[Seite 23↓]

2.  Material und Methoden

2.1. Material

2.1.1. Geräte

Agarosegelkammer Geltray

Renner

Beta-Counter

Wallace

Elektrophorese Einheit Mighty Small II SE250/SE260

Hoefer

ElisaReader MR5000

Dynatech

Fluorimeter Fluostar Reader mit Easy Software

SLT / Tecan

French® Pressure Cell Press

SLM-Aminco

FPLC Äkta

Amersham Pharmacia

Gamma-Counter, Einkanalmessgerät Cobra

Canberra-Packard

HPLC System Gold

Beckman-Coulter

HPLC-Säule: Micra NPS ODS-I 1,5 μm Säule, PC (33x4,6 mm)

Bischoff chromatography

Kühlzentrifuge 54178

Eppendorf

Kühlzentrifuge Avanti J-25, Rotor GA/18 und SW40

Beckman-Coulter

Kühlzentrifuge J2-HS

Beckman-Coulter

Kühlzentrifuge RC24, Rotor SS34

Sorvall

Massenspektrometer, TSQ7000

Finnigan Mat

Minigel-System

Biorad

PCR Maschine UNO Block

Biometra

Phastsystem®

Pharmacia

Photometer UV-2102 PC Software UV-X101 PC

Shimadzu

Pipettus-Akku

Hirschmann

Phosphoimager FLA 3000

Fuji

S&S Biotrap® Elektroelutionskammer

Schleicher und Schnell

Semidry-Blot-Kammer

pEQLAB

Steril gard Hood classll A1 B3

Baker

Stickstofftank

Taylor-Wharton

Ultrafiltrationszelle

Amicon

Ultrazenrifuge L-70, Rotor SW40

Beckman-Coulter

UV-Tisch

Appligen

Zellkultur-Inkubator BB4220CV

Heraeus

2.1.2. Reagenzien, Lösungen, Verbrauchsmaterialien


[Seite 24↓]

3MM Papier

Whatman

AAF-CMK (Ala-Ala-Phe-Carboxymethylketon)

Sigma

Acrylamid 30 %, 29:1

Roth

Ampicillin

Applichem

Amylose-Resin

Biolabs

Aprotinin

Applichem

Bacto-Agar

DIFCO

Bacto-Trypton

DIFCO

Bestatin

Sigma

Beta- Mercaptoethanol

Serva

BSA, Fraktion V

Serva

Centricon® Plus-50

Millipore

Chromium Nuklid 51Cr

NEN

DEAE Sephacel

Pharmacia

DMSO

Fluka

DTT

Roth

Epoxomicin

Alexis

FCS

Biochrom

fluorogene Peptid-Substrate

Bachem Biochemica

G418-Sulfat

GibcoBRL

Hefe-Extrakt

Difco

Hemin

Sigma

HPLC-Acetonitril

Baker

HPLC-Wasser

Baker

Hygromycin B

Roche

Interleukin-2, rekombinant, murin

Roche

IPTG

Roth

Kryoröhrchen

Nunc

Leupeptin

Applichem

L-Glutamin

Biochrom

Magermilchpulver

Difco

Met- freies RMPI-Medium

Seromed

MG132

Calbiochem

Mikrotiterplatten

Dynatec

Molekulargewichtsstandard, DNA

GibcoBRL

Molekulargewichtsstandard, Protein Rainbow

Amersham

Molekulargewichtsstandard, Protein prestained (blue)

Biolabs

MonoQ-Säule

Pharmacia

N- Ethylmaleinamid

Sigma

Nickel- NTA- Agarose

Qiagen

Nitrocellulose, BA-S85, verstärkt

Schleicher und Schnell

Oligonucleotide

BioTeZ Berlin Buch

Paraformaldehyd

Merck

PhastGel 4-15, native Pufferstreifen

Amersham Pharmacia

Penicillin/Streptomycin

Seromed

PepstatinA

Sigma

PMSF

Sigma

Proteinaseinhibitor- Cocktail Complete®

Roche

Protein A Sepharose CL-4B

Pharmacia Biotech

Protein G Agarose

Boehringer Mannheim

Restriktionsenzyme

New England Biolabs

M-MuLV Reverse Transkriptase

Promega

Röntgenfilme: Xomat-UV/AR/Biomax-MR

Kodak

Schwefel Nuklid Tran 35 S Label TM

ICN

Seakem LE Agarose

FMC bioproducts

Shrimp alkalische Phosphatase

Roche

Sterilfilter 4.5, 0.2 µm

Schleicher und Schnell

T4 DNA Ligase

Roche

TEMED

Serva

Trifluoressigsäure

Fluka

Trypsin-EDTA

Gibco BRL

Tween 20

Serva

Zellkultur-Medien

Biochrom

Zellkultur-Plastikwaren, steril

Falcon, Greiner

2.1.3. Kits

QIAquick Gel Extraction Kit

Qiagen

GFXTMPCR DNA and Gel Band Purification Kit

Amersham

QIAprep Spin Miniprep Kit

Qiagen

QIAquick Gel Extraction Kit

Qiagen

TA cloning Kit

Invitrogen

High Pure RNA Isolation Kit

Roche

LigaFastTM Rapid DNA Ligation System

Promega

2.1.4. Oligonucleotide / Primer

PCR- Fragment

Sequenz (Restriktionsenzymschnittstellen kursiv)

pp89 1452 bp (5‘)

atg gat cca tga taa aac aga act atc (Bam HI)

pp89 1452 bp (3’)

cgc gaa ttc cac ttc ttg ctc ttc ttc (Eco RI)

ODC_1; 1381 bp (5’)

cgc gga tcc atg agc agc ttt act aag ga (Bam HI)

ODC_1; 1381 bp(3’)

cgg ggt acc cac att gat cct agc aga ag (Kpn I)

pp89_1; 630 bp (5’)

cgg ggt acc atg ata aaa cag aac tat ca (Kpn I)

pp89_1; 630 bp (3’)

ccg gaa ttc tca caa ggt tct gcc tct ggc ca (Eco RI)

ODC_2; 1381 bp (5’)

ccg gaa ttc atg agc agc ttt act aag ga (Eco RI)

ODC_2; 1381 bp (3’)

ttt tcc ttt tgc ggc cgc cac att gat cct agc aga ag (Not I)

pp89_2; 630 bp (5’)

cgc gga tcc atg ata aaa cag aac tat ca (Bam HI)

pp89_2; 630 bp (3’)

ccg gaa ttc caa ggt tct gcc tct ggc ca (Eco RI)


[Seite 25↓]

2.1.5.  cDNA-Konstrukte

Plasmidname

hergestellt von

pSTP19_pp89 murin

U. Kuckelkorn

pCRII_pp89 (1452bp) murin

A. Voigt

PRSETA_ pp89 (1452bp) murin

A. Voigt

pCR2.1_pp89 (630bp) murin

A. Voigt

pET15b_ODC (1381bp) murin

Y. Murakami

pET_AZ murin

Y. Murakami

PRSETA_ODC/pp89 murin

A. Voigt

pIND/Hygro_pp89 long murin

A. Voigt

p[CMV]_HA Ubi

Treier 1994

p[CMV]_His Ubi

Treier 1994

2.1.6. Antikörper

Symbol

Quelle des Antikörpers

αpp89 b5/1, b5/12 (1:1000, Western blot)

del Val1988

αpp89 b5/4 (1:1000, Western blot, Immunopräzipitation)

del Val 1988

α(RGS)4-His (1:1000, Western blot)

Qiagen

αPENTA-His (Immunopräzipitation)

Qiagen

αUbiquitin (1:1000, Western blot)

DAKO

αHA (1:1000, Western blot, Immunopräzipitation)

Boehringer Mannheim

αMausIgG Peroxidase-konjugiert(1:10000, Western blot)

Dianova

αKaninchenIgG Peroxidase-konjugiert (1:10000, Western blot)

Dianova

αp53 Ab-5 (monoklonal, Immunopräzipitation)

Oncogene

2.2. Methoden

2.2.1. Molekularbiologische Methoden

2.2.1.1. Amplifikation von DNA durch PCR

Material:

PCR-Maschine UNO Block (Biometra), Oligonukleotide (BioTeZ Berlin-Buch GmbH)

PCR-Ansatz (50µl):

1µl DNA (10ng/µl)

je 1µl Oligonukleotid (100pmol/µl)

5µl 10 x PCR-Puffer + MgCl2

2.5µl dNTP (2.5mM)

8µl Betain (10mM)

0.5µl Taq-Polymerase

Ansatz in 0.5ml Eppendorf- Tubes, mit 50µl Mineralöl überschichtet
PCR-Bedingungen: Denaturierung der DNA und der Oligonukleotide für 5min bei 95°C,
30 Zyklen: 1min 95˚C; 1min 60˚C; 1.5min 72˚C; im Anschluss 10min 72˚C.

2.2.1.2. Amplifikation von RNA durch RT-PCR

Im ersten Schritt wird die isolierte RNA mittels der reversen Transkription von mRNA in cDNA umgeschrieben und dann in einer Standard PCR amplifiziert. Diese Methode erlaubt die indirekte Quantifizierung der RNA.
Material:
PCR-Maschine UNO Block (Biometra), High Pure RNA Isolation Kit (Roche),
M-MuLV (Moloney Murine Leukemia Virus) Reverse Transkriptase (Promega),
[Seite 26↓] RT-PCR-Ansatz:
2μg RNA (in DEPC-H2O)

1μl Oligo- dT- Primer (50pmol/μl)

DEPC-H2O auf 14.5μl

Denaturierung der RNA für 10min bei 65°C, danach für 2min in Eis abkühlen.
5µl First Strand Buffer

0.5µl rRNasin

5µl 10mM dNTPs

2.5µl 100mM DTT

1µl M-MuLV RT
Der RT- Ansatz wurde für 1h bei 42°C inkubiert und die M-MuLV Reverse Transkriptase anschließend für 2min bei 95°C denaturiert. Die einsträngige cDNA wurde direkt in der anschließenden PCR- Reaktion eingesetzt.

2.2.1.3. DNA- Gelelektrophorese

DNA-Fragmente wurden elektrophoretisch im Agarosegel (1% Agarose in TBE) aufgetrennt. Unter Zugabe von Ethidiumbromid konnte die DNA mittels UV-Licht visualisiert werden.

Lösungen:
10 x TBE: 108g Tris, 55g Borsäure, 20ml 0.5M EDTA pH 8, Milli Q ad 1l

2.2.1.4. Extraktion von DNA- Fragmenten aus dem Agarosegel

Für die Isolation von DNA-Fragmenten aus dem Agarosegel wurde der QIAquick Gel Extraction Kit (Qiagen) bzw. der GFXTMPCR DNA and Gel Band Purification Kit (Amersham) verwendet.

2.2.1.5. Bestimmung der DNA- und RNA- Konzentration

Die Bestimmung der DNA- bzw. RNA-Konzentration einer Probe erfolgte durch Messung der Absorption bei 260nm. A260=1 Doppelstrang- DNA entsprechen 50mg/ml DNA, A260=1 Einzelstrang- RNA entsprechen 40mg/ml RNA.

2.2.1.6. Verdau von DNA mit Restriktionsenzymen

Die Restriktionsverdaus wurden mit Enzymen und entsprechenden 10 x Puffern der Firma Biolabs durchgeführt. Eine Einheit Enzym verdaut 1µg DNA in einer Stunde (bei optimalen Temperatur- und Pufferbedingungen). Es wurden 30μl, 50μl oder 100μl Verdauansätze durchgeführt. Die Restriktionsenzyme wurden einer Hitzeinaktivierung nach Protokoll unterzogen oder die DNA- Fragmente aus dem Agarosegel (vgl. 2.2.1.4) extrahiert.

2.2.1.7. Dephosphorylierung von DNA

Bei ungerichteten Klonierungen (Schnittstelle am 5´- und 3´-Ende identisch) wurde die Vektor- DNA nach dem Restriktionsverdau an den 5'-Enden dephosphoryliert. Hierzu wurden 20µl Restriktionsansatz in 100µl Volumen in 2 sequentiellen Zyklen mit je 2 Einheiten [Seite 27↓]„Shrimp alkalischer Phosphatase“ (Roche) bei 37˚C für je 30min inkubiert. Daraufhin erfolgte eine Hitzeinaktivierung des Enzyms bei 65°C für 15min.

2.2.1.8. Ligation von Insert- DNA in Vektor- DNA

Äquimolare Mengen Insert- und Vektor- DNA (ca. 250ng) wurden in einem Volumen von 20µl (2µl 10 x Ligationspuffer, 2U T4 DNA- Ligase (Roche)) für 16h bei 14°C ligiert oder mit Hilfe von LigaFastTM Rapid DNA Ligation System (Promega) 1h bei Raumtemperatur.

2.2.1.9. Herstellen kompetenter Zellen (Rubidium- Chlorid- Methode)

Lösungen:

TFB1 (pH 5.8): 100mM RbCl, 50mM MnCl2, 30mM KAc, 10mM CaCl2, 15% Glycerol
Einstellung des pH-Wertes mit 0.2M Essigsäure auf pH 5.8, steril filtriert
TFB2 (pH 6.5): 10mM MOPS, 10mM RbCl, 75mM CaCl
2 , 15% Glycerol
Einstellung des pH-Wertes mit KOH auf pH 6.5, steril filtriert

Durchführung:

Aus einem DH5α- bzw. BL21-Glycerinstock wurde auf eine LB- Agarplatte ausgestrichen, Inkubation bei 37˚C über Nacht. Am nächsten Tag wurden 5ml LB mit einer Einzelkolonie beimpft und über Nacht bei 37˚C geschüttelt. 100ml LB wurden auf 37˚C vorgewärmt und mit 2ml Übernachtkultur angeimpft. Die Kultur wurde bis zu einer A600 von 0.5 unter Schütteln bei 37˚C inkubiert. Dann wurde die Kultur 5min auf Eis gekühlt und anschließend 5min bei 4000 rpm und 4˚C in der Sorvall zentrifugiert (SS-34 Rotor). Im Anschluss Resuspendieren der Zellen in 40ml eiskaltem TFB, 1.5 min auf Eis stehengelassen, 5min bei 4000 rpm und 4˚C in der Sorvall zentrifugiert. Entfernen des Überstandes, resuspendieren des Pellets in 4ml eiskaltem TFB2. Inkubation 15min auf Eis. Die Zellen wurden in gekühlte Eppendorf-Tubes á 50µl aliquotiert auf Trockeneis schock gefroren und dann bei -70˚C gelagert.

2.2.1.10. Transformation von E. coli mit Plasmid- DNA

Material:

E. coli - Stamm

Genotyp

Referenz

ΔDΗ5α

συπ E44 del lacU169 (phi80 lacZ delM15) hsdR17 recA1 gyrA96 t hi-1 relA1]

Sambrook et al.1989

BL21

B F - omp T hsdS (r B - m B - ) dcm + Tet r gal endA Hte [ argU ileY leuW Cam r ]

Stratagene

TOPO10F-

F´{ lacIq Tn10 (TetR) } mcrA (mrr-hsdRMS-mcrBC) φ80lacZ?M15 lacX74 recA1 deoR araD139 (ara-leu)7697 galU galK rpsL (StrR) endA1 nupG

Invitrogen

Lösungen:
LB Medium (1l): 10g Baktotrypton, 5g Hefeextrakt, 10g NaCl
LB Agar (1l): 10g Baktotrypton, 5g Hefeextrakt, 10g NaCl, 15g Agar
[Seite 28↓]LB- Amp- Agarplatten: LB Agar, 100µg/ml Amp
Ampicillin- Stammlösung: 50mg/ml Ampicillin

Durchführung:
Die Zellen wurden auf Eis aufgetaut. Nach Zugabe von 5-10µl Ligationsansatz oder anderer Plasmid- DNA (2ng), wurde der Transformationsansatz 20min auf Eis inkubiert. Anschließend wurde ein Hitzeschock von 2min bei 42˚C durchgeführt und nochmals 5min auf Eis inkubiert. Es wurde 1 ml LB Medium zugegeben und 1 h bei 37˚C leicht geschüttelt. Dann wurden die Zellen bei 2000rpm 3min pelletiert und in einem Volumen von 100 bis 200µl auf einer LB- Amp- Agarplatte ausplattiert. Inkubation über Nacht bei 37 ° C.

2.2.1.11. Plasmidisolation aus E. coli

„Mini-Präp”
Zur Analyse der Klone aus der Transformation wurden von LB- Amp- Agarplatten Einzelkolonien gepickt und über Nacht in 3ml LB- Amp- Medium bei 37˚C unter Schütteln kultiviert. Die Plasmidisolation erfolgte mit dem QIAGEN Spin Kit. Die Plasmid- DNA aus 1.5ml Kultur wurde in 50µl Aqua dest. aufgenommen, 5-10µl wurden für die Analyse im Restriktionsverdau eingesetzt.

„Easy-Präp“
Alternativ wurde die Aufreinigung der Plasmid- DNA nach folgendem Protokoll realisiert: Das Zellpellet einer 1.5ml E. coli Kultur wurde in 50μl Lysepuffer: 15mM Tris HCl pH 8.0, 1mM EDTA pH 8.0, 15% Sucrose, 2mg/ml Lysozym, 0.2 mg/ml RNase A, 0.1mg/ml BSA für 5min bei Raumtemperatur resuspendiert. Nach einminütigem Kochen wurden die Proben für 1min im Eis gekühlt, woran sich 20min Zentrifugation bei 14000rpm anschloss. Der Überstand wurde in ein frisches Eppendorfgefäß transferiert, die DNA mit 50 μl Isopropanol für 5min gefällt und 15min bei 14000rpm pelletiert. Daraufhin erfolgte ein Waschschritt mit 70% Ethanol und eine erneute Zentrifugation. Das DNA- Pellet wurde in 50μl A. dest. gelöst.

„Midi Präp”
Für die Amplifizierung von Vektor- DNA wurde eine Einzelkolonie in 5ml LB- Amp- Medium über Nacht bei 37˚C unter Schütteln inkubiert. 100ml LB- Amp- Medium wurden mit 100μl der Kultur beimpft und über Nacht bei 37˚C inkubiert. Die Isolation der Plasmid- DNA erfolgte mit dem Qiagen Plasmid Midi Kit.

2.2.2. Proteinbiochemische Methoden

2.2.2.1. Bestimmung der Proteinkonzentration

Die Bestimmung der Proteinkonzentration erfolgte durch Absorptionsmessung bei 280 nm. Dabei wurde eine Absorptionseinheit mit 1µg/µl Protein kalkuliert.
Alternativ kam die Proteinbestimmung nach Bradford zur Anwendung, die Eichkurve wurde mit BSA hergestellt.
[Seite 29↓] Material:
Photometer

Lösungen:
Bradford- Reagenz (BioRad), Proteinstandardlösung: BSA (10mg/ml),
0.9% NaCl in A. dest., pH7.5

Durchführung:
5μl der zu untersuchenden Probe wurden mit 795μl 0.9% NaCl verdünnt und 200μl Bradford- Reagenz hinzu gegeben. Die Proben werden gemixt (Vortexer) und bei 595 nm die Extinktion gemessen. Mit Hilfe der Eichkurve wurden die finalen Proteinkonzentrationen ermittelt.

2.2.2.2. TCA/ NaDoc- Fällung von Proteinen

Die Präzipitation von Proteinen erfolgte durch Zugabe von 50% Trichloressigsäure (w/v; Endkonzentration 10%) und 1% Natriumdesoxycholat (Endkonzentration 0.1%). Die Proben wurden anschließend auf Eis für 30min inkubiert. Nach 15min Zentrifugation bei 4˚C und 14000rpm, wurde zweimal mit je 1ml eiskaltem 70% Ethanol gewaschen und jeweils 10min zentrifugiert. Anschließend wurden die Proteinpellets in SDS-Probenpuffer resuspendiert.

2.2.2.3. SDS- Polyacrylamidgelelektrophorese (SDS-PAGE)

Material:
Minigelsystem BIORAD
Lösungen:
10 x SDS-Laufpuffer: 30.25g Tris HCl, 142.5g Glycin, 10g SDS
2 x SDS Probenpuffer: 40% Glycerol, 6% w/v SDS, 0.02M Tris HCl pH 7, 0.1% w/v Bromphenolblau, 6% β- Mercaptoethanol
Acrylamidlösung: "rotiphorese Gel 30" (30% Acrylamid, 0.8% Bisacrylamid, w/v) Roth
4 x Sammelgelpuffer: 250mM Tris HCl pH 6.8, 0.8% w/v SDS
4 x Trenngelpuffer: 150mM Tris HCl pH 8.8, 0.4 % w/v SDS
Elektrophoresepuffer: 25mM Tris, 190mM Glycin, 0.1% w/v SDS
Molekulargewichtsstandard
Rainbowmarker (Amersham):
„high molecular weight marker”, 14.3 – 21.5 – 30 – 46 – 66 – 97.4 – 220 kDa
Prestained Marker (Biolabs):
„prestained protein marker, broad range“, 6.5 – 16.5 – 25 – 32.5 – 47.5 – 62 – 83 – 175kDa

Durchführung:
Die gelelektrophoretische Auftrennung von Proteinen erfolgte in unterschiedlich konzentrierten Acrylamidgelen.
15%iges Trenngel (Ansatz für 2 x 0.75mm Gele):
5.6ml Acrylamidlösung, 2.8ml 4x Trenngelpuffer, 2.8ml A. dest., 30µl 10% APS, [Seite 30↓]3µl TEMED
8%iges Trenngel (Ansatz für 1 großes 0.75 mm dickes Gel):

9.9ml Acrylamidlösung, 7.5ml 4x Trenngelpuffer, 12.6ml A. dest., 180µl 10% APS, 18µl TEMED
4.5%iges Sammelgel:

0.75ml Acrylamidlösung, 1.25ml 4x Sammelgelpuffer, 1.75ml A. dest., 15µl 10% APS, 1.5µl TEMED
Nach Zugabe von 2x Probenpuffer wurden die Proben für 5min bei 95˚C im Heizblock erhitzt und anschließend 1min bei 13000rpm zentrifugiert.
Die Gelelektrophorese erfolgte bei einer Spannung von maximal 120 V.

2.2.2.4. Elektrotransfer von Proteinen aus SDS- PAG auf Immobilon Membran

Material:
Semi dry- Blotkammer (pEQLAB)
WHATMAN Papier
Immobilon® Membran (Millipore)

Lösungen:
Transferpuffer: 2,4g Tris; 11,3g Glycin; 200ml Methanol; 800ml A. dest. (pH 8.1)
Coomassiefärbung für Immobilon Membran: 1% Coomassie R250 in 50% MetOH
Ponceau- Rot: 0.2% w/v in 3% TCA (Sigma), Entfärbung mit Wasser

Transfer-Aufbau (Semidry):

Durchführung:
Der Proteintransfer erfolgte innerhalb 1h bei 400mA. Die Transfereffizienz wurde durch Färbung der Membran entweder mit Ponceau- Rot- Lösung oder Coomassiefärbung nachgewiesen, Entfärbung im Anschluss mit A. dest., respektive Entfärber (50% Methanol). Der Molekulargewichtsstandard wurde zur späteren Identifizierung markiert.

2.2.2.5. Identifizierung von Proteinen mittels Immunodetektion (ECL)

Lösungen:
1 x PBS: 140mM NaCl, 2.7mM KCl, 10mM Na2HPO4, 1.8mM KH2PO4, pH 7.3
[Seite 31↓] 1 x TBS: 10 mM Tris HCl, 150mM NaCl, pH 7.5
TBS-Tween/Triton-Puffer: 1 x TBS, 500mM NaCl, 0.05% Tween20, 0.2% TritonX-100, pH 7.5 (Waschpuffer für His-Antikörper)
Blocklösung: PBS, 5% w/v Magermilchpulver, 10% Pferdeserum, 0.2% TWEEN-20, für His- Antikörper: TBS, 3% w/v BSA
Waschlösung (PBS/T): PBS, 0.1% TWEEN-20
1. Antikörper (PBS/T): entsprechende Verdünnung in PBS, 5% w/v Magermilchpulver, 0.1% TWEEN-20, anti-His Antikörper wurden in TBS, 3% w/v BSA suspendiert
2. Antikörper: Peroxidase- gekoppelter Antikörper „Ziege anti Kaninchen IgG" (DIANOVA) 1:10000 verdünnt in PBS/T, 5% w/v Magermilchpulver; Peroxidase- gekoppelter Antikörper „Kaninchen anti Maus IgG“ (DIANOVA) 1:10000 in TBS, 10% w/v Magermilchpulver
ECL- Reagens: 20ml 100mM Tris HCl pH 8.5 + 44µl 90mM Coumarinsäure + 100µl 250mM Luminol (3-Aminophtalhydrazid in DMSO) + 6µl 30% H2O2

Durchführung:
Zur Absättigung der unspezifischen Bindungsstellen wurde die Immobilon Membranen für 1h in Blocklösung bei Raumtemperatur inkubiert. Die Inkubation der Membran mit der 1. Antikörperlösung erfolgte über Nacht bei 4 °C oder über 1h bei Raumtemperatur. Nach viermaligem Waschen der Membran für je 10min mit PBS/T erfolgte die Inkubation mit der 2. Antikörperlösung während 1h bei Raumtemperatur. Danach wurde wiederum viermal mit PBS/T je 10min gewaschen. Ein zehnminütiger Waschschritt mit 1 x PBS schloss sich an. Die Peroxidasereaktion wurde in der Dunkelkammer durchgeführt. Dazu wurde die Membran 1min in ECL- Reagens inkubiert und anschließend luftblasenfrei in Folie verpackt. Die Reaktion wurde mittels Röntgenfilm (XOMAT-UV von KODAK) detektiert.

2.2.2.6. Coomassiefärbung von SDS- Minigelen

Lösungen:
Färbelösung: 10% Methanol, 40% Eisessig, 0.25% w/v Coomassie R250, (Farbstoff in Methanol über Nacht lösen, filtrieren)
Entfärber: 10% Eisessig, 40% Methanol

Durchführung:
Nach der elektrophoretischen Auftrennung der Proteine wurden die SDS- Polyacrylamidgele 30min gefärbt, anschließend für 60min entfärbt. Die Gele wurden innerhalb von 2h bei 60°C getrocknet.

2.2.2.7. Native Gelelektrophorese und Substrat- Overlay

Zur Überprüfung der Aktivität der gereinigten 20S- bzw. 26S-Proteasoms wurde je 1μg Proteasom mit Bromphenolblau versetzt und anschließend auf ein PhastGel aufgetragen. Die Proteine wurden bei 110Vh getrennt, die Gele im Verlauf einem Substrat- Overlay mit 100μM Bz-VGR-AMC in 50mM Tris HCl pH 8.5 unterzogen (2ml overlay, Inkubation für [Seite 32↓] 15min bei 37°C). Die Fluoreszenz der abgespaltenen AMC- Gruppe wurde auf dem UV- Tisch detektiert. Anschließend erfolgte die Färbung der Gele mit Coomassie.

2.2.2.8. Aufreinigung von pp89 (56kDa)

Material:
Bioradsäule 20ml, Spectra Por® Membrane (Spectrum), Ni- NTA- Agarose (Qiagen)

Lösungen:
LB-Medium, 50mg/ml Ampicillin- Stammlösung, 1M IPTG, 100mM PMSF (in 100% Isopropanol), Proteinaseinhibitor- Cocktail Complete® (Roche), Nickel- NTA- Agarose (Qiagen)
PBS: 140mM NaCl, 2.7mM KCl, 10mM Na2HPO4, 1.8mM KH2PO4, pH 7.3
Lysepuffer: 6M Gua HCl, 0.1M NaH2PO4, 0.01M Tris HCl, 15mM β- Mercaptoethanol, 1% Tween 20, pH 8.0
Waschpuffer A: 8M Harnstoff, 0.1M NaH2PO4, 0.01M Tris HCl, pH 6.3
Waschpuffer B: 8M Harnstoff, 0.1M NaH2PO4, 0.01M Tris HCl, 1.5M NaCl,1% Tween 20, pH 6.3
Elutionspuffer: 8M Harnstoff, 0.1M NaH2PO4, 0.01M Tris HCl, pH 4.5
Dialysepuffer: 0.5M Harnstoff, 0.01M Tris HCl, pH 7.5

Durchführung:
Von einer LB- Amp- Agarplatte wurden transformierte Einzelkolonien gepickt und über Nacht in 3 ml LB- Amp- Medium bei 37 ˚C unter Schütteln kultiviert. Danach wurde eine 500ml LB-Lösung mit der Kultur angeimpft und bei 37°C bis zu einer OD von etwa 0.4-0.5 geschüttelt. Nun erfolgte die Induktion der Genexpression durch Zugabe von 1mM IPTG, weiterhin wurde 1mM PMSF zur Inhibition von Proteasen hinzu gegeben. Nach 2stündiger Expression bei 37°C wurden die Zellen durch eine Zentrifugation für 10min, bei 4°C und 6000rpm pelletiert, im Anschluss mit 10ml PBS gewaschen und erneut zentrifugiert. Die Lyse der Bakterien erfolgte bei Raumtemperatur für 30min durch Resuspension in 14 ml Lysepuffer unter gleichzeitiger Zugabe von 1.5ml Proteinaseinhibitor- Cocktail. Nach 25min Zentrifugation bei 12500rpm wurde der Überstand zu 2ml 50% Ni- NTA- Agarose Suspension transferiert. Die Bindung des His- getaggten Proteins erfolgte innerhalb 1h bei Raumtemperatur. Dieses Gemisch wurde in eine Bioradsäule überführt. Die ungebundenen Proteine wurden mittels SDS-PAGE analysiert. Die Nickelagarose wurde wie folgt gewaschen, um unspezifisch gebundene Proteine zu entfernen: 15ml Waschpuffer A, 15ml Waschpuffer B, 2 x 15ml Waschpuffer A. Das His- getaggte Protein wurde unter Zugabe von 10ml Elutionspuffer von der Nickelagarose eluiert. Das Eluat wurde dann gegen 2l Puffer für 16h bei 4°C dialysiert.


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2.2.2.9.  Proteinsequenzierung

Die N- terminalen Proteinsequenzierungen (Edman- Abbau) sowie der tryptische Verdau des rekombinanten pp89 mit anschließender Massenspektrometrie wurden von Frau Dr. R. Kraft (MDC, Berlin-Buch) durchgeführt.

2.2.2.10. CD- Spektrum

Das CD- Spektrum für das rekombinante pp89 wurde in Zusammenarbeit mit Frau Dr. M. Dathe und Frau H. Nikolenko aus der AG Peptidchemie am FMP in Berlin- Buch aufgenommen (Jasco J-720 Spektrometer). Das Protein wurde dazu erneut gegen 10mM Tris HCl, pH 7.5 dialysiert und bei einer Endkonzentration von 1.8·10-5M analysiert. Die Sekundärstruktur wurde mit dem Deconvolutionsprogramm CDNN bestimmt (Böhm 1992).

2.2.2.11. Aufreinigung von ODC/pp89 Fusionsprotein (77kDa)

Material:
French® Pressure Cell Press (SLM-Aminco) , Bioradsäule 20ml, S&S Biotrap® Elektroelutionskammer (Schleicher & Schnell), Centricon® Plus-50 (Millipore), Ni- NTA- Agarose (Qiagen)

Lösungen:
LB-Medium, 50mg/ml Ampicillin- Stammlösung, 1M IPTG, 100mM PMSF (in 100% Isopropanol), Proteinaseinhibitor- Cocktail Complete® (Roche), Nickel- NTA- Agarose (Qiagen), 0.3M CuCl2 in A. dest., PBS pH 7.3
Lysepuffer: 8M Harnstoff, 0.1M NaH2PO4, 0.01M Tris HCl, pH 8.0
Waschpuffer: 8M Harnstoff, 0.1M NaH2PO4, 0.01M Tris HCl, pH 6.3
Elutionspuffer:8M Harnstoff, 0.1M NaH2PO4, 0.01M Tris HCl, pH 5.0
Elektroelutionspuffer: 25mM Tris HCl, 192mM Glycin, 0.025% SDS, 0.5M Harnstoff, pH 8.6

Durchführung:

Die Kultur der Bakterien und Expression des Fusionsproteins erfolgten wie oben erläutert (insgesamt 1500ml Bakteriensuspension, 3h Expression bei 37°C). Nach dem Waschen des Pellets mit 1 x PBS wurde unter Zugabe von Proteaseinhibitoren selbiges mit 20ml Puffer lysiert und die Zellen zusätzlich drei aufeinander folgenden Zyklen eines Aufschlusses mittels French Press unterzogen. Nach Zentrifugation (13000rpm, 15 min) erfolgte die Bindung des Fusionsprotein für 1.5h an 2ml Ni- NTA- Agarose. Das Gel wurde im Verlauf mit 4 x 15ml Waschpuffer von unspezifisch gebundenen Proteinen gereinigt. Das His- getaggte Protein wurde mit 20ml Elutionspuffer extrahiert. Das Eluat wurde mit Hilfe eines Centricon® Plus-50 (Millipore) auf ein Volumen von etwa 1ml eingeengt, wobei niedrigmolekulare koeluierte Proteine bereits abgetrennt wurden. Das konzentrierte Eluat wurde dann vollständig in einer SDS-PAGE (10%ige Gele) aufgetrennt und die Gele im Anschluss mit CuCl2 gefärbt. Dazu wurde das Gel in A. dest. 3min gewaschen, dann für 5min in 0.3M CuCl2-Lösung inkubiert und anschließend mit A. dest. gespült. Die entsprechenden [Seite 34↓]Proteinbanden wurden aus dem Gel hinaus geschnitten. In einer Proteinelektroelutions-kammer (S&S Biotrap) konnte das Protein über 16h bei U=100V aus dem Gel extrahiert werden (Elektroelutionspuffer). Es erfolgte eine weitere Konzentrierung und Dialyse mit Centricon® Plus-50.

2.2.2.12. Aufreinigung von Antizym

Material:
French® Pressure Cell Press (SLM-Aminco), Bioradsäule 20ml, FPLC Äkta (Amersham Pharmacia), MonoQ- Säule (Pharmacia), Amylose- Resin (Biolabs)

Lösungen:
LB-Medium, 50mg/ml Ampicillin- Stammlösung, 1M IPTG, 100mM PMSF (in 100% Isopropanol), Amylose- Resin (Biolabs), PBS pH 7.3
Phosphatpuffer: Na2HPO4/ NaH2PO4 pH 7.0, 1mM PMSF, 1mM EDTA
Elutionspuffer: Na2HPO4/ NaH2PO4 pH 7.0, 1mM PMSF, 1mM EDTA, 10mM Maltose
Puffer A: 25mM Tris HCl, 100mM NaCl, 1mM DTT ad 1000ml Milli Q, pH 7.6, steril filtriert, entgast
Puffer B: 25mM Tris HCl, 1M NaCl, 1mM DTT ad 1000ml Milli Q pH 7.6, steril filtriert, entgast
Dialysepuffer: 10mM Phosphatpuffer, 100mM NaCl, 1mM EDTA, pH 7.4

Durchführung:
Die Proteinexpression erfolgte wie bereits bei unter 2.2.2.8 beschrieben. Für die Expression des Antizyms wurden 300ml Bakteriensuspension für 20h bei Raumtemperatur inkubiert. Nach Ernte der Zellen wurde das Pellet in 5ml Phosphatpuffer resuspendiert und einer Lyse in 4 konsekutiven Zyklen mittels French Press unterzogen. Dann erfolgte die Inkubation des zuvor zentrifugierten Überstands (10.000rpm, 4°C, 10min) mit 2ml eines 50%igen Amylose- Gels für 1h bei Raumtemperatur. Nach Überführung des Gemischs in eine Säule wurde das Gel mit 20ml Phosphatpuffer gewaschen. Durch Zugabe des Elutionspuffers (10ml) konnte das Antizym isoliert werden. Das Eluat wurde gegen 2l Puffer für 16h bei 4°C dialysiert. Das Dialysat wurde dann 1:2 mit Puffer A verdünnt und filtriert. Die Probe wurde über einen Superloop auf die MonoQ- Säule HR5/5 geladen und getrennt. Das Antizym wurde durch steigende Salzkonzentration (Puffer B bis 100%) mit einer Flussrate von 1ml/min eluiert. Die Peakfraktionen wurden gepoolt und rechromatographiert.

2.2.2.13.  Aufreinigung von 20 S Proteasomen

Material:
Erythrozytenkonzentrate (280-320ml), DEAE- Sephacel 17-0500-01 (Pharmacia)
Chromatographie-Säule Ø 2.5cm x 20cm (Biorad)
96-well Mikrotiterplatten (Greiner), Fluoreszenz - Mikrotiterplatten - Reader (SLT)
Diaflo Membranen XM300 AMICON Ausschlussgröße 300 kDa, Ø 43 mm (Millipore)
[Seite 35↓]Gradientenmischer, SW 40 Zentrifugenröhrchen (polyallomer centrifuge tubes, Beckman-Coulter),
MonoQ- Säule HR5/5, FPLC Äkta (Amersham Pharmacia)

Lösungen:
1 x PBS: 140mM NaCl, 2.7mM KCl, 10mM Na2HPO4, 1.8mM KH2PO4, pH 7.3
10 x TEA:200mM Tris HCl, pH 7.2 (20°C), 10mM EDTA, 10mMNaAzid
Arbeitspuffer (= TEAD- Puffer): 1 x TEA,1mM DTT
Arbeitspuffer A: 1 x TEAD, 100mM NaCl, filtriert und entgast
Arbeitspuffer B: 1 x TEAD, 500mM NaCl, filtriert und entgast
Ammoniumsulfat, 10% Triton X-100
Saccharosegradient A: 10% Saccharose in 1 x TEAD-Puffer, 50mM NaCl
Saccharosegradient B: 40% Saccharose in 1 x TEAD-Puffer, 50mM NaCl
Assay- Puffer: 50mM TrisHCl, pH 7.8, 1mM DTT, 0.5mM EDTA
10mM Z-GGL-AMC (Substrat für chymotrypsinähnliche Aktivität) in DMF (Bachem)

Durchführung:
Die Präparation von 20 S Proteasomen erfolgte aus humanen Erythrozyten.

1. Zellaufschluss:
Die Erythrozytenkonzentrate wurden dreimal mit 1 x PBS gewaschen (Zentrifugation 12min, 980rcf, 4°C). Nach dem letzten Waschschritt wurde das Pellet im Verhältnis 1:2 in 1 x TEAD resuspendiert und 0.1% Triton X-100 zugegeben. Zur vollständigen Lyse der Zellen wurde die Suspension für 1h bei 4°C gerührt. Anschließend wurden die Membranen durch Zentrifugation abgetrennt (90min, 10000rpm, 4°C).

2. DEAE-Ionenaustauschchromatographie:
Etwa 50 ml des äquilibrierten DEAE- Sephacels wurden mit dem Lysat (dekantierter Überstand) über Nacht bei 4°C inkubiert. Die Gel-Suspension wurde in eine Chromatographie-Säule gefüllt und mit Puffer A (1 x TEAD, 100mM NaCl) gewaschen bis kein Protein mehr im Durchlauf erschien (Kontrolle mit Ponceau S). Im Anschluss wurden die noch gebundenen Proteine mit Puffer B (1 x TEAD, 500mM NaCl) in 15ml Fraktionen eluiert. Der Proteinnachweis erfolgte wiederum mit Ponceau S auf Nitrocellulose.

3. Proteasomen- Aktivitätsbestimmung (Mikrotiterplatten)
Das Substrat (Z-GGL-AMC) wurde frisch in den Assay- Puffer gegeben (20µM Endkonzentration). Jeweils 10µl Probe bzw. 10µl Wasser (Referenzwert) wurden in die Kavitäten einer schwarzen Mikrotiterplatte pipettiert. Dazu wurden 100µl Assay- Substrat-Puffer gegeben. Nach Inkubation dieses Reaktionsansatzes für 60 min bei 37°C erfolgte die Messung der Fluoreszenz der freigesetzten AMC- Gruppe bei einer Emissions-Wellenlänge von 460nm (Anregung bei 390nm) in einem Fluostar- Platten- Reader (SLT).Fraktionen hoher Aktivität wurden vereinigt und, wie unter 4. beschrieben, weiter bearbeitet.


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4. Ammoniumsulfat-Fraktionierung
Das 20S Proteasom fällt zwischen 38-75% Sättigung an Ammoniumsulfat aus. Zunächst wurde die Probe mit festem Ammoniumsulfat auf eine 35%ige Sättigung an Ammoniumsulfat eingestellt. Die Probe wurde in ein Eisbad gestellt und das Salz sehr langsam unter ständigem Rühren zugegeben. Anschließend wurde die Probe weitere 15min zur Gleichgewichtseinstellung gerührt und der Niederschlag bei 17000rpm für 10min abzentrifugiert. Das Proteasom wurde durch Zugabe von Ammoniumsulfat bis zu einer 75%igen Sättigung aus dem Überstand gefällt. Das gefällte Protein wurde durch Zentrifugation präzipitiert und der Niederschlag durch Zugabe von 750µl 1 x TEAD- und 50mM NaCl- Puffer gelöst (im Eisbad unter vorsichtigem Schwenken).

5. Saccharose- Dichtegradienten- Ultrazentrifugation und SDS-PAGE
Der Saccharosegradient wurde aus 10%- und 40%igen Saccharoselösungen (je 6.5ml) hergestellt. Der Gradient wurde vorsichtig mit der vollständig gelösten Probe (1ml) überschichtet. Die Ultrazentrifugation erfolgte über 16h bei 40000rpm, 4°C (SW 40-Rotor (Beckman-Coultern)). Die Gradienten wurden in 0.6ml Fraktionen in Eppendorf- Gefäße fraktioniert und die proteolytische Aktivität bestimmt. Die proteolytisch aktiven Fraktionen wurden vereinigt und einer Dialyse für 16h bei 4°C unterzogen (Dialysepuffer: 1 x TEAD, 100mM NaCl).

6. FPLC
Die dialysierten Proben wurden in Puffer A verdünnt und nicht- gelöstes Protein durch Filtration mit einem 0.2µm Filter entfernt. Die Probe wurde auf eine äquilibrierte Anionenaustauschersäule (MonoQ- Säule) mit einer Flussrate von 1ml/min aufgetragen. Anschließend wurde die Säule mit Puffer A gewaschen und die Proteine mit einem linearen NaCl- Gradienten eluiert (5ml: 0- 20% B, 20ml: 20-40% B, 2ml: 40-100% B, 5ml: 100% B, 2ml: 100-0% B, 5ml: 0% B). Während der Elution mit 20-40% Puffer B wurden 1ml Fraktionen gesammelt. Das 20S Proteasom befindet sich in den Fraktionen mit 30% des Puffers B (ca. 270mM NaCl). Die proteinhaltigen Fraktionen wurden erneut, wie unter 3. beschrieben, auf ihre proteolytische Aktivität getestet und bei 280nm (für Proteasom: OD280nmvon 1 entspricht 720μg/ml) quantifiziert. Die proteasomhaltigen Fraktionen wurden gepoolt. Die Reinheit des isolierten Proteasoms wurde in einer 15%igen SDS-PAGE mit anschließender Coomassiefärbung kontrolliert.

2.2.2.14. Aufreinigung von 26S Proteasomen

Die Aufreinigung von 26S Proteasomen erfolgte aus humanen Erythrozyten. An dieser Stelle sei Dr. B. Braun herzlich gedankt, die die Aufreinigung vorgenommen hat und das 26S Proteasom zur Verfügung stellte (Braun 1999, 65). 26S Proteasomen wurden aliquotiert und in flüssigem Stickstoff Schock gefroren und bei -70°C gelagert:
Puffer: 20mM Tris HCl, pH 7.2, 5mM MgCl2, 50mM KCl, 10% Glycerin, 0.5mM ATP


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2.2.2.15.  Aufreinigung von Immunoproteasomen und PA28

Die Aufreinigung von Immunoproteasomen und dem Proteasomaktivator PA28 erfolgte nach Kuckelkorn et al. (Kuckelkorn 2002). An dieser Stelle sei herzlich Frau Dr. U. Kuckelkorn und Frau I. Drung gedankt, die diese Proteasomkomponenten freundlicherweise zur Verfügung gestellt haben.

2.2.2.16. Aufreinigung von His-Ubi mit Ni- NTA-Agarose aus B8 Zell- Lysaten

Material:
Ni- NTA- Agarose (Qiagen), Biorad- Säulen

Lösungen:
Lysepuffer: 8M Harnstoff, 0.1M Phosphatpuffer (Na2HPO4/ NaH2PO4),

pH 8.0, 5mM Imidazol
Waschpuffer: 8MHarnstoff, 0.1M Phosphatpuffer (Na2HPO4/ NaH2PO4),

pH 6.1, 5mM Imidazol
Proteinpuffer: 50mM Phosphatpuffer (Na2HPO4/ NaH2PO4), pH 8.0, 100mM KCl,
20% Glycerol, 0,2% NP40

Durchführung:

B8- Zellpellets wurden in 6ml Lysepuffer resuspendiert und 1h bei Raumtemperatur rotiert. Nach Trennung des Überstandes durch Zentrifugation wurde diesem 1.5ml Ni- NTA- Agarose zugegeben und dieser Ansatz für 16h bei 4°C geschüttelt. Nach Transfer in Säulen wurde das Gel wie folgt gewaschen: 3ml Lysepuffer, 8ml Waschpuffer, 4ml Lysepuffer, 3ml Lysepuffer/Proteinpuffer 1:1, 3ml Lysepuffer/Proteinpuffer 1:2, 3ml Lysepuffer/Proteinpuffer 1:3, 3ml Proteinpuffer + 10mM Imidazol. Eluiert wurden 4 Fraktionen á 1ml mit Proteinpuffer + 250mM Imidazol. Die Eluate wurden mit 10% TCA gefällt und mittels SDS-PAGE und Western blot analysiert.

2.2.2.17. Proteolytische Verdaus mit mCMV pp89

Material:
pp89 Peptid (2µg/µl) 25mer Kloe 1: RLMYDM YPHFMPTNL GPSEKRVWMS
rekombinantes pp89

Lösungen:
10 x Verdaupuffer: 200mM HEPES, 20mM MgAc, pH 7.8
für 26S Proteasom Verdaus zusätzlich:40mM DTT, 25mM Mg-ATP, 400mM Kreatininphosphat, 50μg/ml Kreatininkinase

Durchführung:

Verdau von pp89 25mer (300 μ l Verdauansatz):

1µg 20S Proteasom, 10µg pp89 (25mer), 1 x Verdaupuffer, 2mM DTT
Inkubation bei 37˚C; Entnahme von je 40µl nach 0, 1h, 2 h, 8h und 20h, Stopp durch Zugabe von 3µl 1% TFA


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Verdau von rek pp89 mit20S (450 μ l Verdauansatz):

3µg c20 S bzw. i20S Proteasom, 50µg pp89 (56kDa), 18µg PA 28,
1 x Verdaupuffer, 2mM DTT
Inkubation bei 37˚C; Entnahme von je 50µl nach 0, 0.5, 1, 2, 4, 8 und 20 h, Stopp durch Zugabe von 5µl 1% TFA
Wiederholung der Ansätze mit Inhibitoren: 1mM PMSF, 10µM MG132, 2µM Epoxomicin, 10µM AAF-CMK (Ala-Ala-Phe-Carboxymethylketon), je 1µl Pepstatin (0.7mg/ml), Leupeptin (1mg/ml), Aprotinin (2mg/ml), Bestatin (4mg/ml), Hemin (1mg/ml), Trypsininhibitor (10mg/ml), 50μM N-Ethylmaleinamid.

Verdau von rekpp89 mit 26S (450 μ l Verdauansatz):

4µg 26S Proteasom, 50µg pp89 (56kDa),1 x Verdaupuffer, 2mM DTT, 5mM Mg-ATP, 5mM Kreatinphosphat, 50ng/µl Kreatinkinase
Inkubation bei 37˚C; Entnahme von je 50µl nach 0, 0.5, 1, 2, 4, 8 und 20 h, Stopp durch Zugabe von 5µl 1% TFA

2.2.2.18. Proteolytische Verdaus mit dem ODCpp89 Fusionsprotein

Lösungen:
1M Tris HCl, pH 7.4, 1M MgCl2, 0.2M DTT, 100mM ATP, 0.5M Kreatinphosphat,
50μg/ml Kreatinkinase

Durchführung:
Für den Verdau und die anschließende massenspektrometrische Analyse des ODCpp89-Fusionsproteins soll die finale Glycerolkonzentration unter 2%, die finale Salzkonzentration unter 50mM liegen und das stöchiometrisches Verhältnis von Antizym zu ODC etwa 5:1 betragen. Das 26S Proteasom wurde in Tris HCl Puffer und 10% Glycerol bei -80°C gelagert.
Verdauansatz: 40mM Tris HCl, pH 7.4, 5mM MgCl2, 2mM DTT, 1mM ATP,
10mM Kreatinphosphat, 50ng/μl Kreatinkinase,
10nM 26SProteasom (13.4μg), 50nM ODCp89 Fusionsprotein (4μg), 11μg Antizym

Die Wiederholung der Ansätze erfolgte unter Zugabe von 10μM MG132 oder 2μM Epoxomicin. Insgesamt hatten die Proben ein Volumen von 80μl pro Ansatz. Der Verdau wurde bei 37°C durchgeführt. Nach 0, 4 und 20h wurden jeweils 25μl entnommen und die Reaktion mit 2.5μl 1% TFA gestoppt.

2.2.2.19. Analytische HPLC

Material:
HPLC System Gold, Detektor 166 (Beckman-Coulter),
HPLC Säule: Micra NPS ODS-I 1,5 μm Säule, PC 33x4.6 mm (Bischoff chromatography)

Lösungen:
Puffer A: 0.1% Trifluoressigsäure (TFA) in Wasser (v/v), entgast
Puffer B: 0.1% TFA in Acetonitril (v/v), entgast


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Durchführung:
Ein 20µl Aliquot der jeweiligen proteasomalen Verdaus (0 bzw. 20h) wurde mittels einer RP-HPLC über eine NPS RP18 1.5µm Säule (MICRA) getrennt.
Flussgeschwindigkeit: 0.2ml/min auf 1ml/min (2min), dann 1ml/min;
Gradient: 0-5min 5% B; 5-20min linear auf 30% B; 20-22min von 30% auf 100% B;
22-24min 100% B; 24-26min linear auf 0% B;
26-30min Reäquilibrierung bei 0% B

Die Detektion erfolgte bei 220 nm.

2.2.2.20. Massenspektrometrie

Die Analyse der Proben wurde freundlicherweise von Dr. K. Janek durchgeführt. 30μl der Verdauansätze wurden mittels RP-HPLC aufgetrennt (Hewlett Packard 1100 ausgestattet mit einer μRPC C2/C18 SC 2.1/10 Säule, PHARMACIA). Eluent A: 0.05% TFA in Wasser; Eluent B: 70% Acetonitril in Wasser, 0.05% TFA; Gradient: 5-95% Eluent B in 15min; Flussrate 70 μl/min; die aufgetrennten Peptidfragmente wurden direkt am Tandemquadrupol Massenspektrometer (ESI electrospray ion source TSQ 7000, Finnigan MAT) gemessen (m/z=300-1300 in 3 s).

2.2.3. Zellkultur

2.2.3.1. Verwendete murine Zelllinien

C4: embryonale Fibroblastenzelllinie aus BALB/c Mäusen generiert
B8: C4 Zellen, stabil transfiziert mit MCMV IE1-Gen, Expression von pp89,
Antibiotikaresistenz: 250 µg/ml G-418 Sulfat (Gibco BRL)
P815: Tumormastzelllinie mit H-2d Hintergrund

2.2.3.2. Lösungen für die Zellkultur

Basal Iscove Medium, RPMI- Methionin- freies Medium, Trypsin/EDTA- Lösung, Kalzium-Magnesium freies Medium (Ca++- Mg++- freies Medium)
Iscove Medium komplett: 10% FCS, 100mg/ml Penicillin/Streptomycin, 2mM L-Glutamin
Einfriermedium: Iscove Medium mit 30% FCS, 10% DMSO
2 x HBS Puffer: 280mM NaCl, 10mM KCl, 1.5mM Na2HPO4, 12mM Dextrose, 50mM Hepes pH 7.05, steril filtriert, Aliquots bei -20°C gelagert
Antibiotikastammlösungen: G-418 Sulfat 100mg/ml (GibcoBRL)

2.2.3.3. Kultur von adhärenten Zellen

Die Zellen wurden im Brutschrank bei 37ºC, 5% CO2 und 95% Wasserdampf kultiviert. Das Ablösen der Zellen vom Boden der Kulturschale erfolgte nach einmaligem Waschen mit 1 x PBS durch Trypsinierung mit Trypsin / EDTA- Lösung (GibcoBRL) oder durch Zugabe von Kalzium-, Magnesium- freiem Medium. Zentrifugationen wurden bei 200 x g und 4ºC für 5min ausgeführt.


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2.2.3.4.  Einfrieren und Auftauen

1-2 x 106 Zellen/ml wurden pelletiert und in eiskaltes Einfriermedium aufgenommen, anschließend in Einfrierröhrchen überführt und in einer eisgekühlten Isopropanol- Einfrierbox (Nalgen) für mindestens 2h bei -70ºC progressiv (1ºC/min) gefroren. Die Langzeitlagerung erfolgte in flüssigem Stickstoff. Das Auftauen erfolgte unter leichtem Schwenken im 37ºC Wasserbad. Die Zellen wurden in ein Röhrchen (15ml) überführt, tropfenweise wurden 10ml eiskaltes Iscove Medium zugegeben, anschließend zentrifugiert und die Zellen in frischem Medium in 6 oder 10cm Schalen kultiviert.

2.2.3.5. Kalziumphosphat- Transfektion adhärenter Zellen

Jeweils 10µg Plasmid- DNA, die das zu transfizierende Gen kodieren (bei transienten Transfektionen ohne Resistenzgen, bei stabilen in Anwesenheit eines Resistenzgens für die spätere Selektion), wurden mit 2.5Vol 96%igem Ethanol und 0.1Vol 3M NaCl für 30 min bei
-20 °C gefällt und 10min bei 4°C, 14000rpm zentrifugiert. Danach wurden die Pellets mit 1.5ml 70%igem Ethanol gewaschen und einem weiteren Zentrifugationsschritt unterzogen. Nach Dekantieren des Ethanols erfolgte eine Lufttrocknung der Pellets unter der sterilen Arbeitsbank. Anschließend wurde die DNA in 219µl sterilem A. dest. resuspendiert und nach Zugabe von 31µl 2M CaCl2 in ein 5ml Polypropylenröhrchen überführt. Danach wurden unter sehr langsamem Mischen auf dem Vortexer 250µl 2 x HBS- Puffer zugetropft (innerhalb 1min, die Tropfen wurden gegen die Röhrcheninnenwand pipettiert). Das Gemisch wurde 30min bei Raumtemperatur inkubiert und dann tropfenweise in das Medium der Zielzellen gegeben. Die Zielzellen wurden am Vortag von einer exponentiell wachsenden Kultur in eine 10 cm Schale ausplattiert, so dass die Zellen am Tag der Transfektion etwa 50% konfluent waren (ca. 1 x 106 Zellen). Nach 4 bis 6h erfolgte ein Glycerolschock (das Medium wurde abgesaugt, 2ml 10% Glycerol in 1 x PBS für 1.5min hinzu gegeben, im Anschluss 2 x mit 5ml PBS gewaschen und 10ml frisches Iscove Medium hinzu pipettiert). Alternativ zur Glycerolgabe wurde das Medium nach 16h Kultivierung gewechselt. Je nach Fragestellung wurden 6μM MG132 (10mM stock in DMSO) bzw. DMSO (Kontrolle) 2h vor dem Ernten der Zellen ins Medium hinein pipettiert. Nach 48h wurden die Zellen (transiente Transfektion) geerntet und lysiert.

2.2.3.6. Lyse der kultivierten Zellen

Lysepuffer: 50mM Tris HCl pH 8.0, 5mM MgCl2, 1mM EDTA, 0.1% Triton X-100, steril filtriert pro ml Lysepuffer folgende Proteaseinhibitoren: 5μl 100mM PMSF, 3,3μl Aprotinin (2mg/ml), 1μl Leupeptin (1mg/ml), 1μl Pepstatin (0.7mg/ml), 1μl Hemin (1mg/ml), 1μl Bestatin (4mg/ml), 50μM N- Ethylmaleinamid, 10μM AAF-CMK, 10μM MG132
Die Zellpellets wurden in Lysepuffer resuspendiert und 3 alternierenden Zyklen Schockfrieren in flüssigem Stickstoff und Erwärmen auf 37°C ausgesetzt. Im Anschluss wurde das Lysat bei 14000rpm, 4°C für 15min zentrifugiert und der Überstand [Seite 41↓]weiterverarbeitet. Es erfolgte eine Proteinkonzentrationsbestimmung nach Bradford (vgl. 2.2.2.1).

2.2.3.7. Test der Transfektanten

mittels RT-PCR (transiente Transfektanten):
Die Aufreinigung und Isolation der Gesamt- RNA erfolgte entsprechend des Protokolls „High Pure RNA Isolation Kit“ (Roche), etwa 2 x 106 Zellen wurden in 400μl PBS resuspendiert. Weiteres Procedere wie unter 2.2.1.2 beschrieben.

2.2.3.8. Pulse-Chase-Experimente

Material:
Schwefel Nuklid 35S Translabel (ICN) 0.2mCi/ml in Iscove Medium

Lösungen:
50mM Tris HCl pH 8.0, 5mM MgCl2, 1mM EDTA, 0.5% Triton X-100, steril filtriert

Durchführung:
Mit His- Ubi bzw. HA- Ubi transfizierte Zellen wurden 36h nach Transfektion mit 1.4mCi 35S markiert (pulse). Dazu wurden die Kulturschalen (Ø 10cm) mit den adhärenten Zellen mit 1 x PBS gewaschen und für 30min mit 2ml Methionin- freiem RMPI- Medium bei 37°C inkubiert. Danach wurde das Medium abgesaugt und die Zellen mit 7ml 35S (0.2mCi/ml) in Iscove Medium (Gesamtaktivität 1.4mCi) für 30min bei 37°C inkubiert. Im Anschluss wurde das radioaktive Medium entfernt und die Zellen mit Iscove Medium bei 37°C inkubiert (chase). Nach entsprechenden Zeiten (chaseà0, 1, 2, 4, 8h) wurden die Zellen mit 5ml 1 x PBS gewaschen und unter Zugabe von 1ml Lysepuffer (2min stehen lassen) geerntet und gleichzeitig lysiert. Die Lysate wurden in flüssigem Stickstoff schock gefroren und bei -20°C gelagert. Die Immunopräzipitation ist unter 2.2.4.4 erläutert.

2.2.4. Immunbiologische Methoden

2.2.4.1. Kultivierung der pp89 spezifischen zytotoxischen T-Zellen

Die Herstellung, Kultivierung und Klonierung der pp89 spezifischen zytotoxischen T- Zellen wurde von Frau Dr. U. Salzmann durchgeführt (Dissertation „Untersuchungen zur antigenprozessierenden Funktion des Proteasoms,“ 2003). Sie hat diese CTLs freundlicherweise zur Verfügung gestellt, meinen herzlichsten Dank an dieser Stelle.

Die eingefrorenen CTLs wurden vor dem Experiment expandiert und restimuliert. Von einer murinen Milz (BALB/c Mäuse) wurden Zellsuspensionen hergestellt. Hierzu wurde das Organ durch ein Edelstahlnetz gestrichen und zweimal mit 10ml Iscove Medium gewaschen (1200rpm, 7min, 4°C). Für die Restimulierung wurden Milzzellen nicht immunisierter BALB/c Mäuse mit 10nM pp89-9mer (YPHFMPTNL) 1h bei 37°C beladen und anschließend mit 3000rad gamma bestrahlt. Pro Kavität wurden 5 x 107 peptidbeladene Milzzellen sowie 10nM pp89-9mer zugesetzt. Nach Expansion der spezifischen CTLs erfolgte die wöchentliche Restimulierung mit 1 x 107 CTLs und 1 x 107 peptidbeladenen Stimulatorzellen pro Kavität in [Seite 42↓]Anwesenheit von 25U/ml murinem IL-2. Die stimulierten CTLs wurden am Tag 5 nach der Restimulierung mit IL-2 für die Experimente eingesetzt.

2.2.4.2. Klonierung der pp89 spezifischen zytotoxischen T-Zellen

Aus den expandierten polyklonalen CTL- Kulturen wurden Zelllinien durch limitierte Verdünnung angelegt. Es wurden 104, 5x103, 103 bzw. 5x102 CTLs pro well in je eine 24-well-Platte gegeben und wöchentlich mit je 105 peptidbeladenen Milzzellen restimuliert.

2.2.4.3. Zytotoxischer T Zell Assay

Mit Hilfe des zytotxischen T Zell Assays lässt sich eine Aussage darüber gewinnen, wie effizient die spezifischen zytotoxischen T- Lymphozyten bestimmte Zielzellen erkennen und lysieren. Das Prinzip des chromium release assays besteht darin, dass die mit radioaktivem Chrom markierten Zielzellen durch die spezifischen T- Zellen lysiert werden, die Radioaktivität in das Medium freigesetzt wird und im Zellüberstand gemessen werden kann.
Die prozentuale spezifische Lyse berechnet sich wie folgt:
100% x [(spezifische Lyse – spontane Lyse) / (maximale Lyse – spontane Lyse)]
= % spezifische Lyse
Der Wert der maximalen Lyse ist die freigesetzte Radioaktivität nach 100%iger Lyse der markierten Zellen in Anwesenheit von 1% Triton X im Medium. Der Wert der spontanen Lyse ist die freigesetzte Radioaktivität ins Medium in Abwesenheit zytotoxischer T-Zellen.

Durchführung:
2 x 105 Zielzellen (P815) wurden in 100µl Medium mit 50 µCi radioaktivem Chrom 2h bei 37ºC inkubiert. Für die Kontrolle der zytotoxischen Aktivität der T-Zellen wurden P815 Zellen während dieser Zeit mit und ohne 100nM YPHFMPTNL- Peptid (pp89-Epitop) inkubiert. Anschließend wurden die Zellen mit 2 x 5ml Medium gewaschen (5min, 2000rpm). In einer 96-Loch-Rundbodenplatte wurden jeweils 2000 Zielzellen mit dem Proteasomverdauansatz und den spezifischen T-Zellen z. B. im Verhältnis 1/27, 1/9, 1/3 und 1/1 über 4h bei 37ºC inkubiert. Für jeden Messwert wurden Dreifachansätze pipettiert. Nach der vierstündigen Inkubationszeit wurden von den 200µl Medium pro well jeweils 100µl Überstand in Messröhrchen pipettiert und im Gammacounter (Cobra Packard) gemessen.

2.2.4.4. Immunopräzipitation

Material:
Normales Kaninchenserum (Dr. J. Pinda Antikörperservice)
Protein A- Sepharose (Pharmacia Biotech), Protein G- Agarose (Boehringer Mannheim),
anti pp89-Antikörper b5/4 (Dr. H. Hengel), anti Penta- His- Antikörper (Qiagen), WHATMAN- Papier, Phosphoimager

Lösungen:
NET-T: 150mM NaCl, 5mM EDTA, 50mM Tris HCl, pH 8.0, 0.5% Triton X-100
NET-TO: 150mM NaCl, 5mM EDTA, 50mM Tris HCl, pH 8.0, 0.5% Triton X-100,
[Seite 43↓]1mg/ml Ovalbumin
NET-TON: 500mM NaCl, 5mM EDTA, 50mM Tris HCl, pH 8.0, 0.5% Triton X-100,
1mg/ml Ovalbumin

Durchführung:
Mit His- getaggtem Ubiquitin transfizierte Zellen wurden nach einem Pulse- Chase mit 35S Met (vgl. 2.2.3.8) immunopräzipitiert. In einem Vorreinigungsschritt wurde zu 100μl Zelllysat 5μl normales Kaninchenserum gegeben und für 30min unter wiederholtem Vortexen auf Eis inkubiert. Im Anschluss wurden 20μl gequollene Protein- A- Sepharose in NET-TO äquilibriert, zu den Lysaten hinzu pipettiert und für weitere 30min unter wiederholtem Vortexen auf Eis gelagert. Zu diesem von unspezifisch bindenden Proteinen gereinigten Überstand wurde der präzipitierende Antikörper hinzu gegeben (5μl anti-pp89 b5/4 bzw. 3μl anti-Penta-His (0.2μg/μl) bzw. 2μl anti-HA (0.4μg/μl)), und dieser Ansatz auf einem End- zu- End- Schüttler für 16h bei 4°C inkubiert.
Danach wurden 40μl gequollene Protein A- Sepharose/ Protein G- Agarose (Verhältnis 3:1) beigemischt und dieser Ansatz für 1h bei 4°C auf dem Schüttler rotiert. Die Gelsuspension wurde zentrifugiert (2000rpm, 2min), dann 2mal mit 1ml kaltem NET-TON gewaschen und für 20min auf Eis gelagert. Nach erneuter Zentrifugation wurde das Gel in 1ml NET-T aufgenommen, zentrifugiert und wiederholt mit 1ml NET-T gewaschen. Das Gel wurde in 25μl 1 x SDS-Probenpuffer und 5μl β- ME gelöst, für 5min bei 96°C erhitzt und kurz abzentrifugiert. Der Überstand wurde in 8% Polyacrylamidgelen elektrophoretisch getrennt und auf WHATMAN- Papier getrocknet. Daraufhin wurden die getrockneten Gele auf Phosphoimagerplatten gelagert, die nach drei Tagen analysiert wurden. Dann wurden Biomax- MR Filme (Kodak) aufgelegt und für 2 bis 3 Wochen bei -70°C aufbewahrt und später entwickelt.


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08.09.2004