In vitro Charakterisierung autologer Aktivierung und Klonierung von T-Lymphozyten aus psoriatischen PlaquesWiebke Dorothea Urban 21.1.1.71.2.1.2.1.891.2.2.101.2.3.111.2.4.121.3.132.143.153.1.3.1.1.3.1.1.1.3.1.1.2.3.1.2.3.1.2.1.3.1.2.2.163.1.2.3.3.1.2.4.173.1.2.5.3.2.183.2.1.3.2.2.3.2.3.3.2.4.193.2.4.1.3.2.4.2.203.2.5.3.2.6.213.2.6.1.3.2.6.2.223.2.7.3.2.7.1.3.2.7.2.234.244.1.4.1.1.4.2.4.2.1.4.2.2.25559#34426522#3774.3.4.3.1.27577#293459#2964.3.2.282930375#35231640#2574.3.3.32481#3144.4.4.4.1.3334605#6884.4.2.35541#328535#279365.37385.1.39405.2.6.41 ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS346 Literatur Quellenverzeichnis42434445464748495051 Publikation53DanksagungdeInhaltsverzeichnisHilfe Einleitung
Psoriasis

Psoriasis (Schuppenflechte) ist eine sehr häufige Hauterkrankung mit einer Prävalenz von ca. 2-3 % in kaukasischen Populationen, wobei Frauen und Männer gleichermaßen betroffen sind. Man geht davon aus, daß es sich um eine Krankheit handelt, die polygen und multifaktoriell vererbt wird, d.h. sowohl die genetische Disposition, als auch verschiedene Umwelteinflüsse tragen dazu bei, daß die Krankheit zum ersten Mal auftritt und in Schüben immer wieder aufflammen kann.

Bisher konnte keines der Risiko-Gene identifiziert werden (Elder et al, 2001). Jedoch konnte eine Risiko-Assoziation zu bestimmten HLA-Merkmalen hergestellt werden. Diese sind insbesondere HLA-DR7 und HLA-Cw6, aber auch HLA-DR4,-B13,-B17,-B39,-B57 und -Cw7 (Elder et al, 1994). HLA-Merkmale sind Zellmembranantigene, die wichtig für die Immunantwort in verschiedensten Bereichen sind. Sie sind auf dem kurzen Arm des Chromosoms 6 lokalisiert. HLA-A, HLA-B und HLA-C (MHC-Klasse I) finden sich in den Zellmembranen fast aller kernhaltigen Körperzellen, in höchster Konzentration auf Lymphozyten und Makrophagen. Die durch D/ DR kodierten Antigene (MHC-Klasse II) werden dagegen nur in B-Zellen, in aktivierten T-Zellen, in Makrophagen, Endothelzellen, Langerhans-Zellen der Epidermis und in Spermatozyten gefunden.

Im Zusammenspiel zwischen genetischer Disposition und Umweltfaktoren sind mechanische, infektiöse, chemische und psychosomatische Auslöser bekannt. So kann z.B. das sogenannte Köbner-Phänomen, d.h. mechanische Manipulation, bei Psoriatikern an nicht betroffenen Hautarealen die für die Psoriasis typischen Hautirritationen auslösen (Powles et al, 1990; Weiss G et al, 2002). Ein weiterer wichtiger Trigger-Faktor sind Streptokokken-Infektionen, besonders der oberen Atemwege, die die sogenannte Guttata-Form der Psoriasis hervorrufen können (Baker et al, 1993; s.u. Abschnitt 1.2.3).

Psoriasis befällt v.a. die Haut, aber auch Gelenke und Nägel können mitbetroffen sein. Die typischen Effloreszenzen stellen sich als scharf, oft unregelmäßig begrenzte, streckseitig betonte erythrosquamöse Plaques dar. Charakteristisch für die zugrundeliegende Histologie ist eine epidermale Hyperplasie durch erhöhten Zellumsatz der Keratinozyten. Histologisch findet man eine starke Akanthose durch zehnfach gesteigerte mitotische Aktivität der Basalzellen, eine erhöhte DNA-Synthese, einen verkürzten Zellzyklus und eine verkürzte Transitzeit der Keratinozyten. Außerderm zeichnet sich die Psoriasis durch eine Hyper- und Parakeratose, v.a. bei akuten Veränderungen, mit eingeschlossenen neutrophilen Granulozyten (sog. Munro-Mikro-Abzesse) und Mastzellen aus. Es besteht eine Dilatation und korkenzieherartige Anordnung der papillären Gefäße mit einem lymphohistiozytären Infiltrat im oberen Korium (Nickoloff et al, 2001). Die Aktivität von Endothelzellen, Lymphozyten, Keratinozyten und neutrophilen Granulozyten in den betroffenen Arealen ist gesteigert (Norris et al, 1997).

Immunpathogenese

T-Lymphozyten, dendritische Zellen und ihre Botenstoffe spielen eine entscheidende Rolle in der Pathophysiologie der Psoriasis. Je mehr man über die Schlüsselmechanismen und Interaktion der Zellen weiß, desto wahrscheinlicher läßt sich eine gezielte und wirkungsvolle Therapie der Erkrankung entwickeln.

Die Rolle der T-Lymphozyten

Heute geht man davon aus, daß T-Lymphozyten eine zentrale Rolle in der Pathogenese übernehmen. Klinisch erfolgreiche Blockaden der T-Zell Funktion sowohl mit Cyclosporin A (Mueller et al, 1976), FK506 (Michel et al, 1996), anti-CD3 und -CD4, dem lymphotoxisch wirkenden Methotrexat und mit DAB389-IL-2 (Bos et al, 1999; Gottlieb et al, 1995), als auch die Behandlung mit PUVA (Ultraviolett-Licht- aktiviertes Methoxypsoralen) (Valdimarsson et al, 1986) und Knochenmark-Tansplantationen (Eedy et al, 1990) machen deutlich, daß es sich bei der Psoriasis um ein immunologisches Geschehen handelt, das durch mehr oder weniger gezielte Suppression der T-Lymphozyten unterbrochen werden kann. Die pathologische Relevanz der T-Zellen zeigt sich sowohl in vivo (Bata-Csorgo et al, 1995), als auch in vitro (Prinz et al, 1994). Sie steigern nachweislich die Proliferation von Keratinozyten und die Akkumulation von Neutrophilen und Mastzellen (Vollmer et al, 1994).

Bei der Transplantation sowohl nicht-läsionaler Haut von Psoriatikern, als auch gesunder Haut auf immundefiziente Empfängermäuse und anschließender Injektion von PBMC von Psoriatikern reagierte nur die Haut der Psoriatiker mit den typischen Zeichen eines psoriatischen Infiltrates (Wrone-Smith et al, 1996). Dies läßt darauf schließen, daß auch den Immunozyten im Blut der Erkrankten eine wichtige Funktion in der sekundären Krankheitsentwicklung zuzurechnen ist, und daß auch in der Haut die Prädispostion existiert, durch Stimulation dieser Zellen pathologisch zu reagieren. Während sich auch PBMC, sowohl von Psoriatikern, als auch von gesunden Probanden, durch autologe bzw. allogene Extrakte aus der Haut stimulieren lassen (Hales et al, 1998), lieferten Boyman und seine Mitarbeiter hingegen jüngst Hinweise, daß ausschließlich den lokalen T-Zellen in der Haut eine Schlüsselfunktion in der Pathogenese zukommt. Sie transplantierten symptomlose psoriatische Haut auf Mäuse, denen die Rezeptoren für Alpha- und Gamma-Interferon, sowie funktionell aktive T-Zellen fehlten. Etwa 90 % der Mäuse entwickelten innerhalb von 6-8 Wochen spontan psoriatische Hauterscheinungen mit entsprechenden histologischen Infiltraten. Das Fehlen der Interferon-Rezeptoren bei den Empfängermäusen läßt darauf schließen, daß alle pathogenen Faktoren, die zur Entstehung eines psoriatischen Phänotyps führen, aus dem transplantierten Plaque stammten. Die Autoren schlossen damit eine Beteiligung exogener Zellen und Faktoren aus (Boyman et al, 2004).

Unklar bleibt allerdings, welcher Phänotyp den dominierenden Faktor der Erkrankung darstellt. Man nimmt an, daß sowohl den CD4-(T-Helferzellen), als auch den CD8-(T-Supressorzellen) Zellen eine wichtige Rolle bei der Pathogenese und Aufrechterhaltung der Krankheit zukommt. Dabei sind in der Dermis überwiegend CD4-, in der Epidermis v.a. CD8-Zellen zu finden. Die Arbeitsgruppe von Nickoloff beobachtete, daß die Injektion von T-Lymphozyten in nicht-aktivierte psoriatische Haut, die auf immun-defiziente sog. SCID Mäuse transplantiert wurde, eine gesteigerte T-Zell-Aktivierung, eine Akkumulation von Neutrophilen, sowie das Entstehen von psoriatischen Plaques provozierte (Nickoloff et al, 1999). Hier wäre zu vermerken, daß die Injektion von CD4-Zellen diese Reaktion bewirkte, die von CD8-Zellen jedoch nicht.

Für eine tragende Rolle der CD8-Zellen wiederum spricht, daß Psoriasis im Stadium IV bei HIV mitunter verschlimmert wird bzw. ausbricht (Mallon et al, 2000). Zudem ist die sogenannte PSORS1-Mutation möglicherweise direkt im HLA-C Gen lokalisiert (The International Psoriasis Genetic Consortium, 2003). Diese Mutation spräche für eine Pathogenese in der Interaktion zwischen MHC der Klasse 1 und CD8-Zellen.

Am wahrscheinlichsten scheint eine Interaktion beider Zellarten, wobei die CD8-Zellen funktionell von den CD4-Zellen abhängig zu sein scheinen. Die T-Helferzellen wiederum scheinen durch Interaktion mit HLA-DR+ dendritischen Zellen aktiviert zu werden (Baker et al, 1984).

Auch bei Koebner-initiierten und spontan entstehenden psoriatischen Plaques sind zuerst CD4-Zellen in der Epidermis anzutreffen. In der späten Plaque-Phase akkumulieren überwiegend CD8-Zellen (Baker et al, 1984+1988). Diese CD8-Zellen sind nachweislich aktiviert, was sich durch hohe Aktivität ihrer MHC II-Moleküle und ihrer CD25-Oberflächenmoleküle (Interleukin II-Rezeptoren) ersehen läßt (Gottlieb et al, 1986).

Eine mögliche Theorie für die komplexen Interaktionen lautet, daß die CD4-Zellen mit Unterstützung aktivierter Antigen-präsentierenden dendritischen Zellen (APC) und deren Oberflächenmolekülen (CD40, CD80(B7-1), CD86(B7-2) und CD28) ein “Help”-Signal senden, welches ruhende CD8-Zellen aktiviert. Unterstützt wird diese Theorie durch die Beobachtung, daß die Applikation eines Fusions-Proteins (CTLA4Ig), welches die Interaktion zwischen CD28 und CTLA-4 (CD152) auf T-Zellen und B7 (CD80 und CD86) auf APC spezifisch blockiert, klinisch eine anti-psoriatische Wirkung hat. Dies zeigt sich sowohl in einer Reduktion der zellulären Aktivität von läsionalen T-Zellen, Keratinozyten, dendritischen Zellen und dem vaskulären Endothel, als auch in einer Verminderung der Infiltrate neutrophiler Granulozyten (Abrams et al, 2000; Nickoloff et al, 1999). Bei der Interaktion zwischen T-Zellen und APC, welche das Zentrum bei der Entstehung und des Fortbestehens der Erkrankung bildet, spielen außer T-Zellrezeptoren und MHC-Molekülen noch eine ganze Reihe an Co-Stimulatoren eine Rolle (LFA-1/ ICAM-1, CD2 /LFA-3, VLA-4/ VCAM-1).

Durch HLA-DR-Antikörper läßt sich die Reaktion von T-Zellen und PBMC auf Hautextrakte abschwächen. Dies läßt vermuten, daß die HLA-DR-Moleküle einen essentiellen Faktor für die Antigen-Antikörper-Reaktion darstellen, und daß ein Antigen oder Superantigen an diesem Prozeß beteiligt ist (Hales et al, 1998).

Zytokine, Botenstoffe zwischen den “Hauptakteuren”

Zytokine sind körpereigene Substanzen, die von aktivierten T-Zellen und anderen Zellen während der natürlichen und spezifischen Immunantwort freigesetzt werden (Asadullah et al, 1997). Sie haben vielfältige, v.a. proinflammatorische, immunregulatorische und die Hämato- poese steuernde Funktionen. Sie sind wichtig für Reparaturmechanismen von Gewebeschäden und wirken für viele Zellen als Wachstumsfaktoren. Die Zytokine sind essentiell für die Interaktion zwischen T-Zellen und Keratinozyten, eine der zentralen pathogenen Mechanismen bei der Psoriasis (Baker et al, 1992).

Anhand des Zytokinmusters, welches in läsionaler Haut bestimmt wurde (Vollmer et al, 1994), zeigten sich vermehrt proinflammatorische Zytokine: Keratinozytenproliferation (IL-3, IL-6,IL-19, GM-CSF und IFN-γ), Akkumulation von Granulozyten (IL-8) und Mastzellen (IL-3 und IL-5).

Die CD4-Zellen aus psoriatischer Haut weisen hierbei ein sog. T-Helfer-Typ-1 Profil auf, d.h. man findet in der Epidermis die für diesen Subtypen charakteristischen Zytokine IFN-γ, IL 12 (Nickoloff et al, 1991+1999), TNF-α (oder β) (Kelso et al, 1995; Uyemura et al, 1993) und IL-2, aber nicht das für T-Helfer-Typ-2-spezifische Bild mit IL-4, IL-5 und IL-10 (Horrocks et al, 1997; Schlaak et al, 1994; Friedrich et al, 2000).

In Biopsien und Sekreten aus psoriatischen Plaques findet man weitaus höhere Konzentrationen an IFN-γ als in der Haut gesunder Probanden (Bjerke et al, 1983). IFN-γ spielt eine Schlüsselrolle bei der Induktion der Keratinozyten-Proliferation (Ovigne et al, 2001; Szabo et al, 1998; Prinz et al, 1994). Dies wird durch die Beobachtung bestätigt, daß die Injektion von rekombinantem IFN-γ in läsionsfreie Haut von Psoriatikern eine Läsion setzt, die von einer idiopathischen weder klinisch noch histologisch zu unterscheiden ist (Fierlbeck et al, 1988; Griffiths et al, 1989). Dies führt zu der Annahme, daß in vivo IFN-γ deshalb wachstumsfördernd auf die Keratinozyten wirkt, weil diese auch mit den anderen Zytokinen (IL-3, IL-6, GM-CSF) interagieren (Krueger et al, 1990).

Streptokokken-assoziierte Pathogenese

Halsentzündungen mit Streptococcus pyogenes (Streptokokken der Gruppe A nach Lancefield) treten häufig mit der sogenannten Guttata-Form der Psoriasis, einer gutartig verlaufenden und sich oft selbst limitierenden Form der Erkrankung, auf (White et al, 1964). Da die Streptokokkenantigene M auf Aminosäurebasis homologe Strukturen mit dem Keratin, welches im Zytoskelett der Keratinozyten enthalten ist, teilen, kann es zu Kreuzreaktionen (sog. “Molecular Mimicry”) kommen, so daß Streptokokken-spezifische T-Zellen in der Haut expandieren (Valdimarsson et al, 1995+1997; Robinson et al, 1992).

Aus Plaques isolierte T-Zellen reagieren in vitro mit einer IFN-γ-Sekretion, wenn sie mit Streptokokkenantigenen der Gruppe A stimuliert werden (Brown et al, 2000). Man findet überdies während des aktiven Krankheitsgeschehens im Serum erhöhte Anti-Keratin-Antikörper (Aoki et al, 1989).

Die Beobachtung, daß Streptokokken-Antigene ein Trigger für den Ausbruch der Erkrankung darstellen, hat die Frage aufgeworfen, ob Superantigene oder (Auto-) Antigene der Haut den Hauptstimulus für die darauf folgende pathologische Kaskade liefern. Superantigene,mikrobielle Toxine, die antigenunabhängig mit HLA-Molekülen reagieren, aktivieren T-Zellen und verursachen eine polyklonale T-Zellpopulation.

Für die Superantigen-Theorie spricht, daß ,durch Streptokokkenantigene in der Haut provoziert, eine polyklonale Expansion von einer Unterfamilie von T-Zell-Rezeptoren (der BVβ2 Familie) (s.u. 1.2.4), aufzufinden ist (Leung et al, 1995). Nun lassen sich diese superantigenassoziierten Entzündungen durch antibiotische Behandlung heilen. Psoriatische Hautreaktionen hingegen, die sich gewöhnlich erst Wochen nach der Infektion mit Streptokokken ausbilden, lassen sich nicht durch Antibiotika beeinflussen. Trotzdem könnten Superantigene bei der Psoriasis dahingehend eine Rolle spielen, indem sie den aktivierten T-Lymphozyten die Einwanderung in die Haut erleichtern.

 oliklonaler TCR und Antigen(e)

Der am häufigsten exprimierte T-Zell-Rezeptor (TCR) ist ein Heterodimer, welcher aus einer alpha-(TCRA) und einer beta-(TCRB) Kette besteht. Die CD2-Region auf der α-und β-Kette interagiert mit MHC-Molekülen, die CD3-Region und in geringerem Maße die CD1-Region mit den MHC-gebundenen Peptiden der Antigene. Die CD3-Region auf dem variablen Teil der β-Kette ist der potenteste und wandelbarste Teil des Rezeptors, und somit von besonderem Interesse, wenn man die Interaktion zwischen Antigen und Lymphozyt ergründen will. Diese Region erhält ihre Vielfältigkeit dadurch, daß sie durch Rekombination multipler variabler (BV), zweier diversity (BD) und einiger joining (BJ) Gene zusammengesetzt ist. Diese Variabilität, die normalerweise für 9 bis 11 Aminosäuren kodiert, wird durch mögliche Additionen bzw. Deletionen noch erhöht. Die sehr große Vielfalt, die dadurch entsteht, macht es unwahrscheinlich, daß T-Zellen, die sich in der Reifungsphase befinden, zufällig identische TCR entwickeln. So kann man davon ausgehen, daß Lymphozyten mit identischen TCR-BV-BD-Bj-Anordnungen klonal durch antigenspezifische Aktivierung entstanden sind (Prinz, 2001).

Durch PCR-Analyse der variablen β-Kette des T-Zell-Rezeptors (TCR-BV) aus der Haut von Gesunden und Psoriatikern, fand sich eine Überexprimierung von BVβ2 und BVβ6 bzw. weniger ausgeprägt BVβ3 und BVβ13.1 (Menssen et al, 1995; Chang et al, 1994, 1997; Lewis et al, 1993).

Den Unterschied bedingt, daß in gesunder Haut die TCR in der β-Kette heterogen, in chronisch psoriatischer hingegen nachweislich oligoklonal sind. Dies läßt bei letzteren auf hochgradig repetitive TCR-BV-BD-Bj-Anordnungen schließen, welche auf einer Antigen-getriggerten Expansion beruhen. Auch weitere Biopsien zu einem späteren Zeitpunkt (nach 18 Monaten) bei denselben Patienten ergab, daß die gleichen T-Zell-Rearrangements wie zum früheren Zeitpunkt dominierten (Menssen et al, 1995).

In anderen Studien konnten diese Beobachtungen nicht belegt werden, obwohl eine oliklonale T-Zell-Expansion in psoriatischen Läsionen gefunden wurde (Lin et al, 2001). Diese Beobachtungen unterstützen, trotz ihrer unterschiedlichen Resultate, die Annahme, daß es sich, sowohl bei den verschiedenen Patienten, als auch bei den einzelnen Patienten, im Verlauf der Erkrankung, um das- oder dieselbe(n) Antigen(e) und reagierende(n) T-Zell-Population(en) handelt (Vollmer et al, 2001). Welcher Art diese Antigene sind, bleibt weiterhin unklar (Prinz, 1999).

Ansatz zur Identifizierung der T-Zellspezifitäten

Ein Ansatz, um den potentiellen Antigenen auf zellulärer Ebene auf die Spur zu kommen, besteht darin, T-Zell-Populationen aus psoriatischer Haut zu expandieren, spezifische Subpopulationen zu identifizieren und spezifisch zu restimulieren. Dabei muß beachtet werden, daß man in den jeweiligen Kulturen keine spezifischen Wachstumsstimuli verwendet, weil diese das spezifische T-Zell-Muster der Haut verfälschen würden. So eignen sich z.B. IL-2, anti-CD3 und inaktivierte autologe PBMC.

Die Arbeitsgruppe von Horrocks isolierte 4 T-Zell-Linien, welche mit Hilfe unspezifischer Stimulation mit Interleukin-2, anti-CD3 und inaktivierten autologen PBMC proliferierten, sich aber weder durch Extrakte aus psoriatischem Stratum Corneum, normaler Epidermis, noch einer epidermalen Keratin-Präperation stimulieren ließen (Horrocks et al, 1997). Dies verdeutlicht, wie schwierig es ist, T-Zellen in vitro zu restimulieren.

Als eine andere hilfreiche Methode, spezifische Peptide zu bestimmen, die durch T-Lymphozyten erkannt werden und deren Proliferation stimulieren, hat sich in letzter Zeit die Verwendung kombinatorischer Peptidbanken, sog. Positional Scanning Synthetic Combinatorial Libraries (PS-SCL), bewährt. Dabei lassen sich auch potentiell kreuzreagierende Sequenzen (Epitope), sowohl körpereigenen, als auch pathogenen Ursprungs identifizieren (Hemmer et al, 1999; Rubio-Godoy et al, 2002; Boggiano et al, 2003; Sospedra et al, 2003).

Bei dieser Methode ist nicht vorrausgesetzt, daß man Näheres über die zu untersuchenden T-Zell-Klone weiß, weder ihre Spezifität noch ihre MHC-Eigenschaft (Borràs et al, 2002). Ein weiterer Vorteil besteht im Vergleich zu früheren Methoden darin, daß sie weit weniger zeitlichen und materiellen Aufwand erfordern (Gundlach et al, 1995).

Das Prinzip der PS-SCL besteht darin, daß man in verschiedenen Ansätzen jeder Aminosäure auf einer Peptidsequenz (sinnvollerweise 8 bis 10 Peptide (MHC I) oder 12 bis 16 Peptide (MHC II)) (Zhao et al, 2001) einen bestimmten Platz zuweist, und den Rest des Peptides aus einer Mischung aller 19 natürlichen Aminosäuren auffüllt. Dadurch ergeben sich Millionen von Peptidzusammensetzungen, die, nach Höhe ihrer Stimulation aufgelistet, Aussagen über die Epitope, die die T-Zell-Klone erkennen, ermöglichen (Zhao et al, 2001). Die Aktivierung der T-Zellen durch diese Mischungen sollte man sowohl qualitativ, als auch quantitativ erfassen können. Dazu eignen sich z.B. 3H-Thymidin- und 51Cr-Messungen und die Erfassung der Zytokinproduktion (Borràs et al, 2002).

Vorraussetzung dieser Methode ist zum einen, daß man Klone isoliert und expandiert hat, zum anderen, daß die pathogenetische Relevanz der Zellen in vitro durch autologe Reaktivität belegt ist. Diese technischen Voraussetzungen sind bis dato für die Erforschung der Psoriasis nicht gegeben. Die vorliegende Arbeit will hierzu methodisch beitragen.