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Kapitel 1. Einführung

1.1 Das Endoplasmatische Retikulum

Eine der wesentlichen Neuerungen eukaryotischer gegenüber prokaryotischen Zellen ist die Entwicklung spezieller Membranen mit stark unterschiedlicher Lipidzusammensetzung und dementsprechend abweichenden biophysikalischen Eigenschaften. Dies sind insbesondere die innere Mitochondrienmembran, über die der elektrochemische Gradient für die respiratorische ATP Synthese gebildet wird, die Plasmamembran, die die Abgeschlossenheit der Zelle nach außen gewährleistet, und die Membran des Endoplasmatischen Retikulums (ER). Letztere bildet ein Kompartiment, das (abgesehen von weiteren Aufgaben wie z.B. der Bildung der Kernmembran) für zwei zentrale zelluläre Funktionen verantwortlich ist. Zum einen erfolgt hier die Translokation, Modifikation, Faltung und Assemblierung von Proteinen, die für den sekretorischen Weg bestimmt sind. Zum anderen ist der Hauptteil der Synthese von Glycerolipiden und Steroiden sowie die Synthese der Vorstufen komplexer Sphingolipide am ER und in damit assoziierten Lipidkörpern lokalisiert. Das Endoplasmatische Retikulum ermöglicht der Zelle, die Translokation und Reifung von Proteinen, die für die Plasmamembran und den extrazellulären Raum bestimmt sind, in einem internen Kompartiment ablaufen zu lassen. Auf diese Weise können Eukaryoten eine dickere und weniger permeable Außenmembran aufrechterhalten, die von einer Vielzahl von Funktionen befreit wird, und größere Zellen mit einem geringeren Verhältnis der Oberfläche zum Volumen bilden. Zwischen ER und Plasmamembran befinden sich der Golgi Apparat und das endosomale System, in denen durch Lipidstoffwechsel und gerichtete Transportprozesse die Lipidzusammensetzung der Membran verändert wird, während gleichzeitig Proteine modifiziert und sortiert werden. Angesichts der hohen Transportrate des sekretorischen Weges und des dynamischen Charakters einzelner Kompartimente ist eine komplizierte und koordinierte Regulation der protein - und lipidseitigen Prozesse erforderlich, damit die Zelle auf wechselnde Wachstumsbedingungen und Streßsituationen reagieren kann. Ohne eine genaue Kenntnis des Stoffwechsels der beteiligten Lipide läßt sich daher kein grundlegendes Verständnis der Funktionsweise des sekretorischen Weges gewinnen.

1.2 Das ER-assoziierte Degradationssystem

Ausgangspunkt dieser Arbeit war das Interesse unserer Arbeitsgruppe an der sogenannten ER-assoziierten Protein Degradation (ERAD). Um seine Funktionsfähigkeit unter Streßbedingungen aufrechtzuerhalten, besitzt das Endoplasmatische Retikulum eine Qualitätskontrolle, welche die korrekte Reifung von Proteinen überwacht. Diese erkennt

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Kennzeichnend für dieses Abbausystem ist dessen Abhängigkeit von Ubiquitin konjugierenden Enzymen an der cytosolischen Seite der ER-Membran (in S. cerevisiae Ubc7p, Ubc6p und Ubc1p) . Das für diese Arbeit wichtige Ubc7p bindet über ein integrales Membranprotein (Cue1p) an das ER und ist zusammen mit diesem notwendig für einen Großteil der Degradation von lumenalen und integralen Substraten. Darüber hinaus werden am endoplasmatischen Retikulum unter Beteiligung von Cue1p und Ubc7p auch cytosolische Substrate degradiert . Anhand der Mitwirkung weiterer Proteine (Ubc6p, Hrd1p, Hrd3p, Der1p) lassen sich verschiedene Wege der ER-Degradation unterscheiden.

Bei der Suche nach potentiellen neuen Komponenten der ER-Degradation bzw. nach Funktionen dieses Abbauweges im Zusammenhang mit anderen Aufgaben des Endoplasmatischen Retikulums wurde Scs2p als mit Cue1p quervernetzbares Protein identifiziert und daraufhin begonnen, dieses Protein näher zu charakterisieren.

1.3 Scs2p

SCS2 wurde erstmals beschrieben als ein Gen, dessen verstärkte Expression es einem Stamm mit einer nicht näher charakterisierten dominanten Mutation (CSE1) ermöglicht, in einem Medium zu wachsen, daß Cholin, nicht aber Inositol enthält. CSE1 Hefen werden Inositol-auxotroph, wenn dem Medium Cholin zugesetzt wird (SCS bedeutet daher: „suppressor of cholin sensitivity of CSE1“) . Die Überexpression von Scs2p supprimierte zudem die Inositol-Auxotrophie eines Stammes mit einem mutierten Allel von HAC1, einer Komponente der „unfolded protein response“ (siehe unten) . Das SCS2 Gen erwies sich als nicht-essentiell. scs2 Mutanten zeigten jedoch ein eingeschränktes Wachstum in Abwesenheit von Inositol. Dementsprechend war in Inositol-freiem Medium die Expression des geschwindigkeitsbestimmenden Enzyms der zellulären Inositol Synthese, der Inositol-1-P Synthase Ino1p, in scs2 Zellen verringert (siehe unten).

Bei der weiteren Charakterisierung wurde gezeigt, daß eine starke Überexpression von SCS2 von einem „multi-copy“ Plasmid das Wachstum der Hefen beeinträchtigt. Antikörper gegen Scs2p erkannten im SDS-PAGE eine Bande von 35 kDa. Die Lokalisierung von Scs2p ergab, daß dieses über eine hydrophobe Aminosäuresequenz am C-Terminus in der ER-

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Der aminoterminale Bereich von Scs2p enthält einen Abschnitt von 16 Aminosäuren (37-52), der in einer Reihe eukaryotischer Proteine konserviert ist. Dazu gehören Vertreter in Schizosaccharomyces pombe, Caenorhabditis elegans, Arabidopsis thaliana, Aplysia californica und Homo sapiens . Bei den meisten dieser Proteine ist auch der C-terminale Membrananker vorhanden. Darüber hinaus besitzen sie nahe am C-Terminus eine als „coiled-coil“ Domäne bezeichnete Folge von Aminosäuren, die jedoch in Scs2p fehlt. Eine solche Sequenz findet man z.B. bei den sogenannten SNARE Proteinen, die an der Fusion von Vesikeln beteiligt sind. Sowohl für VAP-33, das Homologe von Scs2p in Aplysia, als auch für die beiden in Säugerzellen vorkommenden Varianten VAP-A und VAP-B ist eine Interaktion mit VAMP, einem v-SNARE, gezeigt worden . Die Injektion von Antikörpern gegen mutmaßliche Homologe von Scs2p in verschiedene Zellen führte zu einer Beeinträchtigung unterschiedlicher Schritte des vesikulären Transportes . Im Gegensatz zu diesen Daten war in scs2 Hefen der Transport eines sekretierten Proteins (Invertase, Suc2p) vom ER zur Plasmamembran unverändert .

Das Genom von Saccharomyces cerevisiae enthält einen DNA Bereich (ybl091c-a), dessen translatierte Aminosäuresequenz eine Homologie zu SCS2 aufweist (35% über 149 Aminosäuren). Dabei sind sowohl der konservierte Bereich von 16 Aminosäuren als auch der C-terminale Membrananker vorhanden. Die Sequenz enthält aber weder ein Startkodon in dem entsprechenden Leserahmen, noch wurden Hinweise auf das Vorhandensein eines Introns gefunden . Bei einer Analyse des gesamten Genoms auf Genexpression (SAGE) zeigte sich, daß dieser DNA-Bereich transkribiert wird (Saccharomyces Genome Database; SGD). Daher ist unklar, ob es sich hierbei um ein Pseudogen handelt oder ob durch eine Reifung des Transkriptes ein translatierbarer Leserahmen entsteht.

1.4 Die „Unfolded Protein Response“

Bei ihrer Charakterisierung von Scs2p erwähnten die Autoren auch, daß scs2 Mutanten sensitiv gegen Tunicamycin (Tm) sind. Tm ist ein Inhibitor der Dolichol-P-(N-acetyl)glucosamin Synthase, der die N-Glykosylierung von Proteinen im ER verringert. Das führt, wie zum Beispiel auch eine Störung der Redoxbedingungen im ER durch DTT, zu einer Akkumulation falsch gefalteter Proteine im Lumen dieser Organelle.

Ein wichtiger Mechanismus zur Gewährleistung einer Toleranz des ER gegen derartige Streßbedingungen ist die sogenannte „unfolded protein response“ (UPR) . Damit bezeichnet man ein Signalsystem, das Streßbedingungen im ER erkennt und daraufhin die Synthese einer Reihe von Proteinen induziert. Darunter befinden sich verschiedene Chaperone des ER und Komponenten der ER-Degradation wie auch Enzyme, die an der Biosynthese von Lipiden beteiligt sind .

Die Hauptkomponenten dieses Systems in S. cerevisiae sind Ire1p, ein Transmembranprotein mit Kinase- und Ribonuklease-Aktivität, die tRNA-Ligase Rlg1p und der Transkriptionsfaktor Hac1p, der über die Bindung an eine UPRE („Unfolded Protein Response Element“) genannte DNA-Sequenz die Expression der Zielproteine steuert. Wenn Ire1p durch Streßbedingungen aktiviert wird, schneidet es aus dem 3' Bereich der HAC1 mRNA (HAC1-u) ein 252 bp großes Intron heraus, woraufhin Rlg1p die verbliebenen Teile zu einer verkürzten mRNA (HAC1-i) ligiert. Dadurch verändert sich zum einen die Aminosäuresequenz, für welche die jeweiligen Transkripte kodieren, zum anderen blockiert die Intronsequenz die Translation der nicht prozessierten mRNA, so daß (Hac1-u)p nur in Spuren synthetisiert wird .

Die Mechanismen der Aktivierung von Ire1p sind nicht genau charakterisiert. Die Bindung von Hsp70 (BiP, Kar2p) an die lumenale Domäne von Ire1p verhindert vermutlich die Dimerisierung und Selbstaktivierung dieses Sensorproteins. Als Folge einer Akkumulation falsch gefalteter Proteine im Lumen des ER verringert sich die Konzentration des für eine Bindung an Ire1p zur Verfügung stehenden nicht an falsch gefaltete Proteine gebundenen Kar2p, wodurch die „unfolded protein response“ ausgelöst wird .

Neben den oben genannten Streßfaktoren aktiviert auch das Wachstum in Inositol-freiem Medium die UPR, wozu ebenfalls die Ire1p-abhängige Prozessierung der HAC1 mRNA erforderlich ist . Das Wachstum in Inositol-freiem Medium führt möglicherweise zu einem geringeren Verhältnis von Phospholipid zu Protein und damit zu einer erhöhten Dichte des Endoplasmatischen Retikulums.

1.5 Lipidstoffwechsel

1.5.1 Der Lipidstoffwechsel der Hefe Saccharomyces cerevisiae

Da aus vorhergehenden Untersuchungen bekannt war, daß die Regulation der Glycerophospholipid Biosynthese in Abwesenheit von Scs2p beeinträchtigt ist, wurde der Einfluß dieses Proteins auf den Lipidstoffwechsel näher charakterisiert. Dabei stellte sich heraus, daß eine Deletion dieses Proteins auch die Synthese von Sphingolipiden beeinflußt.

Molekularbiologie und Biochemie des Lipidstoffwechsels von Saccharomyces cerevisiae sind vergleichsweise gut untersucht. Dies beruht unter anderem auf der einfachen gene

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Die Charakterisierung der Sphingolipid Biosynthese und der physiologischen Funktionen dieser Lipide wurde erst vor relativ kurzer Zeit begonnen. Dabei wurden viele der an dieser Synthese beteiligten Gene zuerst in S. cerevisiae beschrieben. Neben der Suche nach weiteren Komponenten sind die Kompartimentierung der Sphingolipidsynthese und die Regulation der Aktivität dieses Stoffwechselweges von Interesse für das Verständnis der Funktionsweise des sekretorischen Weges. Zudem spielen Zwischenprodukte dieses Syntheseweges eine wichtige Rolle in der zellulären Signaltransduktion . Die Arbeit in dem verhältnismäßig leicht manipulierbaren Hefesystem eröffnet die Möglichkeit, grundlegendes zellbiologisches Wissen über diese Klasse von Lipiden zu erlangen.

1.5.2 Glycerophospholipide

Glycerophospholipide bestehen aus dem lipophilen Molekülteil Diacylglycerol (DAG) und einer polaren Kopfgruppe, in der eine hydrophile Verbindung über einen Phosphodiester an die sn-3 Hydroxylgruppe des Glycerols gebunden ist. Die wichtigsten Verbindungen sind Phosphatidat (PA, DAG-P), Phosphatidylinositol (PI), Phosphatidylserin (PS), Phosphatidylethanolamin (PE) und Phosphatidylcholin (PC). Darüber hinaus gibt es die vorwiegend in Mitochondrien-Membranen vorhandenen Lipide Phosphatidylglycerol-P (PG-P), Phosphatidylglycerol (PG) und Cardiolipin (CL). Die Zusammensetzung der Fettsäuren in Glycerolipiden der Hefe ist vorrangig C_16-18 bei einem hohen Anteil einfach ungesättigter Fettsäuren in der sn-2 Position. Im Gegensatz zu tierischen Zellen enthalten Lipide von S. cerevisiae keine Alkylether. Der Anteil einzelner Glycerolipide variiert bei verschiedenen Wachstumsbedingungen stark. Insbesondere enthalten Hefen bei Zugabe einer hohen Menge Inositol (75µM) zum Medium wesentlich mehr PI (ca. 25%) als bei Wachstum in Inositol-freiem Medium (ca. 7,5%) . Abbildung 1 zeigt eine schematische Darstellung des Glycerolipid Stoffwechsels und seiner Beziehungen zur Sphingolipid Synthese. Eine allgemeine Einführung zum Lipidstoffwechsel in S. cerevisiae findet sich in .

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Abb. 1: Schematische Darstellung der Synthesewege von Glycero- und Sphingolipiden in S. cerevisiae. Abkürzungen: siehe Text; ADHAP 1-Acyl-Dihydroxyaceton-Phosphat; Cho Cholin; Etn Ethanolamin; Gro Glycerol; Ino Inositol; LPA Lysophosphatidat; PIP,PIP₂ Phosphoinositide

Phosphatidat (PA; Diacylglycerol-Phosphat, DAG-P), das aus Glycerol-P oder Dihydroxyaceton-P und Acyl-CoA hergestellt wird, nimmt eine zentrale Position in der gesamten Glycerolipid Synthese ein. Konkurrierende Prozesse wandeln PA entweder in CDP-DAG, die Vorstufe des Hauptsyntheseweges, oder in DAG als Ausgangsstoff des sogenannten „Kennedy-Pathways“ um. Aus CDP-DAG werden in S. cerevisiae mit Inositol und Serin die beiden Produkte PI und PS hergestellt, wobei die Anteile dieser konkurrierenden Reaktionen durch die Verfügbarkeit von Inositol und eine komplexe Regulation der Expression und Enzymaktivität der PS Synthase bestimmt werden. PS wird anschließend durch Decarboxylierung in PE umgewandelt, aus dem durch Methylierung in zwei Schritten PC synthetisiert wird. In dem „Kennedy-Pathway“ werden Ethanolamin und Cholin phosphoryliert, in CDP-Ethanolamin bzw. CDP-Cholin umgewandelt und anschließend zur Synthese von PE bzw PC aus DAG verwendet. Cholin kann dabei aus der Hydrolyse von PC durch die im Golgi Apparat und endosomalen Kompartiment vorhandene Phospholipase D, Ethanolamin aus der Spaltung von Sphingosin-P durch die Sphingosin-P Lyase stammen. Außerdem können beide Substanzen aus dem Medium aufgenommen werden.

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Die Biosynthese von Glycerolipiden wird in Abhängigkeit von der Verfügbarkeit von Inositol und Cholin über die Transkriptionsfaktoren Ino2p und Ino4p reguliert . Diese binden als Heterodimer an ein UAS INO genanntes Element in den Promotoren vieler am Stoffwechsel beteiligter Gene. Die Zugabe von Inositol (>15µM) zum Kulturmedium führt zu einer Repression der Transkription dieser Gene. Die zusätzliche Zugabe von Cholin verstärkt diese Repression, während ein Zusatz von Cholin allein ohne Effekt bleibt. Dabei wird die Expression des INO1 Gens, welches für die Inositol-1-Phosphat Synthase kodiert, über einen weiten Bereich reguliert (50fach), während die meisten anderen Gene von Enzymen der Glycerolipid Synthese eine hohe basale Expression aufweisen und koordiniert um den Faktor 2-3 reguliert werden. Stellvertretend für letztere Gruppe wurde in dieser Arbeit die Genexpression der Phosholipid-N-Methyltransferase Opi3p analysiert.

Die Mechanismen der Ino2p/Ino4p-abhängigen Transkriptionsregulation und die damit verbundenen Signaltransduktionswege sind nur teilweise bekannt. Es wird vermutet, daß die sogenannte Cholin-Repression von der Konzentration eines Zwischenmetabolites der Glycerolipid Biosynthese (z.B. PA oder DAG) abhängt . Die Inositol-Repression erfordert die Aufnahme von Inositol in die Zelle und beruht möglicherweise auf einer direkten Messung des PI Gehaltes der Zelle . Es wurde gezeigt, daß die Aktivierung eines Kinasekomplexes, der die Proteine Snf1p und Snf4p enthält (die Hefehomologen der AMP-abhängigen Kinase), für die Derepression der Inositol Synthese erforderlich ist. Ein Komplex der Phosphatase 1 (Glc7p) mit einer seiner regulatorischen Untereinheiten (Reg1p) deaktiviert den Snf1p/Snf4p-Komplex. In reg1 Deletionsmutanten ist die Expression von Genen der Glycerolipid Biosynthese daher konstitutiv dereprimiert .

Außer von der Verfügbarkeit der Vorstufen Inositol und Cholin wird die Ino2p/Ino4p-abhängige Transkription auch von Wachstums- und Streßbedingungen beeinflußt.

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Eine mögliche Erklärung der Wirkungsweise der Ino2p/Ino4p-abhängigen Regulation besteht darin, daß eine höhere Verfügbarkeit von Inositol (und unter bestimmten Bedingungen Cholin) zu einer insgesamt erhöhten Synthese von Glycerolipiden führt. Daher reprimiert die Zelle bei einer externen Zugabe von Inositol nicht nur die zelluläre Inositol Synthese, sondern reduziert auch die Proteinmenge von vielen weiteren an diesem Stoffwechselweg beteiligten Enzymen. Der Grund dafür dürfte in den Enzymeigenschaften der Proteine liegen, die Reaktionen an den beiden Hauptverzweigungspunkten des Glycerolipid Stoffwechsels (PA CDP-DAG / DAG und CDP-DAG PI / PS) katalysieren. Eine Aktivierung der Ino2p/Ino4p-abhängigen Transkription durch die UPR führt in einem solchen System sowohl zu einer höheren PI Konzentration in der Membran als auch zu einem höheren Phospholipidgehalt der Zelle, wobei möglicherweise beide Veränderungen helfen, Streßbedingungen im sekretorischen Weg zu reduzieren. Dabei könnte es eine Rolle spielen, daß PI ein Ausgangsprodukt für die Synthese von Phosphoinositiden ist, denen wiederum eine sehr wesentliche Funktion bei dem vesikulären Transport vom trans-Golgi zur Vakuole oder zur Plasmamembran zukommt . Die Auswirkungen einer Zugabe von Inositol zum Medium auf das Verhältnis von Phospholipiden zu Proteinen in S. cerevisiae wurde jedoch noch nicht untersucht.

Abgesehen davon gibt es weitere Regulationsmechanismen des Glycerolipid Stoffwechsels. So ist vorgeschlagen worden, daß die zelluläre Konzentration an CTP die Synthese der zentralen Metabolite CDP-DAG, CDP-Ethanolamin und CDP-Cholin steuert, wobei die CTP Synthase von Proteinkinase C reguliert wird . Dies könnte ein Mechanismus für die Koordination von Wachstumsrate und Glycerolipid Biosynthese sein. Zudem beeinflußt das „Phospholipid Transfer Protein“ Sec14p, das am trans-Golgi lokalisiert ist, je nach gebundenem Lipid (PI bzw. PC) die Aktivität von Phospholipase D und „Kennedy-Pathway“ und steuert so das Verhältnis der beiden Lipide (Li et al., 2000.) .

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1.5.3 Sphingolipide

Abbildung 2 zeigt ein Schema des Sphingolipid Stoffwechsels in S. cerevisiae und nennt die derzeit bekannten Gene, deren Genprodukte an den einzelnen enzymatischen Reaktionen beteiligt sind, sowie den Wirkungsort einiger in dieser Arbeit verwendeter Inhibitoren. Zusammenfassende Darstellungen zu Sphingolipiden in Hefe finden sich in .

Sphingolipide setzen sich ebenso wie Glycerolipide aus einem überwiegend hydrophoben Molekülteil (Ceramid) und einer polaren Kopfgruppe zusammen. Bei Pilzen wie bei einem Teil pflanzlicher Sphingolipide basiert diese auf Inositol-Phosphat. Ceramide bestehen aus einem Sphingosin („sphingoid base“), dessen Aminogruppe in S. cerevisiae mit einer C₂₆-Fettsäure acyliert ist.

Der erste Schritt der Sphingolipid Biosynthese ist die Reaktion von Palmitoyl- bzw. Stearoyl-CoA mit Serin zu 3-Ketosphinganin , welches anschließend zu Sphinganin (Dihydrosphingosin, DHS) reduziert wird . Dieses wird zu 4-Hydroxy-Sphinganin (Phytosphingosin, PHS) hydroxyliert, auf dem die Sphingolipide von S. cerevisiae überwiegend basieren . Das ungesättige tierische Sphingosin kommt in Hefen nicht vor.

Die Synthese von Ceramid erfolgt durch die Spingosin-N-Acyltransferase, ein Enzym, das Hexacosyl-CoA (C₂₆-CoA) als Substrat verwendet und dessen Komponenten bisher nicht identifiziert werden konnten. In S. cerevisiae gibt es zwei Ceramidasen, die Ceramid zu Sphingosin und freien Fettsäuren hydrolysieren können, wobei sie eine leicht unterschiedliche Substratspezifität zeigen. Zumindest eines dieser Enzyme kann bei einem niedrigem Ceramidgehalt der Zelle auch die reverse Reaktion katalysieren . Ceramid wird in S. cerevisiae am C₂ der Acylgruppe hydroxyliert, wodurch das in komplexen Sphingolipiden vorrangig vorhandene Ceramid PHS-C₂₆OH (Cer-C) entsteht .

Aus Ceramid wird durch Übertragung einer Inositol-phosphoryl Gruppe von PI das kom-plexe Sphingolipid Inositol-Phosphoryl-Ceramid (IPC, IPC-C) synthetisiert , das dann mittels Übertragung eines Moleküls Mannose zu MIPC und anschließend durch einen weiteren Transfer von Inositol-phosphat zu M(IP)₂C weiter modifiziert wird. Über eine nicht näher charakterisierte Hydroxylierung, die durch Zugabe von Kupfer-Chelatoren zum Medium reduziert werden kann, entstehen die Nebenvarianten IPC-D und MIPC-D (Beeler, T. J. et al., 1997).

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Abb. 2: Darstellung des Sphingolipidstoffwechsels von S. cerevisiae sowie der Wirkorte von Inhibitoren verschiedener Schritte der Sphingolipidsynthese

LCB1/LCB2/TSC3	3-Ketosphinganin Synthase, Serin Palmitoyltransferase
TSC10	3-Ketosphinganin Reduktase
SUR2	Sphinganin C4 Hydroxylase
LCB4, LCB5	Sphingosin Kinasen
LCB3, YSR3	Sphingosin-1-Phosphat Phosphatasen
DPL1	Sphingosin-1-Phosphat Lyase
ELO2, ELO3	Komponenten der Fettsäure Elongasen für C18...C26-CoA
?	Ceramid Synthase, Sphingosin N-acyl tranferase
YPC1, YDC1	Ceramidasen
SCS7	Ceramid Hydroxylase
AUR1	Komponente der Ceramid Inositolphosphoryltransferase
CSG1, CSG2	notwendig für IPC Mannosyltransferase Aktivität
IPT1	MIPC Inositolphosphoryltransferase
ISC1	Sphingolipid-spezifische Phospholipase C

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Sphingosine können über eine Sphingosin Kinase in Sphingosin-P (DHS-P, PHS-P) metabolisiert werden , welches von einer Sphingosin-P Phosphatase wieder dephosphoryliert wird . Alternativ kann Sphingosin-P auch von einer Lyase in Hexanal (bzw. Hydroxy-Hexanal) und Ethanolamin-P gespalten werden, wobei letzteres zur Synthese von PE über den „Kennedy-Pathway“ verwendet wird . Unter normalen Wachstumsbedingungen wird ein erheblicher Teil des neu synthetisierten Sphingosins zu Aminoglycerolipiden statt zu Sphingolipiden metabolisiert. Dabei scheint der Sphingosin-P Phosphatase eine wichtige Rolle bei der Regulation der zellulären Ceramid Konzentration zuzukommen .

Im Gegensatz zu der Situation in tierischen Zellen sind komplexe Sphingolipide in S. cerevisiae weitgehend stabil. Unmittelbar vor Abschluß dieser Arbeit wurde eine für Sphingolipide spezifische Phospholipase C beschrieben, die alle komplexen Sphingolipide hydrolysieren kann, jedoch vermutlich aufgrund ihrer Lokalisation (ER?) nur einen geringen Stoffumsatz bewirkt .

Nur vier Reaktionsschritte in diesem gesamten Syntheseweg sind essentiell: Ketosphinganin Synthese, Reduktion von Ketosphinganin zu Sphinganin, Ceramid Synthese und IPC Synthese. Alle anderen Enzyme lassen sich deletieren, ohne daß unter Laborbedingungen ein Wachstumsphänotyp entsteht.

Die Synthese von Sphingosin und Ceramid erfolgt an der cytosolischen Seite des Endoplasmatischen Retikulums. Dort sollen sich auch die Ceramidasen sowie Sphingosin-P Phosphatasen befinden und möglicherweise die Sphingolipase C . Bis vor kurzem wurde angenommen, daß sich auch die IPC Synthase im ER befindet, während MIPC und M(IP)₂C im Golgi Apparat gebildet werden. Diese Annahme beruhte auf der Beobachtung, daß in sec18-1 oder sec23 Mutanten bei restriktiver Temperatur, wenn der ER-Golgi Transport blockiert ist, IPC synthetisiert wird, während die Synthese von MIPC oder M(IP)₂C stark verringert ist . Es wurde jedoch gezeigt, daß sich auch die IPC Synthase im Golgi Apparat befindet und die Übertragung der Inositol-phosphoryl Gruppe vermutlich an der lumenalen Seite der Membran erfolgt . Der Transport von Ceramid zum Golgi könnte daher unabhängig von Sec18p und Sec23p erfolgen. Eine analoge Situation ist in tierischen Zellen beschrieben worden . Die veränderte Lokalisierung der IPC Synthase beseitigt einen wesentlichen Unterschied zwischen Säuger- und Hefesystem und läßt vermuten, daß die Architektur des Sphingolipid Stoffwechsels relativ stark konserviert ist.

Die komplexen Sphingolipide befinden sich überwiegend in der Plasmamembran, wo sie 20-30% des Lipidanteils ausmachen . Sie binden an das ebenfalls dort konzentrierte Ergosterol, mit dem zusammen sie für die besonderen biophysikalischen Eigenschaften dieser Membran verantwortlich sind . Eine Besonderheit der Lipidzusammensetzung von S. cerevisiae gegenüber tierischen Zellen ist, daß Sphingolipide ausschließlich sehr lange Fettsäuren (C₂₄-C₂₆) enthalten, diese hingegen in Glycerolipiden nicht oder nur in Spuren vorkommen. Daher sind Sphingolipide und Ergosterol für die Zunahme der Dicke der Membran vom ER (5nm) zur Plasmamembran (8nm) verantwortlich .

Einzelne Zwischenprodukte der Sphingolipid Biosynthese sind als Signalmoleküle oder Kofaktoren zellulärer Prozesse bedeutsam. Dies betrifft insbesondere Sphingosin (Endocytose) , Sphingosin-P (Temperaturresistenz) , Ceramid (Zellzyklus) und IPC-C (Calcium Homöostase) .

Ceramid erfüllt zudem in S. cerevisiae eine weitere Funktion. Bei der Reifung von Proteinen mit einem Glycosylphosphatidylinositol (GPI) Anker wird nach erfolgter Transacylierung der Polypeptidkette auf den Lipidanker der hydrophobe Anteil der Lipidkomponente modifiziert. Bei diesem „Remodelling“ genannten Prozeß wird entweder die Fettsäure in der sn-2 Position des Diacylglyerol Anteils durch einen längeren Acylrest (C₂₆) ersetzt oder das gesamte DAG gegen Ceramid ausgewechselt .

Über die Regulation der Biosynthese von Sphingolipiden in S. cerevisiae ist nur wenig bekannt. Vermutlich können die Konzentrationen verschiedener Zwischenmetabolite unabhängig von der Regulation des Sphingolipidgehaltes verändert werden. So erhöht sich bei einem Erwärmen der Hefen von der normalen Wachstumstemperatur (25-30°C) auf 37°C die Konzentration von Sphingosin und Sphingosin-P vorübergehend stark, gefolgt von einer langsameren und langandauernden Erhöhung des Ceramid Spiegels. Dies steht vermutlich im Zusammenhang mit den Signalfunktionen dieser Substanzen . Im Gegensatz zum Glycerophospholipid Stoffwechsel erfolgt kaum eine Expressionsregulation der an der Sphingolipid Synthese beteiligten Enzyme .

Mögliche Interaktionen zwischen Glycero- und Sphingolipid Stoffwechsel sind bisher kaum untersucht worden. Es ist bekannt, daß Zwischenprodukte der Sphingolipid Synthese die Enzymaktivität z.B. der PS Synthase beeinflussen können . Zudem führt eine Inhibition der Ceramid Synthase mit Fumonisin B₁ zu einer verminderten Synthese von Glycerolipiden . Dieser Effekt wurde bisher jedoch nicht näher charakterisiert.

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1.6 Zielstellung

Ausgangspunkt dieser Arbeit war der Befund, daß Cue1p, eine Komponente der ER-assoziierten Proteindegradation, mit quervernetzenden Reagenzien an Scs2p gebunden werden kann und Scs2p somit möglicherweise einer der Hauptbindungspartner von Cue1p ist.

Scs2p war zuvor als ein integrales Membranprotein des Endoplasmatischen Retikulums beschrieben worden, dessen Fehlen zu einer verringerten Expression von Genen der Glycerolipid Synthese führt. Zudem wiesen die Literaturdaten auf einen Einfluß dieses Proteins auf die „unfolded protein response“ (UPR) hin, da scs2 Zellen sensitiv gegen Tunicamycin waren und eine Überexpression von SCS2 die Inositol-Auxotrophie eines Stammes supprimierte, in dem eine Komponente der UPR (Hac1p) mutiert war.

Ziel der Dissertation war daher, den Einfluß von Scs2p auf ER-Degradation und „unfolded protein response“ zu analysieren sowie die Funktion von Scs2p im Rahmen der Lipidbiosynthese weitergehend zu charakterisieren und nach möglichen funktionellen Zusammenhängen zwischen dem Lipidstoffwechsel und den Systemen der ER-Degradation und der „unfolded protein response“ zu suchen.

In dieser Arbeit werden der Einfluß von Scs2p auf die Transkriptionsregulation der Glycerolipid Biosynthese näher charakterisiert und die Auswirkungen eines Fehlens dieses Proteins auf den Sphingolipid Stoffwechsel beschrieben. Zudem wird gezeigt, daß Mutationen in Komponenten der ER-Degradation und der Sphingolipid Synthese unabhängig von Scs2p die Transkriptionsregulation der Glycerolipid Biosynthese negativ beeinflussen. Die ER-assoziierte Proteindegradation und die „unfolded protein response“ werden hingegen durch eine Deletion von SCS2 nicht beeinträchtigt.

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