Aus der Klinik für Dermatologie, Venerologie und Allergologie der Medizinischen Fakultät der
Charité – Universitätsmedizin Berlin

DISSERTATION

In vitro Charakterisierung autologer Aktivierung und Klonierung von T-Lymphozyten aus psoriatischen Plaques

Zur Erlangung des akademischen Grades
Doctor medicinae (Dr. med.)

vorgelegt der Medizinischen Fakultät der Charité
Universitätsmedizin Berlin

Von
Wiebke Dorothea Urban
aus Böblingen

Gutachter:
1. Prof. Dr. Wolfram Sterry
2. Prof. Dr. Walter Lechner
3. Prof. Dr. Arturo Zychlinsky

Datum der Promotion: 20.06.05

Inhaltsverzeichnis

• 1. Einleitung
  • 1.1. Psoriasis
  • 1.2. Immunpathogenese
    • 1.2.1. Die Rolle der T-Lymphozyten
    • 1.2.2. Zytokine, Botenstoffe zwischen den “Hauptakteuren”
    • 1.2.3. Streptokokken-assoziierte Pathogenese
    • 1.2.4. oliklonaler TCR und Antigen(e)
  • 1.3. Ansatz zur Identifizierung der T-Zellspezifitäten
• 2.  Fragestellung
• 3.  Material und Methoden
  • 3.1. Material
    • 3.1.1. Biopsien
      • 3.1.1.1. Patienten
      • 3.1.1.2. Probengewinnung
    • 3.1.2. Verwendete Stoffe und Lösungen
      • 3.1.2.1. Zellkultur und Elispot-Assay
      • 3.1.2.2.  Antikörper
      • 3.1.2.3. Zellsortierung
      • 3.1.2.4.  Zusammensetzung von Lösungen
      • 3.1.2.5. Verbrauchsmaterialien und verwendete Geräte
  • 3.2.  Methoden
    • 3.2.1. Isolierung und Kultivierung der Lymphozyten
    • 3.2.2. Isolierung und Verwahrung der Stimulatorzellen
    • 3.2.3. Isolierung von PBMC und autologem Blutserum
    • 3.2.4.  γ- Interferon-Elispot-Assay
      • 3.2.4.1. Prinzip
      • 3.2.4.2. Durchführung
    • 3.2.5. Bestimmung des Phänotyps der in vitro kultivierten Lymphozyten
    • 3.2.6.  Sortierung der Lymphozyten mit MACS
      • 3.2.6.1. Prinzip und Ansatz
      • 3.2.6.2.  Durchführung der T-Zellisolierung
    • 3.2.7. Klonierung von T-Zellen mittels Einzelzell-Verdünnung
      • 3.2.7.1. Prinzip
      • 3.2.7.2.  Durchführung
• 4.  Resultate
  • 4.1. Etablierung des γ -Interferon-Elispot-Assays
    • 4.1.1. Herstellung optimaler Bedingungen für den Meßbereich:
  • 4.2. Polyklonale T-Zell-Linien
    • 4.2.1. Etablierung polyklonaler T-Zell-Linien aus psoriatischen Plaques
    • 4.2.2.  Phänotypisierung per FACS
  • 4.3. γ-Interferon-Elispot-Assay der polyklonalen T-Zell-Linien
    • 4.3.1. Phänotypisierung der ausgewanderten Zellen
    • 4.3.2.  Restimulierbarkeit polyklonaler T-Zell-Linien durch autologe Plaquezellen
    • 4.3.3.  Stimulierbarkeit polyklonaler T-Zell-Linien durch autologe PBMC
  • 4.4. Isolation von T-Zell-Klonen aus psoriatischen Plaques
    • 4.4.1. Optimierung der Methode
    • 4.4.2.  Restimulation der Klone eines Probanden durch autologe Plaquezellen
• 5.  Diskussion
  • 5.1. γ-Interferon-Elispot-Assay
  • 5.2. Klonierung
• 6.  Zusammenfassung
• ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS
• Literatur  Quellenverzeichnis
• Publikation
• Danksagung

Tabellen

• Tabelle 1: Gegenüberstellung der Ergebnisse des γ-Interferon-Elispot-Assay und der Auswertung der FACS-Analyse bei 10 Patienten. Gezeigt wird (linke Tabellenhälfte) Mittelwerte ± Standardabweichung von jeweils drei unabhängigen Experimenten pro Patient, sowie (rechte Tabellenhälfte) die FACS-Phänotypisierung der für die Stimulationsversuche verwendeten T-Zell-Linien.
• Tabelle 2 : Gegenüberstellung der fach-Stimulation durch autologe Zellen bzw. anti-CD3 bezogen auf die basale Aktivität im γ-Interferon-Elispot-Assay (jeweils drei unabhängige Experimente pro Patient) bei 10 Patienten.
• Tabelle 4: Gegenüberstellung der fach-Stimulation der Mittelwerte der Ergebnisse des IFN-γ-Elispot-Assays (jeweils 3 Experimente pro Patient) von 10 T-Zell-Linien im Veleich zu den Ergebnissen dreier T-Zell-Klone eines Patienten.

Bilder

• Abbildung 1 : Darstellung der prozentualen Anteile von CD4- bzw. CD8-Zellen in Kultur (bei n= 6 Patienten), erste Messung im Mittel nach 40,8 ± 25,2, zweite Messung nach weiteren 57,8 ± 42,9 Tagen.
• Abbildung 2: FACS-Phänotyp von psoriatischen T-Zell-Linien im Mittel nach 34 Tagen ( 21-85 Tagen) in Kultur. Das Diagramm zeigt die gemittelten Daten von 10 Patienten.
• Abbildung 3 : FACS-Phänotypisierung der ausgewanderten autologen Zellen, die in einem Zeitraum von 3 Wochen aus dem Plaque wanderten und zur Restimulation der T-Zell-Linien dienten. Alle ausgewanderten Zellen eines Patienten wurden gepoolt. Die gezeigten Daten entsprechen Mittelwert ± Standardabweichung von n = 5 Patienten.
• Abbildung 4 : Aus dem Biopsat ausgewanderte Zellen wurden über einen Zeitraum von 3 Wochen zwei - bis dreimal die Woche gesammelt und bestrahlt, um primär als Stimulatorzellen für die Elispot-Assays zu dienen. Die Daten zeigen die autologen Zellen von 5 verschiedenen Patienten, gemesen in einem Multiparameter-FACS. Lymphozyten wurden mit forward-sideward-scater gegatet, Leukozyten mittels Eingrenzung auf CD45+ Zellen.
• Abbildung 5 : Darstellung der gemittelten fach-Stimulationen der Elispot-Assay-Versuche (3 pro Patient) der 10 T-Zell-Linien. Durch die logarithmische Skalierung wird die viel höhere Stimulierbarkeit durch anti-CD3 (rechts), im Gegensatz zu der durch autologe Zellen (links) deutlich.
• Abbildung 6a: Mittelwerte und Standardabweichung der fach-Stimulation im Vergleich zur basalen Aktivität von T-Zellinien stimuliert durch autologe Plaquezellen (linke Ordinate) oder anti-CD3 (rechte Ordinate). Die Daten repräsentieren die Ergebnisse aller 10 Patienten, eingeteilt in je 5 High- bzw. Low- Responder mit jeweils drei unabhängigen Experimenten pro Individuum.  Abbildung 6b : Mittelwerte der prozentualen Stimulierbarkeit der T-Zellen durch autologe Plaquezellen, bezogen auf die Aktivität bedingt durch anti-CD3. (Einzelheiten s. Legende zu Abbildung 6a).
• Abbildung 7 : Ergebnisse von γ-IFN-Assays bei denen psoriatische T-Zell-Linien durch autologe Plaquezellen bzw. autologe PBMC restimuliert wurden. Links ist die fach-Stimulation (bez. auf die basale Aktivität) graphisch dargestellt, rechts das prozentuale Verhältnis zur anti-CD3-Stimulation. Es wurden sechs unabhängige Experimente mit Zellen von 3 verschiedenen Patienten durchgeführt.
• Abbildung 8 : FACS-Auswertung der T-Zellen von 3 Patienten vor und nach Sortierung durch magnetische Markierung mittels CD25. Die Markierung umgrenzt diejenigen T-Zellen, die relevant für die Klonierung (CD25⁺ = aktiviert ) waren. Die rechts angegebenen Faktoren ergeben sich aus der relativen Anreicherung der T-Zellen nach der Sortierung.
• Abbildung 9a : Mittelwerte der Interferon-γ-Elispot-Assays mit den 3 Klonen eines Patienten (jeweils durchgeführt in Triplikaten). Dargestellt sind die basale Aktivität und die absolute Stimulation der Klone durch autologe Plaquezellen und durch anti-CD3.
• Abbildung 9b : Mittelwerte der Ergebnisse der Elispot-Assays mit den 3 Klonen eines Patienten (jeweils durchgeführt in Triplikaten). Dargestellt ist fach-Stimulation durch autologe Zellen und anti-CD3 bezogen auf die basale Aktivität der T-Zellen der Klone.