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1.  Einleitung

1.1. Das Proteasom

Eine der wichtigsten zellulären Funktionen ist zweifelsohne der regulierte und kontrollierte Abbau von endogen Proteinen, um einerseits die Homeostase der Zelle zu gewährleisten, andererseits auch Proteine zu definierten Zeitpunkten regulieren zu können. Eine grundlegende Voraussetzung dazu ist eine Kompartimentierung in zellulären Substrukturen, wobei die Autokompartimentierung, die geordnete Zusammenlagerung von verschiedenen Proteasen zu einem zylinderförmigen Komplex, sich als evolutionär stabiles Konzept des kontrollierten Proteinabbaus herauskristallisiert hat. In allen Domänen des Lebens, in Bakterien, Archaebakterien und Eukaryonten konnte dieses Konzept bestätigt werden. In Archaebakterien und Eukaryonten ist es vielmehr gelungen, eine „multikatalytische Proteinase“ zu identifizieren, die wenige Jahre später in „Proteasom“ umbenannt wurde (Dahlmann 1988, Arrigo 1988, Dahlmann 1989, Baumeister 1998).

1.1.1. Aufbau und katalytische Aktivität des 20S Proteasoms

20S Proteasomen setzen sich aus vier aneinander gelagerten Ringen zusammen, die wiederum jeweils aus einem Konglomerat von 7 evolutionär verwandten, aber nicht identischen Untereinheiten (UE) bestehen. Eukaryonten weisen 2 Kopien von 14 verschiedenen Untereinheiten auf, die aufgrund ähnlicher Sequenzen α- und ß- UE zugeordnet sind. Die α-Untereinheiten (α1-α7) bilden die beiden äußeren, die ß-Untereinheiten (ß1-ß7) die beiden inneren Ringe. Durch diese α7ß7ß7α7- Anordnung formiert sich ein Zylinder von 15nm Länge, der einen Durchmesser von 11nm aufweist. Der Zylinder schließt 3 interne Kavitäten ein (vgl. Abb. 1), wobei die innere durch die beiden benachbarten ß-Ringe, die äußeren Vorkammern jeweils durch Anteile eines α- und ß-Rings eingeschlossen werden (Kopp 1993, 1997)

Abb. 1 : Dreidimensionales Modell des S. cerevisiae 20S Proteasoms. In grün dargestellt die 7 α-Untereinheiten, in blau und rot die 7 verschiedenen ß-Untereinheiten, wobei sowohl die Ringstruktur der zusammen gelagerten α- bzw. ß- Untereinheiten als auch die Fassform des Komplexes veranschaulicht werden. Rot hervorgehobene ß-Untereinheiten (vgl. Abb.2) weisen katalytische Aktivität auf (aus Kloetzel 2001).


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Wie aufgrund der ähnlichen Primärstruktur vorherzusehen, weisen α- und ß-Untereinheiten vergleichbare Sekundärstrukturen auf (vgl. Abb. 3). Sie bestehen aus jeweils 2 fünfsträngigen antiparallelen ß-Faltblättern, die an jeder Seite von α-Helices flankiert sind. Die Helices H1 und H2 vermitteln die Wechselwirkungen zwischen α- und ß-Ringen. H3 und H4 auf der gegenüberliegenden Seite interagieren mit den beiden zentralen ß-Ringen. In der Struktur der α-UE findet sich zusätzlich eine α-Helix H0, die aus für die einzelnen UE spezifischen, N- terminalen Verlängerungen der α-Untereinheiten gebildet wird und in einer Furche des ß-Faltblatts liegt. Die Bedeutung dieser zusätzlichen α-Helix liegt, besonders bedingt durch die Position am äußeren Ende des Zylinders, in der Translokation von Substraten in das Proteasom oder in der Interaktion des 20S mit Regulatorkomplexen. Röntgenstrukturanalysen mutierter Proteasomen zufolge ist ein einziger Aspartatrest an Position 9 (Asp-9) der α3-Untereinheit dafür verantwortlich, den Zugang in den Proteasekomplex geschlossen zu halten bzw. zu öffnen (Daten für S. cerevisiae). Bei den ß-Untereinheiten werden die Prosequenzen am Aminoterminus, die bis zu 80 Aminosäuren lang sein können, während der Assemblierung und Reifung des Proteasoms autokatalytisch entfernt, wodurch die innere Kavität frei zugänglich wird und die katalytischen Zentren „aktiviert“ werden (Löwe 1995, Groll 1997, Groll 2000).

Die katalytischen Zentren befinden sich innerhalb der zentralen Kammer des 20S Proteasoms. Das Proteasom ist als N- terminale nukleophile Hydrolase charakterisiert worden (Brannigan 1995). Nach autokatalytischer Entfernung der Prosequenzen befindet sich ein Threonin am N-Terminus der aktiven ß-Untereinheiten (Thr-1), das als essentielles Nukleophil und Protonenakzeptor fungiert (Löwe 1995, Seemüller 1995). Lactazystin, ein in seiner aktiven Form an Thr-1 kovalent bindendes Antibiotikum, führt zu einer Hemmung der proteolytischen Aktivität des Proteasoms, insbesondere der Spaltung nach hydrophoben Aminosäuren (Fenteany 1995, Rock & Goldberg 1999). Neben dem Thr-1 sind weitere AS in den katalytischen Zentren der β-UE erforderlich, um eine effiziente Proteolyse zu gewährleisten: Lysin an Position 33 und Glutamat an Position 17. Dem Lys-33, respektive der N- terminalen Aminogruppe des Thr-1 werden eine Protonendonor- bzw. Protonenakzeptorrolle zugeschrieben, das Glu-17 dürfte die protonierte Form dieser Gruppen stabilisieren (Schmidtke 1996). In Mutationsanalysen (Thr1àAla1 bzw. Lys33àAla33) führten die T1A- bzw. K33A-Mutanten zu einer unvollständigen Prozessierung der aktiven ß-Untereinheiten, woraus verschiedene Primärstrukturen der ß-Untereinheiten mit deutlich reduzierter katalytischer Funktion resultierten (Schmidtke 1996, Heinemeyer 1997, Dick 1998).


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Abb. 2 : Anordnung der 28 Untereinheiten des eukariotischen 20S Proteasoms nach Kristallstrukturanalysen des Hefeproteasoms (Groll 1997) und Immunelektronenmikroskopie (Kopp 1997). In Mutationsanalysen wurden proteolytische Aktivitäten für ß1, ß2 und ß5 (rot markiert, siehe Tab.1) nachgewiesen. In blau die katalytisch inaktiven ß-Untereinheiten, in grün die α-Untereinheiten.

Im Gegensatz zu Archaebakterien (T. acidophilum), bei denen alle ß-Untereinheiten proteolytische Aktivität zeigen, ist die katalytische Funktion bei Eukaryonten auf die 3 ß-UE, ß1, ß2 und ß5 restringiert (vgl. Abb. 1, 2).

Mit Hilfe von fluorogenen Peptidsubstraten konnten diesen aktiven ß-Untereinheiten bestimmte Präferenzen der Peptidhydrolyse in Abhängigkeit von den AS an Position 1 zugeschrieben werden (vgl. Tab.1). Hingegen ist die Enzymspezifität bei Proteinen, also physiologischen Substraten in Mammalia- Proteasomen weitaus geringfügiger ausgeprägt (Kisselev 1999, Akopian 1997).

Tab. 1 : Katalytische Aktivitäten der einzelnen ß-Untereinheiten. PGPH: Peptidyl-glutamyl-peptid Hydrolase, ChT: Chymotrypsin- ähnlich, T: Trypsin- ähnlich, BrAAP: Branched chain aminoacid preference (Heinemeyer 1997, Orlowski 1993, 2000). Mit „i“ benannte Untereinheiten sind Bestandteile des Immunoproteasoms.

Gen

ß-Untereinheit

Katalytische Aktivität

Erläuterung

Peptidsubstrat

PSMB 6

ß1 (Y, δ)

PGPH, BrAAP

Spaltung nach sauren AS und AS mit verzweigten Seitenketten

Suc-L-L-E-ß-NA (PGPH)

PSMB 9

ß1i (LMP 2)

ChT

Spaltung nach hydrophoben AS

Suc-L-L-V-Y-AMC

PSMB 7

ß2 (Z, MC14,ζ)

T

Spaltung nach basischen AS

BZ-V-G-R-AMC

PSMB 10

ß2i (MECL-1)

T

Spaltung nach basischen AS

BZ-V-G-R-AMC

PSMB 5

ß5 (X, MB1, ε)

ChT

Spaltung nach hydrophoben AS

Suc-L-L-V-Y-AMC

PSMB 8

ß5i (LMP 7)

ChT

Spaltung nach hydrophoben AS

Suc-L-L-V-Y-AMC


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1.1.2.  Das Immunoproteasom

Eine der Funktionen des Proteasoms besteht in der Antigenprozessierung. In dieser Eigenschaft ist es direkt in den MHC Klasse I- abhängigen Weg der Immunabwehr integriert. Interferon γ, ein pleiotropes Zytokin, induziert unter anderem einen Austausch der aktiven ß-Untereinheiten gegen die Immunountereinheiten LMP2, LMP7 und MECL-1 (vgl. Abb. 3; Rock & Goldberg 1999). Der konsekutive Einbau dieser Immunountereinheiten ß1i, ß2i und ß5i bedarf jedoch der de novo Assemblierung des Proteasoms (vgl. Abb. 3). Die Untereinheiten stehen dabei in Wechselwirkung untereinander, so ist die Integration der ß2i-UE von der Inkorporation der ß1i-UE in den Präproteasomenkomplex abhängig. Die effiziente Reifung des Immunoproteasoms in Form des ß1i-, ß2i-Präproteasomenkomplexes wiederum erfordert die Anwesenheit bzw. Inkorporation von ß5i (Groettrup 1996, Griffin 1998, Schmidt 1997, Tanaka 1998).

Abb. 3 : Immunoproteasom. Der durch IFNγ induzierte Austausch der aktiven ß-Untereinheiten erfordert die de novo Assemblierung des 20S Core- Komplexes. In der linken Abbildung ist ein Intermediat, bestehend aus einem heptameren α-Ring und 7 ß-Untereinheiten, dargestellt. Die Immunountereinheiten sind rot mit ß1i, ß21 und ß5i gekennzeichnet, wobei gleichzeitig noch die Prosequenzen (rote Fäden) sichtbar sind, die während der Maturierung prozessiert werden. Rechts hingegen das reife 20S Immunoproteasom (in Anlehnung an Kloetzel 2001).

Das Proteasom schneidet Proteine bzw. Peptide in einer prozessiven Weise. Es entstehen dabei hauptsächlich Peptidfragmente einer Länge von 4 bis 24 Aminosäuren. So generiert das 26S Proteasom in 10% der Fälle Octapeptide, in 70% kleinere und in 20% der Fälle größere Fragmente. Die durchschnittliche Länge der Fragmente bei konstitutiven 20S Proteasomen beträgt 7.4 AS, die der von Immunoproteasomen generierten Fragmente dagegen 8.6 AS. Der Proteinabbau erfolgt zufällig, bis die Produkte eine Größe erreicht haben, die die Diffusion aus dem 20S Core-Komplex zulässt. Einige Proteine werden jedoch nicht vollständig abgebaut. Als Ausnahme sei der Transkriptionsfaktor NFκB erwähnt, dessen N- terminales Fragment (50kDa) nach dem proteasomalem Abbau des p105 [Seite 5↓]Vorläuferproteins entsteht und die aktive Form des Transkriptionsfaktors darstellt (Rock & Goldberg 1999, Toes 2001). Immunoproteasomen zeigen auf die Generierung bestimmter viraler Epitope einen positiven Effekt. Sie fördern Peptidhydrolysen nach hydrophoben und basischen Aminosäuren (ChT, T) (Sijts2000a, Sijts 2000b, Schwarz 2000) und führen Schnitte nach sauren Aminosäuren (PGPH) vermindert aus (Gaczynska 1994). Insbesondere korreliert die Schnittpräferenz an Position 1 der Substrate nach hydrophoben Resten mit dem Konzept, dass hydrophobe Ankerreste am C- Terminus der Epitope in der MHC Klasse I- Bindungstasche spezifisch binden (vgl. Abb. 9). Antigen präsentierende Zellen (APZ), wie dendritische Zellen, exprimieren in vergleichsweise hohem Maße Immunoproteasomen (Toes 2001, Falk 1991, 1993). Die genauen molekularen Mechanismen der Generierung dieser veränderten Peptidmuster sind noch nicht vollständig bekannt. Allerdings werden durch Inkorporation der Immunountereinheiten bedingte filigrane Änderungen der Gesamtstruktur des 20S Komplexes postuliert, die die Schnittpräferenzen beeinflussen können. So wurde beispielsweise im Falle des HBV-Epitops nachgewiesen, dass der ß1i-, ß2i- und ß5i-Einbau für die Antigenprozessierung essentiell ist. Auch ß5i-T1A-Mutanten, d.h. Proteasomen mit einer inaktiven ß5i-Untereinheit, generierten das korrekte Epitop, was auf einen strukturellen Einfluss dieser Untereinheit hindeutet. In ß1i-Mutanten konnten für das murine Cytomegalievirus (vgl. 1.4.2) ähnliche Resultate erzielt werden (Sijts 2000a, Schmidtke 1998). Die erwähnten Konformationsänderungen innerhalb des Immunoproteasoms könnten die Eigenschaften der Substratbindungsregion beeinflussen und so den Zugang zu den verschiedenen aktiven ß-Untereinheiten des 20S Komplexes verändern.

1.1.3. Der Proteasomaktivator PA28

Eine weitere durch IFNγ induzierbare Komponente des proteasomalen Systems, die die Antigenprozessierung des MHC Klasse I- Wegs beeinflusst, ist der Proteasomaktivator PA28, auch 11S Regulator oder REG genannt (Dubiel 1992, Ma 1992, Realini 1994). Dieser 180-200kDa große Regulator ist aus PA28 α- und ß-Untereinheiten zusammengesetzt, die im Zytosol eine hexamere Ringstruktur PA28(αß)3 bilden. Im Zellkern wurden hexamere Ringe aus 6 γ-Untereinheiten, PA28(γ)6, identifiziert (Ahn 1996, Kuehn 1996, Tanaka 1998). Rekombinant exprimierte PA28α-Untereinheiten wiederum formieren heptamere Ringe PA28(α)7, die entsprechende in vivo Komplexe suggerieren (Knowlton 1997, Kloetzel 2001).


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Der in Mammalia vorkommende PA28-Komplex hat selbst keine hydrolytische Aktivität, vermag hingegen in in vitro Studien in Anwesenheit von 20S Proteasomen den Abbau von fluorogenen Peptiden ATP- unabhängig zu beschleunigen. Das Peptidrepertoire nimmt ebenso zu. Andererseits wird der Abbau von Proteinen oder Ubiquitin- Protein- Konjugaten nicht stimuliert (Ustrell 1995, Groettrup 1995). Für bestimmte Peptidsubstrate (JAK 1 Protein) zeigte sich, dass in Anwesenheit von PA28 Doppelschnitte im Gegensatz zu Einfachschnitten präferiert werden (Dick 1996). Andere Studien implizieren jedoch, dass sich nach Bindung von PA28 die Substrataffinität bei gleich bleibender enzymatischer Aktivität des Komplexes erhöht. Weiterhin werden sowohl die Substrataufnahme als auch die Freisetzung der generierten Fragmente durch PA28 in ihrer Rate beschleunigt (Stohwasser 2000). Der Effekt von PA28 auf die Antigenprozessierung viraler Epitope zeigte einerseits eine vermehrte Generierung verschiedener Epitope, die Rate des Proteinumsatzes hingegen blieb konstant. Jedoch konnte dieser Effekt für andere virale Epitope nicht nachgewiesen werden (van Hall 2000). In Kristallstrukturanalysen wurden PA26-20S Proteasomenkomplexe analysiert (PA26: zum PA28 homologer Komplex aus Trypanosomen) (Whitby 2000). Der Regulator Komplex bindet ATP-unabhängig an die äußeren α-Ringe des 20S Proteasoms und kann den 19S Regulator an mindestens einer Seite verdrängen, so dass Hybrid- Proteasomen, d.h. asymmetrische Komplexe aus 19S, 20S und PA28, entstehen können.


Wie bereits ausgeführt, sind die N- terminalen Peptidsequenzen der α-Untereinheiten des 20S Kernkomplexes, insbesondere α3, für den verschlossenen Zugang des Proteinasekomplexes verantwortlich (Groll 2000). Nach Bindung von PA28 an das Proteasom werden die aminoterminalen Sequenzen der α-Untereinheiten des 20S Proteasoms in den Hohlraum des PA28-Zylinders umgelagert und somit der Zugang für [Seite 7↓]Substrate in das 20S Proteasom ermöglicht (Whitby 2000, Kopp 2001). Diese offene Konformation des Proteasoms könnte die Freisetzung längerer Peptidfragmente ermöglichen, welche wiederum als N- terminal verlängerte Vorläufer von spezifischen zytotoxischen T- Zellepitopen nicht der sofortigen zellulären Degradation unterlegen wären.

1.1.4. Der 19S Regulator und das 26S Proteasom

Der kontrollierte Proteinabbau durch Proteasomen wird durch einen anderen Regulator Komplex, den so genannten 19S Regulator oder PA700 (Proteasomaktivator 700 kDa) vermittelt. 19S Regulatoren, die haubenartig mit dem 20S Komplex assoziiert sind, binden ubiquitinierte Proteine, deubiquitinieren diese, assistieren bei der Entfaltung und schleusen die Proteine in das Proteasom ein, wo im Anschluss der proteolytische Abbau stattfindet. Jeweils ein 19S Regulator interagiert in einer determinierten Position mit den α-Ringen des 20S Proteasoms, wobei sich die C2-Symmetrie des 20S Proteasoms durch die entgegengesetzte Orientierung der 19S Einheiten manifestiert (vgl. Abb. 4). Der resultierende proteolytische Komplex ist als 26S Proteasom beschrieben worden (Coux 1996, Glickman 1998a, Walz 1998).


Der 19S Regulator setzt sich aus bis zu 20 verschiedenen Untereinheiten mit einem Molekulargewicht zwischen 25 und 110kDa zusammen, welche wiederum zwei Subkomplexe, „base“ und „lid“ genannt, bilden (vgl. Abb. 4). Den “base”- Subkomplex bilden sechs ATPasen (S7, S4, S6, S10b, S6´, S8), die zur Triple-A Familie (ATPases associated with a variety of cellular activities) zählen und die Nicht- ATPasen S1, S2 und S5a. Die ATPase- Untereinheiten formieren einen hexameren Ring, der offenbar direkt mit dem heptameren Ring der α-Untereinheiten des 20S Proteasoms interagiert. Der „lid“- Subkomplex besteht aus nicht- ATPase- Untereinheiten, deren jeweilige Anzahl und Zusammensetzung speziesabhängig ist (bei höheren Eukaryonten: S3, p55, S9, S10, S12, S11, S14, S5b, S15, Poh1). Für diese Untereinheiten wurden starke Sequenzhomologien mit dem COP 9-Signalosom und dem eIF3 (eucaryotic translational initiation factor 3) aufgezeigt (Glickman 1998b).


Die ATPase- Untereinheiten fungieren ähnlich wie molekulare Chaperone. Sie können in ATP-abhängigen Zyklen nicht gefaltete Proteine und partiell gefaltete Intermediate stabilisieren und sie vor Aggregationen schützen. Des Weiteren agieren sie als qualitativer Selektionsmechanismus, um falsch gefaltete oder defekte Proteine (so genannte DRiPs) zu eliminieren. Es wurde postuliert, dass die ATPasen des 19S Komplexes bei der Entfaltung der Proteine mitwirken und somit den Zugang in das enzymatisch aktive Zentrum des 20S Proteasoms ermöglichen und kontrollieren können (Braun 1999).


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Abb. 5 : Aufbau des 26S Proteasoms. Im Zentrum dargestellt sind die α- und ß-Ringe des 20S Kernkomplexes (vgl. Abb. 1). Die 19S Regulatoren bestehen aus 2 Subkomplexen, in orange die 9 nicht- ATPase- Untereinheiten des „lid“-Subkomplexes, der für die Substratbindung von Bedeutung ist. In violett abgebildet die AAA- ATPase- Untereinheiten, die mit weiteren nicht- ATPasen den „base“-Subkomplex formieren. Deutlich wird die Symmetrie des Komplexes (aus Kloetzel 2001).

Wie oben beschrieben, ist der Zugang in den katalytischen Zylinder durch die N- terminalen Peptidsequenzen der α-Untereinheiten verschlossen. Mehrere Autoren diskutieren, dass das Zentrum durch Interaktion mit den 19S Regulatoren, insbesondere mit den „base“-Subkomplexen für die Substrate zugängig wird (Groll 1997, 2000, Glickman 1998a). Dafür spricht sowohl der unmittelbare Kontakt zwischen „base“ und α-Ring, als auch die denkbare Energieabhängigkeit eines Öffnungsmechanismus, der durch ATP-Hydrolyse Rechnung getragen würde.


Ferner spielt der 19S Regulator eine wesentliche Rolle bei der Bindung von polyubiquitinierten Proteinen, wobei Ubiquitin als Degradationssignal in der Zelle fungiert. Für die AAA- ATPase- Untereinheit S5a wurde in vitro eine spezifische Affinität für Polyubiquitin nachgewiesen (Deveraux 1994), hingegen konnte S5a in späteren Arbeiten in vivo nicht als derartiger Rezeptor definiert werden (van Nocker 1996, Fu 1998). In S. cerevisiae ist Rpn 10 (Homolog zu S5a) für den Proteinabbau ubiquitinierter Substrate nicht essentiell (Rubin 1997). Somit muss also mindestens eine weitere Bindungsstelle für Ubiquitin innerhalb des 19S vorhanden sein. So führten zum Beispiel in weiteren Analysen Mutationen der „base“- Untereinheiten Rpn 2 (S1) und Rpn 1 (S2) zu einer Akkumulation von ubiquitinierten Proteinen (Bochtler 1999).


Ergänzend sei erwähnt, dass innerhalb des 19S Regulators auch eine 37kDa Isopeptidase nachgewiesen wurde. Durch deren enzymatische Aktivität können Ubiquitinketten vom jeweiligen Substrat abgespalten und im Zytosol reutilisiert werden (Lam 1997).

1.1.5. Das Ubiquitin- Proteasom- System

Dem Proteasom wird generell der Abbau von bis zu 90% der zellulären Proteine zugeschrieben (Rock 1994). Durch kovalente Bindung von Ubiquitin an kurzlebige Proteine werden diese für den Ubiquitin- abhängigen Abbau durch das 26S Proteasom markiert, wobei einzelne Untereinheiten des 19S Regulators für die Substratbindung und [Seite 9↓]Deubiquitinierung verantwortlich gemacht werden. Dabei ist insbesondere die Beteiligung des Ubiquitin- Proteasom- Systems an der Antigenprozessierung MHC Klasse I- restringierter Epitope hervorzuheben, bei der neben den 26S Proteasomen sowohl 20S-11S, als auch 19S-20S-11S-Komplexe beteiligt sind. Primär wurde für das Ovalbuminepitop SIINFEKL gezeigt, dass einer spezifischen zytotoxischen T-Zellantwort eine Ubiquitinierung vorangeht (Michalek 1993, Grant 1995). Die Funktion des Proteasoms in der Generierung von MHC Klasse I- Peptiden könnte ein Ansatz für antivirale T- Zellvakzine sowie Tumorvakzine sein (Pickart 2000).


Viren können direkt mit der Antigenprozessierungsmaschinerie interagieren. So initiiert beispielsweise das E6 Onkoprotein, das von mit humanen Papillomaviren 16 oder 18 infizierten Keratinozyten des Zervixepithels exprimiert wird, nach Bindung an den Tumorsuppressor p53 dessen Ubiquitin- abhängigen Abbau durch das 26S Proteasom. Dies führt zu einer verminderten intrazellulären Konzentration von p53 und beeinträchtigt somit den kontrollierten Zellzyklus (Coux 1996, Scheffner 1990).


Zum anderen ist das 26S Proteasom für die Degradation von falsch gefalteten Proteinen, von Transkriptionsfaktoren, Zellzyklusregulatoren und Onkogenen verantwortlich. Ubiquitin bindet während des Zellzyklus phasenabhängig an Zyklin B und initiiert dessen Degradation. Dadurch wird simultan Cdk1 (cyclin-dependent kinase) abgeschaltet. Maligne Transformationen von kolorektaler Mukosa werden hingegen mit ß- Catenin assoziiert. Der Abbau dieses Proteins erfolgt ebenfalls nach vorgegangener Ubiquitinierung (Hochstrasser 1996, Hershko 1998). Für das Onkoprotein cJun wurde der Ubiquitin- abhängige Abbau durch das 26S Proteasom in vitro und in vivo beschrieben (Treier 1994). Andere Beispiele Ubiquitin- abhängiger Proteine stellen Ionenkanäle wie der CFTR (cystic fibrosis transmembrane regulator) und der Wachstumshormonrezeptor dar (Ciechanover 1998).

Signaltransduktionskaskaden unterliegen komplexen Regulationsmechanismen. Das Proteasom ist für die Spaltung des p105-Vorläuferproteins des Transkriptionsfaktors NFκB und die folgende Freisetzung der aktiven p50- Untereinheit verantwortlich (Coux 1996). Unter Zuhilfenahme von Proteasomeninhibitoren wie MG132 konnte die beschriebene Aktivierung von NFκB durch das Proteasom in Restenosestudien verhindert werden. Der antiinflammatorische, antiproliferative und proapoptotische Effekt dieser Inhibitoren des Proteasoms reduziert die Neointimaformation von traumatisierten Gefäßwänden und impliziert einen therapeutischen Ansatz in der Prävention von vaskulären Restenosen nach Angioplastien (Meiners 2002).


Für viele Membranproteine stellt Ubiquitin wiederum ein Signal für die Endozytose und [Seite 10↓]Vakuolen- bzw. Lysosomenformation dar. In das ER (Endoplasmatisches Retikulum) eingeschleuste Proteine können nach retrogradem Transport in das Zytosol ubiquitiniert und zytosolisch abgebaut werden. Dies ist zum Beispiel für MHC Klasse I- Ketten der Fall, die nach Infektion von humanen Zellen mit dem Cytomegalievirus und konsekutiver Expression von US11-Genen als ein Mechanismus der Immunabwehr aus dem ER eliminiert werden (vgl. Tab. 2, Wiertz 1996).


Trotz der ausführlich dargestellten Zusammenhänge zwischen Ubiquitin und dem 26S Proteasom stellt sich die Frage, ob sich die Funktion des Ubiquitins auf ein Erkennungssignal für den Proteasekomplex beschränkt. Einerseits wurde postuliert, dass es die Proteinentfaltung initiiere, andererseits wurde ein indirekter Einfluss auf die Denaturierung von Proteinen im Wechselspiel mit dem 19S Regulator diskutiert. So könnte Ubiquitin insofern unterstützend wirken, als dass es schwierig zu entfaltenden Proteinen einen längeren Kontakt zum 19S gewährt, bis die völlige Denaturierung den Abbau durch das 26S Proteasom gestattet (Hochstrasser 1996). Diese These korreliert auch mit den experimentellen Daten, nach denen chemisch denaturierte oder modifizierte Proteine ohne Ubiquitinierung vom Proteasomabgebaut werden können (Michalek 1996).
Gleichzeitig stellt sich die Frage, ob eine Ubiquitinierung in jedem Fall für den proteasomalen Abbau essentiell ist. So konnte für verschiedene Proteine wie den Cdk Inhibitor p21CIP21 oder oxidiertes Calmodulin nachgewiesen werden, dass sie nicht der Ubiquitinierung bedürfen (Sheaff 2000, Ferrington 2001). Ein weiteres, detailliert charakterisiertes Beispiel ist die Ornithindecarboxylase, deren Abbau in Gegenwart von Antizym ohne Ubiquitinierung vom 26S Proteasom vollzogen und im Folgenden näher erläutert wird (Murakami 1992).

1.2. Die Ubiquitin Kaskade

Ubiquitin ist ein hoch konserviertes, globuläres Protein, das aus nur 76 Aminosäuren besteht. In der evolutionären Entwicklung zeigen sich zwischen Hefe- und humanem Ubiquitin lediglich 3 Aminosäureaustausche. Die Ubiquitinierung löslicher zytosolischer und nukleärer Proteine unterliegt einem komplexen Mechanismus, dem verschiedene Enzyme angehören. Initial wird das C- terminale Glycin (G76) des Ubiquitins ATP- abhängig zu einem hochenergetischen Thioesterintermediat aktiviert. Diese Reaktion wird durch E1 (ubiquitin activating enzyme) beschleunigt. Dem schließt sich der Transfer des Intermediates an E2 (ubiquitin conjugating enzyme oder ubiquitin carrier protein) an, wobei eine Vielzahl derartiger Enzyme charakterisiert werden konnten. E3 (ubiquitin protein ligase) katalysiert den finalen Schritt des Konjugationsprozesses, die kovalente Bindung von Ubiquitin an das Substrat. Ubiquitin, speziell G76, bildet mit der ε- Aminogruppe (ε-NH2) eines Lysinrests des Proteinsubstrats eine Isopeptidbindung. Es existieren verschiedene ligierende E3 Enzyme. So sind HECT (homologous to E6-associated protein carboxy terminus) Domänen [Seite 11↓]beschrieben, deren C-Terminus eine Sequenzhomologie zum E6 Protein (Onkoprotein in HPV- infizierten Epithelzellen) aufweist. In diesem speziellen Fall wird Ubiquitin an ein Cystein in der HECT Region in Form eines Thiolesters gebunden und darauf folgend an das Substrat transferiert. Eine Mutation in der 350 AS langen HECT Sequenz wurde bei Patienten mit ANGELMAN-Syndrom nachgewiesen. Eine andere Form von E3 Enzymen sind so genannte RING finger, die Metallionen wie Zn++ binden können. Diese spezifischen Enzymvarianten übertragen Ubiquitin direkt von den konjugierenden Enzymen auf die Substrate (Hershko 1998, Weissmann 2001).

Abb. 6 : Ubiquitinkaskade à Freies Ubiquitin (Ub) wird ATP-abhängig aktiviert und formiert mit E1 (Ub- aktivierendes Enzym) eine Thiolesterbindung. Ub wird dann an E2 (Ub- konjugierendes Enzym) gebunden, welches mit E3 (Ub- Proteinligase) assoziiert. Bei RING E3- Enzymen wird Ub direkt von E2 an das Substrat transferiert, im Falle der HECT (homologous to E6-AP carboxy terminus) Domänen wird Ub zunächst an ein Cystein des E3- Komplexes gebunden, erst im Anschluss wird es an das Substrat übertragen (in Anlehnung an Weissmann 2001).

Die Bindung von Polyubiquitin an Substrate stimuliert die Proteolyse, obwohl in vitro in Retikulozytenlysaten auch Monoubiquitin den Proteinabbau suffizient initiierte (Shaeffer 1995). Allgemein gültig ist jedoch, dass zwischen Lysin 48 und Glycin 76 durch Isopeptidbindungen verknüpfte Polyubiquitinketten das entscheidende Abbausignal darstellen (Chau 1989). Mutanten dieser Lysinreste oder methyliertes Ubiquitin hingegen führen zu einem Kettenabbruch und inhibieren die Proteolyse (Ciechanover 1998).


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Ubiquitinreste sind für die Erkennung des Substrats durch das 26S notwendig, stellen jedoch nicht zwangsläufig ein Abbausignal dar. Mit acht Ubiquitinen markierte Proteine hingegen weisen eine hohe Affinität und zwangsläufig eine längere Verweildauer am Proteasom auf, deubiquitinierende Enzyme benötigen entsprechend mehr Zeit, um einzelne Ubiquitine abzuspalten (Thrower 2000). Die Hydrolyse der die Ubiquitine vernetzenden Isopeptidbindungen erfolgt einerseits durch die Isopeptidase des 19S Regulators. Andererseits wurden deubiquitinierende Enzyme wie Doa4, die nicht Bestandteil des 26S Komplexes sind, identifiziert (Ciechanover 1998).

1.3. ODC- Abbau durch das 26S Proteasom

Die Ornithindecarboxylase (ODC) besteht aus insgesamt 461 Aminosäuren und hat mit wenigen Minuten bis zu einer Stunde eine der kürzesten Halbwertszeiten aller Enzyme überhaupt. ODC katalysiert die Synthese von Diaminoputrescin aus Ornithin, einem Intermediat in der Polyaminsynthese und stellt als induzierbares Enzym den wichtigsten Regulationsfaktor dieses Zyklus dar. Diaminoputrescin wird über weitere Zwischenstufen zu Spermidin und Spermin umgebaut. Polyamine wie Spermin sind multivalente organische Kationen, deren Interaktion mit negativ geladenen Polyanionen wie RNA und DNA einen neutralisierenden Effekt und ergo eine Stabilisierung derselben zur Folge hat. Sie können andererseits die RNA- bzw. DNA- Biosynthese stimulieren, werden auch als Wachstumsfaktoren beschrieben. Die Ornithindecarboxylase unterliegt vielfältigen Regulationsmechanismen. So bewirkt die Zugabe von Somatotropin, Kortikosteroiden oder Testosteron zu Mammalierzellkulturen einen 10- bis 200-fachen Anstieg der ODC- Konzentration in der Zelle. Dies impliziert unter anderem das Potential der Ornithindecarboxylase, ein klinisch relevanter Angriffspunkt einer antimitotischen Chemotherapie zu sein.

Neben der Synthese ist aber auch der Abbau des Enzyms einer besonderen physiologischen Kontrolle unterlegen. So wurde ein Anti-Enzym für ODC, das Antizym, als notwendiges Protein für die Degradation identifiziert. Es handelt sich dabei um ein 227 Aminosäuren langes Protein, dessen C- terminale Reste spezifisch an die Aminosäuren 117-140 der ODC binden (vgl. Abb. 8). Antizym weist eine hohe Affinität zum inaktiven ODC- Monomer auf, bindet hingegen auch an das katalytisch aktive Homodimer der ODC. Im letzten Fall interagieren zwei Antizymmoleküle mit einem ODC- Homodimer und bilden inaktive Antizym- ODC- Heterodimere (Coffino 2001). Die Bindung an ODC bewirkt eine Konformationsänderung des Enzyms, welche das C- terminale Degradationssignal der ODC für das 26S Proteasom zugänglich macht. Dieses Abbausignal ist das für Aminosäure 423 bis 449 beschriebene PEST- Motiv (vgl. Abb. 7). PEST- Sequenzen sind hydrophile Sequenzabschnitte einer Proteinsequenz mit einer Länge von mindestens zwölf [Seite 13↓]Aminosäuren, wobei wenigstens ein Prolin (P), ein Glutamat (E) oder Aspartat sowie ein Serin (S) oder Threonin (T) in dieser Sequenz vorkommen. Diese Bereiche werden von Lysinen, Argininen und Histidinen flankiert.

Abb. 7 : PEST- Motive sind hydrophile Sequenzabschnitte, die wenigstens 12 Aminosäuren lang sind und zudem mindestens ein Prolin ( P ), ein Glutamat oder Aspartat ( E oder D ) und ein Serin oder Threonin ( S oder T ) enthalten (Abb. beruht auf Daten aus Rechsteiner 1996).

Diese spezifischen Sequenzelemente werden als alternative Degradationssignale zum Ubiquitin diskutiert (Rechsteiner 1996, Jariel-Encontre 1995). Die Abspaltung des C-Terminus der murinen ODC an Position 424, also unmittelbar vor Beginn des PEST- Motivs, führte zum Beispiel zu einer Zunahme der Stabilität des Proteins um den Faktor zehn (Ghoda 1989). Demnach initiiert Antizym nach Bindung an ODC deren ATP- abhängige Sequestration an und in das 26S Proteasom, dadurch kommt es zu einer irreversiblen Inaktivierung des Enzyms. Der direkte Nachweis dafür wurde in Immunopräzipitationen erbracht.

Zusammenfassend kann durch ergänzende Studien mit Proteasomeninhibitoren wie MG132 postuliert werden, dass sowohl Energie in Form der Phoshoanhydridbindung des ATP als auch Antizym für die irreversible Inaktivierung der Ornithindecarboxylase durch das 26S Proteasom notwendig sind, die proteolytische Aktivität des 20S Komplexes hingegen für die Degradation des Enzyms unerlässlich ist. Antizym wird infolge der Bindung von ODC an das 26S Proteasom ähnlich dem Ubiquitin vom Substrat abgespalten und kann intrazellulär reutilisiert werden. Die somit inaktivierte ODC unterliegt im Weiteren dem prozessiven proteolytischen Abbau durch die katalytisch aktiven ß-Untereinheiten des 20S Core- Komplexes (Murakami 1992, 1999).

Abb. 8 : Das ODC- Protein ist schematisch dargestellt (AS 1-461), farbig markiert sind funktionell relevante Abschnitte der Sequenz. Rot hervorgehoben ist der Bereich von Aminosäure 117 bis 140 mit positiver Oberflächenladung, der für die Antizymbindung verantwortlich ist. Grün und blau markiert sind PEST- Motive. Das PEST2- Motiv wurde als definitives proteolytisches Signal für den proteasomalen Abbau der Ornithindecarboxylase identifiziert (Murakami 2000, Rechsteiner 1996).


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1.4.  Antigenprozessierung durch das 26S Proteasom

Die Fähigkeit des Immunsystems höherer Eukaryonten, fremde Proteine spezifisch zu erkennen und daraufhin entsprechend zu reagieren, bedarf im Allgemeinen der Aktivierung von T- Lymphozyten. Die Antigen- spezifischen Rezeptoren dieser T- Zellen können Fremdproteine hingegen nicht direkt erkennen, erfordern vielmehr die Bindung von Antigenen an bestimmte körpereigene Oberflächenmoleküle. Diese Moleküle werden von einer Gruppe verbundener Genabschnitte namens major histocompatibility complex (MHC) kodiert; für den humanen MHC wird synonym humanes Leukozyten- Antigensystem (HLA) gebraucht. Zwei Subklassen von T- Lymphozyten (CD4+ und CD8+) erkennen die Peptide im Zusammenhang mit der Bindung an strukturell verwandte MHC- Moleküle, MHC Klasse II und MHC Klasse I. Die an diese beiden Klassen von MHC- Molekülen gebundenen Peptide entstammen zwei verschiedenen intrazellulären proteolytischen Systemen, dem Klasse I oder endogenem und dem Klasse II oder exogenem Weg.

1.4.1. Der MHC Klasse I- Weg der Antigenprozessierung

Antigene Peptide mit hoher Affinität gegenüber MHC Klasse I- Molekülen entstammen überwiegend aus dem zellulären Proteinumsatz, wobei etwa 40% aller neu synthetisierten Proteine unmittelbar nach der Translation degradiert werden. Diese nicht funktionellen Proteine, auch als DRiPs (defective ribisomal products) bezeichnet, werden teilweise ubiquitiniert und vom Proteasom abgebaut. Sie dürften demnach die entscheidende Quelle von MHC Klasse I- Peptiden sein (Schubert 2000, Turner 2000). Die vom Proteasom generierten antigenen Peptide werden ATP- abhängig mittels TAP (transporter associated with antigen processing) aus dem Zytosol in das ER (Endoplasmatische Retikulum) transferiert. TAPs gehören der ABC-Familie von ATP- abhängigen Transporterproteinen an, sie sind Heterodimere, die aus TAP.1- sowie TAP.2- UE bestehen. In der Regel transferieren sie Peptide mit einer Länge von 7 bis 15 Aminosäuren, wobei humane TAPs Peptide mit hydrophoben oder basischen C- terminalen Resten präferieren. MHC Klasse I- Epitope weisen in der überwiegenden Zahl der Fälle eine Länge von 9 Aminosäuren auf, woraus einerseits auf ein zusätzliches Schneiden von Vorläuferpeptiden innerhalb des ER, das so genannte ER- trimming, als auch auf eine Retranslokation einiger Peptidfragmente in das Zytosol geschlossen werden kann (Rock&Goldberg 1999, Pamer&Cresswell 1998). Es wurden inzwischen zahlreiche Aminopeptidasen charakterisiert, die für die Hydrolyse N- terminal elongierter Peptidepitope verantwortlich gemacht werden konnten. Erwähnt seien die IFNγ- induzierbare ERAP 1 (ER Aminopeptidase 1), die Thimet Oligopeptidase sowohl die Puromycin- sensitive Aminopeptidase und die Bleomycin- Hydrolase (Beninga 1998, Koetzel 2001, Stoltze 2000).


Die Expression von Peptidtransportern (TAP) ist unmittelbar mit der Synthese von MHC [Seite 15↓]Klasse I- Molekülen verknüpft, ihre Genloci befinden sich in enger Nachbarschaft auf dem humanen Chromosom 6. Die Synthese beider Proteinkomplexe ist durch das pleiotrope Zytokin IFNγ induzierbar. Die humane MHC Klasse I- Region enthält drei Genloci, HLA-A, HLA-B, HLA-C, bei der Maus wird zwischen H-2K, H-2D und H-2L unterschieden.
MHC Klasse I- Moleküle setzen sich strukturell aus einer glykosylierten schweren Kette (Domänen: α1, α2 und α3) und dem nicht- kovalent assoziierten ß2-Mikroglobulin zusammen. Die extrazellulären Domänen α1, α2 weisen in ihrer Struktur eine lange Furche auf, die als spezifische Peptidbindungstasche identifiziert werden konnte. Sie stellt das Charakteristikum der einzelnen MHC- Haplotypen dar, die sich hauptsächlich durch einzelne Aminosäurenaustausche innerhalb der α1 -und α2- Domänen unterscheiden. Daraus resultieren dramatische Unterschiede in der Struktur der Peptidbindungstasche. Die polymorphen MHC- Moleküle weisen verschiedene Präferenzen für Aminosäurereste in spezifischen Positionen, so genannte Ankerreste auf (vgl. Abb. 9; Madden 1995).

Abb. 9 : MHC Klasse I- Peptidbindungstasche (a), in grün sind die antiparallelen ß-Faltblätter, in blau die α-Helices dargestellt. In die somit formierte Furche ist in diesem Fall das pp89 Epitop YPHFMPTNL (vgl. Abb. 12) mit dem spezifischen C- terminalen Ankerrest Leucin (b) gebunden (aus Kloetzel 2001).

Die Assemblierung der schweren Ketten und MHC- Dimere (bestehend aus schwerer Kette und ß2M) wird durch Chaperone wie Calnexin, Calretikulin und BiP unterstützt. Nach Peptidbindung an die MHC- Heterodimere wird dieser stabilisierte Komplex über den Golgi Apparat an die Zelloberfläche transportiert und von spezifischen T- Zellrezeptoren (TZR) CD8+ zytotoxischer Lymphozyten erkannt (vgl. Abb. 10). Die Interaktion zwischen TZR, CD3 und CD8 mit dem peptidbeladenen MHC- Komplex sowie von kostimulatorischen Proteinen wie CD28 mit dem B7-1-Ligand bewirkt die Aktivierung und Proliferation von Antigen-spezifischen T- Lymphozyten, die wiederum lytisch und toxisch auf Antigen- präsentierende Zellen wirken (Kloetzel 2001, Rock & Goldberg 1999, Yewdell 1999).


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Abb. 10 : MHC Klasse I Assemblierung und Antigenpräsentation. Substrate, die MHC Klasse I - Epitope enthalten, werden an Polyubiquitin gebunden und somit vom 26S Proteasom erkannt und degradiert. Die generierten Peptide mit einer Länge von 7 bis 15 Aminosäuren werden über TAP (transporter associated with antigen processing) in das ER überführt. MHC Klasse I schwere Ketten werden kotranslational in das ER inseriert, dort wird die Assemblierung der MHC- Moleküle durch molekulare Chaperone wie a) Calretikulin, b) ERp57 und c) BiP koordiniert. Die MHC Klasse I- Heterodimere, bestehend aus der gefalteten schweren Kette und ß2-Mikroglobulin (ß2M), werden durch die Peptidbeladung stabilisiert und im Anschluss als Komplex via vesikulären Transport über den Golgi Apparat an die Zelloberfläche transportiert. Spezifische Haplotypen kodieren einzelne MHC- Moleküle, die wiederum charakteristische Peptide binden. Die peptidbeladenen MHC- Komplexe werden von spezifischen T-Zellrezeptoren der CD8+ zytotoxischen T-Lymphozyten erkannt, stimulieren deren Proliferation und initiieren somit die Zerstörung der infizierten Zielzellen. Antigen- präsentierende Zellen sind vor allem dendritische Zellen, Makrophagen und Monozyten (Abb. in Anlehnung an Kloetzel 2001).


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An mehreren Stellen wurde bereits der immunregulatorische Effekt von IFNγ unterstrichen, der in Abb. 11 nochmals zusammenfassend aufgezeigt wird.

Abb. 11 : Zusammenfassende Darstellung des pleiotropen Zytokins Interferon γ (IFNγ).
Das Protein wir vorwiegend von lymphatischen Zellen exprimiert und zeigt vielfältige regulierende Effekte auf die zelluläre Immunantwort. Einerseits übt es einen direkten Effekt auf die Replikation von Pathogenen aus, andererseits kann es die Immunantwort insofern beeinflussen, als dass die Replikation von Pathogenen indirekt limitiert wird. So stimuliert es die Synthese von TAP, ß2-Mikroglobulin, MHC Klasse I schweren Ketten, der Immunountereinheiten des Proteasoms und dessen Regulator PA28. Zytosolische Exopeptidasen wie Leucin-Aminopeptidase (ERAP1) unterliegen ebenfalls der Induktion durch IFNγ (Daten aus Geginat 1997, Beninga 1998).

1.4.2. Das Cytomegalievirus - Prozessierung eines spezifischen viralen Epitops

Das Proteasom spielt, wie oben beschrieben, die entscheidende Rolle in der Generierung antigener Peptide. Im Folgenden sei nun ein spezielles Augenmerk auf ein sehr detailliert studiertes Protein des murinen Cytomegalievirus geworfen, dessen Abbaumechanismus durch das Proteasom jedoch nicht vollständig aufgeklärt ist.

1.4.2.1. Das humane Cytomegalievirus

Das Cytomegalievirus (CMV) ist ein doppelstrangiges DNA-Virus, das durch ein enges Wirtsspektrum und eine langsame Vermehrung gekennzeichnet ist. Pathophysiologisch charakteristisch ist in der Regel eine inapparente Erstinfektion. Bis zum mittleren Erwachsenalter sind bis zu 90% der Population mit dem Virus infiziert. Eine Reaktivierung dieser latenten Infektion kann zu mononukleoseartigen Krankheitsbildern, milden Hepatitiden und fieberhaften Allgemeinsymptomen führen. In der Gruppe Immunsupprimierter wie AIDS-, Transplantations- oder Malignompatienten hingegen manifestiert sich die CMV-Infektion als ein schweres generalisiertes Krankheitsbild in Form einer CID (cytomegalic inclusion disease) mit potentiell letalem Ausgang. Neben der Hepatotoxizität dominieren Retinitiden [Seite 18↓]bei AIDS-Patienten, CMV- Pneumonien sowie ein Befall der Mesangialzellen bei Nierentransplantierten.

Wie auch für weitere Herpesviren gezeigt wurde (Fruh 1995, Hill 1995), weist das Cytomegalievirus zahlreiche Mechanismen zur Umgehung einer adäquaten Immunantwort des Wirts auf. Während der Latenzphase ist die Transkription viraler Proteine deutlich reduziert. Weiterhin kommt es zur Modulation spezifischer Immunfunktionen. Das hCMV (humanes Cytomegalievirus) kodiert 4 Gene, deren funktionelle Proteine mit dem MHC Klasse I- Weg der Antigenpräsentation interagieren (Rensch 1999). Das US3 Gen (gp23 Protein) wird während der Infektion sehr früh exprimiert. Dieses Glykoprotein bindet an MHC Klasse I- Moleküle und führt zu deren Retention und Akkumulation im endoplasmatischen Retikulum (ER) der infizierten Zellen (Jones 1996). Das Glykoprotein 21 (gp21, US6 Gen) wiederum stellt ein Transmembranprotein dar, das durch Interaktion mit TAP an der luminalen Seite im ER dessen Transportfunktion inhibiert und somit die Antigenpräsentation reduziert (Lehner 1997). Glykoproteine 24 und 33 sind Produkte späterer Phasen der Infektion. Diese Proteine bewirken den retrograden Transport neu synthetisierter MHC- Moleküle aus dem ER in das Zytoplasma und damit einen rapiden Abbau dieser körpereigenen Proteine durch das Proteasom (Wiertz 1996). Insgesamt führen diese variablen Mechanismen zu einer dramatisch reduzierten Präsentation von viralen Peptiden gegenüber spezifischen zytotoxischen T- Zellen.

Tab. 2 : Zusammenfassende Darstellung der einzelnen Effekte von hCMV- Proteinen auf die Umgehung der zellulären Immunantwort. Informationen aus Jones 1996, Lehner 1997, Wiertz 1996.

hCMV Gen

Glykoprotein

Effekt auf Immunantwort

US6

gp21

Transmembranprotein inhibiert den Peptidtransport via TAP

US3

gp23

Glykoprotein bindet an MHC Klasse I- Moleküle, dadurch Retention und Akkumulation im ER der Zellen

US2

US11

gp24

gp33

Degradation von MHC Klasse I- Molekülen durch retrograden Transport derselben in das Zytosol

1.4.2.2. Das murine Cytomegalievirus und pp89

Detaillierte Daten hinsichtlich des Proteinabbaus durch das Proteasom und damit der Antigenprozessierung liegen hingegen hauptsächlich für das murine Cytomegalievirus (mCMV) vor. Nach Infektion von Fibroblasten mit mCMV führt die Expression von sehr frühen Genen zur Präsentation eines Peptids auf einem MHC Klasse I H-2Ld Molekül. Dieses antigene Peptid stammt vom mCMV IE pp89 (immediate early phosphoprotein 89kDa) und wurde als das Nonapeptid yphfmptnl charakterisiert (vgl. Abb. 9, 12; Reddehase 1989, [Seite 19↓]del Val 1991). Eine de novo Synthese des pp89 ist Voraussetzung für die proteasomale Degradation des Proteins und somit die Generierung dieses spezifischen Epitops (Geginat 1997).

Das Epitop beinhaltet mit dem Prolin an Position 8 (P8: P) und dem Leucin an Position 1 (P1: L) für das H-2Ld- Molekül spezifische Ankeraminosäuren, die für die MHC- Bindung des Peptids in die Bindungstasche des MHC Klasse I- Moleküls von Bedeutung sind. Proline innerhalb eines viralen Epitops fördern die Präsentation desselben, sie werden für einen verminderten proteasomalen Abbau der Epitope und der daraus folgenden Stabilisierung verantwortlich gemacht (Shimbara 1998).

Abb. 12 : mCMV pp89 : murines Cytomegalievirus immediate early phosphoprotein 89kDa. Das pp89- Epitop (P1-P9) wird auf H-2Ld (murinen MHC KLasse I)- Molekülen präsentiert, dort in der Bindungstasche über spezifische Aminosäurereste (P1 und P8) sowie Wasserstoffbrückenbindungen verankert.

Das an Position 6 (P6) befindliche Phenylalanin hingegen ist für den Kontakt zum peptid-spezifischen T- Zellrezeptor der CD8+ T- Lymphozyten von Relevanz. In Mutationsanalysen wurden die Aminosäuren Y1 und L9 gegen A (Alanin)ausgetauscht, wodurch die antigene Potenz des viralen Epitops (APHFMPTNA) verloren ging. Dies ist insbesondere auf die durch den Aminosäureaustausch hervorgerufene Konformationsänderung des Peptids zu erklären (Reddehase 1991, Rock & Goldberg 1999, Knuehl 2001).


Das Proteasom als Proteasekomplex spielt, wie bereits mehrfach erwähnt, eine entscheidende Rolle in der Prozessierung von MHC Klasse I- Liganden (Rock 1994, Chiechanover 1998). Um einen näheren Einblick in die Antigenprozessierung zu erhalten, wurden verschiedene epitopflankierende Polypeptide synthetisiert und deren Abbau durch Proteasomen untersucht. Auf diesem Wege konnte gezeigt werden, dass 20S Proteasomen in vitro aus 25-40mer Peptiden spezifische Epitope prozessieren. Dieses Resultat wurde durch mehrere experimentelle Ansätze in seiner Gültigkeit bekräftigt, in denen Polypeptide durch Minigene in Mauszellen transfiziert wurden. Die peptidspezifische zytotoxische T- Zellantwort dieser Zellen war der mit spezifischen Peptidsequenzen (durch 20S in vitro generierte Epitope) von extern beladenen Zellen annähernd identisch (Eggers 1995). In [Seite 20↓]diesem Zusammenhang konnte unter anderem demonstriert werden, dass 20S Proteasomen in in vitro Verdaus die proteolytische Aktivität besitzen, aus einem synthetischen epitoptragenden 25mer pp89-Peptid das entsprechende 9mer, das korrekte H-2Ld restringierte Epitop yphfmptnl mit hoher Präzision zu generieren (Boes 1994, Dick 1996).

IFNγ stimuliert im Rahmen der Immunantwort, wie in Abb. 11 dargestellt, einerseits die Synthese von PA28, andererseits die Umwandlung von konstitutiven 20S Proteasomen in Immunoproteasomen. Das pp89-Epitop wird in Anwesenheit von PA28 beschleunigt vom Proteasom generiert, jedoch ändert sich das Verhältnis der verschiedenen Abbauprodukte unter diesen Bedingungen nicht wesentlich (Dick 1996, Groettrup 1996). In Anwesenheit von Proteasomeninhibitoren hingegen wurde eine verminderte Präsentation von pp89-Epitopen auf MHC Klasse I- Molekülen auf der Zelloberfläche infizierter Zellen beobachtet.

In verschiedenen Experimenten wurde gezeigt, dass einige der MHC- Liganden präzise vom Proteasom generiert werden, also keiner zusätzlichen enzymatischen Peptidabspaltung bedürfen (Lucchiari-Hartz 2000, Niedermann 1999). Allerdings demonstrieren Analysen des Transports von Peptiden in das ER, dass zum Beispiel das immunodominante Epitop des mCMV pp89 lediglich in Form eines N- terminal elongierten 11mers vom TAP ins ER transportiert wird. Die epitoptragenden 11mere werden demnach ebenfalls vom Proteasom generiert. Ursache für den nicht erfolgenden Transport des 9mer Epitops ins ER ist anscheinend das Prolin an Position 2 (Knuehl 2001, Neisig 1995, Neefjes 1995, van Endert 1995). Die Identifizierung einer IFNγ- abhängigen Peptidase, der Leucin- Aminopeptidase (Synonym ERAP1) unterstützt diese Vermutung (vgl. Abb. 11). Dieses Bestatin- empfindliche Enzym ist für die N- terminale Hydrolyse von Aminosäuren im ER verantwortlich, unter IFNγ- Zusatz zu Zellen kann eine beschleunigte Prozessierung von 8mer- aus 11mer-Peptiden beobachtet werden (Beninga 1998).

Des Weiteren zeigten Analysen der Generierung des Ovalbuminepitops SIINFEKL, dass hauptsächlich N- terminal verlängerte Varianten als Precursor dieses 8mers nach proteasomalem Verdau entstehen. Das Proteasom ist damit für den Schnitt am C- Terminus verantwortlich. Somit wird die entsprechende AS des spezifischen MHC Klasse I- Haplotyps, die als Ankerrest bezeichnet wird, vom Proteasom am C-Terminus generiert. Die proteasomale Funktion beruht vielmehr auf einem schnellen Abbau von Proteinen zu Aminosäuren als in einer genauen Generierung von spezifischen MHC Klasse I- Liganden. Diese werden vom Proteasom als 10-12mer Peptide generiert und überwiegend durch im ER lokalisierte Amino- Exopeptidasen hydrolysiert (Cascio 2001, Lauvau 1999).


[Seite 21↓]

Ähnlich wie oben für das hCMV beschrieben, konnte anhand des spezifischen pp89-Epitops auch für das mCMV gezeigt werden, dass es im Rahmen einer Infektion zu einer Hemmung der Immunantwort kommt. So führt die Synthese von frühen Genen des mCMV (in chronologischer Folge zu sehr frühen Genen wie pp89) auf der Zelloberfläche zu einer verringerten Präsentation des vom pp89 generierten 9mers (del Val 1989). Für mit mCMV infizierte murine Fibroblasten wurde eine Reduktion von MHC Klasse I- Molekülen auf der Zelloberfläche nachgewiesen (Reusch 1999, del Val 1992). Gene, die in der frühen Phase der Infektion exprimiert werden, rufen eine Destabilisierung von reifenden MHC Klasse I- Molekülen hervor, was wiederum die Antigenpräsentation gegenüber CD8+ T- Lymphozyten beeinträchtigt. TAPs werden in ihrer Fähigkeit, Peptide vom Zytosol ins ER zu translozieren, massiv gehemmt (Hengel 1996). Der Transport der peptidbeladenen MHC- Moleküle zur Zelloberfläche wird bereits zwischen ER und cis- Golgi- Kompartiment inhibiert. Demzufolge kommt es zu einer Retention von MHC Klasse I- Komplexen und einer verminderten Oberflächenpräsentation der Antigene (del Val 1992).
Ein weiterer Mechanismus des „viralen Escape“ ist durch die Charakterisierung des murinen Glykoproteins gp48 (m06 Gen) aufgezeigt worden. Dieses Protein bildet einen festen Komplex mit dem peptidbeladenen MHC Klasse I- Molekül und bewirkt einen raschen lysosomalen Abbau des MHC Klasse I/gp48- Komplexes. gp48 inhibiert auch die Antigenpräsentation gegenüber pp89-spezischen, H-2Ld-restringierten zytotoxischen T-Lymphozyten (Rensch 1999).

1.5. Zielsetzung

Im Rahmen der zellulären Immunabwehr präsentieren körpereigene Zellen intrazelluläre Pathogene, die an spezifische MHC Klasse I- Moleküle binden und auf der Zelloberfläche der Erkennung durch spezifische zytotoxische T-Lymphozyten zugängig werden. Diese intrazellulären Pathogene sind endogenen Ursprungs. Von besonderer Bedeutung für den Organismus sind virale Proteine, die im Allgemeinen Syntheseprodukte infizierter Zellen sind. Deren Prozessierung zum antigenen Peptid, d.h. dem spezifischen Epitop, wird in starkem Maße einer ATP-abhängigen Protease, dem Proteasom zugeschrieben, dessen Inhibition zu einer Blockade der MHC- Assemblierung infolge reduzierter Peptidgeneration führt (Rock 1994). Die optimale Antigenprozessierung bedarf vielfältiger regulatorischer Ereignisse wie der Assemblierung von Immunoproteasomen oder dem Einfluss von PA28- und 19S-Komplexen.

Ein vom mCMV abstammendes, durch das Proteasom generiertes antigenes, virales Peptid ist das 9mer Epitop yphfmptnl des pp89. Seine Präsentation auf der Zelle wird unter Einfluss von PA28 verstärkt, jedoch bewirken Immunoproteasomen und PA28 keine drastische Änderung der Peptidqualität bzw. des Verhältnisses der generierten Peptide (Dick[Seite 22↓] 1996, Groettrup 1996). Allerdings wurden für die in vitro Untersuchungen artifizielle Substrate in Form synthetisierter Peptide (z.B. 25mer) gewählt, der Abbau des Proteins als physiologisches Substrat hingegen ist bislang nicht detailliert analysiert worden. Ziel dieser Arbeit war es, den Abbau des rekombinanten Proteins durch das Proteasom in seiner Kinetik zu verfolgen. Für die Untersuchung dieser Fragestellung sollte geklärt werden, ob das 20S/26S Proteasom dieses virale Protein in vitro ohne Zugabe von Ubiquitin verdauen kann und ob das antigene Peptid tatsächlich prozessiert wird? Des Weiteren sollte der Einfluss des proteasomalen Aktivators PA28 und der Immunountereinheiten auf diesen Prozess hinterfragt werden.

Die Zugabe von Proteasomeninhibitoren zu Zellkulturen resultierte in einer verringerten Präsentation des H-2Ld- restringierten Epitops. Dies führt unter anderem zur Akkumulation von ubiquitinierten Substraten. Ubiquitin stellt ein konserviertes Abbausignal von Proteinen dar, seine Bindung an den 19S Regulator des 26S Proteasoms initiiert die Degradation des Substrats. Bisher konnte jedoch kein Nachweis erbracht werden, dass der Abbau von pp89 in vivo Ubiquitin- abhängig abläuft. Dementsprechend sollte der zelluläre Abbau des Proteins in Zellen, die stabil mit pp89 transfiziert wurden, analysiert werden. Dabei sollte insbesondere die Rolle von Ubiquitin im proteasomalen Substratabbau des pp89 untersucht werden und der Nachweis potentiell vorliegender Ubiquitin-Protein-Konjugate erbracht werden.

Die Möglichkeit eines zum Ubiquitin alternativen Degradationsignals konnte unter anderem für den Antizym- abhängigen Abbau der Ornithindecarboxylase nachgewiesen werden (Murakami 1992). In der Sequenz der ODC sind so genannte PEST- Motive enthalten, die als alternative Abbausignale diskutiert werden. Im Rahmen dieser Arbeit wurde deshalb alternativ auch ein ODCpp89- Fusionsprotein exprimiert und dessen ATP-abhängiger Abbau durch das 26S Proteasom besonders bezüglich der Generierung des 9mer Epitops untersucht.


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08.09.2004