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3  Material und Methoden

3.1 Versuchstiere

Es wurden Aorten und Mesenterialarterien männlicher Sprague-Dawley-Ratten (Gewicht: 200-300g, Alter ca. 8 Wochen) verwendet. Die Haltung der Versuchstiere entsprach Standardlaborbedingungen: Raumtemperatur 20°C, relative Luftfeuchtigkeit 40-50%, 12-stündiger Tag-Nacht-Rhytmus. Die Tiere wurden mit Pressfutter und Wasser ernährt, entsprechend der Standardlaborbedingungen im MDC-Tierhaus.

3.2 Präparation der Untersuchungsgefäße

3.2.1 Präparation der Mesenterialarterie

Die Versuchstiere wurden mit Diethylether betäubt und mit einem Dekapitator (TSE, Bad Homburg) getötet. Die Bauchdecke wurde geöffnet, das Colon transversum dargestellt und durchtrennt. Das Mesenterium mit den Mesenterialarkaden wurde am Übergang des Jejunums zum Zökum durchschnitten und aufsteigend vom Zökum bis zum Abgang der A. mesenterica superior aus der Aorta vom Darm abgesetzt. Die Mesenterialarterie wurde am Abgang aus der Aorta abgetrennt. Das Präparat wurde schnell in eisgekühlte (4°C), begaste (95% O2, 5%CO2) PSS-Lösung (in mM: 119 Natriumchlorid, 4,7 Kaliumchlorid, 1,2 Kaliumdihydrogenphosphat, 25 Natriumhydrogenkarbonat, 1,2 Magnesiumsulfat, 11,1 Glukose, 1,6 Kalziumchlorid) transferiert und sofort präpariert.

Das entnommene Präparat wurde in eine Petrischale transferiert, die ebenfalls eisgekühlte und begaste PSS enthielt, und an beiden Seiten mit dünnen Nadeln auf dem Agarosebett befestigt. Unter einem Mikroskop (Nikon SMZ 645) wurden zwei verschiedene Präparationen angefertigt. Die Mesenterialarterie wurde dargestellt und in vier gleich große Stücke geschnitten, die jeweils dem Teil der Arterie kurz vor [Seite 26↓]Übergang in den 2. Abschnitt der Mesenterialarkaden entsprachen. Bei zwei der vier Stücke wurde vorsichtig das sie umgebende periadventitielle Fettgewebe entfernt, während es bei den anderen beiden Stücken intakt gelassen wurde. Die Gefäße (-)fat hatten einen äußeren Durchmesser von ~ 950 µm, entsprechend einem inneren Durchmesser von ~ 650 µm. Die belassene Menge des Fetts entsprach ungefähr dem doppelten Durchmesser des Gefäßlumens, die Ringe (+)fat hatten damit einen äußeren Gefäßdurchmesser von ~ 1200 – 1700 µm. Für bestimmte Experimente (Siehe Abschnitt 4.2.2) wurde 50% des die Mesenterialarterie umgebenden Fettgewebes longitudinal entfernt.

Die präparierten Gefäßringe wurden in den zuvor vorbereiteten Gefäßmyographen (Vessel Myograph, Firma Danish Myo Technologies, DMT Multimyograph Model 610M, Aarhus, Dänemark) eingespannt. Der Myograph (siehe Abbildung) wurde mehrfach mit PSS ausgespült, das Badvolumen des Organbads dann mit PSS

Abb. 3.1: Der Myograph DMT-610M der Firma Danish Myo Technologies (Quelle: http:\\www.dmt.dk).

gefüllt. Die Gaszufuhr wurde angeschlossen, um eine kontinuierliche Begasung des Organbads zu gewährleisten. Die Lösung wurde auf 37°C vorgeheizt. Diese Bedingungen wurden im Verlauf des Experiments so aufrecht erhalten. Das Volumen des Organbads betrug 5 ml.


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Die Gefäßringe wurden jetzt mit größter Sorgfalt von der eisgekühlten Präparationslösung in das vorbereitete Organbad gegeben. Unter Mikroskopsicht wurden zwei Stahldrähte der Stärke 0,0394 mm, Belastbarkeit bis 0,022 Kg mit größter Behutsamkeit in das Lumen der Gefäßringpräparationen eingebracht und vorsichtig zwischen Kraftaufnehmer und Lastarm des Myographen eingespannt (Siehe Abb. 3.2).

Abb. 3.2: Schematische Zeichnung des Aufbaus des DMT-610M (Quelle: ). Erläuterungen im Text.

Die eingespannten Gefäßringe wurden jetzt kalibriert, indem sie schrittweise auf 2 mN vorgespannt und eine Stunde so belassen wurden, bis die Spannung konstant auf 2 mN eingestellt war und auf diesem Niveau gehalten werden konnte.

3.2.2 Präparation der Aorta

Die Tötung der Ratte geschah wie oben beschrieben. Nach Aufschneiden der Bauchdecke und kompletter Durchtrennung des Sternums wurde die Aorta [Seite 28↓]dargestellt, indem Leber, Milz, Lunge und Thymus abpräpariert wurden. Die Aorta thoracica wurde vom Herz getrennt und entlang der Wirbelsäule vorsichtig freigelegt und bis zum Übergang in die Aorta abdominalis verfolgt. Am Durchtritt durch das Zwerchfell wurde sie durchtrennt, entnommen und sofort in eisgekühlte und begaste PSS transferiert.

Die weitere Präparation erfolgte unter dem Mikroskop (Nikon SMZ 645). Es wurden ebenfalls zwei Versuchsgruppen gebildet. Pro Aorta wurden zwei Stücke mit periadventitiellem Fettgewebe (+)fat und zwei Stücke ohne Fett (-)fat präpariert. Anschließend erfolgte das Einspannen der Gefäßringe in den zuvor vorbereiteten Myographen für größere Gefäße (Hugo Sachs Elektronik, HSE, Freiburg Deutschland). Zwei kleine Stahldrähte (Durchmesser 0,6 mm) wurden in das Lumen der Gefäßringe eingeführt. Einer der beiden Drähte war mit dem Kraftaufnehmer verbunden (Modell F-30, HSE, Freiburg) und die Gefäßringe wurden über eine Stunde schrittweise auf eine Vorspannung von 2g eingestellt (Löhn et al., 2002). Das Badvolumen betrug 20 ml (Siehe Abbildung).

Abb. 3.3: Aufbau des Myographen für die Aorta. Erläuterungen im Text. Modifiziert nach (Löhn et al., 2002).


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3.3  Isometrische Kontraktionsmessungen an der Mesenterialarterie

3.3.1 Das Prinzip der isometrischen Kontraktionsmessungen

Das Ziel des Versuchsaufbaus zur Untersuchung kleiner Blutgefäße dient dem Schaffen experimenteller Bedingungen in vitro, die der Situation der Blutgefäße in vivo so ähnlich wie möglich sind. Das beinhaltet zum Einen die Imitation der Spannungsverhältnisse im Blutgefäß, sowie zum Anderen einer physiologischen trophischen Situation im Organbad für die Dauer des Experiments.

Die Blutgefäße im Körper von Säugetieren sind den Aufgaben des Kreislaufsystems entsprechend von Blut durchströmt, das die Gefäßwand in einen Dehnungszustand versetzt. Dieser Dehnungszustand ist abhängig von den elastischen Eigenschaften des Gefäßes und dem transmuralen Druck, der im wesentlichen dem intravasalen Druck des Blutgefäßes entspricht.

Der transmurale Druck erzeugt im Blutgefäß in Umfangsrichtung eine tangentiale Wandspannung, die von der Größe des transmuralen Drucks, der Wanddicke und des Innenradius abhängt (Caro et al., 1978).

Die Amplitude der Kraftentwicklung ist in Folge der Interaktion der Aktin- und Myosinfilamente in allen Muskeln längenabhängig (Huxley et al., 1969). Optimale Kraftentfaltung wird bei einem Optimum an Vorspannung erreicht, bedingt durch den dadurch optimalen Abstand der Aktin-/Myosinfilamente.

Um eine physiologische Situation herzustellen, wurde das Gefäßmuskelpräparat zuerst einer Vorspannung ausgesetzt, die in Relation zum Durchmesser des Gefäßes stand. Diese Vorspannung, im vorliegenden Fall 2 mN (Angus et al., 2000), wurde über eine Stunde aufrecht erhalten und schrittweise nachreguliert, bis das Gefäß auf diesen Wert kalibriert war.

Um die trophische Situation für die Dauer des Experiments (3-4 Stunden) der Situation im Körper anzugleichen, wurde kontinuierlich mit 95% O2, 5% CO2 begast, woraus ein pH-Wert von 7,4 resultierte. Die Temperatur wurde auf 37°C eingestellt, die applizierten Lösungen bei 37°C zugegeben.


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3.3.2  Protokolle

Nach der Vorspannungsphase wurden die Gefäßringe noch einmal auf eine Kraft von 2 mN justiert und es erfolgte eine ca. dreiminütige Probeaufzeichnung. Dann folgte die Applikation einer 60 mM KCl-Lösung. Die Erhöhung der extrazellulären Kaliumkonzentration hat einen depolarisierenden Effekt auf die Gefäßmuskelzellen (auf ca. –20 mV). Sie führt zu einem erhöhten spannungsabhängigen Ca2+-Einstrom in die Gefäßmuskelzellen und zu einer maximalen Kontraktion der Gefäßmuskulatur (Gollasch et al., 1995). Eine initiale Applikation von 60 mM KCl-Lösung wurde allen Versuchen vorangestellt.

Protokoll 1.1: Dosis-Wirkungskurven

Bei der Anfertigung der Dosis-Wirkungskurven wurden die untersuchten vasokonstriktorischen Agonisten in kumulativ steigenden Dosen zugegeben. Es wurde zuerst 60 mM KCl-Lösung appliziert, anschließend ausgewaschen und danach in PSS rekalibriert. Danach wurden die Agonisten appliziert. Das Zugeben der nächst höheren Dosis erfolgte erst dann, wenn das Plateau der Kontraktion erreicht war. Tabelle 1.1 gibt einen Überblick über die applizierten Dosen der vasokonstriktorischen Agonisten.

Tab. 1.1.: Folgende Dosen wurden für die einzelnen Agonisten appliziert:

Wirkstoff

Dosis

Serotonin

 

10 – 100 – 300 – 700 nM – 1 – 2 – 3,5 – 5 – 6,5 µM

Phenylephrin

 

3 – 10 – 30 – 100 – 300 nM – 1 – 3 – 10 – 30 µM

Endothelin I

 

1 – 3 – 10 – 20 – 30 – 50 nM

U 46619

 

1 – 3 – 10 – 30 – 100 – 300 nM


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Protokoll 1.2: Versuche mit Cromakalim

In diesem Protokoll wurde nach der initialen Stimulation mit 60 mM KCl, sowie anschließendem Auswaschen und Rekalibrieren, der vasokonstriktorische Agonist Serotonin (2 µM) appliziert. Auf dem Plateau der Kontraktionsphase wurde dann der vasodilatatorische KATP-Kanalöffner Cromakalim (100 nM) hinzugeben.

Protokoll 1.3: Inkubation mit Kaliumkanalblockern

In diesen Versuchen wurde ebenfalls zunächst KCl appliziert, danach ausgewaschen und rekalibriert. Es erfolgte die Auslösung einer Kontraktion durch Zugabe von Serotonin (2 µM). Das Wirkmaximum wurde abgewartet, dann Serotonin ausgewaschen und das Gefäß wieder auf 2 mN rekalibriert. Im nächsten Schritt wurden die entsprechenden Kaliumkanalblocker in das Organbad zugegeben. Es wurde Einwirkzeit von 15-20 Min abgewartet, damit sich die Substanzen zur optimalen extrazellulären Wirkung gleichmässig im Badvolumen verteilen konnten. Danach wurde erneut Serotonin appliziert. Der Endpunkt dieses Protokolls war mit der Plateauphase der zweiten Gefäßkontraktion erreicht. Bei der Auswertung war dann die Intensität der Kontraktion vor und nach Applikation des Kaliumkanalblockers von Interesse. Tabelle 1.2 gibt einen Überblick über die eingesetzten Kaliumkanalblocker. Über die Wirkstoffe wurde berichtet, dass sie in der angewendeten Dosierung spezifisch für die Blockade des entsprechenden Kaliumkanals sind (Kohler et al., 1996; Kovacs et al., 1991; Nelson et al., 1995)

Tabelle 1.2 Dosierungen der angewendeten Kaliumkanalantagonisten:

Wirkstoff

Dosis

3,4-Diaminopyridin (3,4-DAP)

1 μM

4-Aminopyridin (4-AP)

2 mM

Apamin

1 μM

Glibenclamid

3 μM

Ibertotoxin (IbTx)

100 nM

Tetraethylammonium (TEA)

1 mM

Tetrapenthylammonium (TPeA)

10 µM


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3.3.3  Datenerfassung

Die vom Kraftaufnehmer registrierten Tonusänderungen wurden in mN registriert, vom Computerprogramm Myodaq 2.01 M610+ gegen die Zeit abgenommen und graphisch dargestellt sowie auf einem PC gespeichert.

3.3.4 Datenanalyse und statistische Auswertung

Die Daten wurden mit dem Computerprogramm Myodaq 2.01 M610+ normalisiert. Die maximale Antwort auf Inkubation mit 60 mM KCl-Lösung wurde als 100 % gesetzt.

Die Erfassung und Speicherung der Daten erfolgte in Excel-Tabellen. Zur Auswertung und graphischen Darstellung wurden sie in die Computerprogramme SigmaPlot 7 oder Origin 7.0 übertragen.

Die Datenanalyse und statistische Auswertung erfolgte mittels des Computerprogramms SigmaStat (Jandel Scientific, USA).

Die Daten wurden als arithmetische Mittelwerte berechnet. Als Streuungsmaß diente die Standardabweichung des Mittelwerts (SEM). Alle Messwerte wurden als Mittelwerte +/- SEM angegeben. Der Term „n“ steht für die Anzahl der gemessenen Gefäßringe. Zur Signifikanzprüfung kamen der STUDENT t-Test für unabhängige und verbundene Stichproben zur Anwendung. Messungen am gleichen Gefäßring wurden als verbundene Stichproben paarweise verglichen (Protokolle 1.2 und 1.3). Vergleiche der Messergebnisse von Gefäßringen (+)fat und (-)fat wurden mit dem t-Test für unverbundene Stichproben getestet (Protokoll 1.1, 1.2, 1.3). Ein Unterschied wurde als signifikant angenommen, wenn die Irrtumswahrscheinlichkeit bei p<0,05 lag.

Die weitere Bearbeitung der in Origin 7,0 erstellten Graphen erfolgte mittels des Computerprogramms Corel Draw 9.


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3.4  Isometrische Kontraktionsmessung an der Aorta

Die Gefäßringe wurden für die Dauer einer Stunde schrittweise auf eine Vorspannung von ca. 2 g eingestellt. Verwendete Lösungen, sowie Einstellungen bezüglich der Temperatur und Begasung entsprachen dem oben Beschriebenen.

3.4.1 Protokolle

Protokoll 2.1: Inkubation mit Inhibitoren der verschiedener Proteinkinasen

Nach Kontraktion mit 60 mM KCl, Auswaschen und Rekalibrieren, erfolgte eine Kontraktion mit Serotonin in der Konzentration 0,7 µM, 1,0 µM, 2,0 µM. Nach erneutem Auswaschen und Rekalibrieren erfolgte die 15-20 minütige Inkubation mit dem entsprechenden Inhibitor der PKA (H-89, 9 µM), PKG (KT5823, 2 µM) und TK (Tyrphostin A25, AG82), 10 µM). Danach wurde erneut Serotonin appliziert. Die Unterschiede in der maximalen Kontraktion vor und nach Inkubation mit dem entsprechenden Antagonisten waren von Interesse.

Über die angewendeten Wirkstoffe wurde berichtet, dass sie in der applizierten Dosierung spezifisch für die selektive Blockierung der Enzyme sind. Für die Blocker der Tyrosinkinase Genistein und Tyrphostin (Wang et al., 2002) und die inaktiven Genistein-Homologa ST638 und Daidzein (Wang et al., 2002) wurde dies belegt. Der Wirkstoff H-89 blockt die PKA (Schubert et al., 1999; Wellman et al., 1998), aber auch die Rho-Kinase (Feng et al., 1999; Leemhuis et al., 2002; Shum et al., 2003) und die PKG (Brunetti et al., 2002). Tabelle 1.3 gibt eine Überblick über die angewendeten Dosierungen der Wirkstoffe.

Tabelle 1.3: Dosierungen der angewendeten Wirkstoffe

Wirkstoff

Dosis

Daidzein

10 μM

Genistein

10 μM

H-89

9 μΜ

KT-5823

0.5 μM

ST-638

10 μM

Tyrphostin A25 (AG82)

10 μM


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Protokoll 2.2: Bioassay

In diesem Versuchsansatz sollte der Freisetzungsmechanismus von ADRF erforscht werden. Zu diesem Zweck kam ein Bioassay zum Einsatz, wie es bereits bei der Erstbeschreibung von ADRF angewendet wurde (Löhn et al., 2002).

Nach der initialen Kontraktion mit KCl wurden beide Gruppen von Gefäßringen mit Serotonin (0,7 µM, 1,0 µM, 2,0 µM) kontrahiert. Die Gefäßringe (+)fat wurden mit einem Antagonisten des entsprechenden Signaltransduktionswegs [PKA (H-89, 9 µM), PKG (KT5823, 2 µM) und TK (Tyrphostin A25, 10 µM)] inkubiert und erneut mit Serotonin (2 µM) stimuliert. Die Organbadkammer mit den Gefäßringen (+)fat wurde „Donor“ genannt, da das periadventitielle Fettgewebe als Donor für ADRF fungiert. Im Folgenden wurde auf der Plateauphase der Kontraktion mit 2 µM Serotonin Flüssigkeit aus dem Organbad entnommen und in die Organbadkammer mit den Gefäßringen (-)fat gegeben, die „Akzeptor“ genannt wurde. Die glatten Gefäßmuskelzellen sind die Effektoren von ADRF.

Bei dem Gegenexperiment wurden die „Akzeptor“-Gefäßringe, das heißt die Ringe (-)fat, mit dem Inhibitor des entsprechenden Enzymsystems inkubiert. Die Flüssigkeit, die aus dem Organbad mit den „Donor“-Gefäßringen [(+)fat] ohne Zugabe eines inhibitorischen Wirkstoffs gewonnen wurde, wurde appliziert.

Ziel dieses Versuchsaufbaus war es, differentielle Aussagen über den Mechanismus der Freisetzung bzw. Wirkung von ADRF machen zu können. Indem zwischen Donor, der Seite der Gefäßringe (+)fat, in der vermutlich ADRF freigesetzt wird, und Akzeptor, der Seite der Gefäßringe (-)fat, unterschieden wird, lassen sich Rückschlüsse auf zugrunde liegende Mechanismen der Freisetzung oder Wirkung ziehen.


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Abb. 3.4.: Skizze des Versuchsaufbaus der Badwechsel-Experimente: In der Organbadkammer, die mit „Donor“ gekennzeichnet ist, sind die Gefäßringe (+)fat lokalisiert, Ort der ADRF-Freisetzung. Als „Akzeptor (Acceptor)“ ist die Organbadkammer mit den Gefäßringen (-)fat gekennzeichnet, Wirkort von ADRF. Entsprechend des eingesetzten Protokolls erfolgte ein Austausch bestimmter Mengen der Organbadflüssigkeit (Pfeil). Quelle: (Löhn et al., 2002).

Protokoll 2.3: Bioassay ohne Kalziumionen

Die Donor-Gefäßringe wurden mit unterschiedlichen Konzentrationen von Kalziumionen vorinkubiert (0 mM, O,3 mM, 1,0 mM, 1,6 mM, 2,5 mM, 5,0 mM, 10mM), und mit 2 µM Serotonin kontrahiert. Es wurden Aliquots dieser Lösung (jeweils 5 ml) in die Akzeptor-Organbadkammer transferiert. Das Organbadvolumen betrug 20 ml, das Transferintervall 15-20 Min.

3.4.2 Datenerfassung und Auswertung

Die Daten wurden mit dem Computerprogramm HSE-Acad erfasst, und mit einem Papieraufzeichnungsgerät graphisch dargestellt und ausgewertet. Alle Messwerte wurden als Mittelwerte ± SEM angegeben und mit STUDENT t-Test für verbundene und unverbundene Stichproben auf statistische Signifikanz geprüft. Unterschiedliche Messungen am gleichen Gefäßring wurden als verbundene Stichproben paarweise verglichen. Vergleiche der Messergebnisse von Gefäßringen (+)fat und (-)fat wurden mit dem t-Test für unverbundene Stichproben getestet. Die Unterschiede waren signifikant, wenn p<0,05. Der Term „n“ steht für die Zahl der untersuchten Gefäßringe.


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3.5  Reagenzien und Chemikalien

Folgende Reagenzien und Chemikalien wurden verwendet:

3,4-Diaminopyridin (3,4-DAP)

Sigma, Deisenhofen

4-Aminopyridin (4-AP)

Sigma, Deisenhofen

5-Hydroxytryptamin (Serotonin)

Sigma, Deisenhofen

Agarose

Roth, Karlsruhe

Apamin

Sigma, Deisenhofen

Azetylcholin (ACh)

Sigma, Deisenhofen

Cromakalim

Sigma, Deisenhofen

Daidzein

Calbiochem, Beeston, Nottingham, UK

Diethylether

Roth, Karlsruhe

Dimethylsulfoxid

Sigma, Deisenhofen

Endothelin I

Sigma, Deisenhofen

Ethanol absolut

Merck, Darmstadt

Genistein

Calbiochem, Beeston, Nottingham, UK

Glibenclamid

Sigma, Deisenhofen

Glukose

Merck, Darmstadt

H-89

Calbiochem, Beeston, Nottingham, UK

Kaliumchlorid (KCl)

Merck, Darmstadt

Kaliumdihydrogenphosphat

Merck, Darmstadt

Kalziumchlorid

Merck, Darmstadt

KT5823

Calbiochem, Beeston, Nottingham, UK

Karbogen

Linde Gas AG, Höllriegelskreuth

Magnesiumsulfat-Heptahydrat

Merck, Darmstadt

Natriumchlorid

Merck, Darmstadt

Phenylephrin

Sigma, Deisenhofen

ST628

Calbiochem, Beeston, Nottingham, UK

Tetraethylammoniumchlorid

Sigma, Deisenhofen

Tetrapentylammoniumchlorid

Sigma, Deisenhofen

Tyrphostin A25 (AG82)

Calbiochem, Beeston, Nottingham, UK

U46619

Sigma, Deisenhofen


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28.09.2005