zellpellet wurde in 1 Vol. eiskaltem, sterilem H₂O resuspendiert und erneut zentrifugiert. Dieser Schritt wurde mit ½ Vol. eiskaltem, sterilem H₂O und mit ¹/₂₅ Vol. eiskaltem 1 M Sorbitol wiederholt. Das Pellet wurde in ¹/₁₀₀₀ Vol. eiskaltem 1 M Sorbitol aufgenommen. Ein Aliquot von 40 µl wurde mit 5µl Plasmid-DNA

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2.2.3.2 Isolierung von Plasmid-DNA aus Hefen

1,5 ml einer Hefe-Übernachtkultur wurden zentrifugiert und das Zellpellet in 200 µl TEST-Puffer (siehe 2.1.5) resuspendiert. Es wurden 200 µl Phenol/Chloroform und kleine Glaskügelchen (425-600 µm, Sigma) hinzugegeben. Nach 2 min Mischen und anschließender Zentrifugation wurde die obere, wässerige Phase zwei weitere Male mit Phenol/Chloroform extrahiert und restliches Phenol durch zweimalige Extraktion mit Chloroform entfernt. 2-4 µl des Plasmid-Extrakts wurden dialysiert (Filter von Millipore, VSWP 025 00) und in eine E.coli-Elektroporation eingesetzt.

2.2.3.3 Kreuzung, Sporulation und Tetradenanalyse

Die Kreuzung zweier haploider Stämme mit verschiedenen Paarungstypen geschah durch Mischen von Aliquoten dieser Stämme (z.B. jeweils 5 µl einer Flüssigkultur) auf einer Vollmedium-Agarplatte und Inkubation bei 30°C für 6-8 h. Es wurden Stämme mit unterschiedlichen Selektionsmarkern gewählt, so daß durch anschließendes Ausstreichen auf Selektionsplatten diploide Klone identifiziert werden konnten.

Die diploiden Hefen wurden für 6-8 h bei 30°C in Prä-Sporulationsmedium (siehe 2.1.5) inkubiert (> 34°C keine Sporulation). Anschließend wurden die Zellen bei 5000 rpm für 2 min zentrifugiert, einmal in Sporulationsmedium (SPO, siehe 2.1.5) gewaschen und in 1 ml SPO-Medium resuspendiert. Die Sporulation erfolgte bei 30°C für etwa 2 Tage im Inkubationsschüttler (längere Inkubation führt zu einem größeren Anteil keimungsunfähiger Sporen). Die Sporulationsrate wurde im Mikroskop überprüft. Optimal ist eine Sporulationsrate von 80-90 %. Die sporulierten Zellen wurden zentrifugiert und in 1 ml SED-Puffer (siehe 2.1.5) aufgenommen. Bei 4°C waren die Sporen für mehrere Tage haltbar.

Für die Tetradenanalyse wurden die sporulierten Zellen protoplastiert. 200 µl sporulierte Hefezellen wurden mit 10 µl 1 M DTT und 20 µl Novozym (10 mg/ml) vermischt und für etwa 20 min (gegebenenfalls auch länger) bei RT inkubiert. Ein Aliquot wurde auf einer YPD-Platte zur Tetradenanalyse ausgestrichen und die vier Sporen von einzelnen Tetraden

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2.2.3.4 Durchführung eines genetischen Screens zur Identifizierung synthetisch letaler Mutanten

Die Durchführung eines genetischen Screens zur Identifizierung synthetisch letaler Mutanten erfolgte in Anlehnung an J. E. Kranz und C. Holm (1990).

Ziel des Screens ist die Identifizierung von bisher unbekannten Interaktionspartnern eines gemeinsamen Funktionsweges. Grundlage dafür ist die Annahme, daß sich Mutationen in zwei Proteinen, die am selben Prozeß beteiligt sind, in ihrer Wirkung additiv auswirken - und im Extremfall letal sind. Wohingegen dies für zwei Mutationen in unabhängigen Prozessen nicht der Fall ist.

Der Screen besteht aus zwei Teilen, der Mutagenisierung zur Herstellung Plasmid-abhängiger Klone und der Komplementierung der erhaltenen Mutanten mit einer genomischen Bank zur Identifizierung der beschädigten Gene. Für die detaillierten Grundlagen dieses Screens siehe J. E. Kranz und C. Holm (1990).

Eine Übernachtkultur des zu mutierenden Stamms (YUC 16 + pCU 085) wurde in frischem Minimalmedium verdünnt und bei 30°C bis zu einer OD₆₀₀= 0,6-1,0 inkubiert. 10 OD₆₀₀ wurden zentrifugiert, einmal mit H₂O gewaschen und anschließend in 1 ml H₂O resuspendiert. Das Resuspendieren der Zellen wurde durch 1 min Beschallen im Ultraschallbad unterstützt. Die Zellsuspension wurde in eine Petrischale gegeben und 150 s auf dem UV-Tisch mit = 312 nm und 90 W bestrahlt. Die Überlebensrate der Hefe betrug ca. 15%. Alle weiteren Schritte erfolgten im Dunkeln, um den Photoreparaturmechanismus der Zellen nicht zu aktivieren. Von einer 1:1000 Verdünnung der mutierten Zellen wurden je 200 µl auf einer Petrischale (Ø = 150 mm) mit Selektionsmedium (SD-His, Trp, Ura) ausplattiert und bei 30°C mehrere Tage inkubiert. Die Ausprägung der auf der Anwesenheit von ADE3 (Teil des pCU 085) beruhenden roten Färbung der Zellen brauchte 5-7 Tage. 150.000 unabhängige Kolonien wurden gesichtet und solche Kolonien, die keine weißen Sektoren zeigten, wurden zur Kontrolle vereinzelt. Klone, die auch nach einer dritten Vereinzelung immer noch ausschließlich rot waren, wurden nach Anzucht in YPD über Nacht parallel auf SD-His, Trp, Ura und 5´FOA SD-His, Trp ausgestrichen. 5´FOA dient der Gegenselektion von Uracil-prototrophen Hefen. Gesucht wurden Klone, die auf das URA-Plasmid mit den Genen für

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Von 150.000 untersuchten unabhängigen Klonen erfüllten zwei Klone (Klon 49-1 und Klon 190-83) all diese Kriterien.

2.2.3.5 Präparation von Hefemembranen

2.2.3.5.1 Präparation von Hefemembranen aus kleinen Kulturen

Aus einer Übernachtkultur in YPD oder Selektionsmedium wurden 20 ml einer frischen Kultur angeimpft. Bei einer OD₆₀₀ 1,0 wurden 10 OD₆₀₀ der Zellen bei 1100 g und RT sedimentiert, einmal mit Lysispuffer (siehe 3.1.5) gewaschen, in 200 µl Lysispuffer resuspendiert und mit Glaskügelchen (425-600 µm, Sigma) bis zur Flüssigkeitsoberfläche gefüllt. Der Ansatz wurde fünfmal 30 s geschüttelt und zwischendurch 30 s auf Eis abgekühlt. Das Lysat wurde abgenommen, und die Glaskügelchen wurden zweimal mit 500 µl Lysispuffer nachgewaschen. Die vereinten Überstände wurden niedertourig bei 400 g und 4°C 10 min in der Tischzentrifuge zentrifugiert, der Überstand dann zur Pelletierung der Membranen 10 min bei 4°C und 14.000 rpm zentrifugiert. Das Pellet wurde entweder in Membranpuffer (siehe 2.1.5.) oder zur direkten Analyse in SDS-Probenpuffer (siehe 2.1.5) aufgenommen. Für eine anschließende SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE) hat sich eine Konzentration der Membranen von 1 OD₆₀₀ / 10 µl bewährt.

2.2.3.5.2 Präparation von Hefemembranen aus großen Kulturen

Es gibt verschiedene Aufschlußmethoden, die sich vor allem durch die technischen Möglichkeiten des Labors ergeben. Im folgenden werden drei Methoden beschrieben, die in dieser Arbeit Anwendung fanden. Der Aufschluß mittels einer Glasmühle eignet sich besonders für große Präparationen, während der Vorteil des Zerreibens in flüssigem Stickstoff besonders in der Anwendung auf mittlere Mengen beruht.

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Aufschluß mittels einer Glasmühle

Die Hefezellen wurden bei einer OD₆₀₀ 1,0 durch Zentrifugation bei 3000 rpm und 4°C für 15 min geerntet und mit 1x Homogenisierungspuffer (siehe 2.1.5) gewaschen. Die Masse des Pellets wurde bestimmt und in dem doppelten Volumen seines Gewichtes 2,5x Homogenisierungspuffer resuspendiert. Die Zellsuspension wurde in einen speziellen Schüttelzylinder (Braun Melsungen) überführt und mit einer der Masse des Pellets entsprechenden Masse Glaskugeln versetzt. Der Aufschluß erfolgte durch viermaliges Schütteln für je 30 s unter CO₂-Kühlung und zwischenzeitliches Kühlen auf Eis.

Das Lysat wurde abgenommen, und die Glaskugeln wurden zweimal mit 1x Homogenisierungspuffer nachgespült. In drei aufeinanderfolgenden Zentrifugationen wurden zuerst Zellreste und Zellkerne (3000 rpm, 10 min bei 4°C im Falcon-tube), dann Mitochondrien, größere Zellfragmente und andere Organellen (9000 rpm im Sorvall SS34 für 10 min bei 4°C) und abschließend die Membranen sedimentiert (75.000 rpm im TL100.3-Rotor (Beckman) für 20 min bei 4°C). Das Membranpellet wurde in einem angemessenen Volumen Membranpuffer (siehe 2.1.5) mit einem Homogenisator resuspendiert.

Die Konzentrationsbestimmung erfolgte durch Vermessen einer Verdünnung in 2% SDS nach folgender Formel: OD₂₈₀ * Verdünnungsfaktor / 50 = x eq/µl.

Aufschluß durch Zymolyase-Behandlung

Die geernteten Zellen wurden in 0,5x YPD / 1,1 M Sorbitol (ca. 2 ml/g Feuchtgewicht) resuspendiert. Es folgten Zugabe von 100%-igem ß-Mercaptoethanol (0,7 µl/ml) und Zymolyase 100T (0,5 mg/g Zellen) und vorsichtiges Schwenken bei 30°C. Der Grad der Sphäroplastierung wurde durch den Anteil der „Ghosts“ in 1% SDS unter dem Mikroskop bestimmt. Zellen, die in Minimalmedium angezogen wurden, bilden eine stabilere Zellwand aus und lassen sich daher schlechter sphäroplastieren als Zellen, die in Vollmedium gewachsen sind. Die Sphäroplasten wurden bei 2800 rpm für 10 min sedimentiert, mit 0,5x YPD / 1,1 M Sorbitol gewaschen und in 1-2 ml Membranpuffer (siehe 2.5.1) resuspendiert. Durch mehrmalige Behandlung mit einem Braun Homogenisator wurden sie aufgeschlossen. Das erhaltene Lysat wurde wie unter 2.2.3.5.2.1 beschrieben in mehreren Schritten zentrifugiert und anschließend vermessen. Die Zellen des niedertourigen Pellets wurden 3-4 Mal aufgeschlossen und die Überstände vereinigt.

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Aufschluß durch Zerreiben in flüssigem Stickstoff

Die geernteten Zellen wurden in einem kleinen Volumen Membranpuffer (siehe 2.1.5) resuspendiert und in einen Mörser mit flüssigem N₂ getropft. Die gefrorenen Kügelchen wurden zu einem feinen Pulver zerrieben, das in ein Zentrifugengefäß überführt und durch Zugabe von wenig Membranpuffer aufgetaut wurde. Nach der niedertourigen Zentrifugation (wie in 2.2.3.5.2.1 beschrieben) wurde der Überstand abgenommen und das Pellet 2-3 weitere Male aufgeschlossen. Die vereinten Überstände wurden wie in 2.2.3.5.2.1 beschrieben weiterbehandelt.

Fußnoten:
<1>	Mo Bi Tec A 6428

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