Dekane: Prof. Dr. Joachim W. Dudenhausen
Prof. Dr. med. Martin Paul

• 1.  Einleitung

  • 1.1 Kreuzbandverletzungen

  • 1.2  Historie

  • 1.3 Status Quo der Therapie

  • 1.4 Anatomie

    • 1.4.1 Makroskopie

    • 1.4.2 Mikroskopische Anatomie

      • 1.4.2.1 Zelluläre Bestandteile

      • 1.4.2.2 Physiologische Blutversorgung des vorderen Kreuzbandes

      • 1.4.2.3 Extrazellulärmatrix

      • 1.4.2.4 Innervation

  • 1.5 Transplantatremodeling

    • 1.5.1 Initiale Phase (Nekrose und Degradation)

    • 1.5.2 Revitalisierungsphase (Reparation und Proliferation)

    • 1.5.3 Remodelingphase (bis zu 2 Jahren)

  • 1.6  Revaskularisierung von Kreuzbandtransplantaten

  • 1.7 Myofibroblasten (MFB)

  • 1.8 Ziel der Untersuchung

• 2.  Material und Methoden

  • 2.1 Studiendesign

  • 2.2 Tiermodell und Standzeiten

  • 2.3  Operatives Vorgehen

    • 2.3.1 Prämedikation, Narkose und Analgesie

    • 2.3.2  Operative Phase

    • 2.3.3 Kreuzbandersatz

  • 2.4 Explantation

  • 2.5 Histologische Aufarbeitung

  • 2.6  Konventionelle Färbungen

  • 2.7 Immunhistologie

    • 2.7.1 Theorie der Immunhistologie

  • 2.8 Immunhistochemische Färbungen

    • 2.8.1 Immunhistologische Darstellung der Revaskularisierung

    • 2.8.2 Immunhistologische Darstellung der Myofibroblasten

  • 2.9 Auswertung und Datenanalyse

    • 2.9.1  Konventionelle Lichtmikroskopie

      • 2.9.1.1 Zellcharakterisierung und morphologisches Erscheinungsbild

      • 2.9.1.2 Revaskularisierung:

      • 2.9.1.3 Myofibroblasten

    • 2.9.2 Polarisationsmikroskopie

      • 2.9.2.1 Kollagencrimp

  • 2.10 Statistische Auswertung

• 3.  Ergebnisse

  • 3.1 Allgemeines

    • 3.1.1 Komplikationen

    • 3.1.2 Postoperativer Verlauf

  • 3.2 Explantation

  • 3.3  Makroskopische Auswertung

  • 3.4 Mikroskopische Auswertung

    • 3.4.1 Konventionelle Lichtmikroskopie

      • 3.4.1.1 Zellcharakterisierung und morphologisches Erscheinungsbild

      • 3.4.1.2 Crimp

    • 3.4.2 Immunhistologie

      • 3.4.2.1 Vaskularisierung und Revaskularisierung

      • 3.4.2.2 Myofibroblasten

• 4.  Diskussion

• 5.  Zusammenfassung

• Danksagung

• Literatur

• Abbildungsverzeichnis

• Anhang

• Erklärung an Eides Statt

• Curriculum vitae

• Veröffentlichungen

• Tabelle 1: Übersicht der verschiedenen Versuchsgruppen und ihre Standzeiten, sowie die vorgenommenen Untersuchungen (natives VKB und die Flexorsehne wurden randomisiert von der nicht operierten Gegenseite entnommen)

• Tabelle 2: Anleitung zur Verwendung der (1.) absteigenden und (2.) aufsteigenden Alkoholreihe.

• Tabelle 3: Mischungsverhältnis der Grundsubstanzen zur Herstellung des TBS-Spülpuffers pH 8,2

• Abbildung 1: A. Humanes Kniegelenk mit Blick auf Kreuzbänder und Femurkondylen. B. Ovines Kniegelenk mit Blick auf Kreuzbänder und Femurkondylen.

• Abbildung 2: Schematische Darstellung des Ursprunges und Ansatzes der Kreuzbänder im Kniegelenk (aus F. H. Netter Interactive atlas of human anatomy): A: Ansicht der Femurkondylen von inferior. B: Ansicht des Tibiaplateaus mit Menisken von superior. (VKB = vorderes Kreuzband, HKB = hinteres Kreuzband, MCL = mediales Kollateralband, LCL = laterales Kollateralband, AM = Außenmeniskus, IM = Innenmeniskus)

• Abbildung 3: Das vordere Kreuzband das Schafes läßt sich deutlich in ein kräftigeres antero-mediales (AMB) und ein postero-laterales (PLB) Bündel unterteilen, wobei stets ein Anteil während Beugung und Streckung gespannt ist. A.: Ansicht von ventral, B.: Ansicht von dorsal.

• Abbildung 4: Schematische Zeichnung von Lage und Verlauf der das Knie versorgenden Arterien.

• Abbildung 5: Modell der Fibroblasten-Myofibroblasten Modulation: TGFß1 wird von Thrombozyten (nicht abgebildet) und Makrophagen freigesetzt. Ursächlich dafür vermutet man die Stimulation dieser Zellen durch GM-CSF. Freigesetztes TGFß1 aktiviert stromaständige Fibroblasten zur Synthese und Organisation eines dreidimensionalen ECM-Gerüstes, das Fibronektin enthält. Gemeinsam mit TGFß1 vermag es die Induktion des myofibroblastischen Phänotypen.(TGFß1 = transformed growth factor ß1; GM-CSF = germcell-colonie stimulating factor; ECM = extracellular matrix; ED-A FN = Fibronectin)

• Abbildung 6: Versuchstiere in der tierexperimentellen Abteilung der Humboldt-Universität zu Berlin, Charité, Campus Virchow.

• Abbildung 7: Anatomische Studie am Hinterlauf des Schafes. Markiert sind die sich beim Schaf nur sehr dünn und flächig darstellenden Sehnenanteile der Mm. semitendinosus und gracilis (), sowie M. semimembranosus ( # ). In der Studie wurde daher die Sehne des M. flexor digitorum superficialis verwendet, die von der Achillessehne () umhüllt wird.

• Abbildung 8: Prüfung der Ausrißfestigkeit der eingebrachten 1,5 fachen Kirchheim-Kessler Sehnennaht.

• Abbildung 9: Vorspannung des Transplantates mit 60 Nm für ca. für 1 min.

• Abbildung 10: Schematische Darstellung des VKB-Ersatzes mittels Flexorsehne und Verankerung mit resorbierbaren Interferenzschrauben auf Gelenkniveau ( aus Weiler et al. 2002 (121) )

• Abbildung 11: Darstellung der Unterteilung der Quersschnittpräparate in eine subsynoviale, eine intermediäre und eine zentrale Zone zur Quantifizierung der Gefäßdichte und –verteilung (aus Unterhauser et al 2003 (115)).

• Abbildung 12: Makroskopische Kniegelenksaufnahme 6 Wochen nach VKB-Ersatzes mit Darstellung des Transplantates, umgeben von einem stark vaskularisierten Synovialschlauch.

• Abbildung 13: A.: 12 Wochen postoperativ zeigt sich das Transplantat noch diskret hypertroph vaskularisiert. B.: Nach 24 Wochen läßt sich das Transplantat (im Bild rechts dargestellt) nicht mehr vom nativen VKB (im Bild links dargestellt) unterscheiden ( aus Weiler et al 2002 (121) ).

• Abbildung 14: Transplantat, 6 Wochen nach VKB-Ersatz (Masson-Goldner Trichromfärbung (MG)): A: Hyperzellulärer Bindegewebsstrang (MG,400x) B: Fingerförmig einwachsender Bindegewebsstrang (MG, 100x) C: Gefäßdarstellung in einwachsendem Bindegewebsstrang (Immunhistochemie, F.VIII, 100x) ( je aus Weiler et al 2001 (122) ).

• Abbildung 15: Stark verdickte synoviale Deckschicht mit 5 - 8 Zelllagen, Transplantat 6 Wochen postoperativ (MG 200x).

• Graphik 1: Gesamtzellzahl/ mm² im VKB, der Flexorsehne, sowie dem Transplantat zu verschiedenen Standzeiten.

• Abbildung 16: A.: Natives vorderes Kreuzband unter polarisiertem Licht: Es imponiert eine hochfrequente, regelmäßige Kollagentertiärstruktur (polarisiertes Licht 200x). B.: Sehne des M. flexor digitorum superficialis unter polarisiertem Licht: Es läßt sich im Vergleich zum nativen VKB eine deutlich niederfrequente Kollagentertiärstruktur abbilden (polarisiertes Licht 200x).

• Abbildung 17: A/ B.: Nach 6 Wochen zeigt sich eine große Diversität der Kollagentertiärstruktur innerhalb eines Transplantates. Das Bandgewebe zeigt sich hinsichtlich seiner Kollagenstruktur sehr inhomogen. Es lassen sich in dieser frühen Remodelingphase neben neugebildetem hochfrequentem Granulationsgewebe (A) immer noch Abschnitte von avaskulärem und niedrigfrequentem “altem“ Transplantatgewebe (B) nachweisen. C.: Nach 9 Wochen zeigt sich das Kollagen zunehmend homogen und es läßt sich nur noch vereinzelt altes niedrigfrequentes Kollagengewebe der Flexorsehen nachweisen.

• Abbildung 18: A.: Nach 12 Wochen zeigt sich im Vergleich zum nativen VKB kein signifikanter Unterschied des Kollagencrimps bei jedoch noch deutlicher Irregularität. B.: Nach 24 Wochen steigt die Frequenz der Kollagenwellen weiter an und ist signifikant kürzer als im nativen VKB, sowie nach 9 und 12 Wochen.

• Abbildung 19: A.: Nach 52 Wochen zeigt sich eine homogene hochfrequente Kollagenstruktur. B.: Nach 104 Wochen imponiert weiterhin eine hochfrequente Kollagenstruktur mit signifikant geringerem Wellenabstand im Vergleich zum nativen VKB.

• Graphik 2: Graphische Darstellung der Kollagenwellenlänge (Crimp)

• Abbildung 20: A.: Die immunhistologische Färbung des nativen vorderen Kreuzbandes zeigt F. VIII (von Willebrandt Faktor) positive Gefäßendothelzellen. Die Gefäße liegen in bindegewebigen Septen von den regelmäßig geformten Kollagenfasern getrennt (100x). B.: Darstellung der Gefäßquerschnitte in der Sehne des M. flexor digitorum superficialis zum Zeitpunkt Null. Die Immunhistologische Anfärbung von F. VIII zeigt nur vereinzelte Gefäßquerschnitte umhüllt von dünnen bindegewebigen Membranen zwischen den Kollagenfaszikeln (100x) (aus Unterhauser et al 2003 (115) ).

• Abbildung 21: A.: Signifikant erhöhte Gefäßdichte der subsynovialen und intermediären Schichten nach 6 Wochen (Immunhistologie F.VIII 50x). B./ C.: Hypervaskularität der synovialen Deckzellschicht mit Gefäßen die in bindegewebigen Septen von Peripher nach Zentral einziehen (Immunhistologie F.VIII 200x)

• Abbildung 22: A.: Synoviale und subsynoviale Hypervaskularität 9 Wochen nach VKB-Ersatz. (Immunhistologische Färbung F.VIII, 50x) B: Hypervaskularisierung des Transplantates nach 9 Wochen bis in die zentralen Anteile (Immunhistologische Färbung F.VIII, 200x)

• Abbildung 23: A.: Nach 12 Wochen zeigt sich eine deutlich reduzierte Vaskularität der subsynovialen Schicht, im Vergleich mit den 6 und 9 Wochen Präparaten. Es formieren sich erstmalig bindegewebige Septen, welche die Gefäße von den kollagenen Fasern trennen (Immunohistochemie Faktor VIII, 200x). B.: Nach 24 Wochen sind alle Gefäße vollständig von einer bindegewebigen Hülle umschlossen und gänzlich von den kollagenen Fasern getrennt. Bis auf die zentrale Schicht sind Gesamtzellzahl und Gefäßstatus des nativen vorderen Kreuzbandes erreicht (Immunohistochemie Faktor VIII, 200x) (aus Unterhauser et al 2003 (115) ).

• Graphik 3: Darstellung der Gefäßdichte in den drei verschiedenen Zonen (subsynovial, intermediär und zentral) des nativen VKB, dem Transplantat zum Zeitpunkt 0 (Flexorsehne), sowie dem Transplantat zu den verschiedenen Explantationszeitpunkten (6-104 Wochen). Es zeigt sich ein deutlicher Rückgang der initial nach 6 Wochen massiven Gefäßexpression über die Zeit. Nach 24 Wochen erreicht das Transplantat subsynovial und intermediär bereits wieder eine dem nativen VKB vergleichbare Gefäßdichte und nach 52 Wochen ist der vaskuläre Status des nativen VKB vollständig erreicht und ändert sich auch nach 104 Wochen nicht mehr signifikant. Die Graphik zeigt weiterhin eine Revaskularisierungskinetik von peripher nach zentral ( signifikant gegenüber VKB, p= ≤ 0,05; signifikant gegenüber Flexorsehne, p= ≤ 0,05)

• Abbildung 24: A.: Nach 52 Wochen hat das Transplantat den Gefäßstatus des vorderen Kreuzbandes erreicht (Immunhistochemie, F.VIII, 200x). B.: Nach 104 Wochen läßt sich keine weitere Veränderung der Vaskularität im Vergleich zum nativen VKB nachweisen (Immunhistochemie, F.VIII, 200x) (aus Unterhauser et al 2003 (115) ).

• Abbildung 25: A.: Die immunhisto-chemische Färbung des intakten VKB zeigt ASMA-positive Myofibroblasten. Die Myofibroblasten sind ungleichmäßig verteilt und weisen eine ovoide Zellform auf (Immunhistologie, ASMA 200x, polarisiertes Licht). B.: Die Myofibroblasten der Flexorsehne weisen einen fusiformen Zellkern auf und sind gleichfalls unregelmäßig verteilt(Immunhistologie, ASMA 200x, teil-polarisiertes Licht) (Weiler et al 2002 (123) )

• Abbildung 26: A.: Nach 6 Wochen zeigt sich eine deutliche Myofibroblastenexpression in einwachsendem Granulationsgewebe). Es zeigt sich deutlich eine Degradation der Kollagenfasern und ihrer Tertiärstruktur, dem Kollagen-Crimp. Das alte, nicht remodelierte Bandgewebe weist vereinzelte Myofibroblasten auf (Pfeile) (Immunhistologie, ASMA 100x, teil-polarisiertes Licht.) B.: Die weitere Vergrößerung des einwachsenden Granulationsgewebes zeigt neu formiertes Kollagengewebe in dem spindelförmige Myofibroblasten nachgewiesen werden können (Pfeile). (Immunhistologie, ASMA 100x, teil-polarisiertes Licht) (aus Weiler et al 2002 (123) )

• Abbildung 27: A.: Bei immunhistologischer Färbung mit anti-α-smooth-muscle Aktin werden glatte Muskelzellen von Gefäßen dargestellt. B: In der unmittelbaren Umgebung von Gefäßen lassen sich Myofibroblasten nicht eindeutig von Perizyten unterscheiden (Immunhistochemie, F. VIII, 100x). C.: Nach 24 Wochen lassen sich Myofibroblasten aufgrund ihrer Morphologie von Perizyten und rein intraligamentärer Lage von glatten Gefäßmuskelzellen differenzieren (Immunhistochemie, F. VIII, 400x)

• Abbildung 28: A.: ASMA exprimierende Myofibroblasten konnten im Kollagenfaserverband nachgewiesen werden (24 Wochen ASMA, 400x) B: Sie zeigten sich longitudinal entlang der kollagenen Fasern orientiert (gleiches Präparat wie A, 400x, polarisiertes Licht)

• Abbildung 29: A.: Nach 52 Wochen stieg der Anteil der ASMA exprimierenden Myofibroblasten weiter an. Sie wiesen eine ovoide Zellform auf und waren weiterhin unregelmäßig verteilt (Immunhistochemie ASMA, 200x). B.: Nach 104 Wochen stieg der Anteil an Myofibroblasten im Vergleich zum nativen VKB weiter an. Die Zellen zeigten erneut eine ovoide Form (Immunhistochemie ASMA, 200x).