Das Ziel des Versuchsaufbaus zur Untersuchung kleiner Blutgefäße dient dem Schaffen experimenteller Bedingungen in vitro, die der Situation der Blutgefäße in vivo so ähnlich wie möglich sind. Das beinhaltet zum Einen die Imitation der Spannungsverhältnisse im Blutgefäß, sowie zum Anderen einer physiologischen trophischen Situation im Organbad für die Dauer des Experiments.

Die Blutgefäße im Körper von Säugetieren sind den Aufgaben des Kreislaufsystems entsprechend von Blut durchströmt, das die Gefäßwand in einen Dehnungszustand versetzt. Dieser Dehnungszustand ist abhängig von den elastischen Eigenschaften des Gefäßes und dem transmuralen Druck, der im wesentlichen dem intravasalen Druck des Blutgefäßes entspricht.

Der transmurale Druck erzeugt im Blutgefäß in Umfangsrichtung eine tangentiale Wandspannung, die von der Größe des transmuralen Drucks, der Wanddicke und des Innenradius abhängt (Caro et al., 1978).

Die Amplitude der Kraftentwicklung ist in Folge der Interaktion der Aktin- und Myosinfilamente in allen Muskeln längenabhängig (Huxley et al., 1969). Optimale Kraftentfaltung wird bei einem Optimum an Vorspannung erreicht, bedingt durch den dadurch optimalen Abstand der Aktin-/Myosinfilamente.

Um eine physiologische Situation herzustellen, wurde das Gefäßmuskelpräparat zuerst einer Vorspannung ausgesetzt, die in Relation zum Durchmesser des Gefäßes stand. Diese Vorspannung, im vorliegenden Fall 2 mN (Angus et al., 2000), wurde über eine Stunde aufrecht erhalten und schrittweise nachreguliert, bis das Gefäß auf diesen Wert kalibriert war.

Um die trophische Situation für die Dauer des Experiments (3-4 Stunden) der Situation im Körper anzugleichen, wurde kontinuierlich mit 95% O₂, 5% CO₂ begast, woraus ein pH-Wert von 7,4 resultierte. Die Temperatur wurde auf 37°C eingestellt, die applizierten Lösungen bei 37°C zugegeben.

Die Daten wurden mit dem Computerprogramm Myodaq 2.01 M610+ normalisiert. Die maximale Antwort auf Inkubation mit 60 mM KCl-Lösung wurde als 100 % gesetzt.

Die Erfassung und Speicherung der Daten erfolgte in Excel-Tabellen. Zur Auswertung und graphischen Darstellung wurden sie in die Computerprogramme SigmaPlot 7 oder Origin 7.0 übertragen.

Die Datenanalyse und statistische Auswertung erfolgte mittels des Computerprogramms SigmaStat (Jandel Scientific, USA).

Die Daten wurden als arithmetische Mittelwerte berechnet. Als Streuungsmaß diente die Standardabweichung des Mittelwerts (SEM). Alle Messwerte wurden als Mittelwerte +/- SEM angegeben. Der Term „n“ steht für die Anzahl der gemessenen Gefäßringe. Zur Signifikanzprüfung kamen der STUDENT t-Test für unabhängige und verbundene Stichproben zur Anwendung. Messungen am gleichen Gefäßring wurden als verbundene Stichproben paarweise verglichen (Protokolle 1.2 und 1.3). Vergleiche der Messergebnisse von Gefäßringen (+)fat und (-)fat wurden mit dem t-Test für unverbundene Stichproben getestet (Protokoll 1.1, 1.2, 1.3). Ein Unterschied wurde als signifikant angenommen, wenn die Irrtumswahrscheinlichkeit bei p<0,05 lag.

Die weitere Bearbeitung der in Origin 7,0 erstellten Graphen erfolgte mittels des Computerprogramms Corel Draw 9.

Protokoll 2.1: Inkubation mit Inhibitoren der verschiedener Proteinkinasen

Nach Kontraktion mit 60 mM KCl, Auswaschen und Rekalibrieren, erfolgte eine Kontraktion mit Serotonin in der Konzentration 0,7 µM, 1,0 µM, 2,0 µM. Nach erneutem Auswaschen und Rekalibrieren erfolgte die 15-20 minütige Inkubation mit dem entsprechenden Inhibitor der PKA (H-89, 9 µM), PKG (KT5823, 2 µM) und TK (Tyrphostin A25, AG82), 10 µM). Danach wurde erneut Serotonin appliziert. Die Unterschiede in der maximalen Kontraktion vor und nach Inkubation mit dem entsprechenden Antagonisten waren von Interesse.

Über die angewendeten Wirkstoffe wurde berichtet, dass sie in der applizierten Dosierung spezifisch für die selektive Blockierung der Enzyme sind. Für die Blocker der Tyrosinkinase Genistein und Tyrphostin (Wang et al., 2002) und die inaktiven Genistein-Homologa ST638 und Daidzein (Wang et al., 2002) wurde dies belegt. Der Wirkstoff H-89 blockt die PKA (Schubert et al., 1999; Wellman et al., 1998), aber auch die Rho-Kinase (Feng et al., 1999; Leemhuis et al., 2002; Shum et al., 2003) und die PKG (Brunetti et al., 2002). Tabelle 1.3 gibt eine Überblick über die angewendeten Dosierungen der Wirkstoffe.

Wirkstoff

Dosis

Daidzein

10 μM

Genistein

10 μM

H-89

9 μΜ

KT-5823

0.5 μM

ST-638

10 μM

Tyrphostin A25 (AG82)

10 μM

Tabelle 1.3: Dosierungen der angewendeten Wirkstoffe

Protokoll 2.2: Bioassay

In diesem Versuchsansatz sollte der Freisetzungsmechanismus von ADRF erforscht werden. Zu diesem Zweck kam ein Bioassay zum Einsatz, wie es bereits bei der Erstbeschreibung von ADRF angewendet wurde (Löhn et al., 2002).

Nach der initialen Kontraktion mit KCl wurden beide Gruppen von Gefäßringen mit Serotonin (0,7 µM, 1,0 µM, 2,0 µM) kontrahiert. Die Gefäßringe (+)fat wurden mit einem Antagonisten des entsprechenden Signaltransduktionswegs [PKA (H-89, 9 µM), PKG (KT5823, 2 µM) und TK (Tyrphostin A25, 10 µM)] inkubiert und erneut mit Serotonin (2 µM) stimuliert. Die Organbadkammer mit den Gefäßringen (+)fat wurde „Donor“ genannt, da das periadventitielle Fettgewebe als Donor für ADRF fungiert. Im Folgenden wurde auf der Plateauphase der Kontraktion mit 2 µM Serotonin Flüssigkeit aus dem Organbad entnommen und in die Organbadkammer mit den Gefäßringen (-)fat gegeben, die „Akzeptor“ genannt wurde. Die glatten Gefäßmuskelzellen sind die Effektoren von ADRF.

Bei dem Gegenexperiment wurden die „Akzeptor“-Gefäßringe, das heißt die Ringe (-)fat, mit dem Inhibitor des entsprechenden Enzymsystems inkubiert. Die Flüssigkeit, die aus dem Organbad mit den „Donor“-Gefäßringen [(+)fat] ohne Zugabe eines inhibitorischen Wirkstoffs gewonnen wurde, wurde appliziert.

Ziel dieses Versuchsaufbaus war es, differentielle Aussagen über den Mechanismus der Freisetzung bzw. Wirkung von ADRF machen zu können. Indem zwischen Donor, der Seite der Gefäßringe (+)fat, in der vermutlich ADRF freigesetzt wird, und Akzeptor, der Seite der Gefäßringe (-)fat, unterschieden wird, lassen sich Rückschlüsse auf zugrunde liegende Mechanismen der Freisetzung oder Wirkung ziehen.

Abb. 3.4.: Skizze des Versuchsaufbaus der Badwechsel-Experimente: In der Organbadkammer, die mit „Donor“ gekennzeichnet ist, sind die Gefäßringe (+)fat lokalisiert, Ort der ADRF-Freisetzung. Als „Akzeptor (Acceptor)“ ist die Organbadkammer mit den Gefäßringen (-)fat gekennzeichnet, Wirkort von ADRF. Entsprechend des eingesetzten Protokolls erfolgte ein Austausch bestimmter Mengen der Organbadflüssigkeit (Pfeil). Quelle: (Löhn et al., 2002).

Protokoll 2.3: Bioassay ohne Kalziumionen

Die Donor-Gefäßringe wurden mit unterschiedlichen Konzentrationen von Kalziumionen vorinkubiert (0 mM, O,3 mM, 1,0 mM, 1,6 mM, 2,5 mM, 5,0 mM, 10mM), und mit 2 µM Serotonin kontrahiert. Es wurden Aliquots dieser Lösung (jeweils 5 ml) in die Akzeptor-Organbadkammer transferiert. Das Organbadvolumen betrug 20 ml, das Transferintervall 15-20 Min.

Die Daten wurden mit dem Computerprogramm HSE-Acad erfasst, und mit einem Papieraufzeichnungsgerät graphisch dargestellt und ausgewertet. Alle Messwerte wurden als Mittelwerte ± SEM angegeben und mit STUDENT t-Test für verbundene und unverbundene Stichproben auf statistische Signifikanz geprüft. Unterschiedliche Messungen am gleichen Gefäßring wurden als verbundene Stichproben paarweise verglichen. Vergleiche der Messergebnisse von Gefäßringen (+)fat und (-)fat wurden mit dem t-Test für unverbundene Stichproben getestet. Die Unterschiede waren signifikant, wenn p<0,05. Der Term „n“ steht für die Zahl der untersuchten Gefäßringe.