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Kapitel 3. Ergebnisse

3.1 Analyse der Funktion von SEC71

3.1.1 Coletalität von SEC71 in Kombination mit sbh1.

Zu Beginn der funktionellen Analyse von SEC71 und SEC72 in der Bäckerhefe Saccharomyces cerevisiae war bekannt, daß die Deletionsmutanten der beiden Gene unter normalen Wachstumsbedingungen weder einzeln noch in Kombination letal sind. Ein sec71-Stamm ist bei 37°C letal (Kurihara und Silver, 1993; Feldheim et al., 1993).

Um die Funktion von Sec71p in Kombination mit anderen nichtessentiellen Komponenten des SEC-Komplexes erforschen zu können, wurde nach synthetisch letalen Phänotypen gesucht. Dazu wurde die Deletionsmutante von SEC71 mit Deletionen für SBH1 bzw. SBH2 kombiniert, beides sind nichtessentielle Komponenten der Translokationskomplexe. Eine Kombination von sec71 und sec72 erübrigte sich, da aus der Literatur bekannt war, daß Sec72p in einem sec71-Hintergrund stark destabilisiert ist und mit einer Halbwertszeit von 12 min degradiert wird (Feldheim und Schekman, 1994).

Der sec71-Stamm ist kreuzungsdefizient, deswegen wurden die diploiden Doppeldeletionsstämme sec71/SEC71, sbh1/SBH1 (YUC 1) bzw. sec71/SEC71, sbh2/SBH2 (YUC 3) durch aufeinanderfolgende Transformation des diploiden YTX69 mit PCR-Fragmenten zur Einführung entsprechender Nullmutanten hergestellt. Durch Tetradenanalyse der beiden diploiden Stämme YUC 1 und YUC 3 wurden die 4 Sporen segregiert. Im Falle des sec71/sbh2 fanden sich Sporen, die beide Selektionsmarker besaßen und in denen die Abwesenheit von Sec71p und Sbh2p im Western Blot nachgewiesen wurde (YUC 14). Die Doppeldeletionsmutante sec71/sbh2 ist somit lebensfähig.

Im Falle des Stamms YUC 1 (sec71/SEC71, sbh1/SBH1) fanden sich keine haploiden Doppelnullmutanten. Um die Letalität der Doppelmutante zu bestätigen, wurde YUC 1 mit einem Plasmid, das für SBH1 codiert und einem URA-Selektionsmarker besitzt, transformiert und anschließend einer Tetradenanalyse unterzogen. Dabei entstehende Sporen, die nachweislich alle drei Selektionsmarker trugen (YUC 2 + pSBH1^URA), wurden auf einer 5´FOA-haltigen Selektionsplatte ausgestrichen, um gegen das SBH1-codierende URA-Plasmid zu selektieren. 5´FOA (5´-Fluoroovatic Acid ) wird im Uracil-Stoffwechselweg zu einem Zellgift umgewandelt. Nur Uracil-prototrophe Hefen, die in diesem Stoffwechselweg deletiert sind,

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Abb. 3: Genetische Interaktion von SEC71 und SBH1. Hefestämme wie angegeben, wurden über Nacht in YPD angezogen, ausgestrichen und bei den angegebenen Temperaturen 2-3 Tage inkubiert.

Als nächstes stellte sich die Frage, ob die Doppelnullmutante durch andere Komponenten des Translokationskomplexes außer SEC71 oder SBH1 komplementiert werden kann. Dazu wurde der Stamm YUC 2 + pSBH1^URA (sec71/sbh1, pSBH1^URA) mit Plasmiden für S.c. SBH2, Säuger SEC61ß und S.c. SEC72 transformiert. Es handelte sich dabei um multicopy-Plasmide; die Gene waren unter Kontrolle des starken PGK-Promotors (Phosphoglyceratkinase). Bei dem anschließenden Ausstreichen auf Selektionsplatten + 5´FOA kann die Doppelmutante das SBH1-codierende URA-Plasmid nur verlieren und somit wachsen, wenn eines der anderen Gene die letalen Deletionen komplementiert. Die erhöhte Expression von Sbh2p konnte den Phänotyp unter allen getesteten Bedingungen komplementieren, während das Sec61ß aus Säugern dies nur bei 25°C tut. Überexpremiertes Sec72p ist unter keinen Umständen zu einer Komplementation fähig (Abb. 4).

Interessant ist die Tatsache, daß das endogen vorhandene Sbh2p nicht ausreicht, um die Doppeldeletionsmutante zu komplementieren. Da bekannt war, daß der Proteingehalt an Sbh2p deutlich abnimmt, wenn es im ssh1-Stamm seinen Bindungspartner verliert (Finke et al., 1996), stellte sich die Frage, ob das zusätzliche Deletieren des Gens für SSH1 im sec71/sbh1-Stamm ausreichend Sbh2p freisetzen kann, um den letalen Effekt zu beheben. Dazu wurde in den sec71/sbh1, pSBH1^URA-Stamm (YUC 2 + pSBH1^URA) mittels Transformation die ssh1-Deletion eingeführt (YUC4). Die erhaltenen Transformanten wurden wie bereits beschrieben auf ihr Wachstum in Anwesenheit von 5´FOA getestet. Es

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Abb. 4: Versuch zur Komplementation des Hefestamms sec71/sbh1. Hefezellen der sec71/sbh1-Doppelmutante, die ein SBH1-codierendes URA-Plasmid (pCU 051) enthielten, wurden mit 2µ-Plasmiden für SBH2 (pCU 049), Säuger SEC61ß (Klon 7/11) oder SEC72 (pCU 033) transformiert. Die Transformanten wurden über Nacht in YPD angezogen, auf SD-Platten mit bzw. ohne 5´FOA ausgestrichen und bei den angegebenen Temperaturen 2-4 Tage inkubiert.

Das Komplementieren der sec71/sbh1-Doppeldeletionsmutante durch einen erhöhten Gehalt an Sbh2p bzw. durch das zusätzliche Deletieren von SSH1 deuten darauf hin, daß Sbh2p unter diesen Umständen in den SEC-Komplex integriert sein könnte und Sbh1p teilweise funktionell ersetzen kann. Im Wildtyp ist Sbh2p Bestandteil des Ssh1-Komplexes, ein Austausch von Sbh1p und Sbh2p in den unterschiedlichen Translokationskomplexen des Wildtyps ist nicht bekannt. Für die Doppelnullmutante sbh1/ssh1 konnte Kerstin Finke jedoch mittels Coimmunpräzipitation zeigen, daß Sbh2p in Assoziation mit Sec61p vorliegt.

Daraus ergab sich die Frage, ob eine Assoziation von Sbh2p mit dem SEC-Komplex verantwortlich ist für die Komplementation der sec71/sbh1-Doppeldeletionsmutante.

Um dies zu untersuchen, wurde eine Coimmunpräzipitation von solubilisierten SEC-Komplexen des Wildtyps (YTX 57) und YUC 4 (sec71/sbh1/ssh1) mit Antikörpern gegen Sec62p durchgeführt. Durch Western Blot Analyse wurde die Assoziation von Sbh2p mit dem SEC-Komplex (Sec62-Präzipitat) in der dreifachen Deletionsmutanten nachgewiesen. Im Wildtyp wurde kein Sbh2p in Assozi

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Abb. 5: Coimmunpräzipitation zur Analyse der Komplexumgebung von Sbh2p in Abwesenheit von Ssh1p. 300 eq Membranen des Wildtyps (YTX57) und des YUC 4 (sec71/sbh1/ssh1) wurden in Digitonin solubilisiert, und das Solubilisat über Nacht mit Antikörper gegen Sec62p sowie mit ProteinG Sepharose inkubiert. Die an ProteinG Sepharose gebundenen Fraktionen wurden im SDS-PAGE aufgetrennt und im Western Blot mit Antikörpern gegen Sec62p und gegen Sbh2p getestet.

3.1.2 Die N-terminalen 160 Aminosäuren des Sec71p sind in vivo in Abwesenheit von Sbh1p essentiell.

Um die Bedeutung der cytosolischen Domäne von Sec71p zu erforschen, wurden mittels PCR C-terminale Verkürzungen von Sec71p hergestellt und unter die Kontrolle des starken PGK-Promotors in Plasmide eingefügt (Abb. 6).

Abb.6: Schematische Darstellung der C-terminalen Verkürzungen von SEC71. Das Konstrukt SEC71-206 entspricht dem Wildtyp. Alle Zahlenangaben beziehen sich auf Aminosäuren. Die Transmembrandomäne zwischen Aminosäuren 28 und 51 ist gemustert dargestellt.

Als erstes wurde untersucht, inwieweit die einzelnen Verkürzungen in der Lage sind, für SEC71 zu komplementieren. Dazu wurden die entsprechenden Plasmide in den Stamm

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Wie Abb. 7 zeigt, können SEC71-206 und SEC71-180 für normales Wachstum komplementieren, während SEC71-170 und SEC71-160 zwar komplementieren, dies aber mit einem deutlich verminderten Wachstum. SEC71-120 komplementiert nicht.

Das gleiche Ergebnis erhält man mit entsprechenden Transformanten des YUC 10-Stamms (sec71/sbh1/sbh2), der durch ein Plasmid mit dem Gen für SBH2 unter Kontrolle des Methionin-Promotors komplementiert wird. Bei Zugabe von 4 mM Methionin zum Selektionsmedium erfolgt eine Repremierung des Met-Promotors und der Gehalt an Sbh2p sinkt auf Null. Die Hefen der Triple-Deletionsmutante können daher nur auf Methionin-haltigen Selektionsplatten wachsen, wenn die zusätzlich eingeführte Sec71p-Verkürzung die Funktion von Sec71p übernehmen kann. Auch in diesem System darf der C-Terminus nicht weiter als bis Pos. 160 aa verkürzt werden, um zu komplementieren (Daten nicht gezeigt).

Abb. 7: Versuch zur Komplementation des Hefestamms sec71/sbh1 mit C-terminalen Verkürzungen von SEC71. Zellen des Hefestamms sec71/sbh1, pSBH1^URA wurden mit Plasmiden transformiert, die für das Wildtyp-Protein (SEC71-206), sowie C-terminale Verkürzungen von Sec71p codierten. Die Transformanten wurden über Nacht in YPD angezogen, auf Selektionsplatten mit bzw. ohne 5´FOA ausgestrichen und bei 30°C drei Tage inkubiert. Alle Positionsangaben sind Aminosäureangaben.

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3.1.3 Der C-Terminus von Sec71p ist notwendig für die Bindung von Sec72p, sowohl in vivo als auch in vitro.

Wie bereits erwähnt, ist Sec71p für die stabile Anlagerung von Sec72p an die Membran notwendig. Interessant ist daher die Frage, ob es zwischen der Fähigkeit der verkürzten Sec71p-Formen einen sec71/sbh1-Phänotyp zu komplementieren und der Stabilisierung von Sec72p an der Membran einen causalen Zusammenhang gibt. Dazu wurde ein sec71-Deletionsstamm (YUC 11) mit den Plasmiden für die verkürzten Sec71-Konstrukte transformiert. Von den erhaltenen Transformanten wurden Membranen präpariert, die im Western Blot auf die Anwesenheit von Sec72p getestet wurden. Abb. 8 ist zu entnehmen, daß eine Anlagerung von Sec72p nur an Sec71p-Varianten von mindestens 160 Aminosäuren Länge erfolgt. Somit korrelieren die Eigenschaften von Sec71p-Verkürzungen Sec72p anlagern zu können und den letalen sec71/sbh1-Phänotyp zu komplementieren.

Die Bindung von Sec72p an die verschiedenen Sec71p-Verkürzungen wurde außerdem auf ihre Hochsalz- bzw. Alkali-resistente Anlagerung getestet. Unterschiede in der Qualität der Anlagerung konnten dabei nicht festgestellt werden.

Abb. 8: Anlagerungsverhalten von Sec72p an C-terminale Verkürzungen von Sec71p. Transformanten des sec71-Stamms mit Plasmiden, die für Sec71p-Verkürzungen wie angegeben codierten, wurden in Selektions-medium angezogen. Aus kleinen Kulturen wurden Membranen präpariert, je 2 OD₆₀₀ der Membranen im SDS-PAGE aufgetrennt und im Western Blot mit Antikörpern gegen Sec72p getestet. Die kreuzreaktive Bande (-x) bestätigt das Auftragen gleicher Mengen.

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Abb. 9: Untersuchung zur in vitro Anlagerung von Sec72p an verschiedene Sec71p-Varianten. Jeweils 5 eq der angegebenen Membranen wurden mit frischem, in vitro synthetisiertem Sec72p 20 min bei 30°C inkubiert. Die Membranen wurden sedimentiert, gewaschen und in Probenpuffer aufgenommen. Die Proteine aus den Überständen wurden mit TCA gefällt und in gleichen Mengen Probenpuffer resuspendiert. Mittels SDS-PAGE und Radiographie wurde die Verteilung von Sec72p zwischen Membranpellet und Überstand und daraus die Anlagerungseffizienz in vitro bestimmt. Mehrere Experimente bestätigten die hier gezeigten Ergebnisse. Der relativ hohe Hintergrund von ca. 30% Sec72p, der sich auch ohne Sec71p und vor allem auch ohne Membranen im Pellet findet, ist vermutlich auf Aggregate zurückzuführen.

Aus diesem Experiment lassen sich mehrere Aussagen ableiten. Zum einen bestätigt es die Abhängigkeit der Sec72p-Anlagerung von Sec71p (sec71, 72-Membranen versus sec72Membranen). Zum anderen unterstreicht es die Bedeutung des C-Terminus von Sec71p für

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Zusammen mit den Ergebnissen aus 4.1.2 beweisen diese Daten, daß in Abwesenheit von Sbh1p die Ausbildung eines postulierten Signalsequenz-Antennenkomplexes durch Sec62p, Sec71p und Sec72p eine bedeutende Funktion übernimmt, und daß der C-terminale Bereich von 160-206 aa des Sec71p nicht zuletzt durch die Rekrutierung von Sec72p dabei eine wichtige Rolle spielt.

3.1.4 Ein 160-mer von Sec71p ist erforderlich für die Assoziation mit dem SEC-Komplex

Um auszuschließen, daß der oben beschriebene Anlagerungsunterschied auf einen Abbau der Sec71p-Verkürzungen zurückzuführen ist, wurden N-terminale Fusionen der Sec71p-Verkürzungen mit einem dreifachen myc-tag kloniert und in einem sec71-Hintergrund (YUC 11) expremiert. Membranproteine der entsprechenden Hefestämme wurden im SDS-PAGE aufgetrennt und im Western Blot mit Antikörpern gegen c-myc getestet. Abb. 10A zeigt, daß alle Verkürzungen von Sec71p stabil in die Membran integriert werden.

Die membranständige Expression ist kein ausreichender Beweis für die Integration der Sec71p-Verkürzungen in den SEC-Komplex , deshalb wurde mit den gleichen Membranen eine Coimmunpräzipitation unter 1% Digitonin mit Antikörpern gegen Sec62p durchgeführt. Unter den gewählten Bedingungen wird der SEC-Komplex als Ganzes solubilisiert und die Interaktion von Sec62p und Sec71p bleibt - zumindest im Wildtyp - erhalten.

Abb. 10B zeigt, daß unter den gewählten experimentellen Bedingungen die Assoziation der C-terminalen Sec71p-Verkürzungen mit Sec62p bis zum Sec71^1-160p-myc erhalten bleibt. Die Menge an coimmunpräzipitiertem Sec71^1-160p-myc ist im Vergleich zu den längeren Konstrukten jedoch geringer. Sec71^1-120p-myc wird zwar membranständig expremiert, ist aber nicht wie die längeren Sec71p-Varianten mit Sec62p assoziiert. Damit ist bewiesen, daß der cytosolische C-Terminus von Sec71p nicht nur für die Sec72p-Anlagerung, sondern auch für die Assoziation mit dem SEC-Komplex wichtig ist.

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Abb. 10: Western Blot und Coimmunpräzipitationen der verkürzten Sec71p-myc Fusionsproteine. A) Der Hefestamm YUC 11 (sec71) wurde mit Plasmiden für verkürzte Sec71p-Varianten mit N-terminalen 3x myc-Epitopen transformiert. 0,4 OD₆₀₀ entsprechender Membranpräpartionen wurden im SDS-PAGE aufgetrennt und mit einem Antikörper gegen c-myc im Western Blot getestet. Die N-terminale Fusion des 3x myc-Epitops führt vermutlich zu Beeinträchtigungen der Glykosylierung von Sec71p. Mit * markierte Banden zeigen glykosylierte Formen der Sec71p-Varianten. B) Je 300 eq der jeweiligen Membranen wurden in eine Coimmunpräzipitation mit Antikörpern gegen Sec62p eingesetzt und und im Western Blot auf die Anwesenheit der c-myc-markierten Sec71p-Verkürzungen getestet.

Bei näherer Betrachtung fällt auf, daß die glykosylierten Formen der Sec71p-Verkürzungen zwar prozentual den kleineren Anteil ausmachen, sich aber deutlich besser coimmunpräzipitieren lassen. Die zwei Glykosylierungen von Sec71p scheinen somit ein Indiz für die korrekte Konformation bzw. Orientierung der Fusionsproteine zu sein, die wiederum wichtig für die Assoziation der Sec71-Varianten mit dem SEC-Komplex ist.

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3.1.5 Die 46 C-terminalen Aminosäuren von Sec71p sind ausreichend, um Sec72p zu binden.

Unklar ist, ob der cytosolische Teil des Sec71p für die Assoziation mit dem SEC-Komplex ausreicht, und inwiefern der Sec71-Membrananker ersetzt werden kann.

Um diesen Fragen nachzugehen, wurden Fusionsproteine des P450-Membranankers aus Candida maltosa (P450 Cm1^1-44) und unterschiedlich langen cytosolischen Bereichen von Sec71p kloniert. Zu Detektionszwecken wurden die Konstrukte wieder N-terminal durch eine 3x-myc Domäne ergänzt (Abb. 11).

Menzel et al. (1996) haben für den P450 Cm1^1-44 Membrananker gezeigt, daß er ER-membranständig expremiert wird und die Orientierung der des Sec71-Membranankers entspricht (N-Terminus im Lumen, C-Terminus im Cytosol).

Abb. 11: Schematische Darstellung der Fusionsproteine von P450 Cm1-Membrananker aus Candida maltosa (P450 Cm1^1-44) und verschiedenen cytosolischen Fragmenten von S.c. Sec71p. Jedes Konstrukt existiert sowohl als Fusion mit einem 3x myc-Epitop sowie auch ohne. Alle Positionsangaben beziehen sich auf Aminosäuren.

Zunächst wurde getestet, ob die P450-Sec71-Fusionsproteine expremiert und stabil in die Membran integriert werden. Dazu wurde der YUC 11-Hefestamm (sec71) mit den P450-Sec71 Konstrukten, die das 3x myc-Epitop tragen, transformiert.

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Desweiteren wurden Membranen der Transformanten von YUC 11 mit den drei P450-Sec71 Konstrukten ohne myc-Epitop auf die Anlagerung von Sec72p untersucht (Abb. 12B). Aus Abb. 12 ist zu ersehen, daß alle drei P450-Sec71p-Fusionsproteine sowohl membranständig expremiert werden, als auch Sec72p stabil an die Membran assoziieren können. Sec72p kann nur von der cytosolischen Seite aus angelagert werden, so daß zumindest ein Teil der Fusionsproteine die richtige Membranorientierung besitzen muß.

Abb. 12: Untersuchung zur Expression von P450-Sec71p-Fusionsproteinen und dem Anlagerungsverhalten von Sec72p an diese Fusionsproteine. A) Expressionsnachweis der P450-Sec71p-Fusionsproteine im Western Blot. Je 2 eq Membranen der angegebenen Hefestämme wurden in einer SDS-PAGE aufgetrennt und im Western Blot auf das c-myc-Epitop getestet. An der Übergangsstelle zwischen c-myc-Epitop und P450-Membrananker ist eine neue Glykosylierungsstelle entstanden. Durch unvollständige Glykosylierung kommt es zum Auftreten der Doppelbanden bei P450-71^80-206p-myc und P450-71^160-206p-myc. B) In vivo Anlagerung von Sec72p an Membranen, die P450-Sec71p-Fusionsproteine enthalten. Membranen wie in A) sowie Membranen eines sec71-Stamms wurden im Western Blot mit Antikörpern gegen Sec72p getestet.

Vor allem aber grenzen diese Ergebnisse die Sec72-Bindungsdomäne von Sec71p ein. Die Assoziation von Sec72p mit P450-Sec71^160-206p beweist, daß die letzten 46 Aminosäuren des

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Bezieht man die in vitro Anlagerungsdaten (Abb. 9) mit in die Überlegungen ein, dann gibt es mindestens zwei Bindungsstellen für Sec72p, eine im Bereich 120-160 aa und eine weitere zwischen 160-206 aa. Beide Bereiche sind in der Lage sind, Sec72p selbständig zu binden, wenn auch mit eingeschränkter Effizienz. Inwiefern es sich dabei um unabhängige Bindungsdomänen handelt, oder ob durch die willkürlich gewählte Verkürzungsposition bei 160 aa eine zusammenhängende Bindungsdomäne geteilt worden ist, läßt sich aus diesen Ergebnissen nicht ableiten.

Für das P450-SEC71^160-206-Konstrukt wurde außerdem nachgewiesen, daß die Assoziation mit diesem Bereich Hochsalz- und Alkali-resistent ist (Daten nicht gezeigt).

3.1.6 Der P450Cm1-Membrananker aus Candida maltosa ist nicht in der Lage den Sec71-Membrananker zu ersetzen.

Aus den oben beschriebenen Ergebnissen ergab sich die Frage: ob der cytosolische Teil von Sec71p ausreicht, um mit dem Translokon zu assoziieren und ob die P450-Sec71p-myc Konstrukte mit Antikörpern gegen Sec62p coimmunpräzipitieren. Dazu wurden Membranen der entsprechenden YUC 11-Transformanten wie unter 3.2.2.2 beschrieben mit 1% Digitonin solubilisiert und in eine Coimmunpräzipitation mit Antikörpern gegen Sec62p eingesetzt (Abb. 13).

Wie Abb. 13 zu entnehmen ist, können P450-71^80-206p-myc, P450-71^120-206p-myc und auch P450-71^160-206p-myc mit Antikörpern gegen Sec62p coimmunpräzipitiert werden. Somit reichen die letzten 46 Aminosäuren von Sec71p aus, um mit Sec62p zu interagieren. Vergleicht man die Effizienz der Immunpräzipitationen allerdings mit der einer Sec62 Coimmunpräzipitation gegen Sec71^1-206p-myc im selben Stammhintergrund (Daten nicht gezeigt), so ist die Assoziation der P450-Sec71-myc Fusionsproteine mit Sec62p deutlich schwächer als die des wt-Sec71p. Der cytosolische Teil des Sec71p ist somit wichtig und ausreichend für die Assoziation mit Sec62p und somit mit dem SEC-Komplex. Wie schon bei den Coimmunpräzipitationen der C-terminalen Sec71p-Verkürzungen mit Antikörpern gegen Sec62p (Abb. 10) werden auch in diesem Experiment die glykosylierten Formen deutlich

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Der Einfluß des P450Cm1-Membranankers aus Candida maltosa läßt sich nur schwer abschätzen. Anzunehmen ist, daß er für die Verankerung der cytosolischen Fragmente von Sec71p an der ER-Membran notwendig ist. Ob er aber auch problemlos den Platz des Sec71-Membranankers im SEC-Komplex einnehmen kann, oder ob die hier beobachtete Assoziation nicht vor allem das Resultat einer rein statistischen Verteilung ist, bleibt offen. Vorstellbar ist auch, daß eine Assoziation der cytosolischen Fragmente von Sec71p auch ohne Membrananker möglich wäre. Die Anwesenheit des P450-Membranankers könnte deswegen auch eher störend für die Funktionalität des SEC-Komplexes sein.

Abb. 13: Coimmunpräzipitation der P450-Sec71p-Fusionsproteine mit Antikörpern gegen Sec62p. Der Hefestamm YUC 11 (sec71) wurde mit den Plasmiden pCU 109, pCU 110 und pCU 111 transformiert. Je 200 eq Membranen der Transformanten wurden in eine Coimmun-präzipitation mit Antikörpern gegen Sec62p eingesetzt. Die an Protein A Sepharose gebundenen Fraktionen wurden im SDS-PAGE aufgetrennt und im Western Blot mit einem Antikörper gegen das c-myc Epitop auf die Anwesenheit von c-myc-markierten P450-Sec71-Fusionsproteinen getestet.

Komplementationsexperimente mit den P450-Sec71-myc Fusionsproteinen bzw. einem Sec71^46-206p-Konstrukt ohne Membrananker sollten zeigen, ob die Fusionsproteine bzw. Sec71^46-206p den letalen Genotyp sec71/sbh1 komplementieren können. Dazu wurde der

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Das Ergebnis war unerwartet. Während keines der P450-Sec71-myc Fusionsproteine YUC 2 komplementiert, ist Sec71^46-206p bei allen getesteten Temperaturen in der Lage, für das wt-Sec71p zu komplementieren (Daten nicht gezeigt).

Diese Daten sprechen dafür, daß es die störende Wirkung des P450-Membranankers aus C. maltosa war, der eine Komplementation verhindert hat, und nicht das Fehlen des Sec71p-Membranankers, dessen Deletion sogar bei erhöhter Wachstumstemperatur toleriert werden kann. Außerdem zeigt dieses Experiment, daß Sec71p keinen Membrananker braucht, um seine Funktion (an der Membran) zu erfüllen. Wahrscheinlich ist eine Assoziation mit dem SEC-Komplex und eine Rekrutierung von Sec72p auch ohne Membrananker möglich.

3.2 Untersuchungen zur Rolle von SEC72

3.2.1 Coletalität von SEC72 in Kombination mit sbh1

In den bisherigen Untersuchungen wurde der Beitrag verschiedener Domänen von Sec71p zur Assoziation von Sec71p mit dem SEC-Komplex, zur Komplementationsfähigkeit eines sec71/sbh1-Stamms und ihr Beitrag zur Sec72-Bindung untersucht. Dabei fällt auf, daß die Fähigkeit C-terminal verkürzter Sec71p-Varianten einen sec71/sbh1-Stamm zu komplementieren mit der Sec71p-vermittelten Bindung von Sec72p an die Membran einhergeht. Daraus ergab sich die Frage, ob das Ausbleiben der Assoziation von Sec72p mit dem SEC-Komplex im sec71/sbh1 -Hintergrund entscheidend für den letalen Phänotyp ist.

Dazu sollte zuerst eine sec72/sbh1 -Doppelnullmutante erzeugt werden. Die haploiden Stämme YUC 6 (sec72) und YKF 8 (sbh1) wurden gekreuzt, diploide Klone sporuliert und einer Tetradenanalyse unterzogen. In mehreren Anläufen gelang es nicht, lebensfähige Sporen, die beide Selektionsmarker trugen, zu finden. Daraufhin wurde der diploide Stamm aus YUC 6 x YKF 8 mit einem für SEC72 codierenden Plasmid, das einen URA3-Marker trägt (pCU 085), transformiert, sporuliert und erneut in Sporen segregiert. Es wurden vollständige Tetraden erhalten, mit einzelnen Sporen, die alle 3 Marker trugen.

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Abb. 14 zeigt das Ergebnis. Die durch pSEC72^URA komplementierte Doppelmutante sec72/sbh1 ist auf das URA-Plasmid angewiesen und kann somit nicht auf SD + 5´FOA wachsen. Die Doppeldeletion sec72/sbh1 ist daher letal (siehe auch Kapitel 4.4). Das bedeutet, daß ein sbh1 Stamm mit einer Sec71p-Verkürzung, die kein Sec72p binden kann, zwangsläufig letal sein muß, da sec72/sbh1 letal ist. Und wie schon bei der sec71/sbh1 Doppelnullmutante, ist auch im Falle von sec72/sbh1 der endogene Proteingehalt an Sbh2p nicht in der Lage zu komplementieren.

Abb. 14: Genetische Interaktion von SEC72 und SBH1. Hefestämme wie im Schema links angegeben wurden über Nacht in Vollmedium angezogen, auf SD- bzw. SD + 5´FOA-Platten ausgestrichen und für 2-3 Tage bei 30°C inkubiert.

3.2.2 Eine C-terminale TPR-Domäne des Sec72p ist essentiell für seine Funktion.

Sec72p ist ein 193 Aminosäure langes Protein, das nahe dem C-Terminus eine Domäne enthält, die eine Ähnlichkeit zu „Tetratricopeptide repeat Domänen“ (TPR-Domänen) aufweist (Abb. 15). TPR-Domänen sind als Protein-Interaktionsdomänen beschrieben. In der Regel kommt die Konsensussequenz aus 34 Aminosäuren zwischen drei und zwölf Mal in einem Protein vor (Für einen Überblick siehe Goebl und Yanagida, 1991). Proteine mit TPR-Domänen sind beteiligt an Mitose, Transkription und auch am Proteinimport in

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Abb. 15: Aminosäuresequenz von S.c. SEC72. Die Tetratricopeptide Domäne (TPR-Domäne) ist grau unterlegt, die Lsyine sind f ett dargestellt.

Mittels PCR wurde ein entsprechendes low-copy Plasmid konstruiert, das SEC72TPR hinter dem endogenen Promotor codiert (pCU 065). Dadurch sollte verhindert werden, daß eine erhöhte Proteinkonzentration an Sec72TPRp einen möglichen Defekt suppremiert. Als Positivkontrolle diente ein identisches Plasmid mit dem intakten Gen (pCU 060).

Beide Plasmide wurden in den YUC 15 Hefestamm transformiert, der durch ein pSEC72^URA komplementiert wurde. Als Negativkontrolle wurde das Ausgangsplasmid (pRS 415) mitgeführt. Transformanten aller drei Klone wurden über Nacht in YPD angezogen, um ihnen die Möglichkeit zu geben, daß komplementierende pSEC72^URA zu verlieren. Dann wurden die Klone auf SD- bzw. SD + 5´FOA-Platten ausgestrichen und 2-3 Tage bei 30°C inkubiert (Abb. 16). SEC72TPR kann YUC 15 nicht komplementieren, das intakte SEC72 ist dazu in der Lage. Somit ist die TPR-Domäne des Sec72p von Bedeutung für seine Funktion. Aufgrund der entfernten Homologie zu anderen TPR-Domänen und der aufgeklärten Funktion dieser Proteine kann man daher die Hypothese aufstellen, daß die TPR Domäne von Sec72p für die Interaktion mit cytosolischen Proteinen wichtig ist.

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Abb. 16: Genetische Untersuchung zur Rolle der TPR-Domäne des Sec72p in Abwesenheit von SBH1. Transformanten von YUC15 + pSEC72^URA (sec72/sbh1 + pSEC72^URA) mit pSEC72, mit pSEC72TPR und mit pRS415 (Ausgangsvektor) wurden über Nacht in Vollmedium angezogen, auf SD- bzw. SD + 5´FOA-Platten ausgestrichen und 2-3 Tage bei 30°C inkubiert.

3.2.3 Die Deletion der TPR-Domäne ändert nicht die Lokalisierung von Sec72TPRp.

Um auszuschließen, daß die Deletion der TPR-Domäne Sec72p instabilisiert hat, und es deswegen degradiert wurde, oder nicht mehr korrekt an die Membran assoziiert ist, wurde die Lokalisierung und die Art der Bindung von Sec72TPRp im Vergleich zum wt-Protein untersucht. Wie bereits erwähnt, zeichnet sich die Assoziation von Sec72p an die Membran vor allem durch ihre Hochsalz-Resistenz und ihre Alkali-Beständigkeit aus. Sollte Sec72TPRp sich ähnlich verhalten, so wäre davon auszugehen, daß es sich um eine korrekte Membranassoziation handelt.

Membranen von Transformanten von YUC 6 (sec72) mit pCU 060 (pSEC72), bzw. mit pCU 065 (pSEC72TPR) und Membranen von einem Wildtyp wurden entweder mit 500 mM NaCl oder mit 100 mM Na₂CO₃, pH11 behandelt (3.2.2.4). Die Membranen wurden hochtourig sedimentiert und die Verteilung von Sec72p bzw. Sec72TPRp zwischen Membranen und Überstand durch eine Western Blot Analyse mit Antikörpern gegen Sec72p bestimmt (Abb. 17).

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Abb. 17: Untersuchung zur Lokalisierung von Sec72TPRp. Plasmide, die für SEC72 bzw. SEC72TPR kodieren wurden in den Stamm YUC 6 (sec72) transformiert. Transformanten sowie ein Wildtyp als Kontrolle wurden in Minimalmedium angezogen und geerntet, Membranen wurden nach einem Standardprotokoll präpariert und entweder mit 500 mM NaCl oder mit 100 mM Na₂CO₃, pH 11 für 20 min inkubiert. Die Membranen wurden sedimentiert und die Verteilung von Sec72p bzw. Sec72TPRp zwischen Membranen und Überstand durch eine Western Blot Analyse mit Antikörpern gegen Sec72p durchgeführt.

Wie Abb. 17 zu entnehmen ist, assoziiert Sec72TPRp unverändert Hochsalz-resistent und Alkali-beständig an Membranen. Der Funktionsverlust ist somit nicht auf eine Degradation oder falsche Lokalisierung zurückzuführen. Nach der Hochsalz- und Alkali-Resistenz zu urteilen, unterscheidet sich die Bindung von Sec72TPRp nicht von der des wt-Proteins.

3.3 Quervernetzungstudien zur Identifizierung von Interaktions-partnern von Sec72p.

Durch die cytosolische Ausrichtung von Sec72p und durch die Anwesenheit eines C-terminalen Bereichs mit Ähnlichkeit zu TPR-Domänen, dessen Fehlen nicht die Bindung an die Membran via Sec71p ändert, wohl aber die Fähigkeit eine sec72/sbh1 Doppelnullmutante zu komplementieren, lag es nahe, nach eventuellen cytosolischen Interaktionspartnern von Sec72p zu suchen. Dazu wurde ein experimenteller Ansatz gewählt, der es erlaubt, ein Protein in vitro zu seiner Umgebung photochemisch querzuvernetzen (3.2.2.1).

Sec72p wurde in vitro translatiert und dabei durch den Einbau von ³⁵S-Methionin radioaktiv markiert. Außerdem wurde teilweise anstelle der normalen Aminosäure Lysin ein

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In einem ersten Experiment sollten benachbarte Membranproteine von Sec72p identifiziert werden. Das in vitro translatierte Sec72p wurde zu Sec72p-freien Membranen gegeben und für 20 min auf Eis inkubiert. Durch hochtourige Zentrifugation wurde membrangebundenes von nicht an Membranen gebundenes Sec72p getrennt. Die Membranen mit assoziiertem Sec72p wurden in einem kleinen Volumen Membranpuffer resuspendiert und der Ansatz halbiert. Während die eine Hälfte mit UV-Licht bestrahlt wurde, diente die andere Hälfte als Negativkontrolle. Beide Proben wurden im SDS-PAGE aufgetrennt und radioaktive Proteinbanden durch Auflegen und Auswerten einer Phosphorimagerplatte sichtbar gemacht.

Abb. 18: Photoreaktive Quervernetzung von Sec72p zu seiner Membranumgebung. Sec72p wurde in vitro translatiert und dabei durch Einbau von ³⁵S-Methionin radioaktiv markiert. Das Lysin des Standard-Aminosäuremixes wurde bei der Translation durch photoreaktives TBDA-Lys ersetzt. Das in vitro translatierte Sec72p wurde mit Sec72p-freien Membranen 20 min auf Eis inkubiert. Durch hochtourige Zentrifugation wurden die Membranen und assoziiertes Sec72p sedimentiert. Das Membranpellet wurde in 20 µl Membranpuffer resuspendiert, der Ansatz halbiert und die eine Hälfte UV-bestrahlt. Beide Proben wurden im SDS-PAGE aufgetrennt und die radioaktiven Proteinbanden mit Hilfe eines Phosphorimagers sichtbar gemacht.

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Das Quervernetzungsprodukt kann wie zu erwarten mit Antikörpern gegen Sec72p immunpräzipitiert werden, außerdem bindet es an ConA Sepharose, was ein Hinweis auf Sec71p ist. Um Sec71p eindeutig als Quervernetzungspartner zu identifizieren, wurde das Experiment mit Membranen wiederholt, die Sec71^1-180p anstelle von Sec71^1-206p (wt) enthielten. Dies führte zu einer geringen Verschiebung des Quervernetzungsprodukts zu kleinerem Molekulargewicht und identifizierte somit Sec71p eindeutig als Interaktionspartner von Sec72p (Daten nicht gezeigt). Festzuhalten ist auch die Tatsache, daß unter diesen Bedingungen weder Sbh1p noch Sec61p noch Sec62p sich photochemisch mit Sec72p verknüpfen lassen, und somit nicht in unmittelbarer Nähe zu sein scheinen.

Abb. 19: Immunpräzipitation des Sec72p-Quervernetzungsproduktes mit Antikörpern gegen verschiedene Proteine des SEC-Komplexes. Membranen mit in vitro translatiertem Sec72p (³⁵S, TBDA-Lys) wurden UV-bestrahlt und anschließend in Immun-präzipitationen mit Antikörpern gegen Sec61p, Sec62p, Sec72p, Sbh1p sowie mit ConA Sepharose eingesetzt. Sowohl die an Protein A Sepharose bzw. ConA Sepharose gebundenen Fraktionen als auch die TCA-gefällten Überstände wurden im SDS-PAGE aufgetrennt. Die Verteilung des radioaktiven Quervernetzungsproduktes wurde durch Auflegen und Auswerten einer Phosphorimagerplatte analysiert.

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Durch diesen Ansatz der photochemischen Quervernetzung konnte Sec71p als Interaktionspartner von Sec72p bestätigt werden; eine Wechselwirkung mit cytosolischen Proteinen wurde nicht gefunden.

3.4 Screen zur Identifizierung synthetisch letaler Mutanten in Kombination mit sec72.

Die nicht gefundene photochemische Quervernetzung von Sec72p zu cytosolischen Proteinen bedeutet nicht, daß es keine solche Interaktionen gibt. Eine mögliche Ursache für das Ausbleiben einer Quervernetzung könnte sein, daß kein TBDA-Lys sich in der unmittelbaren Nähe der Interaktionsgrenzfläche befindet. Andere Gründe könnten sein, daß die gesuchte Interaktion entweder sehr kurzlebig ist, oder die Affinität der Interaktionspartner in vitro sehr gering ist. Beides erschwert das Knüpfen einer kovalenten Bindung und wirkt sich negativ auf die Menge an Quervernetzungsprodukt aus.

Nachdem der biochemische Ansatz keine Interaktionspartner aufzeigen konnte, wurde daher mittels eines genetischen Ansatzes nach bisher unbekannten genetischen Interaktionspartnern von SEC72 gesucht. Dazu wurde ein Screen zur Identifizierung synthetisch letaler Mutanten durchgeführt. Dieser Screen kann Proteine, die an einem gemeinsamen Stoffwechsel- oder Transportweg beteiligt sind, identifizieren.

Die Grundidee basiert darauf, daß Mutationen in zwei Genen eines gemeinsamen Stoffwechselweges additiv in ihrer Wirkung und im Extremfall synthetisch letal sind, während dies für zwei Mutationen in unabhängigen Stoffwechselwegen nicht zutrifft.

Im durchgeführten Screen gingen wir von einem sec72/sbh2, pSEC72-Stamm aus. Wir wählten einen sec72/sbh2-Stammhintergrund, um durch Beeinträchtigen des Ssh1-Komplexes größeren Streß auf die Zelle auszuüben.

150.000 unabhängige Klone wurden analysiert. Zwei Kandidaten (Klon 49-1 und Klon 190-83) waren auf ein komplementierendes pSEC72 angewiesen. Membranen beider Klone wurden daraufhin im Western Blot auf die Anwesenheit aller möglichen Proteine des

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sec72

sbh1

Der Klon 190-83 ließ sich nicht durch die LiOAc-Methode transformieren, sondern nur durch Elektroporation. In der Western Blot Analyse seiner Membranen waren alle bekannten Proteine des Translokationsapparates nachweisbar. Die Komplementation mit der genomischen Hefe-Bank ergab keine komplementierenden Klone (50.000 unabhängige Klone wurden gescreent, 1.000 unabhängige Klone sollen nach Angaben des Herstellers das Hefe-Genom repräsentieren). In weiteren Kontrollen wurde ausgeschlossen, daß es sich um eine dominante Mutation bzw. um eine Doppelmutation handelt. Unverständlich ist, daß selbst das Bank-Plasmid für SEC72 - dessen Existenz in der Hefe-Bank mit der Komplementation von 49-1 und zusätzlich durch vier unabhängige PCRs nachgewiesen worden ist - nicht gefunden wurde.

Bei der verwendeten genomischen Bank (ATCC 77162) handelte es sich um eine low-copy Bank. Um auszuschließen, daß die Anzahl der Plasmide pro Zelle eine Rolle spielt, wurde der Klon 190-83 mit einer zweiten genomischen Bank auf einem high-copy Plasmid (ATCC 37323, bezogen von der American Type Culture Collection) durchgeführt. Die Analyse weiterer 50.000 Klone ergab auch bei Verwendung dieser zweiten Bank keinen positiven Klon.

Somit konnte durch den synthetisch letalen Screen kein weiterer genetischer Interaktionspartner von Sec72p aufgedeckt werden. Allerdings wurde auf einem unabhängigen Weg die synthetische Letalität von SEC72 und SBH1 bestätigt.

3.5 Ursachen für die synthetische Letalität von sec71/sbh1 und sec72/sbh1

Im weiteren Verlauf der Arbeit wurde die Ursache für die Letalität der Mehrfach-Mutanten näher untersucht. Für die Deletionsmutanten sec71 bzw. sec72 sind Transportdefekte

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Die Transportdefekte könnten zwei unterschiedliche Ursachen haben: zum einen das Fehlen einer essentiellen Funktion, z.B. im Signalsequenz-Antennenkomplex, zum anderen aber auch eine Instabilität und eventuelle Dissoziation des SEC-Restkomplexes. Auch diese zweite Möglichkeit wird untersucht.

3.5.1 Die Stämme sec71/sbh1/sbh2 und sec72/sbh1/sbh2 zeigen deutliche Transportdefekte.

Um die Akkumulation von Präkursoren zu untersuchen, verwendeten wir drei Modellsubstrate: Carboxypeptidase Y (CPY) und -Faktor als Substrate des posttranslationalen Transportweges (Ng et al., 1996) und Invertase als vornehmlich cotranslationales Substrat (Rothe und Lehle, 1998).

Zu Beginn wurde die Verteilung von CPY sowie ihrer Präkursoren im steady state betrachtet. Um eventuelle Komplementationen durch Sbh2p zu verhindern, wurden alle Experimente in sbh2-Stämmen durchgeführt. Ein wt-Stamm, sowie YUC 9 + pMET-SBH1 (sec72/sbh1 /sbh2, pMET-SBH1) und YUC 10 + pMET-SBH1 (sec72/sbh1/sbh2, pMET-SBH1) wurden ausgehend von einer Vorkultur parallel in SD - Methionin und in SD + 4 mM Methionin für 18 Stunden angezogen. Durch die Anzucht in Methionin-haltigem Medium wurde der MET-Promotor repremiert und die synthetisch letalen Phänotypen konnten im folgenden untersucht werden. Abb. 20 zeigt die Entwicklung des Sbh1-Proteingehalts während eines Abschaltexperiments. Deutlich zu sehen ist die durch Zugabe von 4 mM Methionin induzierte Abnahme von Sbh1p. Bereits 12 Stunden nach der Zugabe von 4 mM Methionin ist der Proteingehalt von Sbh1p im Western Blot kaum noch zu detektieren, nach 16 Stunden liegt er unterhalb der Nachweisgrenze. Im Vergleich dazu bleibt die Menge an Sec62p konstant.

Um die Verteilung von CPY sowie ihrer Präkursoren im steady state zu vergleichen, dienten Zellen zum Zeitpunkt der Methionin-Zugabe (t = 0) als Kontrolle. Die geernteten Zellen wurden aufgeschlossen und das erhaltene Zelllysat in eine Immunpräzipitation mit Antikörpern gegen Carboxypeptidase Y eingesetzt.

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Abb. 20: In vivo System zur Untersuchung der letalen Hefestämme durch Repremierung des Methionin-Promotors. A) Flüssigkulturen der angegebenen Hefestämme wurden aus Methionin-freien Vorkulturen in Minimalmedium +/- 4 mM Methionin mit einer OD₆₀₀ = 0,1 angeimpft. Durch Verdünnen der Kulturen wurde gewährleistet, das die OD₆₀₀ über die gesamte Versuchszeit unter 1,0 lag. Die Bestimmung der OD₆₀₀ erfolgte zu den angegebenen Zeitpunkten, entsprechende Verdünnungsfaktoren wurden bei der Berechnung der Gesamtzelldichte berücksichtigt. B) Zu den angegebenen Zeitpunkten wurden 10 OD₆₀₀ Zellen der Kulturen aus A) geerntet, aufgeschlossen und im Western Blot mit Antikörpern gegen Sec62p und Sbh1p getestet. Hier werden die Ergebnisse für den sec72/sbh1/sbh2, pMET-SBH1-Stamm in Abwesenheit bzw. Gegenwart von 4 mM Methionin gezeigt. Die Daten für den Wildtyp (wt) und den sec71/sbh1/sbh2, pMET-SBH1-Stamm decken sich mit den gezeigten.

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Abb. 21: Untersuchung zur Akkumulation von ppCPY im steady state in verschiedenen letalen Stammhintergründen. Hefestämme, wie angegeben, wurden in Minimalmedium mit bzw. ohne 4 mM Methionin angezogen. Nach 18 Stunden Wachstum bei 4 mM Methionin ist der Gehalt an Sbh1p im Western Blot nicht mehr nachweisbar. Zu den angegebenen Zeitpunkten wurden je 50 OD₆₀₀ Zellen geerntet und aufgeschlossen. Die Zelllysate wurden in eine Immunpräzipitation mit Antikörpern gegen CPY eingesetzt. Anschließend wurden die an ProteinA Sepharose gebundene mCPY/ppCPY-Fraktionen mit Endo H deglykosyliert. Die Deglykosylierung dient der Unterscheidung zwischen mCPY und ppCPY, die ansonsten im SDS-PAGE das gleiche Laufverhalten zeigen. mCPY^-Gluc = deglykosylierte mCPY.

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In Abb. 22 ist das Ergebnis einer Pulsmarkierung für Carboxypeptidase Y gezeigt.

Abb. 22: Pulse-Markierung zur Detektion von CPY Präkursor-Akkumulation. Hefen der angegebenen Stämme wurden in SGal-Medium angezogen und für 18 Std. in SD-Medium umgesetzt. Durch Repremierung des GAL-Promotors entstehen die angegebenen Phänotypen. Die Zellen wurden wie im Abschnitt 3.2.2.3 beschrieben 4 min pulse-markiert, aufgeschlossen und in eine Immunpräzipitation mit Antikörpern gegen CPY eingesetzt. Präzipitiertes CPY wurde im SDS-PAGE aufgetrennt und mit Hilfe eines Phosphorimagers ausgewertet. Zu sehen sind die unprozessierte präpro-Form des CPY (ppCPY), sowie die einfach bzw. zweifach glykosylierten Golgi-Formen der CPY (p1 bzw. p2).

Die Daten aus der Pulse-Markierung zeigen wesentlich stärkere Präkursor-Akkumulationen als die des steady state. Auch die Stämme YUC 6 und YUC 11 zeigen signifikante Mengen ppCPY. Dies ist konform mit Ergebnissen von Feldheim et al. (1994), die 50 % CPY Präkursor-Akkumulation für einen sec72-Stamm beschrieben haben. Fehlt zusätzlich zu

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Es ist mit hoher Wahrscheinlichkeit anzunehmen, daß der absolute Translokationsblock die Ursache für den letalen Phänotyp ist. Diese Sichtweise wird auch durch die Untersuchung der Präkursor-Akkumulation von -Faktor im steady state unterstützen. Während der Wildtyp keine Präkursor-Akkumulation zeigt, und auch der sec71- bzw. der sec72-Deletionsstamm keine merklichen Transportdefekte aufweisen, ist in den letalen Mehrfachmutanten sec72/sbh1/sbh2 und sec71/sbh1/sbh2 eine deutliche Ansammlung von präpro--Faktor zu detektieren (Daten nicht gezeigt).

Interessant war die Frage, inwieweit sich der Translokationsblock auch auf cotranslationale Substrate auswirkt. Um dies zu klären, wurde die Verteilung von sekretorischer Invertase und ihren Vorläufer-Formen im steady state analysiert. Wie bereits im vorhergehenden Experiment wurden die Hefestämme der Einfach- bzw. Mehrfach-Mutanten aus SGal-Kulturen 18 Std. in SD angezogen, wodurch der GAL-Promotor repremiert wurde. Um eine konstitutive Expression der Invertase auch in Glucose-haltigem Medium zu erreichen, wurde das SUC2-Gen unter Kontrolle des PGK-Promotors auf einem 2µ-Plasmid in die Hefen eingeschleust. Die so erhaltenen Hefen wurden geerntet, aufgeschlossen und in eine Immunpräzipitation mit Antikörpern gegen Invertase eingesetzt.

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Abb. 23: Präkursor-Akkumulation von pre-Invertase im steady state. Hefestämme, wie angegeben, wurden aus Vorkulturen in SGal für 18 Std. in SD-Medium angezogen. Um eine konstitutive Expression der Invertase auch in Glucose-haltigem Medium zu erreichen, wurde das SUC2-Gen unter Kontrolle des PGK-Promotors auf einem 2µ-Plasmid in die Hefen transformiert. Die Zellen wurden geerntet, aufgeschlossen und die Lysate in eine Immunpräzipitation mit Antikörpern gegen Invertase eingesetzt. Die Auswertung erfolgte durch SDS-PAGE und Western Blot Analyse.

Abb. 23 zeigt für die Mehrfach-Mutanten deutliche Transportdefekte von pre-Invertase als Substrat des cotranslationalen Translokationsystems im steady state. Somit sind nicht nur Substrate des posttranslationalen Translokationswegs durch die Deletion von SEC72 und SBH1 betroffen, sondern auch Substrate, die unter wt-Bedingungen den cotranslationalen Weg nehmen.

3.5.2 Untersuchungen zur Stabilität des posttranslationalen Komplexes

Für die im vorangegangenen Kapitel beschriebenen Transportdefekte kann es mehrere Ursachen geben. Zum einen kann das Fehlen von Sec71p, Sec72p und Sbh1p direkt eine Funktion des Translokationsmechanismus, z.B. die des Signalsequenz-Antennenkomplexes stören. Zum anderen kann das Fehlen von mehreren Komponenten eines heptameren Proteinkomplexes auch zu einer Destabilisierung des Restkomplexes führen. Im folgenden wurde daher die Stabilität des SEC-Komplexes in Abwesenheit mehrerer Proteine mit Hilfe von Coimmunpräzipitationen untersucht.

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Wie Abb. 24 zu entnehmen ist, wird die Wechselwirkung zwischen Sec61p und Sec62p, die hier stellvertretend für die jeweiligen Subkomplexe betrachtet werden, durch das Fehlen von Sec71p, Sec72p und Sbh1p nicht beeinflußt.

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Abb. 24: Der SEC-Restkomplex ist in Abwesenheit von Sec71p, Sec72p und Sbh1p stabil. Membranen der angegebenen Stämme wurden zu den Zeitpunkten 0 bzw. 18 Std. geerntet. 90 eq entsprechender Membranpräparationen wurden unter 1% Digitonin im Hochsalzpuffer (siehe 3.2.2.2) solubilisiert und mit einem Antikörper gegen Sec62p gefällt. Präzipitate entsprechend 25 eq wurden im SDS-PAGE aufgetrennt und im Western Blot auf die Anwesenheit von Sec61p und Sec62p getestet. Gefragt wurde, ob im SEC-Restkomplex in Abwesenheit von Sec71p, Sec72p und Sbh1p immer noch eine Sec61p x Sec62p Interaktion nachweisbar ist.

Daraus kann geschlußfolgert werden, daß eine Destabilisierung des Zusammenhalts zwischen dem trimeren Sec61p-Komplex (der nach dem Abschalten von SBH1 nur noch aus Sec61p und Sss1p besteht) und dem tetrameren Sec62/63-Komplex (der nur noch aus Sec62p und Sec63p besteht) im Falle der synthetisch letalen Phänotypen nicht der Grund für die Transportdefekte von ppCPY, pre-Invertase und pp-Faktor ist. Vielmehr handelt es sich dabei um direkte Transportdefekte, die durch das Fehlen von Sec72p und Sbh1p bzw. Sec72p, Sec71p und Sbh1p verursacht werden.

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