3.  Material und Methoden

Bei den verwendeten Proben handelte es sich um spindelförmige Hautbiopsien und 100 ml heparinisiertes Venenblut von 22 Patienten (Altersdurchschnitt 57 Jahre; von 26-77 Jahren; 64 % davon männlich) mit einer klinisch gesicherten, voll-stationärer Therapie bedürftiger Psoriasis vulgaris, welche zum Zeitpunkt der Probenentnahme mindestens 4 Wochen nicht systemisch, sowie mindestens 2 Wochen nicht lokal extern therapiert worden war.

Unmittelbar nach Entnahme der Hautproben wurden diese steril in PBS (auf Eis) aufgenommen, die Erythrozyten mit PBS abgespült, das Unterhautfettgewebe mit einem Skalpell entfernt und anschließend in Stücke mit einem Durchmesser von 2 mm zerteilt und umgehend in 2 ml AIM-V+(40) Medium in 12-Well-Mikrotiterplatten im Inkubator verwahrt. Das Venenblut wurde noch am selben Tag zur Gewinnung von PBMC und autologem Serum verarbeitet.

Nach 2-3 Tagen wurden die aus dem Haut-Bioptat (siehe 3.1.1.3.) ausgewanderten Zellen aufgenommen und in kleinem Volumen (200 μl) AIM-V+ (100) in eine 96-well-Rundbodenplatte umgesetzt. Je nach Dichte der Lymphozyten bzw. Proliferationsbereitschaft der Kultur wurden die Zellen auf Platten mit größeren Wells umgesetzt. Falls die Zellen unzureichend proliferierten, wurden sie mit anti-CD3 (1:5000) und anti-CD28 (1:2000) stimuliert. Wenn eine Stimulation mit anti-CD3 und anti-CD28 erfolgte, wurde mindestens 14 Tage abgewartet, bevor ein Elispot-Assay angesetzt wurde. Sobald die Zellen gut proliferierten, wurde die IL-2 Konzentration im Medium auf 40 Einheiten/ ml reduziert.

Das Biopsat wurde nach Abnahme der ausgewanderten Lymphozyten, in AIM-V+ Medium inkubiert. Alle 2 bis 3 Tage wurde das Medium der Bioptate ersetzt, bzw. bei ausreichender Zelldichte, diese abgenommen, abzentrifugiert und in Einfriermedium bei –146°C kryopreserviert. Nach 4 bis 6 Wochen wurden die Biopsien verworfen. Die ausgewanderten Zellen wurden wieder aufgetaut, gepoolt und anschließend mit 30 Gy bestrahlt. Danach wurden sie gezählt und krypreseviert, bis sie als Stimulatorzellen im Elispot-Assay benötigt wurden.

Das heparinisierte Venenblut (50 ml pro Patient) wurde zu gleichen Anteilen auf 4 Reaktions- gefäße mit je 18 ml Ficoll (37 °C) verteilt, so daß sich 2 Phasen bildeten, wobei das Blut die oberste Phase ergab. Anschließend wurden die Proben 15 min mit 2200 Umdrehungen / min ohne Bremse zentrifugiert. Es bildeten sich 4 Phasen. Das Serum, welches die oberste Phase darstellte, wurde abgenommen und 45 min bei 55 °C denaturiert, danach 15 min mit 3000 Umdrehungen / min (G-Zahl) ohne Bremse zentrifugiert, der Überstand abgenommen und bei 20 °C gelagert. Die PBMC in der Interphase wurden 1:1 mit PBS verdünnt, abzentrifugiert und 5-6 mal mit PBS zur Abtrennung von Thrombozyten und Erythrozyten gewaschen, mit der Zählkammer unter dem Mikroskop gezählt, anschließend mit 30 Gray bestrahlt und in Einfriermedium erst 24 h bei –80 °C, dann bei –146 °C kryopreserviert.

Durch den γ-Interferon-Elispot-Assay sollte die in psoriatischen Plaques in vivo beobachtete T-Zell-Stimulation in vitro rekonstruiert werden, um die spezifische Stimulation durch autologe APC nachzuweisen. Die polyklonalen T-Zellen aus der Haut wurden mit in vitro emigrierten Zellen aus der Haut restimuliert. Als Positiv-Kontrolle wurde mit aktivierendem CD3-Antikörper stimuliert, die Negativ-Kontrolle mit reinem Medium. Bei 3 Patienten wurde zusätzlich eine Kontrolle mit autologen PBMC hinzugenommen.

Der Assay war auf einen Zeitraum von 3 Tagen angesetzt. Am ersten Tag wurde die PVDF-beschichtete Mikrotiterplatte mit 0,192 μg Bindungsantikörpern in 100 μl PBS/ Well beschichtet und bei RT aufbewahrt. Die Lymphozyten wurden 24 h in AIM-V+ ohne IL2 verwahrt. Nach 24 Stunden wurden 100 μl PBS pro Well auf die Milliporeplatte gegeben und die Lösung steril abgesaugt. Pro Well wurden 5x104 Lymphozyten in 100 μl AIM-V+ (40) gegeben. Dazu je 100 μl AIM-V+ mit 0,001 μg anti-CD3, 2x103 bis 3x104 Stimulatorzellen bzw. 5x103 bis 1x104 PBMC. Jeder Reaktionsansatz wurde 4 fach pro Versuch angesetzt. Die Milliporeplatte wurde anschließend 24 h in den Inkubator (37 °C) gestellt. Am letzten Tag wurde die Milliporeplatte, unter Verwendung einer Multipipette mit einem Volumen von 200 μl, 5 bis 6 mal unsteril mit PBS gespült. Anschließend wurden auf die noch mit PBS benetzten Membranen 0,25 μg Nachweisantikörper in 100 μl 4 % BSA-PBS pro Well hinzugegeben und 2 h bei RT stehen gelassen. Dann erfolgte erneutes Spülen (3mal). Auf die noch benetzten Membranen wurde dann je 0,1 μl SA-AP (in 100 μl 4% BSA-PBS) pro Well gegeben. Die Platten wurden daraufhin 1h bei RT inkubiert. Dann erfolgte wiederum Spülen mit PBS (3mal). Im Anschluß wurde 100 μl Substrat pro Well zugegeben und die Platte für 70-120 min bei 37 °C inkubiert. Danach wurden die blau gefärbten Spots unter Zuhilfenahme eines Netzgitters ausgezählt.

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Die zu untersuchenden Lymphozyten wurden aus der Kultur abgenommen und in 500 μl FACS-Puffer resuspendiert. Je 30 μl der Suspension wurden in FACS-Röhrchen gegeben (4 Proben) und anschließend mit je 2 μl der FACS-Antikörper beladen. Es handelte sich um CD3-, CD4-, CD8-, CD25-, CD69-, CD45RO- und CD45RA-Antikörper. Nach Inkubation der Proben im Dunklen (10 min bei RT), wurden diese mit 2 ml FACS-Puffer aufgefüllt und zentrifugiert. Anschließend wurde der Überstand abgegossen, die Röhrchen ausgeklopft und wiederum 500 μl FACS-Puffer hinzugegeben. Nun erfolgte die Messung der Proben mittels Durchflußzytometer (FACS).

Bei den aus den Biopsien ausgewanderten Zellen handelt es sich sowohl um ein Gemisch verschiedener Zellarten, als auch um Lymphozyten mit unterschiedlicher Aktivität bzw. Relevanz im Bezug auf die Ausbildung von psoriatischen Plaques. Um eine effiziente Klonierung zu gewährleisten, wurde versucht, die T-Lymphozyten vor der Klonierung so zu sortieren, daß eine möglicht hohe Ausbeute an aktivierten T-Zellen erlangt wurde. Die T-Zellen sollten zum einen noch aktiviert sein, d.h. möglichst früh aus der Haut isoliert werden, zum anderen schonend sortiert werden, um eine weitere Proliferation nicht zu gefährden. Außerdem mußte eine Methode gewählt werden, mit welcher auch bei relativ geringer Zellzahl effektiv gearbeitet werden konnte.

Dazu eignete sich das MACS-System, bestehend aus MS Trennsäulen und einer Mini-MACS Separations-Einheit. Das System basiert auf Magnetismus, d.h. Zellen werden mit magnetischen Microbeads markiert. Gibt man nun das Zellgemisch, welches je nach Antikörper aus markierten und unmarkierten Zellen besteht, durch die Magnetsäule, bleiben die markierten Zellen in der Säule haften.

Zur Vorbehandlung der Biopsate wurden verschiedene Verfahren angewendet. Zum einen wurde mit Kollagenase 1A vorbehandelt, um die Lymphozyten schneller aus der Haut zu isolieren, zum anderen wurde versucht, mit Hilfe der sog. Medimaschine durch mechanische Disruption eine für die Zellen schonendere Desaggregation zu etablieren.

Bei der dritten Variante verwahrte man die Biopsate mehrere Tage im Inkubator in AIM-V+, und ließ dort die T-Zellen selbständig auswandern.

In allen drei Fällen wurde die gewonne Zellsuspension ohne Vorbehandlung und Druck durch eine Magnetsäule gegeben, um diese von Zell-und Gewebsresten zu befreien. Danach kamen wiederum verschiedene Verfahren zum Einsatz. Die Lymphozyten wurden durch verschiedene Floureszenz-Antikörper markiert (siehe 4.4.1.). Anschließend erfolgte die Bindung an floureszenz-positive Micro-Beads.

Die zu sortierenden Zellen wurden nach 7 Tagen samt Medium abgenommen und durch eine Magnetsäule gegeben, um größere Fremdkörper zu entfernen. Der Säulendurchlauf wurde abzentrifugiert, das enstandene Zellpellet in 100 μl Medium aufgenommen und in ein 50 ml Reaktionsgefäß überführt. 5 μl der Suspension wurden abgenommen und als FACS-Kontrolle auf Eis gestellt. Zu der Zellsuspension in dem 50 ml Reaktionsgefäß wurden 10 μl anti-25-Fitc gegeben und anschließend 10 min bei RT im Dunklen inkubiert. Danach wurde mit 5 ml Medium resuspendiert und abzentrifugiert. Zu dem Zellpellet wurden dann 80 μl Medium gegeben, resuspendiert und 4 μl als FACS-Kontrolle abgenommen. Zu der Zellsuspension wurden nun 25 μl anti-FITC-micro-beads gegeben und der Ansatz danach 15 min im Kühlschrank inkubiert. Anschließend wurde das Pellet mit 5 ml Medium gewaschen, abzentrifugiert und in 2 ml FACS-Puffer aufgenommen.

Nach Äquilibrierung einer zweiten Magnetsäule mit 3 ml FACS-Puffer, wurde die Zellsuspension durch die Säule gegeben, danach mit Hilfe eines 3-Wege-Hahns die Säule von beiden Richtungen mit FACS-Puffer gespült. Die aufgefangene Suspension bildete die Negativ-Fraktion, von welcher 5% als FACS-Kontolle abgenommen wurden. Beide Proben wurden auf Eis gelagert. Danach wurde die Säule aus dem Magneten entfernt und abermals gespült, diesmal mit Druck, wir erhielten dadurch die Positiv-Fraktion. Wieder wurden 5 % der Zellsuspension zur FACS-Kontrolle abgenommen.

Die 4 FACS-Proben wurden mit Propidium-Jodid (als Vitalfärbung) CD3-APC, CD8-PE, CD25-FITC angefärbt und zur Kontrolle und Dokumentation der erreichten Reinheit gemessen.

Die sortierten T-Zellen sollten so ausverdünnt und auf 96-Well-Mikrotiterplatten aufgebracht werden, daß theoretisch auf jedes dritte Well eine einzelne T-Zelle kommt, die dann monoklonal expandieren kann (sog. “Limiting Dilution”). Es wurde auf 5 Platten ausplattiert. Zur Stimulierung der Proliferation wurden die autologen PBMC mit je einer von 4 Peptidbanken beladen, eine Platte wurde zur Kontrolle mit CON A stimuliert.

Für den Ansatz von 5 Platten wurde eine Suspension aus 50 ml AIM-V, 2,5 ml autologem inaktiviertem Serum, 100 Einheiten / ml IL 2 und 150 T-Zellen hergestellt. Je 5x106 inaktivierte PBMC wurden mit je 1 μl Peptidlösung beladen bzw. mit 5 μl CON A, anschlißend 30 min bei RT inkubiert. Anschließend wurden die beladenen PBMC mit je 10 ml der Suspension vermischt und mittels Multipipette (100 μl pro Well) auf die Platten aufgetragen. Die Platten wurden mit Alufolie luftdicht verschlossen und 14 bis 21 Tage bei 37 °C steril inkubiert.