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2  Einleitung

2.1 Adipositas und die Blutgefäße

Adipositas ist zu einem bedeutenden Gesundheitsproblem in den westlichen Industriestaaten geworden (McLellan et al., 2002). Fast 60 Prozent der erwachsenen amerikanischen Bevölkerung sind übergewichtig, mit steigender Prävalenz auch in der jugendlichen Bevölkerung und mit negativen Folgen für Morbidität und Mortalität (Must et al., 1999).

Adipositas ist häufig assoziiert mit Hypertonus, Dyslipidämie und Diabetes mellitus Typ II, den drei wichtigsten kardiovaskulären Risikofaktoren für das Auftreten von Atherosklerose und kardiovaskulären Krankheiten (Chen et al., 1999). Übergewicht ist als unabhängiger kardiovaskulärer Risikofaktor in den Brennpunkt der aktuellen Forschung geraten, mit dem Ziel, den genauen Zusammenhang zwischen Adipositas und kardiovaskulären Erkrankungen zu erforschen.

Verschiedene einschlägige epidemiologische Studien konnten früh belegen, dass es eine enge Korrelation zwischen kardiovaskulären Erkrankungen und Adipositas gibt. Bereits 1967 konnte in der Framingham-Studie gezeigt werden, dass ein erhöhtes Risiko für Angina pectoris und plötzlichen Herztod für adipöse Männer und Frauen besteht (Kannel et al., 1967). Das gilt sowohl für Individuen, die an hohem Blutdruck und erhöhtem Serum-Cholesterin leiden, als auch für solche, die diesbezüglich nicht belastet sind. Bereits hier wurde postuliert, dass es einen von anderen Risikofaktoren unabhängigen Beitrag der Übergewichtigkeit für die Entwicklung von kardiovaskulären Erkrankungen gibt (Kannel et al., 1967).

In neuen Ergebnissen der Framingham-Studie konnte bewiesen werden, dass ein erhöhter BMI einen weitgehend unabhängigen Risikofaktor für Herzversagen darstellt (Kenchaiah et al., 2002). Die Autoren konnten zeigen, dass bereits der Anstieg des BMI vom Normalwert (18,5-24,9) zu übergewichtigen Werten (25,0-29,9) mit einer Erhöhung des Risikos für ein kardiovaskuläres Ereignis um fünf Prozent bei Männern und sieben Prozent bei Frauen einhergeht. Übergewicht allein ist in elf Prozent der Fälle bei Männern und 14 Prozent der Fälle bei Frauen allein für Herzversagen [Seite 7↓]verantwortlich. Das kardiovaskuläre Risiko ist auch erhöht, wenn der Bauchumfang (Waist Circumference, WC) als Kriterium für abdominale Fettleibigkeit verwendet wird (Peiris et al., 1989). Diese epidemiologischen Zahlen belegen den engen Zusammenhang von Übergewicht und kardiovaskulären Krankheiten. Über die zugrunde liegenden Mechanismen herrscht jedoch weitgehende Unklarheit.

2.2 Die arteriellen Blutgefäße

Die essentielle Bluthochdruckkrankheit des Menschen geht mit einem erhöhten Blutdruck bei initial normalem Herzminutenvolumen einher (Mulvany et al., 1976). Der totale periphere Widerstand (TPR) ist dabei erhöht. Alle Gefäße im menschlichen Körper nehmen an der Determination des TPR teil, jedoch ist der Anteil und die Bedeutung kleinerer Arterien und Arteriolen am Gesamtwiderstand größer (Mulvany et al., 1976). Kleine Arterien und Arteriolen sind entscheidende Determinanten des Blutdrucks. Durch Kontraktion und Relaxation der arteriellen Blutgefäße wird der TPR und damit der Blutdruck reguliert. Schäden an den Blutgefäßen, wie zum Beispiel jene am Endothel im Rahmen der Atherosklerose und der endothelialen Dysfunktion, sind wichtige ätiopathologische Schritte auf dem Weg zu kardiovaskulären Erkrankungen. Daher konzentrieren sich seit Jahren intensive Forschungsbemühungen auf die einzelnen Schichten der Blutgefäße, um ihren pathophysiologischen Beitrag zur Entwicklung kardiovaskulärer Erkrankungen zu klären (Drexler, 2000).

2.2.1 Das Endothel der Blutgefäße

Das Endothel ist die innerste Schicht der Blutgefäße. Es ist auf der dem Lumen zugewandten Seite in direktem Kontakt mit der Blutströmung und auf der dem Lumen abgewandten Seite in unmittelbarem Kontakt mit der Gefäßmuskulatur. Das Endothel wurde lange Zeit lediglich als eine das Lumen auskleidende Schicht ohne Funktion angesehen. Die Entdeckung der endothelialen Vasodilatation änderte diese Sichtweise.


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2.2.1.1  Endothelium-Derived Relaxing Factor (EDRF)

1980 entdeckten Furchgott und Zawadzki, dass das Endothel vasoaktive Substanzen produziert (Furchgott et al., 1980). In Organbad-Experimenten an isolierten Gefäßringen konnten sie zeigen, dass für die Azetylcholin-abhängige Vasodilatation ein intaktes Endothel notwendig ist. Sie folgerten, dass die Endothelzellschicht der Blutgefäße einen Faktor produzieren muss, der relaxierend auf die Gefäßmuskelzellen wirkt und nannten ihn, ohne Kenntnis seiner molekularen Struktur Endothelium-Derived Relaxing Factor (EDRF). Dieser Faktor konnte in der Folgezeit als Stickstoffmonoxid (NO) identifiziert werden (Vanheel et al., 1994). Nach der Bestätigung der Ergebnisse in vivo an Tiermodellen, konnte schon 1986 das Prinzip der Regulation des Gefäßtonus durch das Endothel klinisch am Menschen getestet und betätigt werden (Ludmer et al., 1986). Die Ergebnisse bestätigten, dass arteriosklerotische Gefäße nicht in der Lage sind, NO nach Stimulation durch Acetylcholin freizusetzen. In der weiteren Forschung wurde NO als ein Schutzfaktor der Arterie angesehen. Die Fähigkeit des Endothels NO zu produzieren hilft, die ischämischen Auswirkungen der Atherosklerose zu verhindern (Egashira et al., 2002).

Mittlerweile ist die Substanz NO sehr gut untersucht. Besondere Bedeutung hat es vor allem in großen Gefäßen. Dort wird es als Antwort auf physikalische Stimuli, wie zum Beispiel eine vergrößerte Schubspannung oder durch rezeptorabhängige Agonisten, wie Bradykinin und Azetylcholin, freigesetzt. Die Wirkung von NO ist in vielen verschiedenen Gefäßen beschrieben worden. Seine relaxierende Wirkung ist zum Beispiel an der Mesenterialarterie der Ratte (Garland et al., 1992) und an der Aorta der Ratte (Vanheel et al., 1994) gezeigt worden.

Durch die oben genannten Stimuli erhöht sich die Kalziumkonzentration in der Endothelzelle. Die NO-Synthase wird aktiviert, die die Aminosäure L-Arginin zu NO und Citrullin umsetzt. NO aktiviert die Guanylatzyklase, die GTP zu cGMP umsetzt. Dadurch wird die Proteinkinase G aktiviert, die mit der Phosphorylierung von Proteinen über verschiedene Mechanismen, wie z.B. die Aktivierung von Ionenkanälen, der Reduktion der Kalziumsensitivität des kontraktilen Systems, der Inhibierung des Inositriphosphatrezeptors, die globale intrazelluläre [Seite 9↓]Kalziumkonzentration in der glatten Muskelzelle senkt und damit eine Relaxation erzeugt (Carvajal et al., 2000).

2.2.1.2 Prostazyklin (PGI2)

Das Endothel produziert außer NO noch eine Vielzahl anderer Substanzen, die relaxierend auf die glatte Gefäßmuskulatur wirken und damit den TPR modulieren: Aus der Arachidonsäure wird über die Zyklooxygenase (COX) Prostazyklin (PGI2) gebildet. Prostazyklin führt über eine Konzentrationserhöhung von cAMP ebenfalls zu einer Relaxation von glatten Gefäßmuskelzellen. Das geschieht durch die Ausfuhr von Kalzium (Ca2+) aus dem Zytosol und durch Verminderung der Kalziumsensitivität des kontraktilen Systems und Aktivierung von Kaliumkanälen der Zellmembran. Es ist beschrieben worden, dass KATP-Kanäle durch PGI2 aktiviert werden. (Jackson et al., 1993; Nakashima et al., 1995; Parkington et al., 1993).

2.2.1.3 Endothelium-Derived Hyperpolarizing Factor (EDHF)

Im Laufe der Endothel-Forschung ist es zu der Beobachtung gekommen, dass die endothelbedingte Hyperpolarisation und nachfolgende Relaxation der Arterien nicht ausschließlich über NO und PGI2 erklärt werden konnten (Cowan et al., 1991; Ding et al., 2000). Es wurde die Hypothese aufgestellt, dass ein weiterer Faktor vom Endothel gebildet werden muss, der diese Wirkung vermittelt. Nach Hemmung der NO-Synthase (z.B. durch LNNA) und der COX (z.B. durch Indometacin) konnte weiterhin eine Dilatation erzeugt werden. Da die NO/PGI2-unabhängige Vasodilatation mit einer Hyperpolarisation der glatten Muskelzellen verbunden war, wurde angenommen, dass ein weiterer Faktor der endothelabhängigen Vasodilatation existiert. Man gab ihm den Namen EDHF, Endothelium-Derived Hyperpolarizing Factor (Busse, 2002; Campbell, 1996; Quilley, 1997).

EDHF verursacht eine Hyperpolarisation der glatten Muskelzellen, aus der eine Vasodilatation durch Inhibition von spannungsabhängigen Kalziumkanälen (Nagao et al., 1992) resultiert. Diese Veränderung des Membranpotentials muss durch eine [Seite 10↓]Veränderung des Kalium-Flusses zustande kommen, da ein Anheben der Kaliumkonzentration auf 25-40 mM oder die Inhibition spezifischer Kaliumkanäle, wie BK- und SK-Kanäle, die EDHF-Wirkungen blockiert (Dora et al., 2001; Nagao et al., 1992).

Als Kandidaten für EDHF gelten Epoxide der Arachidonsäure (Adeagbo et al., 1993; Cowan et al., 1991; Mombouli et al., 1997). Über das Zytochrom-P-450-System (CYP 450) findet im Endothel die Umwandlung der Arachidonsäure in kurzlebige Epoxide statt: Epoxyeikosatriensäure (EET) (Campbell et al., 1996; Campbell et al., 1999; Quilley et al., 2000; Quilley et al., 1997). Verschiedene EETs mit unterschiedlichen Wirkungen an unterschiedlichen Blutgefässen konnten identifiziert werden, wie 5,6-, 8,9-, 11,12-, 14,15-EET und auch Hydroxyeikosatetraensäuren wie 20- und 19-HETE. Für Koronararterien des Schweins wurde nachgewiesen, dass 14,15 EET eine Vasorelaxation durch Öffnung von KCa 2+-Kanälen bewirkt (Campbell et al., 1999; Campbell et al., 2002; Lauterbach et al., 2002). Lauterbach et al. zeigten an Zerebralarterien der Ratte, dass auch die Epoxyeikosatetraensäure 17,18-EETeTR, ein Epoxid der Eikosapentaensäure (EPA), zu einer Aktivierung von BK-Kanälen führt (Lauterbach et al., 2002).

Abb. 2.1: Einfluss des Endothels auf die glatte Gefäßmuskulatur. Modell der endothelabhängigen Vasodilatation. Die Endothelzelle produziert über die Zyklooxygenase Prostaglandine, z.B. PGI2 und über die NO-Synthase NO. Durch Aktivierung der Adenylatzyklase und Guanylatzyklase in der glatten Gefäßmuskelzelle kommt es zur Aktivierung von Proteinkinasen, PKA und PKG, wodurch Kaliumkanäle, wie KATP- und BK-Kanäle, geöffnet werden. Außerdem existiert ein weiterer Faktor der endothelabhängigen Vasodilatation: EDHF. Als Kandidaten für diesen noch nicht einheitlich identifizierten Faktor gelten Epoxyeikosatriensäuren (EETs) und Epoxyeikosatetraensäuren (EETeTRs), die über das Zytochrom-P-450-System der Endothelzelle gebildet werden. Zielstruktur in der glatten Gefäßmuskelzelle sind ebenfalls Kaliumkanäle, wie BK-Kanäle. Die Öffnung von Kaliumkanälen führt zu verstärktem Kaliumausstrom, zu Hyperpolarisation der Zellmembran und zur Relaxation der glatten Gefäßmuskelzelle.

2.2.2 Die Media der Blutgefäße

2.2.2.1 Glatte Gefäßmuskelzellen

Die glatten Gefäßmuskelzellen der kontraktilen Schicht der Blutgefässe, der Media, regulieren durch Kontraktion und Dilatation die Weite des Gefäßlumens und damit den Strömungswiderstand des Blutes. Eine wichtige Funktion haben hierbei die Kaliumkanäle der Zellmembran, die das Membranpotential der arteriellen glatten Muskelzellen regulieren (Nelson et al., 1995). Das Öffnen der K+-Kanäle in der Zellmembran erhöht den K+-Ausstrom, wodurch das Membranpotential hyperpolarisiert wird. Das führt zum Schließen spannungsabhängiger Ca2+-Kanäle, zu einem geringeren Ca2+-Einstrom in die Gefäßmuskelzelle und damit zu Vasodilatation. Viele endogene Vasodilatatoren wirken über die Aktivierung von Kaliumkanälen. Die Inhibierung von Kaliumkanälen verursacht Membrandepolarisation, die zu Vasokonstriktion führt (Nelson et al., 1995).

2.2.2.2 Die Kaliumkanäle der glatten Gefäßmuskelzelle

Vier Gruppen von K+-Kanälen wurden bisher im glatten Muskel identifiziert (Nelson et al., 1995):


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2.2.2.2.1

ATP-abhängige K+ (KATP)-Kanäle

2.2.2.2.2

Einwärtsgerichtete K+ (Kir)-Kanäle

2.2.2.2.3

Ca2+-aktivierte K+ (KCa 2+)-Kanäle

2.2.2.2.4

Spannungsabhängige K+(KV)-Kanäle

2.2.2.2.1 KATP-Kanäle

KATP-Kanäle, die zuerst am Herzen entdeckt wurden (Noma et al., 1983), finden sich in einer Vielzahl von Geweben, wie zum Beispiel der β-Zelle des Pankreas und bestimmten Neuronen (Ashcroft et al., 1990). Sie sind auch in der glatten Gefäßmuskulatur von Aorta und der Mesenterialarterie lokalisiert (Quayle et al., 1994). Diese Kanäle zeichnen sich dadurch aus, dass sie durch intrazelluläres ATP geschlossen werden (Nelson et al., 1995). Damit haben sie eine wichtige Aufgabe im zellulären Stoffwechsel. Außerdem werden sie durch eine Reihe endogener Vasodilatatoren aktiviert. Die resultierende Hyperpolarisation der Zellmembran verursacht Vasodilatation (Nelson et al., 1995).

KATP-Kanäle sind in unterschiedlichen Geweben verschiedenartig exprimiert. Ein KATP-Kanal setzt sich zusammen aus einer Kir6.x-Untereinheit (Kir 6.1 oder Kir 6.2) und einem Sulfonylharnstoff-Rezeptor-Subtyp, SUR1 oder SUR2 (Wang, 2003). Die Kir6.x-Untereinheit bildet die Pore des Kanals, während die SUR-Region die regulatorische Untereinheit darstellt. Die physiologischen Eigenschaften eines KATP-Kanals sind abhängig von der Zusammensetzung dieser Untereinheiten.

Verschiedene endogene Vasodilatatoren wirken über eine Aktivierung von KATP-Kanälen. Adenosin ist ein potenter Vasodilatator von Koronararterien. Es aktiviert KATP-Ströme in Koronararterien via A1-Rezeptor (Dart et al., 1993). Ein weiterer endogener Vasodilatator, der KATP-Kanäle aktiviert, ist Calcitonin Gene Related Peptide (CGRP). Es aktiviert den Kanal über den Adenylatcyclase-Proteinkinase-A-Weg (Quayle et al., 1994). Das legt nahe, dass auch andere endogene Vasodilatatoren über diesen Signaltransduktionsweg wirken könnten.

Ein selektiver KATP-Kanal-Blocker ist Glibenclamid (halbmaximaler Block 20-100 nM, keine Antagonisierung anderer Kalium-Kanäle bei 10 µM)(Nelson et al., 1995). [Seite 13↓]Tetrapenthylammonium (TPeA) ist in der Konzentration von 10 µM ebenfalls ein KATP-Kanal-Blocker (Kovacs et al., 1991), blockt jedoch in der Konzentration von 1,49 mM (EC50) auch BK-Kanäle (Yao et al., 2000). Cromakalim (100 nM) ist ein Öffner des KATP-Kanals (Nelson et al., 1995).

2.2.2.2.2 Kir-Kanäle

Kir-Kanäle sind in sehr kleinen Gefäßen des mesenterialen, koronaren und zerebralen Stromgebiets der Größe 200 µm nachgewiesen worden (Edwards et al., 1988; Hirst et al., 1986; Quayle et al., 1993).

Sie sind einwärts rektifizierend und leiten einwärts gerichtete Strömungen bei Membranpotentialen negativ zum Kalium-Gleichgewichtspotential (EK) in größerem Maße als kleinere auswärts gerichtete Strömungen bei Membranpotentialen positiv zu EK (Nelson et al., 1995).

Die Kir-Kanäle, die bis jetzt in arteriellen glatten Muskelzellen identifiziert wurden, gehören zur Kir–Subfamilie Kir2 (Bradley et al., 1999). Kir-Ströme in isolierten Glattmuskelzellen von zerebralen, koronaren und mesenterialen Arterien der Ratte scheinen beispielsweise durch Kir2.1, aber nicht Kir2.2 und Kir2.3, vermittelt zu sein (Zaritsky et al., 2000). Molekulare Untersuchungen zeigten, dass in Mesenterialarterien der Ratte nur Kir2.1 exprimiert wird (Bradley et al., 1999; Dora et al., 2001).

Kir-Kanäle werden durch Barium-Ionen (Ba2+) in der Konzentration von 2 µMhalbmaximal blockiert (Nelson et al., 1995).

2.2.2.2.3 KCa 2+-Kanäle

Die KCa 2+-Kanäle bilden eine heterogene Familie, deren Vertreter in drei Klassen eingeteilt werden: Ca2+-aktivierte K+ (KCa 2+)-Kanäle großer- (BK), mittlerer- (IK), und kleiner- (SK) Leitfähigkeit. KCa 2+-Kanäle finden sich in nahezu allen glatten Gefäßmuskelzellen und erfüllen dort vielfältige Aufgaben (Nelson et al., 1990).


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In glatten Gefäßmuskelzellen werden KCa 2+-Kanäle großer Leitfähigkeit (BK) in der Zellmembran durch lokal begrenzte intrazelluläre Ca2+-Freisetzung, genannt Ca2+-Sparks, durch die Aktivierung von Ryanodin-Rezeptoren aktiviert (Gollasch et al., 1998; Nelson et al., 1995). Ca2+-Sparks führen zu Hyperpolarisation der Zellmembran, reduziertem Ca2+-Influx in die Zelle und damit zu Vasodilatation (Gollasch et al., 2000). Der BK-Kanal ist aus zwei Untereinheiten aufgebaut, α- und β1-Untereinheit. In Experimenten mit BKβ1-knockout-Mäusen konnte gezeigt werden, dass die β1-Untereinheit für die Feineinstellung der Eigenschaften des BK-Kanals für die Anforderungen der VSMC entscheidend ist (Brenner et al., 2000; Plüger et al., 2000). So spielt die BKβ1-Untereinheit eine entscheidende Rolle in der Regulation des menschlichen Baroreflexes und damit der Blutdruckregulation (Gollasch et al., 2002).

BK-Kanäle werden durch die Skorpiontoxine Charybdotoxin (halbmaximaler Block bei 1-10 nM) und Iberiotoxin (halbmaximaler Block bei 1-10 nM), sowie durch Tetrapentylammonium (TEA) blockiert (halbmaximaler Block bei 1 mM) (Nelson et al., 1995). Charybdotoxin und Iberiotoxin blocken weder KV, KATP noch Kir, während TEA als unspezifischer Kaliumkanalblocker in einer EC50-Konzentration von 10mM auch KV-Kanäle blockiert, in der Konzentration von 1 mM aber weder KATP noch Kir (Nelson et al., 1995). BK-Kanäle sind im glatten Gefäßmuskel, nicht jedoch im Endothel der Blutgefäße, exprimiert (Mistry et al., 1998).

KCa 2+-Känale mittlerer Leitfähigkeit (IK-Kanäle) sind nicht in der glatten Gefäßmuskelzelle selbst lokalisiert, sondern im Endothel der Gefäßmuskulatur (Crane et al., 2003; Doughty et al., 1999; Edwards et al., 1998; Walker et al., 2001). Diese Kanäle spielen eine wichtige Rolle in der endothelabhängigen Vasodilatation. Die Aktivierung der IK-Kanäle führt zur Hyperpolarisation der Endothelzelle und nachfolgender Hyperpolarisation und Relaxation der vaskulären Glattmuskelzelle. Die Wirkung von EDHF geschieht auf diesem Weg (Busse et al., 2002). Die IK-Kanäle werden von Charybdotoxin (1-10nM) geblockt (Dora et al., 2001).

KCa 2+-Kanäle kleiner Leitfähigkeit (SK-Kanäle) sind sowohl in der Endothelzelle (Crane et al., 2004; Edwards et al., 1998) als auch in der glatten Muskelzelle der Blutgefäße präsent (Gauthier et al., 2004). Die Kanäle werden typischerweise von [Seite 15↓]Apamin geblockt (EC50, 1 µM). Deren Öffnungswahrscheinlichkeit ist nicht spannungsabhängig (Kohler et al., 1996). SK-Kanäle sind vielfältig in die Prozesse der endothelabhängigen Vasodilataion involviert (Crane et al., 2003). Verschiedene Autoren belegen die Beteiligung des Apamin-sensitiven Kanals an der NO-Wirkung (Murphy et al., 1995; Qiu et al., 2001).

2.2.2.2.4 KV-Kanäle

KV-Kanäle bilden verschiedene Unterfamilien. Einige von ihnen sind in glatten Muskelzellen nachgewiesen worden (Clement-Chomienne et al., 1996; Cole et al., 1996), wie zum Beispiel in menschlichen Mesenterialgefäßen (Smirnov et al., 1992). KV-Kanäle bestehen, wie auch die KCa 2+-Kanäle, aus einerporenbildenden α- und einer modulatorischen β-Untereinheit (Thorneloe, 2001). Ein KV-Kanal setzt sich aus vier porenbildenden K-Untereinheiten und vier regulatorischen K-Untereinheiten zusammen. K Proteine werden von neun verwandten Familien enkodiert, KV1-9. KV1-4. Diese Proteine formen homotetramere Kanäle oder vereinigen sich mit Mitgliedern der selben Familie zu heterotetrameren Kanälen (Martens et al., 1999). Zusätzliche Verschiedenheit wird erreicht, wenn sich KV1α-Untereinheiten mit verschiedenen K-Untereinheiten zusammenlagern. Für K-Proteine kodieren 4 Gene, KVβ1-4 wobei Splice-Varianten von KVβ1 und KVβ2 identifiziert worden sind (Accili et al., 1997; Heinemann et al., 1996; Rhodes et al., 1997; Trimmer et al., 1998).

KV-Kanäle werden geöffnet, wenn das Membranpotential der Zelle depolarisiert wird(Hille et al., 1992; Knot et al., 1995). Der Kaliumausfluss durch KV-Kanäle erhöht sich mit der Depolarisation auf Grund der spannungsabhängigen Aktivierung. Der elektrochemische Gradient für den K+-Ausfluss aus der Zelle nimmt zu. Auf diese Weise verhindern sie eine weitere Depolarisation. Nach der Depolarisation werden sie inaktiviert. Die Aktivität des 4-AP-sensitiven KV-Kanals wird von Agonisten beeinflusst, die über den Signaltransduktionsweg der Proteinkinase A und C wirken (Waldron et al., 1999).

Der selektivste KV-Kanal-Blocker im glatten Gefäßmuskel ist 4-AP (halbmaximaler Block bei 1 mM) (Robertson et al., 1994). 4-AP blockt weder Kir- noch KCa 2+-Kanäle in der Konzentration, in der es KV-Kanäle inhibiert, während es KATP-Kanäle bei einer [Seite 16↓]EC50-Konzentration von 0,2 mM blockt (Nelson et al., 1995). Auch andere Stoffe, wie 3,4-Diaminopyridin inhibieren KV-Kanäle effektiv (halbmaximaler Block bei 1 mM) (Jaggar et al., 1998a).

2.2.2.3 Intrazelluläre Signaltransduktionsmoleküle

Eine wichtige Rolle für die Weiterleitung der Informationen extrazellulär zirkulierender Botenstoffe an intrazelluläre Effektoren spielen intrazelluläre Signaltransduktionsmoleküle. Hierbei wird ein extrazellulärer Stimulus über die rezeptorgebundene Aktivierung von G-Proteinen und subsequente Aktivierung von Proteinkinasen weitergeleitet. In VSMC sind Proteinkinase A, G und Tyrosinkinase wichtige intrazelluläre Signaltransduktionsmoleküle, die verschiedenste Antworten der Zelle, so auch kontraktile Antworten modulieren können (Jaggar et al., 1998b; Muller et al., 1996). In Adipozyten sind intrazelluläre Signaltransduktionsmoleküle ebenfalls an der Weiterleitung hormonaler Informationen beteiligt. (Anderson el al., 1993; Fredriksson et al., 2000; Klein et al., 1999; Lindquist et al., 2000; Sordella et al., 2003).

2.2.2.3.1 Proteinkinase A (PKA)

Das intrazelluläre Signaltransduktionsmolekül PKA spielt eine wichige Rolle in vaskulären glatten Muskelzellen (Jaggar et al., 1998b; Muller et al., 1996). Für die glatte Gefässmuskulatur konnte gezeigt werden, dass die Proteinkinase A sich in kleinen Arterien, die einen myogenen Tonus aufbauen, in aktiviertem Zustand befindet (Schubert et al., 1999). Selektive Inhibition der Proteinkinase A durch H-89 resultierte in einer Kontraktion des untersuchten Gefäßes, was zu der Schlussfolgerung führte, dass die PKA an der Aufrechterhaltung des myogenen Tonus beteiligt ist. Der Effekt der PKA wird teilweise auf die Aktivierung von BK-Kanälen zurückgeführt (Schubert et al., 1999). Auch für die Wirkung der endogenen Vasodilatatoren Adenosin und CGRP ist die Aktivierung der Proteinkinase A von Bedeutung. Adenosin, das eine bedeutende Rolle in der hypoxischen Vasodilatation [Seite 17↓]und ischämieinduzierten Hyperämie spielt, scheint zum Teil über eine Öffnung von KATP-Kanälen zu wirken (Kleppisch et al., 1995b).

In Adipozyten spielt der β-adrenerge Weg der PKA-Aktivierung ebenfalls eine wichtige Rolle für verschiedenste zelluläre Funktionen. Die Rezeptoren des adrenergen Systems sind in Adipozyten exprimiert (Klein et al., 1999). Auch hier findet man den „klassischen“ Weg der PKA-Aktivierung von β-Rezeptor-Aktivierung, Gs- und Adenylatzyklasen-Aktivierung, Erhöhung der intrazellulären cAMP-Konzentration und schließlich Aktivierung der PKA. Für die β3-adrenerge Aktivierung von Transkriptionsfaktoren in braunen Adipozyten ist eine PKA-vermittelte Phosphorylierung von Bedeutung (Lindquist et al., 2000). Ebenso konnte gezeigt werden, dass die Expression des potenten angiogenetischen Faktor VEGF in Primärkulturen brauner Adipozyten der Ratte durch PKA vermittelt wird (Fredriksson et al., 2000).

2.2.2.3.2 Tyrosinkinase (TK)

Der Signaltransduktionsmechanismus der Tyrosinkinase ist sowohl am glatten Muskel (Murphy et al., 2002; Murphy et al., 2001; Spurrell et al., 2000; Yan et al., 2002), als auch in Adipozyten (Fredriksson et al., 2000; Klein et al., 1999; Lindquist et al., 2000; Sordella et al., 2003) von Bedeutung. Die Tyrosinphosphorylierung ist ein wichtiger regulatorischer Mechanismus für die Zellfunktion. Das gilt nicht nur für wachstumsbezogene Antworten der Zelle, wie Gentranskription und Zellteilung, sondern auch für schnelle zelluläre Antworten, wie Muskelkontraktion (Spurrell et al., 2000).

In der glatten Muskulatur ist für Kalziumkanäle eine Beteiligung der Tyrosinkinase nachgewiesen worden. Die Blockade der Tyrosinkinase durch Genistein und Tyrphostin, aber nicht durch Daidzein reduzierte die Aktivität der L-Typ-Kalzium-Kanäle. Diese Kanäle scheinen teilweise über Tyrosinkinase reguliert zu werden (Keef et al., 2001). In der α1-adrenergen Vasokonstriktion spielt die Signaltransduktion über Tyrosinkinase ebenfalls eine Rolle (Yan et al., 2002).


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In Adipozyten besitzt die Tyrosinkinase vielfältige Funktionen. Die Tyrosinphosphorylierung durch Tyrosinkinase ist in die insulinabhängige Glukoseaufnahme in Fettzellen involviert (Klein et al., 1999). Hier konnte auch eine Interaktion mit adrenergen, PKA-abhängigen Mechanismen festgestellt werden (Klein et al., 1999).

2.2.2.3.3 Proteinkinase G (PKG)

Im glatten Gefäßmuskel fungiert PKG als Vermittler vasorelaxierender Effekte, so in der Wirkungskausalität von Stickstoffmonoxid (NO). Das NO aktiviert die Guanylatzyklase, die GTP zu cGMP umsetzt. Dadurch wird Proteinkinase G aktiviert, die dann die NO-Wirkung über verschiedene Mechanismen vermittelt (Cohen et al., 1995). Durch die aktivierte PKG werden verschiedene Zielproteine phosphoryliert, darunter kalziumkontrollierende Enzyme, Ionenpumpen und Ionenkanäle (Carvajal et al., 2000). Die Aktivierung des BK-Kanals durch die cGMP-abhängige Proteinkinase spielt eine wichtige Rolle in der Vermittlung der NO-Wirkung am glatten Gefäßmuskel (Robertson et al., 1993).

2.2.3 Die Adventitia und das perivaskuläre Fettgewebe

Die Adventitia umschließt die Blutgefäße nach außen. Sie ist zwischen der Gefäßmuskulatur und den umgebenden Organen und Strukturen gelegen und dient als Stützschicht für die Blutgefäße. Sie besteht aus Zellen, vor allem Fibroblasten, Bindegewebe, elastischen Fasern und Fettzellen und ist stark innerviert (Gutterman et al., 1999).

2.2.3.1 Arten des perivaskulären Fettgewebes

Man kann Fettgewebe in braunes und weißes Fett unterteilen. Beides hat unterschiedliche Aufgaben und Baupläne. Braunes Fettgewebe kommt beim Menschen nahezu ausschließlich beim Säugling vor. Es hat hier vor allem [Seite 19↓]temperaturschützende Aufgaben und verschwindet fast vollständig beim Erwachsenen. In Ratten gibt es auch bei erwachsenen Tieren unterschiedliche Anteile braunen und weißen Fettgewebes (Cinti et al., 2000).

2.2.3.2 Fettgewebe: Eigenschaft und Funktion

Unterschiedliche Studien haben nachgewiesen, dass das Fettgewebe ein endokrin aktives, sekretorisches Organ ist. Es sezerniert eine Vielzahl von Substanzen, die das innere Milieu des Körpers beeinflussen (Engeli et al., 2000; Sharma et al., 2001).

Verschiedene Vertreter des Angiotensinsystems, wie Angiotensinogen, Angiotensin-Converting-Enzyme und Angiotensin-Rezeptoren wurden im Fettgewebe identifiziert (Cassis et al., 1988; Engeli et al., 2002; Engeli et al., 2001). Die Stimulierung der Angiotensin-I- und Angiotensin-II-Rezeptoren in Adipozyten lösen eine Freisetzung von Prostazyklin aus Adipozyten aus (Darimont et al., 1994).

Fettgewebe ist eine Produktionsstätte für Prostaglandine. Vorherrschend finden sich PGE2 und PGI2, die beide potente Vasodilatatoren sind. In situ Studien mit Mikrodialysetechnik im Fettgewebe der Ratten zeigten, dass Prostaglandine eine große Rolle betreffs des lokalen Metabolismus spielen, da das Fettgewebe außerdem hormonell reguliert ist (Crandall et al., 1997).

Zwei weitere Substanzen, denen kürzlich in der Forschung viel Aufmerksamkeit geschenkt wurde, sind Leptin und Adiponektin. Sie eröffnen interessante Perspektiven in der Rolle des Fettgewebes für das Gefäßsystem.

Leptin wird hauptsächlich vom weißen Fettgewebe produziert (Kimura et al., 2000). Die Produktion ist bei Übergewichtigen erhöht (Considine et al., 1996). Jüngere Untersuchungen zeigten, dass Leptin eine signifikante Rolle in der Pathogenese des Adipositas-bezogenen Bluthochdrucks spielen kann (Engeli et al., 2000). In einer anderen Studie konnte demonstriert werden, dass Leptin auch vasodilatierende Wirkungen auf die Mesenterialarterie der Ratte hat. In den in vitro Experimenten relaxierte das Leptin die Gefäßringpräparationen dosisabhängig (Kimura et al., 2000). Die Vasorelaxation durch Leptin war endothelabhängig und durch NO vermittelt.


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Adiponektin ist ein in Adipozyten produziertes Hormon. Es hat primäre Aufgaben in der Energiehomöostase und im Insulin-Metabolismus (Zhang et al., 2002). Die Expression und daraus resultierende Serumspiegel von Adiponektin sind bei Menschen und Tieren mit Insulin-Resistenz und Übergewicht erniedrigt (Arita et al., 1999). In Untersuchungen an Adiponektin-knockout-Mäusen, sowie klinischen Untersuchungen, konnte darüber hinaus ein Zusammenhang zwischen Hypoadiponektämie und endothelialer Dysfunktion hergestellt werden. Bei hypertensiven, übergewichtigen Patienten bestand eine signifikante Korrelation zwischen erniedrigten Adiponektin-Serumspiegeln und einer beeinträchtigten endothelabhängigen Vasorelaxation (Ouchi et al., 2003).

2.3 Die Entdeckung des Adventitium-Derived Relaxing Factor (ADRF)

1991 hat die Arbeitsgruppe um Lisa Cassis zeigen können, dass perivaskuläres Fettgewebe die Gefäßspannung der Aorta im in vitro Experiment beeinflusst (Soltis et al., 1991). Gefäßringpräparationen wurden dabei in einen Myographen eingespannt und isometrische Kontraktionsmessungen durchgeführt. Die Gruppe um Cassis entdeckte, dass das periadventitielle Fettgewebe der Aorta eine antikontraktile Wirkung auf durch Norepinephrin kontrahierte Aorta-Segmente der Ratte hatte. Durch elektrische Feldreizung induzierte Kontraktionen des Gefäßmuskels wurden durch das die Blutgefäße umgebende perivaskuläre Fettgewebe gehemmt. Es wurden gleiche kontraktile Antworten auf hohe Molaritäten KCl bei den Präparaten (+)fat und (-)fat gefunden. Der beobachtete antikontraktile Effekt des periadventitiellen Fettgewebes in vitro wurde über eine verstärkte Wiederaufnahme von Norepinephrin in die sympathischen Nervendigungen und eine dadurch abgeschwächte Wirkung des sympathisch-adrenergen Nervensystems gedeutet (Soltis et al., 1991).

Im Jahre 2002 ist die Idee von Soltis et al. erneut aufgegriffen worden. Man untersuchte die Wirkung des perivaskulären Fettgewebes auf die Gefäßkontraktion am Modell der thorakalen Aorta der Ratte. Löhn et. al. wählten einen Versuchsansatz mit zwei Gruppen von Gefäßringpräparationen. In der einen Gruppe wurde das [Seite 21↓]periadventitielle Fettgewebe nicht entfernt, die Gefäßringe blieben in intaktem Zustand [Gefäßringe (+)fat]. In der anderen Gruppe entfernte man das die Gefäße umgebende Fettgewebe [Gefäßringe (-)fat] (Löhn et al., 2002).

In den isometrischen Kontraktionsmessungen zeigte sich, dass die Gefäßringe (+)fat eine abgeschwächte kontraktile Antwort auf vasokontrahierende Agonisten haben (Löhn et al., 2002). Durch mechanisches Enfernen des Endothels, sowie den Einsatz von Antagonisten der endothelabhängigen Vasodilatation (Inhibition des NO-Systems durch NG-Nitro-L-Arginin, LNNA, 300 µM, der COX, Indometazin, 300 µM, sowie des Zytochrom-P-450-Systems durch 17-ODYA, 10 nM) konnte die Beteiligung des Endothels an dem beobachteten antikontraktilen Effekt ausgeschlossen werden. Durch Einsatz von Kaliumkanalantagonisten wurde nachgewiesen, dass bei Blockade von glattmuskulären Kaliumkanälen (v.a. Blockade von KATP-Kanälen mit Glibenclamid, 3 µM) die antikontraktile Wirkung aufgehoben werden konnte (Löhn et al., 2002).

Durch Bioassay-Experimente wurde nachgewiesen, dass das perivaskuläre Fettgewebe einen humoralen, transferablen Faktor sezerniert, der antikontraktil auf die Muskulatur der Aorta wirkt (Löhn et al., 2002). Der Faktor wurde Adventitium-Derived Relaxing Factor (ADRF) genannt. Abbildung 2.2 zeigt eine Modellvorstellung einer dualen Regulation des Gefäßwiderstandes durch Endothel und periadventitielles Fettgewebe unter Einbeziehung der von Löhn et. al. gewonnenen Erkenntnisse (Löhn et al., 2002).


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Abb. 2.2.: Modell der dualen Regulation des Gefäßtonus durch Endothel und Adventitia/perivaskuläres Fettgewebe. Zusätzlich zu den Mechanismen der endothelabhängigen Vasodilatation (Siehe Abb. 2.1) wird ein humoraler, transferabler Faktor aus der Adventitia bzw. dem periadventitiellen Fettgewebe freigesetzt: Adventitium-Derived Relaxing Factor (ADRF). Seine Wirkungsweise besteht vermutlich in der Öffnung von glattmuskulären Kaliumkanälen, der Hyperpolarisation der Zellmembran und daraus resultierender Relaxation der Gefäßmuskelzelle.


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2.4  Hypothese und Herleitung der Aufgabenstellung

Im ersten Teil der vorliegenden Arbeit sollen zelluläre Mechnismen der Freisetzung von ADRF aus dem perivaskulären Fettgewebe der Aorta untersucht werden. Nachdem in vorangehenden Studien beschrieben wurde, dass die antikontraktile Wirkung durch einen eigenständigen, transferablen Faktor vermittelt wird, sollen nun die näheren Bedingungen der Freisetzung und Wirkung erörtert werden.

Im zweiten Teil der Arbeit soll gezeigt werden, ob und inwieweit das periadventitielle Fettgewebe einen antikontraktilen Effekt auf die Mesenterialarterie der Ratte ausübt. Ihre anatomischen Nähe zu Widerstandsarterien und die daraus erwachsene größere Bedeutung für die Regulation des Gesamt-Gefäßwiderstands ist dabei von Interesse. Des weiteren soll überprüft werden, ob auch hierbei Kaliumkanäle eine Rolle spielen.

Im Einzelnen wird folgenden Hypothesen nachgegangen:

Teil I:

Welche zelluläre Mechanismen liegen der Freisetzung von ADRF aus dem periadventitiellen Fettgewebe der Rattenaorta zugrunde?

Teilhypothesen:

  1. Ist die Freisetzung von ADRF aus dem perivaskulären Fettgewebe der Aorta kalziumabhängig?
  2. Ist der antikontraktile Effekt von ADRF reversibel, der Faktor auswaschbar?
  3. Welche Rolle spielen PKA, PKG und TK bei der Freisetzung und Wirkung von ADRF?

Teil II:

Übt das periadventitielle Fettgewebe des Durchblutungsgebiets der Mesenterialarterie einen antikontraktilen Effekt auf die glatte Gefäßmuskulatur der Mesenterialarterie der Ratte aus?


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Teilhypothesen:

  1. Gibt es unterschiedliche Dosis-Wirkungs-Beziehungen auf vasoaktive Hormone bei Gefäßringen (+)fat und (-)fat?
  2. Welche Rolle spielen Kaliumkanäle bei der antikontraktilen Wirkung des perivaskulären Fettgewebes in der Mesenterialarterie?
  3. Welcher glattmuskuläre Kaliumkanaltyp ist möglicherweise an der Vermittlung des antikontraktilen Effekts des perivaskulären Fettgewebes in der Mesenterialarterie beteiligt?


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28.09.2005