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Kapitel 4. Diskussion

Die hier vorgelegte Arbeit beschäftigt sich mit dem posttranslationalen Transport in das ER der Bäckerhefe Saccharomyces cerevisiae. Der besondere Fokus liegt auf der Untersuchung von Sec71p, Sec72p und Sbh1p, drei Proteinen, die größtenteils cytosolisch orientiert sind und deren Funktion bei der posttranslationalen Translokation bisher ungeklärt ist.

Lyman und Schekman (1997) haben das Modell eines Signalsequenz-Antennenkomplexes, bestehend aus Sec62p, Sec71p und Sec72p, vorgeschlagen. Ein solcher Signalsequenz-Antennenkomplex wäre der erste Kontaktpunkt eines posttranslationalen Transportsubstrats und eventueller Targeting-Faktoren mit dem SEC-Komplex.

4.1 Die verschiedenen Domänen des Sec71p und ihre Funktionen

Einen Schwerpunkt dieser Arbeit bildet die Analyse von wichtigen Bereichen des Sec71p für die Assoziation mit dem SEC-Komplex und für die Komplementation einer sec71/sbh1 Doppelmuntante. Durch Einsatz sowohl N- als auch C-terminal verkürzter Varianten von Sec71p wurden entsprechende funktionelle Domänen von Sec71p identifiziert. Sowohl für die Bindung von Sec72p, als auch für die Assoziation mit dem SEC-Komplex ist ein Bereich von Pos. 120 bis Pos. 160 des Sec71p minimal notwendig. Die Hinzunahme des angrenzenden C-terminalen Sequenzbereichs bis Pos. 180 steigert die Effizienz der beiden Funktionen.

Wie mittels Coimmunpräzipitationen von Sec71p mit Antikörpern gegen Sec62p in einem sec72-Hintergrund gezeigt werden konnte, ist die Assoziation der beiden Proteine im SEC-Komplex unabhängig von der Anwesenheit von Sec72p.

Eine N-terminal verkürzte Variante Sec71^1-120p bindet weder Sec72p (Abb. 8), noch kann sie mit Antikörpern gegen Sec62p coimmunpräzipitiert werden (Abb. 10). Wie von Feldheim et al. (1994) bekannt, wird Sec72p in Abwesenheit von Sec71p mit einer Halbwertszeit von ca. 12 min degradiert. Eine Sec71-Variante ohne Sec72p-Bindungsstelle verursacht somit einen zusätzlichen sec72p Phänotyp. Da die Kombination sbh1/sec72 letal ist (Abb. 14), muß aufgrund des Abbaus von Sec72p in Anwesenheit der Sec71^1-120p-Variante zwangsläufig auch sbh1/sec71/SEC71^1-120 letal sein. Es bleibt zu klären, ob die Abwesenheit von Sec72p der einzige Grund für die Unfähigkeit von Sec71^1-120p ist, einen sbh1/sec71-Stamm zu komplementieren.

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Durch Ersetzen des N-terminalen Membranankers von Sec71p durch die P450Cm1-Membranankerdomäne von Candida maltosa wurde die Bedeutung des Transmembranbereichs von Sec71p getestet. Zum Vergleich wurde eine Sec71p-Variante ohne Membrananker und luminalen Teil betrachtet.

Der Versuch einer Komplementation eines sbh1/sec71-Stamms mit den drei Fusionsproteinen bzw. einer Sec71p-Variante ohne Membrananker und luminalen Teil zeigte, daß der cytosolische Teil von Sec71p genügt, um für das wt-Protein zu komplementieren, und daß der Membrananker dazu nicht notwendig ist. Andererseits wirkt sich der Austausch gegen einen fremden Membrananker, in diesem Fall den des P450Cm1 aus C. maltosa, negativ auf die Funktionalität des Sec71p aus. Die drei Fusionsproteine können daher den sbh1/sec71-Stammhintergrund nicht komplementieren. Der Membrananker des Sec71p ist somit nicht essentiell, aber seine Struktur von Bedeutung für die korrekte Integration in den SEC-Komplex.

Interessant und aufschlußreich sind auch die Glykosylierungsmuster der verwendeten myc-Fusionsproteine. Es ist offensichtlich, daß durch N-terminale Fusion des 3x-myc-Epitops der Grad der vollständigen Glykosylierung deutlich abnimmt (Abb. 10). Betrachtet man das Verhalten der unterschiedlich glykosylierten Formen in den Coimmunpräzipitationen mit Antikörpern gegen Sec62p, so fällt auf, daß vornehmlich die vollständig glykosylierten Varianten zusammen mit Sec62p gefällt werden, obwohl sie teilweise nur einen Bruchteil an der Gesamtpopulation des Sec71-myc Fusionsproteins ausmachen (Abb. 10). Die vollständige Glykosylierung scheint somit ein Indikator für die korrekte Orientierung in der Membran und für die Assoziation mit dem SEC-Komplex zu sein. Betrachtet man unter diesem Aspekt die P450-Membranankerkonstrukte, so ist der P450Cm1-Membrananker von C. maltosa nicht in der Lage, sich problemlos in den SEC-Komplex zu integrieren.

Die Versuche mit den P450-Sec71p-myc Konstrukten bestätigten auch, daß der cytosolische Teil von Sec71p ausreicht, um Sec72p zu binden. Selbst ein Fusionsprotein, daß nur die letzten 46 Aminosäuren von Sec71p enthielt, war zu einer eingeschränkten Bindung von Sec72p fähig (Abb. 12).

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• Den cytosolischen C-Terminus, der verantwortlich ist für die Bindung von Sec72p, die Assoziation mit Sec62p und die Komplementation eines sec71/sbh1-Stamms.
• Den Membrananker, der nicht essentiell ist, dessen Struktur aber wichtig für eine korrekte Integration in den SEC-Komplex ist, und der nicht durch einen beliebigen Membrananker ersetzt werden kann.

• Darüber hinaus bietet der luminale Teil, mit seinen zwei Glykosylierungsorten die Möglichkeit die korrekte Integration in die Membran zu beurteilen.

4.2 Sec72p besitzt eine potentielle Interaktionsstelle für cytosolische Proteine

Sec72p ist die einzige Komponente des SEC-Komplexes, die keine Transmembrandomäne besitzt und ein peripheres Membranprotein mit ungewöhnlicher Bindung an die ER-Membran darstellt. Unter Bedingungen, die andere periphere Membranproteine von der Membran ablösen (pH = 11 oder 500 mM NaCl), bleibt Sec72p unverändert mit dem SEC-Komplex assoziiert (Abb. 17).

Sequenzvergleiche von Sec72p mit anderen Proteinen zeigten im C-terminalen Bereich von Sec72p eine Aminosäuresequenz mit Ähnlichkeit zu einer TPR-Domäne. TPR-Domänen sind als Protein-Interaktionsdomänen beschrieben. In der Regel kommt die Konsensus-Sequenz aus 34 Aminosäuren zwischen drei und zwölf Mal in einem Protein vor (für einen Überblick siehe Goebl und Yanagida, 1991). Für Proteine mit TPR-Domänen sind Beteiligungen an der Mitose, der Transkription und auch am Proteinimport in Mitochondrien und Peroxisomen nachgewiesen. S.c.Tom70p als Teil des mitochondrialen Translokationskomplexes ist ein Protein mit 7 TPRs (Woolford, 1989). S.c.Pas10p interagiert mit der peroxisomalen Targetingsequenz und ist ebenfalls ein Protein mit mehreren TPR Domänen (Brocard et al., 1994). Außerdem zeigten Radanyi et al. (1994), daß das Immunophilin FKBP59-HBI mit Hsp90 durch seine TPR-Domänen interagiert. Sec72p besitzt nur eine einzelne TPR-Domäne, mit eingeschränkter Ähnlichkeit zu der TPR-Konsensus-Sequenz. Die Deletion dieser TPR-Domäne des Sec72p führt zu einem Funktionsverlust. Dieser Funktionsverlust kommt phänotypisch erst zum Tragen, wenn Sec72TPRp mit einer SBH1-Deletion kombiniert wird,

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In der vorliegenden Arbeit wurde versucht, bisher unbekannte Interaktionspartner von Sec72p zu identifizieren. Die Versuche zur photochemischen Quervernetzung unterstrichen die räumliche Nähe zu Sec71p. Die Durchführung eines Screen zur Identifizierung synthetisch letaler Mutanten bestätigte die Coletalität von sec72 mit sbh1. Beide Ansätze führten nicht zur Identifizierung neuer Interaktionspartner von Sec72p. Diese Ergebnisse sind jedoch nicht gleichbedeutend mit dem Fehlen derartiger Wechselwirkungen. Beide experimentellen Ansätze haben ihre Grenzen und müssen daher nicht notwendigerweise zur Identifizierung neuer Proteine führen.

Sind es z.B. mehrere Interaktionspartner, die sich in ihrer Funktion überlagern und ersetzen können, so ist es sehr unwahrscheinlich, daß sie im Rahmen eines synthetisch letalen Screens identifiziert werden. Dazu wäre es notwendig, störende Mutationen in allen Interaktionspartnern gleichzeitig zu setzen. Für die photochemische Quervernetzung gilt, daß sie vor allem geeignet ist für stabile, langanhaltende Wechselwirkungen. Je kürzer die räumliche Interaktion, desto geringer ist die Ausbeute an Quervernetzungsprodukt. Das gleiche gilt für den Fall, daß es mehrere verschiedene Interaktionspartner gibt. Die Ausbeute an Quervernetzungsprodukt verteilt sich dann auf alle möglichen Wechselwirkungspartner und geht somit zu Lasten der Detektierbarkeit einzelner Banden.

Ein möglicher Ansatz, um in zukünftigen Experimenten eventuelle posttranslationale Targetingfaktoren zu identifizieren, wäre die Durchführung eines high-copy Suppressor Screens. Die Kombination der Einzelmutanten und der synthetisch letale Screen haben ergeben, daß sec72 und sbh1 coletal sind. Wie weiter unten diskutiert wird, könnte dies durch eine überlappende Funktion beim Signalsequenz-Erkennungsmechanismus bedingt sein. Eine solche Störung könnte sich durch einen erhöhten Gehalt an Targetingfaktoren beheben lassen. Deshalb wäre es sinnvoll, einen regulierbaren sec72/sbh1-Doppeldeletionsstamm mit einer genomischen high copy Bank zu transformieren, um zu untersuchen, ob es ein Gen gibt, das in erhöhter Konzentration für sec72/sbh1

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Photochemische Quervernetzungsexperimente haben gezeigt, daß sich Sec72p mit Sec71p kovalent verknüpfen läßt. Alle anderen getesteten Komponenten des SEC-Komplexes wurden nicht zu Sec72p quervernetzt (Abb. 18 und Abb. 19). Dieser Befund bestätigt, daß die starke Bindung an die Membran vor allem von Sec71p vermittelt wird. Das ist konform mit der Beobachtung, daß Sec72p in einem sec71 Stammhintergrund nicht an der Membran bzw. im SEC-Komplex gefunden wird (Feldheim et al. (1994), Abb. 8 diese Arbeit).

Während alle bekannten Daten dafür sprechen, daß Sec71p und Sec72p eine Rolle während der Translokation in das ER ausüben, findet man sie in der Literatur auch in anderen Zusammenhängen:

In einem genetischen Screen zur Regulation der DNA-Replikation während der Mitose wurde SEC72 als SIM2 (SIM = ’start independent of mitosis‘) gefunden (Dahmann, C. et al., 1995). Ein Hefestamm der in den Genen CLB1 bis CLB4 deletiert ist, repliziert nur einmal seine DNA und kann nicht in eine Mitose eintreten. Eine Mutation in SIM2 (= SEC72) ermöglicht es diesem Stamm seine DNA ein weiteres Mal zu replizieren. Es liegt der Verdacht nahe, daß es sich um einen indirekten Effekt handelt, der durch die Mißlokalisierung von Proteinen des sekretorischen Weges (dazu gehören auch integrale Proteine der Kernmembran) auftritt. Denkbar wäre aber auch eine Mutation im Bereich der TPR-Domäne von Sec72p, die dann mit TPR-Domänen von Proteinen, die an der Regulation der Mitose beteiligt sind, konkurrieren könnte und dadurch den Level an wichtigen Steuerungsfaktoren herabsetzt. Um dies zu klären, wäre es hilfreich mehr über die Mutation im SIM2 zu erfahren. Eine direkte Rolle von Sec72p in der Mitose ist sehr unwahrscheinlich.

In zwei Veröffentlichungen (Brizzio et al., 1999; Ng und Walter, 1996) werden Sec63p, Sec71p, Sec72p und Kar2p als Beteiligte an der Verschmelzung von Kernmembranen nach einer Zellfusion beschrieben. SEC63, KAR2 und KAR7 (= SEC71) wurden in einem genetischen Screen zur Kernfusion gefunden. Weder Brizzio et al. Noch Ng und Walter präsentieren Daten, in denen sie eine Assoziation eines der vier Proteine mit Komponenten der Kernfusionsmaschinerie zeigen. Einen einfachen Translokationsdefekt als Ursache schließen sie aus, da Mutanten von SEC61 und SEC62 deutlich stärkere Translokationsdefekte als SEC63, KAR2, SEC71 und SEC72 aber keine Hemmung der Kernmembranverschmelzung zeigen. Meiner Meinung nach handelt es sich bei den

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4.3 Synthetische Letalität als Indikator für Interaktionen und ergänzende Funktionen

Die Kombinationen der Deletionsmutanten von SEC71 und SEC72 mit Nullmutanten von SBH1 bzw. SBH2 führten zu den coletalen Genotypen sec71/sbh1 bzw. sec72/sbh1 und zu den vitalen Genotypen sec71/sbh2 bzw. sec72/sbh2. Diese Doppeldeletionsmutanten ermöglichen eine Reihe von Aussagen über die Bedeutung von Sbh1p und Sbh2p im co- bzw. posttranslationalen Transport. Synthetische Letalität ist nach Huffacker et al. (1987) ein Indiz für die Beteiligung zweier Proteine an einem gemeinsamen Stoffwechsel- oder Transportweg. Demnach sind Sec71p, Sec72p und Sbh1p an einem gemeinsamen Transportweg beteiligt, während Sbh2p in ein anderes Transportsystem eingebunden ist. Dies bestätigen Daten von Finke et al. (1996), die zeigen, daß die beiden homologen Beta-Untereinheiten sich trotz ca. 50% Identität der Aminosäuren nicht gegenseitig ersetzen können. Die vorliegende Arbeit belegt, daß Sbh2p in einem letalen sbh1/sec71-Hintergrund eher im Ssh1-Komplex assoziiert bleibt, als im Sec61-Komplex für Sbh1p zu komplementieren. Das dies prinzipiell möglich ist, zeigt der sbh1/sec71/ssh1 -Stamm, in dem Sbh2p in Abwesenheit seines eigentlichen Bindungspartners in Assoziation mit dem SEC-Komplex gefunden wird und den letalen Phänotyp komplementiert (Abb. 5).

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Einzeldeletionsmutanten von SEC71 bzw. SEC72 sind unter normalen Wachstumsbedingungen ebenfalls nicht essentiell für das Wachstum der Zelle. Aus den coletalen Genotypen sec71/sbh1 bzw. sec72/sbh1 läßt sich allerdings ableiten, daß Sec71p und Sec72p in Abwesenheit von Sbh1p notwendig für das Überleben der Zelle sind. Andersherum ist Sbh1p in einem sec71 bzw. sec72 -Hintergrund essentiell.

Eine naheliegende Schlußfolgerung ist, daß Sbh1p in Abwesenheit von Sec71p und/oder Sec72p eine tragende Funktion im posttranslationalen Transport einnimmt. Wäre dies nicht der Fall, und Sbh1p wäre nur für den cotranslationalen Weg wichtig, dürfte sich die Präkursor-Akkumulation eines posttranslationalen Substrates im letalen sec72/sbh1-Hintergrund nicht wesentlich von der eines sec72-Stamms unterscheiden. Abb. 21 bis Abb. 23 im Kapitel 4.5 zeigen dagegen die deutlichen Unterschiede in der Präkursor-Akkmulation dieser beiden Stämme.

Über die Rolle von Sbh1p und Sbh2p im Translokationsprozeß gibt es derzeit keine konkreten Vorstellungen. Daten aus dem homologen Säuger-System erlauben dennoch erste Vermutungen.

Bei Untersuchungen zur Rolle von Sec61ß im cotranslationalen Transport der Säuger haben Kalies et al. (1998) Proteoliposomen von Sec61ß depletierten und dadurch eine starke Reduzierung der Translokationseffizienz erzeugt. Dieser Defekt konnte behoben werden, wenn die Proteoliposomen vor dem eigentlichen Translokationsprozeß zusammen mit dem Transportsubstrat auf Eis inkubiert wurden, und somit für den Insertionsschritt der

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In Quervernetzungsexperimenten mit cotranslationalen Transportsubstraten wurden in Abhängigkeit von der Kettenlänge zuerst Verknüpfungen zu Sec61ß und dann zu Sec61 beschrieben (Laird und High, 1997). Dies ist ein weiterer Hinweis für eine Beteiligung der Beta-Untereinheit an einem sehr frühen Schritt der Translokation.

Aus diesen Daten läßt sich ableiten, daß Sbh1p und Sec71p/Sec72p im posttranslationalen Transport eine gemeinsame essentielle Funktion übernehmen , daß es sich dabei um einen frühen Schrittes der Translokation handelt , und daß Sbh1p und Sec71p/Sec72p sich aufgrund von ergänzenden bzw. überlappenden Funktionen gegenseitig im SEC-Komplex ersetzen können.

Es ist somit folgendes Modell vorstellbar: Ein posttranslationales Substrat bindet zuerst an den Signalsequenz-Antennenkomplex aus Sec72p, Sec71p und Sec62p und wird dann an Sbh1p weitergereicht. Sbh1p stabilisiert die Anlagerung der Signalsequenz an das Translokon und ermöglicht eine effiziente Translokation. In Abwesenheit von Sbh1p reicht die Funktion des Signalsequenz-Antennenkomplexes aus, um die Signalsequenz mit dem SEC-Komplex zu assoziieren. In Abwesenheit von Sec71p und/oder Sec72p kann der verbleibende Signalsequenz-Antennenkomplex aus Sec62p (im Falle des sec71-Stammes) bzw. Sec62p und Sec71p (im Falle des sec72-Stammes) die Signalsequenz ausreichend binden, um eine stabile Integration der Signalsequenz in das Translokon durch Sbh1p und somit eine Translokation zu ermöglichen.

Für Sec62p ergibt sich daraus eine zentrale Rolle im Signalsequenz-Antennenkomplex, der seine Funktion bei normalen Wachstumsbedingungen nur in Anwesenheit von Sec62p ausüben kann. Erst bei einer Wachstumstemperatur von 17°C ist SEC62 nicht mehr essentiell für die Zelle (Deshaies et al., 1989). Der posttranslationale Targetingprozeß ist dann wahrscheinlich so stark verlangsamt, daß die Effizienz der Interaktion des Transportsubstrates mit dem Translokon auch ohne Signalsequenz-Antennenkomplex ausreicht für einen erfolgreichen Membrandurchtritt.

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4.4 Sind Sec71p/Sec72p und die Beta-Untereinheit des Translokons analoge Proteine ?

Die ergänzende Funktion von Sec71p/Sec72p und Sbh1p in einem frühen Schritt der Translokation ist ein überraschender Befund. Die hier präsentierten Daten passen sich in das Modell eines Signalsequenz-Antennenkomplexes - wie es von Lyman und Schekman (1997) vorgeschlagen wurde -ein. Sie ergänzen es jedoch um eine wichtige Funktion für Sbh1p, das in Abwesenheit von Sec71p oder Sec72p essentiell für den posttranslationalen Transport wird und einen unvollständigen Signalsequenz-Antennenkomplex komplementieren kann. Die ergänzende bzw. überlappende Funktion von Sbh1p und Sec71p/Sec72p ist mit hoher Wahrscheinlichkeit auch der Grund, warum sie nicht in den bisher durchgeführten genetischen Screens als essentiell für die Zelle gefunden wurden.

In S. cerevisiae kennt man drei destinkte Translokationskomplexe, die nebeneinander vorliegen und sowohl cotranslationalen, als auch posttranslationalen Transport durch die ER-Membran ermöglichen. Auf der Suche nach Homologen des posttranslationalen Sec62/63-Subkomplexes wurden in Drosophila ein essentielles Sec62-Homologes (Noel und Cartwright, 1994) und im Hund Homologe zu S.c.SEC62 und S.c.SEC63 (Skowronek et al., 1999; Woollatt et al., 1999; H. Meyer, persönliche Mitteilung) gefunden. Homologe zu S.c.SEC71 und S.c.SEC72 wurden bisher nicht entdeckt. Aufgrund der zahlreichen Genom-Projekte erscheint es mit fortschreitender Zeit immer unwahrscheinlicher, daß entsprechende Homologe zu S.c.SEC71 bzw. S.c.SEC72 außerhalb des Reichs der Pilze noch gefunden werden.

Höhere Eukaryonten translozieren bekanntermaßen vornehmlich cotranslational in das ER. Es wäre daher vorstellbar, daß sie auf die spezialisierte Funktion von Sec71p/Sec72p-Homologen während eines posttranslationalen Transports verzichten können, und gegebenenfalls die jeweilige Beta-Untereinheit die Funktion im Signalsequenz-Antennenkomplex übernimmt.

In diesem Zusammenhang ist es interessant, daß Sec61ß aus dem Hund einen sec71/sbh1- Doppeldeletionsstamm bei 25°C komplementieren kann (Abb.5). Wie schon für Sbh1p im sec71-bzw. sec72-Hintergrund argumentiert, muß auch Sec61ß bei 25°C im sec71/sbh1-Stamm eine wichtige Rolle im posttranslationalen Transport von S. cerevisiae übernehmen, um den letalen Hintergrund zu retten. Sec61ß des Hundes ist somit prinzipiell in der Lage eine posttranslationale Funktion zu erfüllen.

Weitere Untersuchungen des posttranslationalen Transports und der beteiligten Proteine im Säuger

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