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Zusammenfassung

Das Proteasom ist eine ATP- abhängige Protease, die sich aus vielen Untereinheiten zusammensetzt. Es ist unter anderem für die Generierung der MHC Klasse I- restringierten Peptide verantwortlich, die nach Komplexbildung mit spezifischen MHC Klasse I- Molekülen auf der Zelloberfläche präsentiert werden. Nicht- funktionelle Proteine, die als so genannte defective ribosomal products (DRIP) bezeichnet werden, stellen eine wichtige Quelle für die Generierung von antigenen Peptiden, insbesondere jedoch von viralen Peptiden dar. Der Abbau von polyubiquitinierten Proteinen durch das 26S Proteasom ist Grundlage für die Generierung von MHC Klasse I- Liganden. Allerdings ist weiterhin unklar, ob virale Proteine zwingend einer Ubiquitinierung bedürfen, um vom 26S Proteasom erkannt und abgebaut zu werden. Im Rahmen dieser Arbeit sollte der Proteasom- abhängige Abbau des mCMV ie pp89 Proteins vor allem hinsichtlich einer potentiellen Ubiquitinierung untersucht werden. Die Generierung des pp89 Epitops bzw. des 11mer Precursors wurde bislang für synthetische pp89 Peptide (21-40mere) untersucht. Um den physiologischen Bedingungen näher zu kommen, wurden Konstrukte sowohl für ein rekombinantes pp89 (rek pp89) als auch für ein ODCpp89 Fusionsprotein entworfen. Somit konnten der in vitro Abbau dieser Proteine durch das Proteasom und die Prozessierung des spezifischen MHC Klasse I- restringierten H-2Ld Epitops bzw. des 11mer Precursors verfolgt werden. Experimente zum in vivo Abbau des endogen exprimierten pp89 und zum Nachweis einer potentiellen Ubiquitinierung wurden mit stabil transfizierten Mausfibroblasten (B8 Zellen) durchgeführt.


Die experimentellen Daten sprechen für einen schnellen in vitro Abbau des rek pp89 durch das 20S Proteasom. Das rekombinante Protein weist eine partielle Faltung auf, etwa 41% der Sekundärstrukturelemente lassen sich antiparallelen β- Faltblättern zuordnen. Für das pp89 Epitop spezifische CTL Assays weisen auf die Generierung des korrekten MHC Klasse I- Epitops bzw. dessen 11mer Precursorpeptids hin. Das ODCpp89 Fusionsprotein wurde in Anwesenheit von Antizym durch 26S Proteasomen verdaut. Auch in diesem Falle konnten mit dem CTL Assay das 9mer Epitop bzw. das 11mer Peptid des pp89 nachgewiesen werden. Eine mögliche Ubiquitinierung des pp89 wurde in vivo in Zellkulturen untersucht. Nach Gabe von Proteasomeninhibitoren zu Mausfibroblasten konnte eine starke Akkumulierung von Ubiquitin- Konjugaten beobachtet werden. Allerdings wurden auch nach radioaktiver Markierung des pp89 mit 35 S Methionin und anschließender Immunopräzipitation mit polyklonalen αpp89- Antikörpern keine pp89- Ubiquitin- Konjugate beobachtet. Demzufolge ist für die Generierung des viralen MHC Klasse I- restringierten Epitops des mCMV pp89 ein Proteasom- abhängiger, aber Ubiquitin- unabhängiger Abbauweg denkbar.


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08.09.2004