Resultate

Etablierung des γ -Interferon-Elispot-Assays Herstellung optimaler Bedingungen für den Meßbereich:

Um ein verwertbares bzw. optimales Ergebnis bei dem γ-IFN-Elispot-Assay zu erzielen, wurden Elispot-Platten mit PVDF (Polyvinyldifluorid) -Beschichtung verwendet. Es wurde getestet, ob eine Vorbehandlung mit Äthanol sinnvoll ist, was sich nicht bestätigte, da ein zu intensiver Hintergrund auf den Platten entstand. Die optimale Lymphozytenzahl belief sich auf 5x104 Lymphozyten pro Well, da bei dieser Menge die entstehenden Spots am optimalsten ausgezählt werden konnten. Außerdem produzierten die Lymphozyten die am besten zählbaren Spots, wenn sie 24 h vor der Messung ohne IL-2 kultiviert worden waren, da sonst eine zu große Produktion an IFN-γ entstand, welche die Auswertung der Platten erschwerte. Die Zahl der verwendeten ausgewanderten Zellen variierte von 103 bis 105 Zellen pro Well. Außerdem wurde die Konzentration der Bindungs- und Nachweis-Antikörper optimiert. Optimale Bedingungen lagen bei Verwendung von 0,192 μg Bindungs-AK in 100 μl PBS/ Well und 0,25 μg Nachweis-AK in 100 μl 4 % BSA-PBS/ Well. Die optimale Inkubationszeit reichte von 75 bis 120 min.

Polyklonale T-Zell-Linien Etablierung polyklonaler T-Zell-Linien aus psoriatischen Plaques

12 gut proliferierende Kulturen aus 23 Biopsien (Alter der Patienten zwischen 26 und 81 Jahren, mittleres Alter 55 Jahre ± 14,5; 14 davon männlich) konnten etabliert werden, welche sich einfrieren und nach Wiederauftauen weiter expandieren ließen. 2 Kulturen mußten aufgrund von Kontaminationen, 9 wegen ungenügender Proliferation verworfen werden. Mit 10 dieser T-Zell-Kulturen ließ sich letztendlich eine Elispot-Assay-Versuchsreihe mit ausreichenden Durchläufen durchführen (Alter der Patienten zwischen 26 und 81 Jahren, mittleres Alter 52,6 Jahre ± 19,3; 6 davon männlich).

Phänotypisierung per FACS

Obwohl die T-Zellen in vitro unspezifisch stimuliert wurden (mit Interleukin-2, anti CD3 und gegebenenfalls CON A) zeigte sich im Verlauf, daß sich die relative Frequenz der CD4- und CD8-Zellen bedeutend veränderte (Abbildung 1). So war der Anteil der CD4-Zellen in der frühen Phase der Kultur (im Mittel nach 41 Tagen in vitro) um 56 % höher als der der CD8-Zellen. Nach 100 Tagen in vitro zeigte sich ein ganz anderes Bild: der Anteil der CD8-Zellen war nun 3 mal höher als der der CD4-Zellen. Dies ergab die FACS-Analyse von 6 T-Zell-Linien über einen Zeitraum von etwa 3 Monaten.

Abbildung 1 : Darstellung der prozentualen Anteile von CD4- bzw. CD8-Zellen in Kultur (bei n= 6 Patienten), erste Messung im Mittel nach 40,8 ± 25,2, zweite Messung nach weiteren 57,8 ± 42,9 Tagen.

Alle 10 bei dem Elispot-Assay verwendeten T-Zell-Linien wurden zum Zeitpunkt des Assays mittels FACS-Analyse phänotypisiert. Davor waren diese im Mittel 34 Tage (zwischen 21 und 85 Tagen) in Kultur gewesen. Es wurden die Oberflächenmolküle CD3, CD4, CD8 und CD69 markiert. Die Kulturen unterschieden sich beträchtlich in den gemessenen Phänotyp-Zusammensetzungen (siehe Abbildung 2 und Tabelle 1 unter 4.3.2). Auffallend war insbesondere der relativ hohe Anteil an sog. “doppelt negativen” (d.h. CD4^- CD8^-) T-Zellen.

Abbildung 2: FACS-Phänotyp von psoriatischen T-Zell-Linien im Mittel nach 34 Tagen ( 21-85 Tagen) in Kultur. Das Diagramm zeigt die gemittelten Daten von 10 Patienten.

γ-Interferon-Elispot-Assay der polyklonalen T-Zell-Linien Phänotypisierung der ausgewanderten Zellen

Die zur autologen Stimulation vorgesehenen Zellen, emigriert aus demselben Plaque - dem die expandierten T-Zell-Linien entstammten - wurden mittels FACS phänotypisiert, um die zelluläre Zusammensetzung dieser Population näher zu bestimmen. Dabei wurden die Oberflächenmoleküle CD1a, CD19, CD3, CD4, CD8 und MHC-II (= HLA-DR) markiert, um die Langerhans-Zellen, B- und T-Zellen, die wichtig für die Antigen-Präsentation sind, zu erfassen. Die ausgewanderten Zellen wurden jeweils aus Zellen gepoolt, die in einem Zeitraum von 3 Wochen aus der Hautprobe ausgewandert waren. Abbildung 3 zeigt die Verteilung der Oberflächenmarker. Bemerkenswert ist, gerade im Hinblick auf die große Heterogenität der T-Zell Linien (s.o.), daß die interindividuelle Varianz der aus den Plaques ausgewanderten Zellen relativ gering war, d.h. bei fünf unterschiedlichen Spendern waren ca. 20 % der emigrierten Zellen Langerhans-Zellen (Abbildung 3).

Abbildung 3 : FACS-Phänotypisierung der ausgewanderten autologen Zellen, die in einem Zeitraum von 3 Wochen aus dem Plaque wanderten und zur Restimulation der T-Zell-Linien dienten. Alle ausgewanderten Zellen eines Patienten wurden gepoolt. Die gezeigten Daten entsprechen Mittelwert ± Standardabweichung von n = 5 Patienten.

Abbildung 4zeigt weiterhin, daß, wiederum mit geringer interindividueller Variabilität, die Langerhans-Zellen zu etwa gleichen Teilen inaktiv bzw. aktiviert waren; jeweils 10 % der CD45+ Leukozytenpopulationen waren HLA-DR⁺ bzw. HLA-DR^-.

Abbildung 4 : Aus dem Biopsat ausgewanderte Zellen wurden über einen Zeitraum von 3 Wochen zwei - bis dreimal die Woche gesammelt und bestrahlt, um primär als Stimulatorzellen für die Elispot-Assays zu dienen. Die Daten zeigen die autologen Zellen von 5 verschiedenen Patienten, gemesen in einem Multiparameter-FACS. Lymphozyten wurden mit forward-sideward-scater gegatet, Leukozyten mittels Eingrenzung auf CD45+ Zellen.
Restimulierbarkeit polyklonaler T-Zell-Linien durch autologe Plaquezellen
Mit jeder der 10 T-Zell-Linien wurden jeweils 3 Elispot-Assay-Serien durchgeführt. Dabei wurde mittels Erfassung der IFN-γ -Sekretion durch Auszählen der entstandenen Spots, die basale Aktivität und die Aktivität durch Stimulation durch anti-CD3 und inaktivierter autologer Plaquezellen gemessen. Es ergab sich hierbei keine Korrelation zwischen dem Phänotyp der T-Zellen (CD4, CD8), ihrem Aktivierungszustand (CD69) und ihrer Aktivität im Elispot-Assay (graphisch nicht dargestellt). Trotz der hohen intraindividuellen Variabilität der absoluten Spot-Zahlen (Tabelle 1) war die relative Stimulierbarkeit deutlich reproduzierbarer.

Spots / 5x 10 ⁴ Lymphozyten

Phänotypverteilung der T-Zellen

Patient

basal

stimuliert

anti-CD3

CD4+

CD8+

DN

DP

CD69+

CD8/CD4

1

32 ± 32,5

40,3 ± 32

93 ± 73

65

31

1,6

1,9

48

2,1

2

144 ± 119

160 ± 140

171 ± 146

43

53

3,3

0,8

41

1,2

3

41 ± 31

41 ± 22

355 ± 159

13,7

65

21

0,3

65

4,7

4

37 ± 23

58 ± 43

522 ± 192

7,3

53

40

0

27

7,3

5

2,1 ± ,0

4,1 ± 2

18 ± 4

7,8

11

81

0

16

1,4

6

68 ± 95

115 ± 161

165 ± 184

0,4

43

56

0,3

53

108

7

93 ± 67

74 ± 38

262 ± 162

42

44

12

1,3

24

1,0

8

10 ± 6

26 ± 9

35 ± 15

9

89

1

1,2

37

9,9

9

7 ± 5

12 ± 5

420 ± 195

82

15

1,5

0,6

26

0,2

10

22 ± 9

36 ± 14

886 ± 313

15

78

6,3

0,5

42

5,3

Tabelle 1: Gegenüberstellung der Ergebnisse des γ-Interferon-Elispot-Assay und der Auswertung der FACS-Analyse bei 10 Patienten. Gezeigt wird (linke Tabellenhälfte) Mittelwerte ± Standardabweichung von jeweils drei unabhängigen Experimenten pro Patient, sowie (rechte Tabellenhälfte) die FACS-Phänotypisierung der für die Stimulationsversuche verwendeten T-Zell-Linien.

Weiterhin zeigt sich, daß die Stimulation der T-Zell-Linien durch autologe Zellen nur einen Bruchteil der maximalen, durch direkte Stimulation des T-Zell-Rezeptors auslösbaren, IFN-γ- Sekretion bewirkte (Abbildung 5 und Tabelle 2). Außerdem variierte die individuelle Restimulierbarkeit durch autologe Plaquezellen der 10 T-Zell-Linien stark. Zur Veranschaulichung stellen wir die prozentuale Stimulation, relativ zur Stimulation durch anti-CD3, dar (Tabelle 2). Hier zeigt sich eine Spanne von 3,2 % bis hin zu 119,3 %.

fach-Stimulation

% der CD3-Stimulation

Patient

autologe Zellen

anti-CD3

1

1,5 ± 0,4

3,2 ± 2,5

60,8

2

1,4 ± 0,6

1,2 ± 0,1

119,3

3

1,1 ± 0,4

10,8 ± 6,2

12,6

4

1,6 ± 0,4

19,0 ± 12,1

11,9

5

2,5 ± 1,3

10,9 ± 5,4

24,9

6

2,0 ± 0,5

11,2 ± 7,6

22,3

7

0,9 ± 0,2

3,0 ± 0,9

30,2

8

3,0 ± 1,4

4,9 ± 4,1

87,9

9

1,8 ± 0,4

82,9 ± 73,7

3,2

10

1,6 ± 0,1

43,4 ± 15,6

4,1

Tabelle 2 : Gegenüberstellung der fach-Stimulation durch autologe Zellen bzw. anti-CD3 bezogen auf die basale Aktivität im γ-Interferon-Elispot-Assay (jeweils drei unabhängige Experimente pro Patient) bei 10 Patienten.

Abbildung 5 : Darstellung der gemittelten fach-Stimulationen der Elispot-Assay-Versuche (3 pro Patient) der 10 T-Zell-Linien. Durch die logarithmische Skalierung wird die viel höhere Stimulierbarkeit durch anti-CD3 (rechts), im Gegensatz zu der durch autologe Zellen (links) deutlich.

Abbildung 5 verdeutlicht mittels der logarithmischen Skalierung, wie breit die Spanne der Restimulierbarkeit durch anti-CD3 ist. Die Stimulierbarkeit durch die autologen Zellen ist weit weniger breit gestreut (siehe auch Tabelle 2).

Sowohl die basale Aktivität, als auch die Aktivität durch anti-CD3-Stimulation (gemessen durch IFN-γ-Sekretion) variieren bei den 10 T-Zell-Linien erheblich. Um etwaige Trends besser identifizieren zu können, wurden die Linien daraufhin in 2 Gruppen unterteilt: in sog. “High-Responder” und “Low-Responder” (Tabelle 3). Den High-Respondern wurden die T-Zell-Linien zugeordnet, deren Aktivität durch anti-CD3-Stimulation sich in mehr als 250 Spots pro 5 x10⁴ Zellen zeigte. Dies traf genau auf die Hälfte der Linien zu.

Diese Art der Auswertung verdeutlicht, daß bei ähnlich hoher basaler Aktivität die Stimulierbarkeit durch anti-CD3 bei den sog. High Responder-Linien ca. 7-fach höher war, als bei den Low Responder-Linien.

Tabelle 3: Einteilung der 10 T-Zell-Linien in High- und Low- Responder. Die Daten repräsentieren die Mittelwerte ± Standartabweichung der Anzahl der Spots von jeweils drei unabhängigen Experimenten pro Patient.

Spots pro 5x10 ⁴ Lymphozyten

n

basal

Plaquezellen

anti-CD3

alle

10

46 ±45

57 ±48

293 ±266

High-Responder

5

40 ±33

44 ±24

489 ±241

Low-Responder

5

51 ±57

69 ±66

96 ±71

Nachdem die T-Zell-Linien in 2 Gruppen unterteilt waren, fiel auf, daß die Low-Responder, d.h. die T-Zellen, die schwach auf anti-CD3 reagierten, eine weitaus höhere Akivität gegenüber den autologen Zellen zeigten, als es die High-Responder taten (Abbildung 6a und 6b).

Abbildung 6a: Mittelwerte und Standardabweichung der fach-Stimulation im Vergleich zur basalen Aktivität von T-Zellinien stimuliert durch autologe Plaquezellen (linke Ordinate) oder anti-CD3 (rechte Ordinate). Die Daten repräsentieren die Ergebnisse aller 10 Patienten, eingeteilt in je 5 High- bzw. Low- Responder mit jeweils drei unabhängigen Experimenten pro Individuum.
Abbildung 6b : Mittelwerte der prozentualen Stimulierbarkeit der T-Zellen durch autologe Plaquezellen, bezogen auf die Aktivität bedingt durch anti-CD3. (Einzelheiten s. Legende zu Abbildung 6a).
Stimulierbarkeit polyklonaler T-Zell-Linien durch autologe PBMC
Die T-Zell-Linien wurden bei 3 Patienten sowohl mit autologen Plaquezellen als auch mit autologen PBMC restimuliert. Die Restimulierbarkeit durch autologe PBMC war sowohl im Vergleich der fach-Stimulation (um ca. 25 %), als auch des prozentualen Anteils, bezogen auf die anti-CD3-Stimulation (über 100 %) deutlich höher (Abbildung 7).

Abbildung 7 : Ergebnisse von γ-IFN-Assays bei denen psoriatische T-Zell-Linien durch autologe Plaquezellen bzw. autologe PBMC restimuliert wurden. Links ist die fach-Stimulation (bez. auf die basale Aktivität) graphisch dargestellt, rechts das prozentuale Verhältnis zur anti-CD3-Stimulation. Es wurden sechs unabhängige Experimente mit Zellen von 3 verschiedenen Patienten durchgeführt.

Isolation von T-Zell-Klonen aus psoriatischen Plaques Optimierung der Methode
Anfangs wurden die aus der Biopsie ausgewanderten Zellen CD3-positiv sortiert (MACS: s. Methodenteil). Es bildeten sich bei der nachfolgenden Klonierung mittels limitierender Verdünnung (siehe Methodenteil) jedoch keine Klone. Um die Lymphozyten schneller aus der Haut zu isolieren, wurden die Biopsien in weiteren Vorversuchen mit Kollagenase 1A vorbehandelt, und anschließend CD3-negativ sortiert, um die T-Zellrezeptoren nicht zu blockieren. Auch mit dieser Methode wuchsen keine Klone. Daraufhin wurde eine Biopsie mittels einer sog. Medimaschine mechanisch desaggregiert und anschließend die Zellen CD3-negativ sortiert, um den T-Zell-Rezeptor nicht für die nachfolgenden Stimulation zu blockieren. Die Negativ-Sortierung erfolgte mittels einer Antikörper-Mischung aus CD1-, CD19-, CD56- Antikörpern. Die Ausbeute an Klonen hierbei war allerdings ebenfalls sehr gering. Als nächstes wurde zur Isolierung aktivierter Zellen eine Sortierung mittels intrazellulärer IFN-γ Markierung versucht, die jedoch eine zu geringe Anreicherung hervorbrachte.

Schlußendlich stellte sich heraus, daß die Variante, CD25-positiv zu sortieren, sowohl für die erreichbare Reinheit, als auch für das Klonierungsergebnis die bis dahin effizienteste Methode darstellte. Die hierbei erreichte Anreicherung wurde per FACS ermittelt und ist exemplarisch in Abbildung 8 dargestellt. Durchschnittlich erreichten wir ein Aneicherungsrate von CD25+ Zellen von über 70 %. Funktionell gesehen wurde durch die Sortierung über CD25 (Interleukin-2 Rezeptor alpha Kette) auch gleichzeitig eine Anreicherung der aktivierten T-Zellen erreicht.

Abbildung 8 : FACS-Auswertung der T-Zellen von 3 Patienten vor und nach Sortierung durch magnetische Markierung mittels CD25. Die Markierung umgrenzt diejenigen T-Zellen, die relevant für die Klonierung (CD25⁺ = aktiviert ) waren. Die rechts angegebenen Faktoren ergeben sich aus der relativen Anreicherung der T-Zellen nach der Sortierung.
Restimulation der Klone eines Probanden durch autologe Plaquezellen
Die Klone, die durch Limiting Dilution aus einer T-Zell-Linie isoliert wurden, ließen sich durch anti-CD3 und autologe Zellen restimulieren (dargestellt in Abbildung 9a und 9b).

Abbildung 9a : Mittelwerte der Interferon-γ-Elispot-Assays mit den 3 Klonen eines Patienten (jeweils durchgeführt in Triplikaten). Dargestellt sind die basale Aktivität und die absolute Stimulation der Klone durch autologe Plaquezellen und durch anti-CD3.

Abbildung 9b : Mittelwerte der Ergebnisse der Elispot-Assays mit den 3 Klonen eines Patienten (jeweils durchgeführt in Triplikaten). Dargestellt ist fach-Stimulation durch autologe Zellen und anti-CD3 bezogen auf die basale Aktivität der T-Zellen der Klone.

Im Vergleich zu den polyklonalen T-Zell-Linien, zeigten die Klone eine 6 mal höhere Aktivität auf autologe Plaquezellen, bezogen auf die Stimulation durch anti-CD3 und eine um den Faktor 1,8 höhere Aktivität, bezogen auf die basale IFN-γ-Sekretion (Tabelle 4).

fach-Stimulation bezogen auf basale Aktivität

T-Zell-Linien

T-Zell-Klone

anti-CD3

6,4 ± 3,7

1,9 ± 1,3

autologe Plaquezellen

1,2 ± 1,2

2,2 ± 1,5

Tabelle 4: Gegenüberstellung der fach-Stimulation der Mittelwerte der Ergebnisse des IFN-γ-Elispot-Assays (jeweils 3 Experimente pro Patient) von 10 T-Zell-Linien im Veleich zu den Ergebnissen dreier T-Zell-Klone eines Patienten.