Urban, Jörg: Untersuchungen zur Regulation des Lipidstoffwechsels in Saccharomyces cerevisiae

Instititut für Biologie der Humboldt-Universität zu Berlin


D i s s e r t a t i o n
Untersuchungen zur Regulation des Lipidstoffwechsels in Saccharomyces cerevisiae

zur Erlangung des akademischen Grades doctor rerum naturalium (Dr. rer. nat.)

Mathematisch-Naturwissenschaftliche Fakultät I

Dipl. Biochemiker Jörg Urban,
geb. am 29. März 1968 in Hoyerswerda

Prof. Dr. Bernhard Ronacher

Gutachter:
1. Prof. Dr. Andreas Herrmann
2. Prof. Dr. Ralf Erdmann
3. Prof. Dr. Enno Hartmann

eingereicht: 01.06.2001
Datum der Promotion: 19.10.2001


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Zusammenfassung

Scs2p ist ein integrales Membranprotein des Endoplasmatischen Retikulums (ER), dessen Deletion zu einer geringeren Expression der Inositol-1-P Synthase INO1 in Inositol-freiem Medium führt und dessen Überexpression die Inositol-Auxotrophie eines Stammes mit einer defekten „unfolded protein response“ supprimiert. scs2 Mutanten weisen zudem eine erhöhte Sensitivität gegen Tunicamycin auf, eine Substanz, welche die N-Glykosylierung von Proteinen im ER inhibiert. Für die mutmaßlichen Orthologen von Scs2p in höheren Eukaryoten wurde eine Funktion dieser Proteine im vesikulären Transport postuliert.

In dieser Arbeit wurde Scs2p als mit Cue1p, einer Komponente der ER-assoziierten Proteindegradation, quervernetzbares Protein identifiziert, und daraufhin begonnen, die Funktion von Scs2p näher zu charakterisieren.

Eine Deletion von SCS2 hatte keinen Einfluß auf die bekannten Cue1p-abhängigen Degradationswege. Auch die Induktion der „unfolded protein response“ (UPR) infolge einer Akkumulation von falsch gefalteten Proteinen wurde durch eine Deletion von SCS2 nicht beeinträchtigt. Eine Beeinträchtigung des Transportes durch den sekretorischen Weg konnte in scs2 Hefen ebenfalls nicht nachgewiesen werden.

scs2 Mutanten zeigten eine generell verminderte Expression von Genen der Glycerolipid Biosynthese, deren Transkription über Ino2p/Ino4p reguliert wird. Dabei beeinträchtigte eine Deletion von SCS2 nicht die Induktion der UPR in Inositol-armem Medium und die darüber vermittelte Induktion der INO1 Expression. Ein analoger Phänotyp wurde auch in Mutanten beobachtet, in denen die Gene von Ubc7p, einer Komponente der ER-Degradation oder Lcb3p, einer Sphingosin-P Phosphatase, deletiert waren. Dabei bestand in bezug auf die Ino2p/Ino4p-abhängige Expressionsregulation keine epistatische Beziehung zwischen den drei Gendeletionen. Untersuchungen des Einflusses verschiedener Mutanten und Inhibitoren des Sphingolipid Stoffwechsels zeigten, daß Änderungen der Synthese von komplexen Sphingolipiden die Regulation der Inositol Synthese nur indirekt beeinflußten und gaben Hinweise auf eine Regulation des Glycerolipid Stoffwechsels durch Sphingosin.

scs2 Mutanten erwiesen sich als sensitiv gegen Inhibitoren der Sphingolipid Biosynthese. Untersuchungen von Stämmen, in denen verschiedene Gene der Sphingolipid Synthese deletiert wurden, sowie Analysen der Lipidzusammensetzung zeigten, daß in scs2 Zellen eine Regulation beeinträchtigt ist, welche die IPC Synthase Aktivität bei einem verringerten Sphingolipid Gehalt der Zelle erhöht.

Die geringere Expression von Genen der Glycerolipid Synthese und die niedrigere Kapazität zur Synthese von komplexen Sphingolipiden erwiesen sich als voneinander unabhängige Auswirkungen eines komplexen Phänotyps von scs2 Deletionsmutanten, wobei die primäre Funktion von Scs2p vermutlich nicht im Lipidstoffwechsel liegt.


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Abstract

Scs2p is an integral membrane protein of the endoplasmic reticulum (ER), whose deletion leads to a reduced expression of INO1 encoding inositol-1-phosphate synthase and whose over-expression suppresses the inositol auxotrophy of a strain with a defect unfolded protein response (UPR). scs2 mutants display an enhanced sensitivity to Tunicamycin, an inhibitor of protein N-glycosylation in the ER. It has been proposed that the putative orthologs of Scs2p in higher eukaryotes function in vesicular transport.

In this work Scs2p, which was identified as a protein that can be crosslinked to Cue1p, a protein involved in ER-associated protein degradation, was further characterised.

A deletion of SCS2 did not affect the known Cue1p-dependend degradation pathways. Cells lacking Scs2p normally induced the UPR upon an accumulation of misfolded proteins. An impairment of protein transport through the secretory pathway could also not be detected in scs2 cells. scs2 mutants displayed a generally reduced expression of genes involved in glycerolipid synthesis, whose transcription is regulated by Ino2p/Ino4p. The induction of the UPR in inositol-free medium and the subsequent upregulation of INO1 expression were not impaired in these cells. A similar effect was observed in strains lacking Ubc7p, a component of the ER -associated protein degradation system and in cells lacking the sphingoid base-1-phosphate phosphatase Lcb3p. Regarding the Ino2p/Ino4p-dependend gene expression no epistatic relationship was observed between Scs2p, Ubc7p and Lcb3p. An examination of the influence of various mutants and inhibitors of the sphingolipid pathway indicated that alterations of the synthesis of complex sphingolipids have only an indirect influence on the regulation of inositol synthesis and pointed towards a control of glycerolipid synthesis by sphingoid bases.

scs2 cells were found to be sensitive to inhibitors of sphingolipid biosynthesis. The examination of strains lacking various enzymes involved in sphingolipid synthesis and direct analysis of lipid composition showed that a deletion of SCS2 impairs an upregulation of IPC synthase activity under conditions where the sphingolipid content of the cell is diminished.

The reduced expression of genes involved in glycerolipid synthesis and the lower capacity for the synthesis of complex sphingolipids turned out to be mutually independent consequences of the complex phenotype of cells lacking Scs2p, whose primary function may not be in the lipid metabolism.


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Inhaltsverzeichnis

TitelseiteUntersuchungen zur Regulation des Lipidstoffwechsels in Saccharomyces cerevisiae
1 Einführung
1.1Das Endoplasmatische Retikulum
1.2Das ER-assoziierte Degradationssystem
1.3Scs2p
1.4Die „Unfolded Protein Response“
1.5Lipidstoffwechsel
1.5.1Der Lipidstoffwechsel der Hefe Saccharomyces cerevisiae
1.5.2Glycerophospholipide
1.5.3Sphingolipide
1.6Zielstellung
2 Materialien und Methoden
2.1Chemikalien und Medien
2.1.1Allgemeine Chemikalien
2.1.2Biochemikalien
2.1.3Enzyme, Kits und chromatographische Materialien
2.1.4Radiochemikalien
2.2Molekulargenetische Methoden
2.2.1DNA Techniken
2.2.1.1Allgemeine Arbeitstechniken
2.2.1.2Plasmidliste
2.2.2Hefegenetik
2.2.2.1Medien und allgemeine Methoden
2.2.2.2Konstruktion von Deletionsmutanten
2.2.2.3Stammliste
2.2.2.4Wachstumstests auf Platten
2.2.2.5Test auf das Überleben einer hohen Dosis von Tunicamycin
2.3Proteinbiochemische Methoden
2.3.1Allgemeine Methoden
2.3.2Quervernetzungs Experimente
2.3.3Untersuchungen von Scs2(DeltaT)p
2.3.4Reinigung von His6-Scs2(DeltaT)p aus Bakterienlysat
2.3.5Antikörper
2.3.5.1Affinitätsreinigung von Antikörpern
2.3.5.2Präparation von Antikörpersäulen
2.3.6Reinigung von Quervernetzungsprodukten von Cue1p
2.3.7„pulse-chase“ Experimente
2.3.8Untersuchung des Transportes von CPY und Gas1p durch den sekretorischen Weg
2.3.9Messung der beta-Galaktosidase Aktivität
2.4Analyse von mRNA
2.4.1Präparation von mRNA
2.4.2„Northern blot“ Analyse
2.4.3Messung der Expression von INO1 und OPI3 in Mutantenstämmen
2.4.4Einfluß von Inhibitoren des Lipidstoffwechsels
2.5Lipidanalytik
2.5.1Allgemeine Techniken
2.5.2Bestimmung des Gehalts an Sphingolipiden
2.5.3Analyse der Stabilität von Sphingolipiden
2.5.4Identifizierung der verschiedenen Lipide
2.5.5Bestimmung des Ceramidgehaltes
2.5.6Analyse des Lipidtransports in sec18-1 Stämmen
2.5.7Analyse der Zusammensetzung von GPI-Ankern
3 Ergebnisse
3.1Reinigung eines Kopplungsproduktes von Cue1p
3.1.1Vorversuche
3.1.2Identifizierung von Scs2p als Quervernetzungspartner von Cue1p
3.2Auswirkungen einer Deletion von SCS2 auf die Cue1p-abhängige Proteindegradation am ER
3.3Die „Unfolded Protein Response“ ist in scs2 Zellen nicht beeinträchtigt
3.4Notwendigkeit der Membranlokalisation von Scs2p für dessen Funktionalität
3.5Der Proteintransport durch den sekretorischen Weg ist in scs2 Stämmen nicht beeinträchtigt
3.6Die Einflüsse von Scs2p, UPR und ER-Degradation auf die Regulation des Glycerolipidstoffwechsels
3.6.1Mutationen in SCS2, UPR und CUE1/UBC7 bewirken additiv eine Inositol-Auxotrophie
3.6.2Die Deletion der Gene SCS2, HAC1 oder UBC7 verringert die Expression von INO1 und OPI3
3.7Der Einfluß von Scs2p auf den Sphingolipidstoffwechsel
3.7.1Die Deletion von SCS2 führt zu einer Sensitivität gegen Aureobasidin A
3.7.2Der Einfluß des potentiellen Homologen von Scs2p
3.7.3Deletionen von HAC1 oder UBC7 erhöhen nicht die Sensitivität gegen Aureobasidin A
3.7.4Die Auswirkungen von Veränderungen im Sphingosin-Phosphat Stoffwechsel
3.7.5scs2 Mutanten sind sensititv gegen Myriocin und Australifungin
3.7.6Ein erhöhter Ceramid Gehalt komplementiert nicht den scs2 Phänotyp
3.7.7Der Einfluß von Hydroxylasen des Sphingolipid Stoffwechsels
3.7.8Die Beziehung zwischen Sphingolipid- und Glycerolipid- Stoffwechsel
3.7.9Die Auswirkungen eines Fehlens der Sphingolipid Hydrolase
3.7.10Die Auswirkungen einer erhöhten Expression von Scs2p
3.8Die Lipidzusammensetzung von scs2 Zellen
3.8.1Der Sphingolipidgehalt
3.8.2Der Ceramidgehalt von scs2 Zellen
3.8.3Die Auswirkungen einer Deletion von SCS2 auf den Transport von Ceramid zwischen ER und Golgi Apparat
3.8.4Der Einbau von Ceramid in GPI-geankerte Proteine ist in scs2 Zellen nicht beeinträchtigt
4 Diskussion
4.1Einfluß einer Deletion von SCS2 auf ER-Degradation, „Unfolded Protein Response“ und den vesikulären Transport durch den sekretorischen Weg
4.2Die Regulation des Glycerolipid Stoffwechsels
4.3Der Einfluß von Scs2p auf den Sphingolipid Stoffwechsel
4.4Der Einfluß des Sphingolipid Stoffwechsels auf die Regulation der Glycerolipid Synthese
4.5Zur Funktion von Scs2p
4.6Überlegungen zur Untersuchung einer möglichen Steuerung des Glycerolipid Stoffwechsels durch Sphingosin
Bibliographie Literaturverzeichnis
Abkürzungsverzeichnis Abkürzungsverzeichnis
Danksagung
Lebenslauf
Anhang A Publikationen
Selbständigkeitserklärung

Tabellenverzeichnis

Tabelle 1: Plasmidliste
Tabelle 2: Stammliste

Abbildungsverzeichnis

Abb. 1: Schematische Darstellung der Synthesewege von Glycero- und Sphingolipiden in S. cerevisiae. Abkürzungen: siehe Text; ADHAP 1-Acyl-Dihydroxyaceton-Phosphat; Cho Cholin; Etn Ethanolamin; Gro Glycerol; Ino Inositol; LPA Lysophosphatidat; PIP,PIP2 Phosphoinositide
Abb. 2: Darstellung des Sphingolipidstoffwechsels von S. cerevisiae sowie der Wirkorte von Inhibitoren verschiedener Schritte der Sphingolipidsynthese
Abb. 3: A Aufreinigung von Kopplungsprodukten einer glykosylierten Variante von Cue1p (mit Coomassie gefärbtes Gel). Aus der oberen Bande wurden Peptide gewonnen und ansequenziert, wodurch Scs2p als Quervernetzungspartner von Cue1p identifiziert wurde. B Sowohl Cue1p als auch Scs2p ergeben bei Behandlung mit BMH ein ca. 70 kDa großes Kopplungsprodukt, welches in scs2 bzw. cue1 Stämmen abwesend ist.
Abb. 4: A Die Deletion von SCS2 komplementiert nicht die Temperatursensitivität von sec61-2 Zellen. B Sec61-2p ist in scs2 Zellen im Gegensatz zu cue1 Mutanten nicht stabilisiert. C Die Deletion von SCS2 hat keinen Einfluß auf die Abbaurate von CPY* in wt und UBC7SER Stämmen (Bezeichnung des mutierten Allels von CPY: prc1-1).
Abb. 5: A Die Deletion von SCS2 in wt, hac1 und ire1 Zellen führt zu einer erhöhten Sensitivität dieser Stämme gegenüber Wachstum auf Tunicamycin-haltigem Medium. B Überlebensrate von Zellen nach einer kurzen Behandlung mit hohen Konzentrationen an Tm (10µg/ml). scs2 Zellen sind, im Gegensatz zu Mutanten mit einer defekten „unfolded protein response“, nicht sensitiv gegenüber einer akuten Behandlung mit Tm. C Nachweis einer Epitop-markierten Form von Hac1p im Immunoblot (* Nebenbande des Anti-HA Antikörpers). Die Bildung von 6xHA-(Hac1-i)p nach Induktion mit Tm ist in scs2 Mutanten nicht verändert.
Abb. 6: Immunoblot Analysen mit Anti-Scs2 Antikörpern. A Verteilung von Scs2p und Scs2(DeltaT) zwischen Pellet (P) und Überstand (Üb). B Vergleich des Laufverhaltens von Scs2p und Scs2(DeltaT)p im SDS-PAGE mit dem von rekombinant hergestelltem Scs2(DeltaT)p. C Analyse der Quervernetzungsprodukte (BMH) von nativem Scs2p und mutierten Varianten, in denen die beiden Cysteine durch Valin ersetzt wurden.
Abb. 7: A Inositol-Abhängigkeit von Hefen mit Deletionen in SCS2, HAC1 und UBC7. B „Northern blot“ Analyse der Expression von INO1, OPI3 und HAC1 in Zellen mit Deletionen in SCS2 und UBC7, die in Inositol-armem Medium kultiviert wurden. C Expression von OPI3 bei Supplementation des Mediums mit 75µM Inositol.
Abb. 8: A Abhängigkeit von Stämmen mit Deletionen der Gene SCS2, INO2 und INO4 von der Zugabe von Inositol und Cholin zum Medium. B Sensitivität dieser Stämme gegen Aureobasidin A (AbA) in mit 1mM Cholin und 75µM Inositol supplementiertem Medium.
Abb. 9: Die Deletion von Ybl091c-a, einer Sequenz mit Homologie zu SCS2, beeinflußt weder die Inositol-Abhängigkeit noch die AbA-Sensitivität von wt und scs2 Zellen.
Abb. 10: Die Deletion von LCB3 verstärkt die Inositol-Abhängigkeit und AbA-Sensitivität von scs2 Zellen. Eine zusätzliche Deletion von LCB4 komplementiert den lcb3 Phänotyp.
Abb. 11: A scs2, lcb3 und hac1 Deletionen erhöhen additiv die Abhängigkeit von dem Medium zugesetztem Inositol. B „Northern blot“ Analyse der Expression von INO1, OPI3 und KAR2 sowie der Prozessierung von HAC1. Die Quantifizierung zeigt die Expressionshöhe relativ zu Aktin (ACT1) und zum wt Wert (Mittelwert aus zwei Experimenten mit gleichartigem Ergebnis).
Abb. 12: Das Fehlen der Sphingosin-P Lyase Dpl1p führt nicht zu einer erhöhten Inositol-Abhängigkeit von scs2 Zellen.
Abb. 13: Vergleich der Sensitivität von scs2 und lcb3 Mutanten gegen Inhibitoren der Sphingosin (Myriocin) bzw. Ceramid Synthese (Australifungin).
Abb. 14: A Ein Fehlen der beiden Ceramidasen Ypc1p und Ydc1p führt nicht zu einer veränderten Inositol-Abhängigkeit oder AbA-Sensitivität. B Einfluß der Abwesenheit der Ceramidasen auf die Expressionshöhe von INO1 und OPI3 in Inositol-armem Medium (Mittelwert von zwei Experimenten).
Abb. 15: A Inositol-Abhängigkeit und AbA-Sensitivität von Stämmen mit Deletionen in SCS2, SUR2 und SCS7. B Expression von INO1 und OPI3 in diesen Stämmen nach Wachstum in Inositol-armem Medium.
Abb. 16: „Northern blot“ Analyse der Expression von INO1 und OPI3 sowie der Prozessierung der HAC1 mRNA in Wildtyp Zellen in Gegenwart von Inhibitoren der Sphingolipid Biosynthese. Die Zunahme der INO1 sowie die Abnahme der OPI3 Expression in unbehandelten Zellen wird durch die Wachstumsphase bedingt.
Abb. 17: A Die Deletion der Sphingolipid Hydrolase Isc1p hat keinen Einfluß auf Inositol-Abhängigkeit und AbA-Sensitivität von scs2 und hac1 Stämmen. B Eine Expression von Isc1p von einem „multi-copy“ Plasmid (ISC1mc) verändert die Inositol-Abhängigkeit von scs2, hac1 oder scs2 hac1 Zellen nicht.
Abb. 18: Die zusätzliche Expression von Scs2p von einem „single-copy“ Plasmid (SCS2sc) verringert die Inositol-Abhängigkeit von hac1 und hac1 lcb3 Stämmen.
Abb. 19: scs2 Zellen weisen nach Wachstum in Inositol-freiem Medium einen geringeren Gehalt an Sphingolipiden relativ zu den gesamten Phospholipiden auf als wt Zellen. In mit Inositol supplementiertem Medium ist der Anteil der Sphingolipide in wt und scs2 Zellen vergleichbar.
Abb. 20: scs2 Zellen zeigen nach Behandlung mit intermediären Konzentrationen an AbA (9ng/ml) eine stärkere Abnahme ihres Sphingolipidgehaltes als wt Zellen (Mittelwert zweier Experimente).
Abb. 21: Stabilität von Sphingolipiden bei vollständiger Inhibition der IPC Synthese durch hohe Konzentrationen an Aureobasidin A (1µg/ml) (Doppelbestimmung).
Abb. 22: Analyse der mit 3H-Serin markierten Sphingolipide von Stämmen mit Deletionen in den Genen SCS2, SUR2 (Sphinganin Hydroxylase) und SCS7 (Ceramid Hydroxylase). * und ** bezeichnen in der Literatur nicht beschriebene Substanzen. sur2 Stämme enthalten neben Cer-B (wird durch * verdeckt) auch Cer-A in einer höheren Konzentration. Zuordnung der Lipide nach .
Abb. 23: Analyse des Cer-C Gehaltes relativ zu komplexen Sphingolipiden in wt, scs2 und lcb3 Hefen nach Wachstum in Inositol-freiem bzw. Inositol-reichem Medium.
Abb. 24: Synthese von Sphingolipiden in sec18-1 bzw. sec18-1 scs2 Zellen unter permissiven (25°C) und nicht-permissiven Bedingungen (38°C).
Abb. 25: Analyse der mit 3H-Inositol markierten Spaltprodukte von GPI-Ankern aus wt und scs2 Zellen. Zum Vergleich dienen Lipide aus wt und scs7 Zellen.

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