Nach 2-3 Tagen wurden die aus dem Haut-Bioptat (siehe 3.1.1.3.) ausgewanderten Zellen aufgenommen und in kleinem Volumen (200 μl) AIM-V+ (100) in eine 96-well-Rundbodenplatte umgesetzt. Je nach Dichte der Lymphozyten bzw. Proliferationsbereitschaft der Kultur wurden die Zellen auf Platten mit größeren Wells umgesetzt. Falls die Zellen unzureichend proliferierten, wurden sie mit anti-CD3 (1:5000) und anti-CD28 (1:2000) stimuliert. Wenn eine Stimulation mit anti-CD3 und anti-CD28 erfolgte, wurde mindestens 14 Tage abgewartet, bevor ein Elispot-Assay angesetzt wurde. Sobald die Zellen gut proliferierten, wurde die IL-2 Konzentration im Medium auf 40 Einheiten/ ml reduziert.

Isolierung und Verwahrung der Stimulatorzellen

Das Biopsat wurde nach Abnahme der ausgewanderten Lymphozyten, in AIM-V+ Medium inkubiert. Alle 2 bis 3 Tage wurde das Medium der Bioptate ersetzt, bzw. bei ausreichender Zelldichte, diese abgenommen, abzentrifugiert und in Einfriermedium bei –146°C kryopreserviert. Nach 4 bis 6 Wochen wurden die Biopsien verworfen. Die ausgewanderten Zellen wurden wieder aufgetaut, gepoolt und anschließend mit 30 Gy bestrahlt. Danach wurden sie gezählt und krypreseviert, bis sie als Stimulatorzellen im Elispot-Assay benötigt wurden.

Isolierung von PBMC und autologem Blutserum

Das heparinisierte Venenblut (50 ml pro Patient) wurde zu gleichen Anteilen auf 4 Reaktions- gefäße mit je 18 ml Ficoll (37 °C) verteilt, so daß sich 2 Phasen bildeten, wobei das Blut die oberste Phase ergab. Anschließend wurden die Proben 15 min mit 2200 Umdrehungen / min ohne Bremse zentrifugiert. Es bildeten sich 4 Phasen. Das Serum, welches die oberste Phase darstellte, wurde abgenommen und 45 min bei 55 °C denaturiert, danach 15 min mit 3000 Umdrehungen / min (G-Zahl) ohne Bremse zentrifugiert, der Überstand abgenommen und bei 20 °C gelagert. Die PBMC in der Interphase wurden 1:1 mit PBS verdünnt, abzentrifugiert und 5-6 mal mit PBS zur Abtrennung von Thrombozyten und Erythrozyten gewaschen, mit der Zählkammer unter dem Mikroskop gezählt, anschließend mit 30 Gray bestrahlt und in Einfriermedium erst 24 h bei –80 °C, dann bei –146 °C kryopreserviert.

γ- Interferon-Elispot-Assay Prinzip

Durch den γ-Interferon-Elispot-Assay sollte die in psoriatischen Plaques in vivo beobachtete T-Zell-Stimulation in vitro rekonstruiert werden, um die spezifische Stimulation durch autologe APC nachzuweisen. Die polyklonalen T-Zellen aus der Haut wurden mit in vitro emigrierten Zellen aus der Haut restimuliert. Als Positiv-Kontrolle wurde mit aktivierendem CD3-Antikörper stimuliert, die Negativ-Kontrolle mit reinem Medium. Bei 3 Patienten wurde zusätzlich eine Kontrolle mit autologen PBMC hinzugenommen.

Durchführung

Der Assay war auf einen Zeitraum von 3 Tagen angesetzt. Am ersten Tag wurde die PVDF-beschichtete Mikrotiterplatte mit 0,192 μg Bindungsantikörpern in 100 μl PBS/ Well beschichtet und bei RT aufbewahrt. Die Lymphozyten wurden 24 h in AIM-V+ ohne IL2 verwahrt. Nach 24 Stunden wurden 100 μl PBS pro Well auf die Milliporeplatte gegeben und die Lösung steril abgesaugt. Pro Well wurden 5x104 Lymphozyten in 100 μl AIM-V+ (40) gegeben. Dazu je 100 μl AIM-V+ mit 0,001 μg anti-CD3, 2x103 bis 3x104 Stimulatorzellen bzw. 5x103 bis 1x104 PBMC. Jeder Reaktionsansatz wurde 4 fach pro Versuch angesetzt. Die Milliporeplatte wurde anschließend 24 h in den Inkubator (37 °C) gestellt. Am letzten Tag wurde die Milliporeplatte, unter Verwendung einer Multipipette mit einem Volumen von 200 μl, 5 bis 6 mal unsteril mit PBS gespült. Anschließend wurden auf die noch mit PBS benetzten Membranen 0,25 μg Nachweisantikörper in 100 μl 4 % BSA-PBS pro Well hinzugegeben und 2 h bei RT stehen gelassen. Dann erfolgte erneutes Spülen (3mal). Auf die noch benetzten Membranen wurde dann je 0,1 μl SA-AP (in 100 μl 4% BSA-PBS) pro Well gegeben. Die Platten wurden daraufhin 1h bei RT inkubiert. Dann erfolgte wiederum Spülen mit PBS (3mal). Im Anschluß wurde 100 μl Substrat pro Well zugegeben und die Platte für 70-120 min bei 37 °C inkubiert. Danach wurden die blau gefärbten Spots unter Zuhilfenahme eines Netzgitters ausgezählt.

1.Tag

0,192 μg Bindungsantikörper in 100 μl PBS/ Well

2.Tag

steril spülen

5x104 Lymphozyten in 100 μl AIM-V+ (40)

+100 μl AIM-V+ mit 0,001 μg anti-CD3

bzw.

+2x103 bis 3x104 Stimulatorzellen

bzw.

+5x103 bis 1x104 PBMC

3.Tag

unsteril spülen

+0,25 μg Nachweisantiköper in 100 μl 4% BSA-PBS

unsteril spülen

+0,1 μl SA-AP in 100 μl 4% BSA-PBS

unsteril spülen

+100 μl Substrat

Bestimmung des Phänotyps der in vitro kultivierten Lymphozyten

Die zu untersuchenden Lymphozyten wurden aus der Kultur abgenommen und in 500 μl FACS-Puffer resuspendiert. Je 30 μl der Suspension wurden in FACS-Röhrchen gegeben (4 Proben) und anschließend mit je 2 μl der FACS-Antikörper beladen. Es handelte sich um CD3-, CD4-, CD8-, CD25-, CD69-, CD45RO- und CD45RA-Antikörper. Nach Inkubation der Proben im Dunklen (10 min bei RT), wurden diese mit 2 ml FACS-Puffer aufgefüllt und zentrifugiert. Anschließend wurde der Überstand abgegossen, die Röhrchen ausgeklopft und wiederum 500 μl FACS-Puffer hinzugegeben. Nun erfolgte die Messung der Proben mittels Durchflußzytometer (FACS).