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3.  Ergebnisse

3.1. Abbau und Prozessierung des rekombinanten pp89

3.1.1. Klonierung des rekombinanten pp89

Das pp89 ist das durch differentielles Splicing der (IE1) major immediate- early Region des mCMV hervorgehendes immediate early Protein 1, das durch sein antigenes Potential von besonderem Interesse ist. Der Abbau dieses Proteins durch das 20S Proteasom sollte zunächst in vitro analysiert werden, da bisher lediglich unphysiologische Substrate in Form von Peptidfragmenten (25mer) untersucht wurden. Dazu wurde eine Teilsequenz des pp89, die für 484 Aminosäuren kodiert, in den Expressionsvektor pRSET A kloniert. Das resultierende Protein hat ein Molekulargewicht von 55kDa und wird im Folgenden als rek pp89 bezeichnet.

Die verwendeten Primer trugen die Schnittstellen für die Restriktionsenzyme Bam H I (5’-Primer) und Eco R I (3’-Primer). Mittels PCR erfolgte die Amplifikation der cDNA mit den entsprechenden terminalen Schnittstellen. Die PCR- Fragmente wurden anschließend in den pCRII-TOPO-Vektor kloniert. Positive Klone (Insert vorhanden) wurden nach Plasmid- Aufreinigung mittels Restriktionsverdaus mit Bam H I und Eco R I in der DNA- Gelelektrophorese nachgewiesen (Abb. 13). Die isolierte Plasmid- cDNA wurde sequenziert, unter Berücksichtigung der bekannten Nukleotidsequenz erfolgte ein Alignement. Trotz mehrfacher Wiederholungen der PCR und Verwendung von Pfu DNA Polymerase konnten zwei Aminosäureaustausche nicht unterbunden werden. Da die Aminosäureaustausche nicht im Bereich des Epitops liegen, wurde mit diesem Konstrukt im Weiteren gearbeitet. Außerdem wurden in der pp89 Sequenz zwei stumme Mutationen nachgewiesen (Abb. 14).

Abb. 13 : PCR des rek pp89 (A) und Restriktionsverdau (B). A: Die DNA- Gelelektrophorese zeigt in Spur 1 die Positivkontrolle (pp89 1452bp). Nach PCR mit Bam H I- Forward- und Eco R I- Reverse- Primern Probenauftragung wie folgt: in Spur 2 der Leerwert, in Spalte 3 das PCR-Produkt rek pp89. B:In Spalte 1 sind das Insert pp89 (1452bp) und der linearisierte TOPO-Vektor (3900bp) dargestellt.


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Das Plasmid mit dem pp89- Insert, das in TOPO10F--Zellen transfiziert wurde (K13), wurde mit Bam H I und Eco R I geschnitten und das Insert in den ausgewählten Expressionsvektor pRSET A, der analog mit den genannten Enzymen geschnitten und anschließend dephosphoryliert wurde, umkloniert. Dieses Plasmid wurde zunächst in ΔDΗ5α—Zellen transfiziert, folglich amplifiziert und charakterisiert. Anschließend wurde die Plasmid- DNA (rek pp89/pRSET A) für die Proteinexpression in BL21-Zellen transfiziert.

Abb. 15 : pp89 im Expressionsvektor pRSET A. A: Restriktionsverdau des pp89/ pRSET A mit Bam H I, Eco R I. In Spur 1 ist das geschnittene Insert rek pp89 dargestellt, bei 2.9kb der linearisierte Vektor abgebildet. B: Insertion der pp89-Sequenz in den pRSET A Vektor: Ligation über Bam H I und Eco R I- Schnittstellen. Der Vektor beinhaltet den T7 Promoter, das exprimierte Protein trägt einen N- terminalen His-tag (His)6.

3.1.2. Expression und Aufreinigung des rekombinanten pp89

Das His- getaggte rekombinante Protein wurde, wie in 2.2.2.8 erläutert, unter Zugabe von Proteaseinhibitoren exprimiert und mit Hilfe von Nickel- NTA- Agarose (Qiagen) aufgereinigt.


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In Abb. 16 ist einerseits das gereinigte Protein in der Coomassiefärbung zu sehen, des Weiteren konnte im Westernblot mit αpp89 b5/1- und α(RGS)4-His- Antikörpern die Identität des Proteins bestätigt werden.

Das Molekulargewicht des aus 484 Aminosäuren bestehenden Proteins ist mit etwa 55kDa kalkuliert worden, wobei unter Einbeziehung des His- tags ungefähr von einem Molekulargewicht von 56kDa auszugehen ist. Aus der Abbildung wird hingegen ersichtlich, dass das Protein in der elektrophoretischen Auftrennung in einem höhermolekularen Bereich nachzuweisen ist (etwa 75kDa). Das Laufverhalten des pp89 änderte sich auch nach nativer Reinigung des Proteins (Imidazolgradient) nicht. Allerdings konnte durch native Reinigungsbedingungen nur eine stark reduzierte Proteinausbeute realisiert werden. Auch die Gelelektrophorese im Tris HCl- gepufferten Harnstoffsystem, dass der Bestimmung des Molekulargewichts dienen kann, zeigte kein verändertes Laufverhalten des Proteins. Zur exakten Identifizierung des pp89 wurde die beschriebene Proteinbande isoliert und von Frau Dr. R. Kraft (MDC Berlin) wie folgt analysiert. Nach reduktiver Alkylierung mit Jodacetamid und tryptischem Verdau wurden sowohl ESI-MS/MS- als auch Edman- Sequenzierungen durchgeführt. Die so gewonnenen Peptidfragmente konnten als Teile der Aminosäuresequenz des pp89 zugeordnet werden (vgl. Abb. 17). Ein kopurifiziertes Protein (Laufverhalten bei etwa 55kDA) entspricht einem Elongationsfaktor von E. coli.

Abb. 16 : Aufreinigung und Nachweis des pp89. In der Coomassiefärbung (Abb. A) sind nach SDS- PAGE jeweils 0.5 und 1.0 μg des gereinigten und dialysierten Proteins aufgetragen. Im Westernblot konnte pp89 sowohl mit dem polyklonalen αpp89- Antikörper (B) als auch mit dem monoklonalen αHis- Antikörper (C) nachgewiesen werden.


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3.1.3. In vitro Verdau des rekombinanten pp89 durch das Proteasom

In Analysen zur Antigenprozessierung des Proteasoms konnte mit Hilfe synthetischer Polypeptide (das Epitop beinhaltende Sequenzen) gezeigt werden, dass 20S Proteasomen in vitro aus 21-40mer Peptiden spezifische Epitope prozessieren können. So konnte unter anderem demonstriert werden, dass 20S Proteasomen in in vitro Verdaus aus einem synthetischen epitoptragenden pp89-25mer Peptid das entsprechende 9mer, das korrekte
H-2Ld restringierte Epitop yphfmptnl mit hoher Präzision generieren (Boes 1994, Dick 1996). Allerdings stellt sich die Frage, ob diese Resultate auch der physiologischen in vivo Situation entsprechen. Um diesem Punkt näher zu kommen, wurden sowohl der Abbau des rek pp89 durch das 20S Proteasom als auch der Einfluss von PA28 und des Immunoproteasoms auf diesen Prozess untersucht. Die aus humanen Erythrozytenkonzentraten gewonnenen 20S Proteasomen wurden einerseits mit pp89, andererseits zur Kontrolle der Aktivität des 20S mit dem 25mer RLMYDM YPHFMPTNL GPSEKRVWMS (Kloe1) inkubiert (vgl. 2.2.2.17). So konnte der zeitliche Verlauf des Proteinabbaus beobachtet werden. Die Verdauprodukte wurden in der SDS-PAGE aufgetrennt und pp89 im Westernblot analysiert. Die Aktivität des eingesetzten c20S und i20S wurde nach Inkubation mit Kloe 1 in der HPLC analysiert. Es konnte sowohl das charakteristische Peakmuster, das bei den Verdaus entsteht, gezeigt werden als auch der Peak, dessen Retentionszeit dem 9mer zugeordnet werden konnte, nachgewiesen werden (vgl. Abb. 18).

Trotz der nicht erfolgten Verwendung von Detergentien lässt sich in der Coomassiefärbung sowie im Westernblot (αpp89) bei Verdau mit dem konstitutiven 20S Proteasom innerhalb von 4 Stunden der nahezu komplette Abbau des rekombinanten, partiell gefalteten pp89 beobachten. Um einen Einfluss von kopurifizierten Proteasen auszuschließen, wurden während der gesamten Isolierung des pp89 Proteinaseinhibitor- Cocktail Complete® (Roche) hinzu gegeben, der ein sehr breites Spektrum proteolytischer Aktivität inhibiert. Der Abbau des Proteins wurde weiterhin in Anwesenheit von PA28 und bei Inkubation mit Immunoproteasomen verfolgt, da in Abhängigkeit davon Aktivitätsänderungen und verschiedene Schnittmuster des 20S beschrieben sind (Dick 1996, Groettrup 1996, [Seite 48↓]Kuckelkorn 2002). Wie in Abb. 18 C zu sehen ist, bauen Immunoproteasomen das rekombinante Protein wesentlich langsamer ab, nach 8 Stunden ist das Substrat noch, allerdings deutlich vermindert, nachweisbar. PA28 zeigt keinen stimulatorischen Effekt auf den Abbau des pp89, es scheint sogar vielmehr die Effizienz des Substratumsatzes zu beeinträchtigen (vgl. Abb. 18 B/D).

Abb. 18 : In vitro Degradation des pp89 durch c20S und i20S in An- bzw. Abwesenheit von PA28. SDS-PAGE und Westernblot mit αpp89 b5/1. In Abb. A ist der Abbau des Proteins in Gegenwart von c20S dargestellt, wobei 3μg 20S und 50μg pp89 bei 37°C verdaut und jeweils 50μl Fraktionen mit 1% TFA inaktiviert wurden. Links oben ist der 0h-Wert ohne 20S zum Vergleich aufgetragen. Nach nur 4h zeigt sich ein nahezu vollständiger Abbau des pp89. In Gegenwart von PA28 (18µg)ist der Substratumsatz hingegen vermindert (B). Auch bei Einsatz von Immunoproteasomen (C) wird ein zeitlich verzögerter Abbau des pp89 deutlich, obwohl im Test mit fluorogenen Substraten die Aktivität von c20S und i20S identisch erschien. Bei Gabe von PA28 zum Ansatz mit i20S (D) zeigt sich ein mit C vergleichbarer Proteinumsatz, so dass der Effekt von PA28 auf die Proteindegradation zu diskutieren ist (vgl. 4.1.2).

Wie bereits beschrieben, erfolgte die gesamte Aufreinigung des rekombinanten Proteins unter Zusatz von Proteinaseinhibitoren (Proteinaseinhibitor- Cocktail Complete®), womit die Stabilität des Proteins gewährleistet werden konnte. Um den Einfluss derartiger Proteasen auf den Proteinabbau auch während des Verdaus sicher auszuschließen, wurden diverse Kontrollversuche durchgeführt, in denen sich bei Zugabe von Inhibitoren kein verändertes Verhalten des Proteinabbaus beobachten ließ. Folgende Inhibitoren wurden verwendet: Pepstatin*, Leupeptin*, Aprotinin* (* inhibieren Aspartat- und Serinproteasen), Bestatin (inhibiert Aminopeptidasen), Trypsininhibitor, PMSF, AAF-CMK (AAF- Carboxymethylketon inhibiert Tripeptidylpeptidase II). In Abb. 19 E/F wird deutlich, dass der Abbau des rekombinanten Proteins eindeutig dem 20S Proteasom zuzuschreiben ist, erst durch Zugabe des c20S erfolgt die Proteindegradation. Wird hingegen lediglich der zeitliche Verlauf des rek pp89 in Abwesenheit jeglicher Proteaseinhibitoren und ohne Zusatz von 20S dargestellt [Seite 49↓](Abb. 19 A), zeigt sich während des Beobachtungszeitraumes ein stabiles Protein. Somit kann indirekt ein Vorhandensein bzw. ein Einfluss von kopurifizierten Proteasen ausgeschlossen werden.

Des Weiteren wurde die Abhängigkeit des Proteinabbaus von charakteristischen Proteasomeninhibitoren veranschaulicht. Sowohl im Falle des reversibel inhibierenden Peptidaldehyds MG132 (Endkonzentration=10μM) als auch nach Zugabe des potenten irreversiblen Inhibitors Epoxomicin (ein Epoxyketon isoliert aus Aktinomyzeten, Endkonzentration=2μM) konnte ein stark verminderter Proteinabbau beobachtet werden (Abb. 19 C/D). Diese Tatsache unterstreicht die bereits postulierte Abhängigkeit der Proteindegradation vom 20S Proteasom.

Die bisher dargelegten Daten sprechen für einen Abbau des rekombinanten pp89 durch das Proteasom. Diese Annahme wurde in weiteren Experimenten bekräftigt. Das Interesse richtete sich dabei insbesondere auf den Nachweis prozessierter Peptidfragmente, wie sie einerseits in der RP-HPLC nachgewiesen werden können und sich in der ESI- MS/MS spezifischen Aminosäuresequenzen zuordnen lassen. Zunächst wurden die einzelnen Verdaufraktionen (Kloe1 und rek pp89 jeweils als Substrat) über ein HPLC System (siehe 2.2.2.19) mittels Wasser/ Acetonitrilgradienten getrennt und die Peakmuster der 0- und 20-Stundenverdaus verglichen. Da das pp89 Epitop YPHFMPTNL nur einen geringen Prozentsatz der Abbauprodukte darstellt, konnte ein sicher zuzuordnender Peptidpeak nicht gefunden werden (Dick 1996). Demnach kann mit diesem analytischen Verfahren kein konkreter Anhaltspunkt für die Generierung des Epitops bzw. von Epitop- Precursorfragmenten gefunden werden. Allerdings lassen sich im Vergleich mit dem 0-Stundenwert einzelne Peptidpeaks nachweisen, die aus dem Abbau des pp89 resultieren (Abb. 20).


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Abb. 19 : In vitro Abbau des rekombinanten pp89 durch das c20S Proteasom. Auftrennung in 12,5% Acrylamidgelen mittels SDS-PAGE, Westernblot mit αpp89 b5/1 und ECL. In Abb. A (ohne Proteasom) und B wird deutlich, dass der Abbau des Proteins dem c20S unterliegt. In Anwesenheit des Proteasoms ist pp89 bereits nach 4h im Westernblot nicht mehr nachweisbar. Dies wird durch den inhibitorischen Effekt von MG132 und Epoxomicin, einem sehr spezifischen Hemmstoff des Proteasoms, auf die Degradation bestätigt (Abb. C/D). Der Zusatz verschiedener Proteaseinhibitoren zeigt keinen Effekt auf den Abbau, das Protein ist unter diesen Bedingungen stabil und wird bei Zugabe von c20S, ähnlich wie in Abb. B zu sehen, proteasomabhängig abgebaut und ist nach 4h nicht mehr nachweisbar.

In weiteren Experimenten wurden die einzelnen HPLC- Fraktionen einer Analyse durch die ESI- MS/MS unterzogen. Diese Untersuchungen wurden freundlicherweise von Frau Dr. K. Janek (Institut für Biochemie, Charité Berlin) durchgeführt. Auch in der Auswertung der ermittelten Daten war das zuvor erwähnte Problem hinsichtlich der geringen Menge und großen Vielzahl der generierten Fragmente des Proteins deutlich, es ließen sich keine konkreten Peptidsequenzen identifizieren. Deshalb stellte sich die Frage nach einem alternativen Analytikverfahren, um die Prozessierung des rek pp89 durch das Proteasom und insbesondere die Generierung des 9mer Epitops in diesem Zusammenhang zu charakterisieren.


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Abb. 20 : RP-HPLC der Peptid- bzw. Proteinverdaus mit dem c20S Proteasom. Dargestellt sind zwei Chromatogramme, der 0-Stundenverdau entspricht dem roten Graphen, der 20-Stundenverdau dem schwarz gezeichneten. Links gezeigt ist der Verdau des pp89 25mers Kloe 1 (RLMYDM YPHFMPTNL GPSEKRVWMS). Bei 22.5min findet sich der Peak des 25mer und ist nach Verdau durch 20S nicht mehr nachweisbar, hingegen sind viele einzelne Peaks zu erkennen, die der prozessiven Aktivität des 20S Rechnung tragen. In der rechten Abb. wiederum kommen die Chromatogramme eines pp89 Verdaus zur Darstellung, das Laufverhalten ist uncharakteristisch. Nach 20 Stunden sind einzelne Peptidpeaks, die aus dem Abbau des rek 20S resultieren, zu sehen.

Ein sehr sensitives Verfahren stellt der CTL- Assay dar, der mittels spezifischen zytotoxischen T-Lymphozyten (CTL) eine selektive Erkennung des Epitops des pp89 (YPHFMPTNL) erlaubt. Als antigenpräsentierende Zellen (so genannte Targetzellen) fungierten murine P815 Mastozytomazellen, die zunächst mit 51Cr markiert und dann von außen mit dem Verdauansatz beladen wurden. Von spezifischen CTLs erkannte Mastozytomazellen wurden lysiert, setzten 51Cr frei. Die Zelllyserate ist ein Maß dafür, ob und wie viele der Targetzellen durch die CTLs erkannt werden. An dieser Stelle sei Frau Dr. U. Salzmann (ehemals Institut für Biochemie, Charité Berlin) sehr herzlich gedankt. Sie hat die CTLs generiert und stand bei den Experimenten unterstützend zur Seite.

Wie in Abb. 21 ersichtlich ist, führt die Beladung von P815-Zellen mit den vom c20S generierten Peptiden (Verdauansatz: pp89 + c20S nach 20h Inkubation) zu einer spezifischen Lyse dieser Targetzellen durch die für das pp89 Epitop spezifischen zytotoxischen T- Lymphozyten (A). Daher kann zusammenfassend aus den unter 3.1 dargestellten Daten geschlussfolgert werden, dass konstitutive 20S Proteasomen große, nur partiell gefaltete Proteine abbauen können. Sie können das gleiche Epitop generieren, das während des Abbaus des synthetischen pp89 25mers entsteht oder wie es in Zellkulturen [Seite 52↓]von mit pp89 transfizierten Mausfibroblasten (B8-Zellen) nachgewiesen wurde (Eggers 1995, del Val 1989).

Abb. 21 : Detektion des H-2L d restringierten pp89 Epitops YPHFMPTNL im CTL Assay. A: P815-Zellen (murine Mastozytomazellen) wurden mit 51Cr markiert und im Anschluss für 4 Stunden mit dem Verdauansatz (20h) des pp89 und des c20S (schwarze Quadrate) inkubiert. Die leeren Quadrate symbolisieren den Nullstundenwert des Verdauansatzes. B: Als Kontrollpeptid fungierte das synthetische 9mer YPHFMPTNL (schwarze Kreise), es wurde ebenfalls über 4 Stunden mit P815-Zellen inkubiert. Die Lyse von P815-Zellen ohne Peptidzusatz ist mit leeren Kreisen dargestellt. Die Lyserate wurde anhand der 51Cr Freisetzung ermittelt.

Abb. 21 : Detektion des H-2L d restringierten pp89 Epitops YPHFMPTNL im CTL Assay. A: P815-Zellen (murine Mastozytomazellen) wurden mit 51Cr markiert und im Anschluss für 4 Stunden mit dem Verdauansatz (20h) des pp89 und des c20S (schwarze Quadrate) inkubiert. Die leeren Quadrate symbolisieren den Nullstundenwert des Verdauansatzes. B: Als Kontrollpeptid fungierte das synthetische 9mer YPHFMPTNL (schwarze Kreise), es wurde ebenfalls über 4 Stunden mit P815-Zellen inkubiert. Die Lyse von P815-Zellen ohne Peptidzusatz ist mit leeren Kreisen dargestellt. Die Lyserate wurde anhand der 51Cr Freisetzung ermittelt.

3.1.4. CD- Spektrum des rekombinanten pp89

Das isolierte rekombinante pp89 (vgl. 2.2.2.8) wurde unter denaturierenden Bedingungen gereinigt und in weiteren Schritten gegen einen Puffer (0.5M Harnstoff, 0.01M Tris HCl,

pH 7.5) dialysiert und in dieser Form in den Verdaus eingesetzt. Bei einer Harnstoffkonzentration von 0.5M kann bereits von einer partiellen Rückfaltung des Proteins ausgegangen werden. Um diese Vermutung mit experimentellen Daten zu untermauern, wurde in Zusammenarbeit mit Frau Dr. M. Dathe und Frau H. Nikolenko (FMP Berlin- Buch) ein CD- Spektrum des Proteins aufgenommen. Da Harnstoff das Absorptionsverhalten während der Messung stark beeinträchtigt, wurde das Protein erneut gegen ein Tris- Puffer- System (0.01M Tris HCl pH 7.5) dialysiert und das entsprechende Spektrum aufgenommen. Das Spektrogramm wies eine deutliche Überlagerung verschiedener Sekundärstrukturen auf, wobei jedoch aufgrund charakteristischer Bandenmuster auf das Vorliegen zahlreicher β- Faltblätter und damit einer partiellen Faltung geschlossen werden konnte.


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Abb. 22 : CD Spektrum des rekombinanten pp89. Das im Bereich von 195-260nm gewonnene Spektrum zeigt eine Überlagerung verschiedener Sekundärstrukturen, die mit Hilfe eines Dekonvolutionsprogramms quantitativ bestimmt wurden (vgl. Tab. 3).

Mit Hilfe eines Dekonvolutionsprogramms konnte unter Berücksichtigung der Aminosäuren des Proteins die prozentuale Verteilung der einzelnen Sekundärstrukturen ermittelt werden (vgl. Tab. 3), wobei über das gesamte Spektrum antiparallele β- Faltblätter dominieren. Alle anderen möglichen Sekundärstrukturelemente sind jedoch auch vorhanden. Etwa 35% der Sekundärstrukturen werden der Gruppe ungeordneter Strukturen (random coil) zugerechnet, die auf partiell entfaltete Sequenzbereiche innerhalb des pp89 hindeuten. Insgesamt stellt sich das rekombinante Protein somit als partiell gefaltetes Protein dar, das vom 20S Kernkomplex in dieser Form degradiert wird. Ein Einfluss des restlichen Harnstoffs (0.5M in Dialysepuffer 1) auf die Rückfaltung konnte primär nicht ausgeschlossen werden. Kontrollverdaus mit dem gegen Puffer 2 (0.01M Tris HCl pH 7.5) dialysiertem Protein zeigten jedoch ein annähernd identisches kinetisches Verhalten wie in Abb. 21 A dargestellt. Somit ist der Effekt der restlichen Harnstoffkonzentration von 0.5M auf die Sekundärstruktur als minimal anzusehen, insbesondere scheint er ohne Auswirkung auf den proteasomalen Abbau des rek pp89 zu sein.


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Tab. 3 : CD- Dekonvolution: pp89 Sekundärstruktur. Die Berechnung der prozentualen Verteilung der einzelnen Anteile von Sekundärstrukturformen zeigt, dass das rekombinante Protein in einer partiell gefalteten Form (etwa 65% geordnete Struktur) vorliegt, 35% der Proteinsequenz liegen nicht gefaltet im Sinne denaturierter Abschnitte vor.

Wellenlänge λ

λ

Λ

λ

Durch-schnittswert

Sekundärstruktur

195-260 nm

200-260 nm

205-260 nm

210-260 nm

 

α - Helix

8,20%

7,30%

4,40%

4,70%

6,15%

β - Antiparallel

40,10%

39,70%

41,40%

42,70%

40,98%

β - Parallel

5,40%

5,60%

5,30%

5,30%

5,40%

β - Turn

18,60%

19,50%

19,20%

19,40%

19,18%

random coil

32,70%

36,30%

35,00%

35,30%

34,82%

totale Summe

105,10%

108,50%

105,40%

107,40%

 

3.2. Polyubiquitinierung des pp89 Abbaus durch das 26S Proteasom in vivo

In 3.1 wurde die Fähigkeit des 20S Proteasoms, aus dem partiell gefalteten pp89 das entsprechende antigene Peptid YPHFMPTNL bzw. den Precursor in vitro zu generieren, ausführlich dargelegt. Diese Erkenntnis und die Tatsache, dass die Präsentation dieses viralen MHC Klasse I- Epitops in vivo vom Proteasom abhängig ist, implizieren gleichzeitig die Frage, ob der proteasomale intrazelluläre Abbau dieses viralen Proteins einer intrazellulären Polyubiquitinierung bedarf. Wie bereits unter 1.1.5 detailliert erläutert, unterliegen viele Proteine einer Polyubiquitinierung und werden danach durch das 26S Proteasom erkannt und abgebaut. In den folgenden Experimenten wurde zur Analyse einer potentiellen Polyubiquitinierung die murine Fibroblastenzelllinie B8 verwandt, die durch eine stabile Transfektion mit pp89 in C4 Zellen generiert wurde (Boes 1994).

3.2.1. Transiente Transfektion von HA- bzw. His- markiertem Ubiquitin in B8 Zellen

C4 und B8 Zelllysate wurden zunächst im Westernblot mit Ubiquitin-, pp89- und HA- Antikörpern analysiert, wobei einerseits das pp89 in den B8 Zellen (mit pp89 cDNA stabil transfizierte Zellen) nachgewiesen werden konnte (Abb. 23), sich jedoch unter selben Bedingungen kein Hinweis auf eine Ubiquitinierung in Form höhermolekularer Proteinbanden zeigte (Abb. 23 B, C, Spur 2). Um eine Limitierung des Ubiquitins auszuschließen, wurden die B8 Zellen transient mit HA- bzw. His- getaggtem Ubiquitin (HA- bzw. His- Ubi Plasmide, Abb. 24) transfiziert. Die Zellen wurden nach der Transfektion für 48 Stunden inkubiert. Zusätzlich wurden 2 Stunden vor der Ernte der Zellen jeweils 6μM MG132 (respektive als Kontrolle die volumenäquivalente Menge DMSO) als spezifischer Proteasomeninhibitor zu den Zellen gegeben. Nach der Transfektion von HA- Ubiquitin konnten in den Westernblots vermehrt polyubiquitinierte Substrate sowohl mit dem Ubiquitin- Antikörper (Abb. 23 B, Spur 3) als auch mit dem monoklonalen HA- Antikörper nachgewiesen werden (Abb. 23 A, Spur 3). Im Gegensatz dazu wurde mit dem pp89- Antikörper kein polyubiquitiniertes pp89 detektiert (Abb. 23 C, Spur 3). Obwohl eine quantitativ ausreichende Menge an freiem [Seite 55↓]intrazellulären Ubiquitin angenommen werden kann, findet sich in diesem Experiment kein Hinweis auf eine Ubiquitinierung des viralen Substrats pp89.

Der inhibierende Effekt des MG132 auf das Proteasom spiegelt sich in der quantitativen Zunahme der polyubiquitinierten Substrate wider, die insbesondere mit dem Ubiquitin- Antikörper, der sowohl endogen als auch transfiziertes Ubiquitin nachweist, deutlich werden (Abb. 23 B, Spur 4). Allerdings führte die Inhibition der Proteasomen ebenfalls zu keinem Nachweis von ubiquitiniertem pp89 (Abb. 23 C, Spur 4). Somit ergab sich aus diesem Experiment kein Hinweis auf eine Ubiquitinierung des viralen Proteins.

Abb. 23 : Detektion von pp89 und Ubiquitin aus Zelllysaten im Westernblot. Murine Fibroblasten (C4 Zellen, jeweils Spur 1) wurden mit einem pp89 Konstrukt stabil transfiziert (B8 Zellen, jeweils Spur 2). Zellkulturen der B8 Zellen wurden transient (Kalziumphosphat- Transfektion) mit HA- markiertem Ubiquitin transfiziert. Die Inkubation erfolgte einerseits ohne MG132 (Spur 3, stattdessen DMSO- Kontrolle), in Spur 4 sind die Lysate dargestellt 2 Stunden nach Zugabe von 6μM MG132. Im linken Teil der Abb. sind die zugehörigen Blots (Immobilon®) nach Färbung mit Coomassie zu sehen, um die Äquivalenz der aufgetragenen Proteinmengen zu belegen (Proteinbestimmung nach Bradford). Abb. A: αHA- Antikörper; Abb. B: αUbiquitin- Antikörper; Abb. C: αpp89- Antiköper. Die am rechten Bildrand dargestellten Klammern deuten auf die polyubiquitinierten Produkte hin.


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Abb. 24 : Struktur der Vektoren, die markiertes Ubiquitin exprimieren. Die Vektoren bestehen aus der CMV Promoter/ Enhancer Region, die die Transkription der mRNA initiiert. Diese mRNA kodiert ein Molekül aus 8 N- terminal markierten (HA- tag bzw. His- tag) Ubiquitineinheiten. Die Proteinsequenzen des His6- und des HA- markierten Ubiquitins sind im unteren Abschnitt der Abbildung dargestellt (Treier 1994).

Parallel wurde die Polyubiquitinierung des viralen pp89 in einem ähnlichen Experiment untersucht, wobei murine B8 Zellen mit His- markiertem Ubiquitin (His6- Ubi) transient transfiziert wurden. Neben dem Ubiquitin- Plasmid wurden zusätzlich pp89 und β- Catenin cDNA cotransfiziert. Für β- Catenin, das im Zusammenhang mit der malignen Transformation kolorektaler Mukosa steht, ist ein ubiquitinabhängiger Abbauweg durch das 26S Proteasom bekannt (Hochstrasser 1996, Hershko 1998). Damit wäre eine Akkumulation von His- Ubi- markierten Proteinen in der Zelle zu erwarten gewesen. Auch in diesem Experiment wurde das proteasomale System inhibiert, in diesem Falle wurden 10μM Lactacystin eingesetzt. Die ubiquitinierten Proteine sollten mit dem His- tag über das exprimierte Ubiquitin- Plasmid versehen sein. Nach Lyse der Zellen können die His- Proteine mittels Ni- NTA- Agarose isoliert werden. Die an Ni- Agarose gebundenen Proteine werden dann mittels eines imidazolhaltigen Puffers von der Ni- Agarose eluiert, die desorbierten Proteine mit TCA gefällt und in einer 12,5%igen SDS-PAGE aufgetrennt. Der folgende Westernblot mit dem polyklonalen αpp89- Antikörper (Abb. 25) zeigt in allen Spuren das virale Protein mit dem korrekten Molekulargewicht von 89kDa, unabhängig von der Transfektion mit His- markiertem Ubiquitin oder kotransfiziertem His-Ubi, pp89 und β-Catenin. Möglicherweise bindet das virale Protein unspezifisch an Nickelagarose und ein spezifischer Nachweis von geringen Mengen an His- markiertem Protein ist somit nicht möglich. Es stellte sich die Frage, ob das pp89 ein besonders histidinreiches Protein ist. Laut Sequenzanalyse beinhaltet das Protein 25 Histidine bei einer Gesamtzahl von 669 Aminosäuren, was einen prozentualen Anteil von 3,7% darstellt. Dies ist nicht als besonders histidinreich zu werten. Cluster von Histidinen, die eine Bindung an Ni- NTA bewirkten, bestehen nicht. Über die Proteinstruktur, die ebenfalls ein derartig spezifisches Bindungsverhalten von pp89 gegenüber Ni- NTA- Agarose erklären könnte, ist nichts bekannt. Auffallend ist jedoch der hohe Anteil an Glutamatresten (9,6%) innerhalb des Proteins, der theoretisch berechnete isoelektrische Punkt des vollständigen Phosphoproteins liegt bei 4.53. Dies könnte eine unspezifische Bindung an die positiv geladene Ni- Agarose erklären.


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In den entsprechenden Auftragungen in der SDS-PAGE (Abb. 25, Spur 2-5) waren keine Proteinleitern im Sinne polyubiquitinierter Substrate auszumachen. Auch in diesem Experiment konnte der inhibitorische Effekt des Lactacystins auf die proteasomale Degradation beobachtet werden: im Vergleich zu den Lysaten ohne Zusatz des Inhibitors (Abb. 25, Spur 2 und 4) akkumulieren nach Zugabe von Lactacystin jeweils mehr Substrate (Abb. 25, Spur 3 und 5). Zusammenfassend betrachtet ließ sich auch in diesem experimentellen Ansatz der Nachweis eines ubiquitinabhängigen Abbaus des viralen Proteins pp89 nicht zeigen.

Abb. 25 : Isolation von His- markierten Proteinen aus B8 Zellen. B8 Zellen (Spur 1) wurden einerseits mit His- Ubiquitin (His6- Ubi) transient transfiziert, zum anderen wurde pp89- und β- Catenin- cDNA (Spur 4 und 5) kotransfiziert. Zudem wurde das Proteasomsystem mit 10μM Lactacystin inhibiert (Spur 3 und 5), als Kontrolle diente DMSO (Spur 2 und 4). Die Zelllysate (Lyse in 8M Harnstoffpuffer) wurden an Ni- NTA- Agarose gebunden, mittels Imidazol- haltigem Puffer erfolgte die Isolation der an Ni- NTA- Agarose gebundenen, histidinreichen Proteine. Anschließende TCA- Fällung und Auftrennung der Eluate in 12,5%-igen Acrylamidgelen (SDS-PAGE). Blotting auf Immobilon® und Westernblot mit αpp89.

3.2.2. Immunopräzipitation von pp89

Da aus den bisher dargestellten Versuchen keine Ubiquitinierung des viralen pp89 nachgewiesen werden konnte, wurde im folgenden Experiment versucht, die Empfindlichkeit der Detektion ubiquitinierter Substrate durch die metabolische Markierung der murinen Fibroblasten mit 35S Methionin / Zystein zu erhöhen. Im Anschluss an die 30minütige Inkubation mit den radioaktiv markierten Aminosäuren und konsekutiver Zugabe des Standardmediums wurden die Zellen zunächst nach einer Zeitspanne von zwei Stunden geerntet. Zum Vergleich wurde erneut das proteasomale System der Fibroblasten für 2 Stunden mit 10μM MG132 inhibiert, um eine Akkumulation eventuell ubiquitinierter Substrate zu erreichen. Aus den Zelllysaten wurde mit dem polyklonalen Antikörper αpp89 b5/4 immunopräzipitiert. Die pp89- IgG- Komplexe wurden mittels Protein A- Sepharose präzipitiert und nach Solubilisierung elektrophoretisch in 8%igen Polyacrylamidgelen [Seite 58↓]aufgetrennt. Nach Trocknung der Gele wurden die mit pp89 Antikörpern präzipitierten Proteine mit dem Phosphoimager bzw. nach Inkubation auf Filmmaterial (Biomax-MR (Kodak)) visualisiert. Unmittelbar nach der radioaktiven Markierung (Abb. 26 A Spur 2 und 3) ist das virale Protein in seiner gesamten Länge (MW 89kDa) in für die Detektion ausreichender Menge synthetisiert. Im Vergleich dazu sind in Spur 1 derselben Abbildung Lysate von C4 Zellen verwandt worden, die das pp89 nicht exprimieren. Auch in diesem Experiment konnte kein Nachweis einer Ubiquitinierung des pp89 Proteins erbracht werden. Höhermolekulare Proteine, die, wie für das p53 (Abb. 26B) gezeigt, das Resultat einer Polyubiquitinierung wären, waren nicht nachweisbar. Sogar die zeitgleiche Gabe des proteasomspezifischen Hemmstoffs MG132 zeigte keinen Effekt hinsichtlich einer Akkumulation von potentiell ubiquitiniertem pp89, so dass auch hier keine Anzeichen für eine ubiquitinabhängige Degradation des viralen Proteins offenbar wurden.

In einem Versuchsansatz wurde p53 als Positivkontrolle immunopräzipitiert. Wie bereits in 1.1.5 beschrieben, erfolgt der Abbau dieses Tumorsuppressors Ubiquitin- abhängig durch das 26 S Proteasom (Scheffner 1990). In Abb. 26 B erkennt man sowohl das markierte Protein bei etwa 53kDa nach 30minütiger Inkubation als auch höhermolekulare Proteine, die durch den monoklonalen Antikörper präzipitiert werden und die polyubiquitiniertem p53 entsprechen. Bereits während der 30minütigen Markierung ist der Effekt des Proteasomeninhibitors MG132 deutlich, die Hemmung des Proteasoms hat die erwartete Akkumulation ubiquitinitierter Substrate zur Folge (Spur 2). Ein ähnlicher Verlauf ist auch nach 2stündiger Inkubation der Zellen im Standardmedium zu beobachten, lediglich ist insgesamt eine Abnahme der Proteinkonzentration zu verzeichnen (Abb. 26 B Spur 3 und 4), was durch die kurze Halbwertszeit von p53 zu erwarten war.


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Abb. 26 : Immunopräzipitation von pp89 aus B8 Zellen, als Kontrolle Immunopräzipitation des ubiquitinabhängigen Transkriptionsfaktors p53. A: C4 (Spur 1) und B8 Zellen (Spuren 2 bis 5) wurden über 30min mit 35S Methionin markiert (pulse) und nach 2 Stunden Inkubation geerntet (chase). Das proteasomale System der B8 Zellen wurde gleichzeitig mit 10μM MG132 (Spuren 3 und 5) inhibiert. Im Anschluss an die Lyse der Zellen erfolgte die Immunopräzipitation mit αpp89- Antikörpern, eine Auftrennung durch SDS- PAGE und Exposition des getrockneten Gels auf einem Röntgenfilm. In einem parallelen Ansatz wurde das Zelllysat mit einem monoklonalen αp53- Antikörper präzipitiert. Dieses Kontrollexperiment zeigt unter selbigen Versuchsbedingungen die Polyubiquitinierung des Substrats und den durch MG132 inhibierten Abbau des Proteins infolge Hemmung des Proteasoms (Daten aus experimenteller Zusammenarbeit mir Frau Dr. U. Kuckelkorn).

Aus dem beschriebenen Experiment wird auch deutlich, dass B8 Zellen genügend intrazelluläres Ubiquitin aufweisen, das den kontrollierten Proteinabbau gewährleistet. Dies wird durch die Positivkontrolle (Immunopräzipitation mit αp53- Antikörpern) veranschaulicht, der Tumorsuppressor wird ubiquitiniert und akkumuliert bei Inhibition des proteasomalen Systems. Somit ist im Grunde ein quantitativ limitierender Effekt des intrazellulären Ubiquitins auf den kontrollierten Proteinabbau eher unwahrscheinlich. Da es sich im Falle der stabil transfizierten B8 Zellen jedoch um gentechnisch veränderte Zellen handelt und infolge Selektion der pp89- produzierenden Zellen mit G418 von einer unphysiologischen Überexpression des immediate early gen product pp89 auszugehen ist, wäre hypothetisch auch ein quantitativer Mangel intrazellulären Ubiquitins zu diskutieren. Um einen derartig limitierenden Effekt auszuschließen, erfolgte erneut eine radioaktive Markierung (30min) von B8 Zellen und die folgende Immunopräzipitation mit dem αpp89- Antikörper, wobei diese B8 Zellen im Vorfeld transient mit His6 markiertem Ubiquitin transfiziert wurden (Abb. 27). In diesem Ansatz wurde insbesondere auch das Verhalten des viralen Proteins im Zeitverlauf über mehrere Stunden beobachtet, auch nach 8 Stunden Inkubation lassen sich keine Veränderungen im Vergleich zum 30 Minutenwert bzw. 2 Stundenwert feststellen. Zum Vergleich sind jeweils C4 Zelllysate (Abb. 27 Spur 1) präzipitiert worden, die kein pp89 exprimieren. Mit Ubiquitin cDNA transfizierte B8 Zellen (Abb. 30, Spur 3 und 4) weisen jedoch keine präzipitierten Substrate auf, die höhermolekular als das pp89 sind. Auch in Zellen, die mit dem spezifischen Proteasominhibitor MG132 behandelt wurden, wurden keine [Seite 60↓]ubiquitinierten Proteine nachgewiesen. Lediglich lässt sich quantitativ mehr pp89 als Hinweis auf einen gehemmten proteasomalen Abbau des pp89 finden (Abb. 27 Spur 4, 2h und 4h).

Auch diesem Experiment zufolge liegt keine Polyubiquitinierung des pp89 vor. Somit ergibt sich aus sämtlichen durchgeführten Experimenten kein Indiz für einen Ubiquitin- abhängigen Abbau des viralen Proteins pp89.

Abb. 27 : Immunopräzipitation von pp89 aus B8 Zellen, Zeitverlauf. Sowohl C4 (Spur 1) als auch B8 (Spur 2) und mit His6- markiertem Ubiquitin transfizierte B8 Zellen (Spur 3, 4) wurden über 30min mit 35S Methionin markiert (pulse) und im Zeitverlauf nach 2, 4 und 8 Stunden geerntet (chase). Hemmung des Proteasoms für jeweils 2h mit 10μM MG132 (Spur 4). Immunopräzipitation mit αpp89- Antikörpern, Auftrennung in der SDS- PAGE. Der inhibierende Einfluss von MG132 wird deutlich, allerdings besteht hier kein Anhalt für eine Ubiquitinierung des pp89.

3.3. Abbau des ODCpp89 Fusionsproteins durch das 26S Proteasom

Wie bereits mehrfach ausgeführt, werden höhermolekulare Proteine normalerweise durch das 26S Proteasom abgebaut, andererseits ist dafür in der Regel eine Polyubiquitinierung des Substrates erforderlich. Hingegen wurde für die ODC der Ubiquitin- unabhängige Abbau durch das 26S Proteasom in Anwesenheit von Antizym beschrieben (vgl. 1.3). Ben-Shahar et al. charakterisierten diesen Abbauweg für eine Reihe von Epitopen, indem sie eine 12mer Aminosäuresequenz an den C- Terminus der ODC fusionierten. Diese Sequenz beinhaltete das H-2Kb- restringierte Ovalbuminepitop SIINFEKL. Mittels dieses Konstruktes konnten sowohl das Epitop als auch Precursorpeptide durch das 26S generiert werden (Ben-Shahar 1999). In einem ähnlichen Ansatz sollte der Abbau für ein ODCpp89 Fusionsprotein analysiert werden. Dabei galt es, die Frage zu klären, ob das 26S Proteasom in der Lage ist, das korrekte pp89 Epitop (YPHFMPTNL) ohne Zusatz von Ubiquitin zu generieren.


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3.3.1.  Klonierung des rekombinanten ODCpp89 Fusionsproteins

Das Fusionsprotein besteht einerseits aus der vollständigen Sequenz der murinen Ornithindecarboxylase (461 Aminosäuren) und einer Teilsequenz des pp89 (210 Aminosäuren), wodurch insgesamt ein Protein von etwa 77kDa zu erwarten ist.

Abb. 28 : ODCpp89 Fusionsprotein. Aminosäuresequenz des ODCpp89 Fusionsproteins. In grün dargestellt die murine ODC, daran anschließend in schwarz die pp89 Sequenz. Zwischengeschaltet sind 2 Linkeraminosäuren HG (schwarz kursiv), die zur Aufrechterhaltung des korrekten Leserasters eingefügt wurden. Schwarz und fett gedruckt ist das pp89 Epitop. In Position 39 (bzw. 502) lässt sich erneut ein Aminosäureaustausch nachweisen (F à S).

Abb. 29 : Insertion des ODCpp89Fusionsproteins in den Expressionsvektor pRSET A.
A: In Spur 1 ist das pp89 Insert (630bp) mit Kpn I und Eco R I Schnittstellen, in Spur 2 das ODC Insert (1383bp) mit Bam H I und Kpn I Schnittstellen jeweils nach Restriktionsverdau dargestellt. Der positive Klon A1 wurde einerseits mit Bam H I und Kpn I verdaut, in Spur 3 sind die entsprechenden Produkte ODC und Vektor pRSET A+pp89 zu sehen. Nach Inkubation der Plasmid- DNA mit Kpn I und Eco R I kann das pp89(630bp) und pRSET A+ODC (Spur 4) gezeigt werden.
B: Die ODC- Sequenz wurde über Bam H I und Kpn I Schnittstellen in den zuvor identisch verdauten Vektor ligiert. Direkt im Anschluss des C- Terminus der ODC wurde über Kpn I und Eco R I eine 603 bp große pp89- Sequenz inseriert, so dass im Vektor letztendlich die Fusionssequenz vorliegt: Die Plasmid- DNA wurde initial in ΔDΗ5α—Zellen transformiert, amplifiziert und sequenziert sowie nach positiver Selektion für die Proteinexpression in BL21-Zellen transformiert.

Nach Amplifikation der DNA und gleichzeitiger Einführung der Restriktionsschnittstellen Bam H I, Kpn I und Eco R I wurden jeweils Klone der einzelnen Fragmente in pCRII-TOPO- Vektoren isoliert. Nach erfolgtem Restriktionsverdau wurden aus den geschnittenen Inserten [Seite 62↓]und den pREST A- Expressionsvektoren zunächst Klone von pREST A und jeweils einem Insert erzeugt. Nach Testung der positiven Klone mit der PCR, anschließendem Restriktionsverdau und Ligation konnten schließlich Klone mit der entsprechenden Fusionssequenz selektioniert werden.

3.3.2. Expression und Aufreinigung des rekombinanten ODCpp89Fusionsproteins

Die Plasmid- DNA des Klons A1 wurde zur Expression in BL21- Zellen transformiert. Die Expression des Fusionsproteins, die anschließende Lyse der Bakterien und die Aufreinigung des His- getaggten Proteins erfolgte wie in 2.2.2.11 beschrieben. Das Protein wurde unter denaturierenden Bedingungen isoliert, da im Falle eines nativen Reinigungsverfahrens eine extrem geringe Proteinausbeute beobachtet wurde. Da trotz zahlreicher Waschschritte des Ni- NTA- Agarosematerials mit verschiedenen Puffern (Zusatz von 1.5M NaCl, 1% Tween 20 und mit variablen pH- Werten) immer eine Kopurifikation diverser Proteine in geringer Konzentration beobachtet wurde, erfolgte die Auftrennung des gesamten eluierten Proteins in der SDS-PAGE. Anschließend wurde die spezifische Bande des ODCpp89 Fusionsproteins ausgeschnitten und aus dem Gel elektroeluiert. Dadurch wurde eine hohe Reinheit erzielt.

Abb. 30 : A ufreinigung das ODCpp89 Fusionsprotein, Coomassie- Färbung und Westernblot.
Nach Isolation des getaggten Fusionsproteins nach beschriebenem Protokoll (vgl. 2.2.2.11) wurden die Proben in 12,5%igen Polyacrylamidgelen getrennt und mit Coomassie gefärbt. In Spur 1 und 2 sind jeweils 2 und 4 μg des Proteins mit zu erwartendem Molekulargewicht (77kDa) sichtbar. Nach Blotting der Proteine erfolgte der spezifische Proteinnachweis mit α(RGS)4His- (Spur 3) und αpp89- Antikörpern (Spur 4).

3.3.3. Expression und Aufreinigung von Antizym

Der Abbau der ODC erfolgt durch das 26S Proteasom in Abhängigkeit eines regulierenden Proteins, dem Antizym. Die Plasmid- DNA des Antizyms wie auch für ODC wurde uns freundlicherweise von Frau Dr. Y. Murakami (Tokio, Japan) zur Verfügung gestellt. Das mit MBP (maltose binding protein) assoziierte Antizym wurde exprimiert (vgl. 2.2.2.12) und entsprechend dem Protokoll isoliert (Abb. 31).


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Abb. 31 : Aufreinigung des Antizyms. Nach Expression des MBP- Antizym und Bindung an Amylose- Resin erfolgte die Elution mit dem Maltose- haltigen Puffer. Das Eluat wurde zweimal in der FPLC über einen NaCl-Gradienten getrennt (Proteinpeaks E6, E7). Nach Trennung der Eluate liegt das Antizym homogen vor. Die Peakfraktionen (E5), E6 und E7 in der Coomassiefärbung entsprechen den Fraktionen des Chromatogramms.

3.3.4. In vitro Verdau des rekombinanten ODCpp89 durch das 26S Proteasom

Ähnlich wie unter 3.1.3 für das rekombinantes pp89 beschrieben, wurde der Abbau des ODCpp89 Fusionsproteins analysiert. Das eingesetzte 26S Proteasom stammt aus humanen Erythrozyten und wurde freundlicherweise von Frau Dr. B. Braun (Charité Berlin) zur Verfügung gestellt. Zunächst sollte die Aktivität des 26S Proteasoms überprüft werden, da während der Lagerung bei -80°C mit einem Zerfall in den 20S Core- Komplex und die 19S Regulatoren zu rechnen ist. Dazu wurde eine native Gelelektrophorese durchgeführt, die eine Trennung von 20S und 26S Fraktionen gestattet. Die Aktivität des Proteasoms konnte nach Inkubation (Overlay) mit 100μM Bz-VGA-AMC durch die fluoreszierende Eigenschaft der abgespaltenen AMC- Gruppe detektiert werden.


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Abb. 32 : Aktivität des 26S Proteasoms. Die aus humanen Erythrozyten isolierten 26S Proteasomen wurden in einer nativen Gelelektrophorese aufgetrennt und mit einem Substratoverlay (100μM Bz-VGA-AMC) nachgewiesen. In Spur 1 ist zur Kontrolle reines 20S Proteasom aufgetragen, in Spur 2 das in den Verdaus eingesetzte 26S. Im Anschluss wurde das Gel mit Coomassie gefärbt. Das 26S Proteasom (Spur 2) zeigt 26S Aktivität und darüber hinaus ist partiell zerfallenes 26S in Form des 20S Core- Komplexes sichtbar.

In den Verdauanalysen wurde das ODCpp89 Fusionsprotein mit Antizym, 1mM ATP und 26S Proteasomen in einem ATP- generierenden System (1mM ATP, 10mM Kreatinphosphat, 50ng/μl Kreatinkinase) bei 37°C inkubiert und die Reaktion nach 0, 4 und 20 Stunden mit 1% TFA gestoppt. Zunächst wurden die Verdauprodukte in einer SDS-PAGE analysiert und das spezifische Protein im Westernblot (αpp89 -Antikörper) nachgewiesen. Zur Kontrolle wurde dieselbe Inkubation ohne 26S Proteasom untersucht (Abb. 33 A), in einem weiteren Ansatz hingegen neben dem Proteasom der spezifische Inhibitor Epoxomicin (2μM, Abb. 33 C) zugesetzt. In dem dargestellten Westernblot (Abb. 33) zeigt sich im Zeitverlauf ein stabiles ODCpp89 Fusionsprotein in Anwesenheit von 26S. Für den Proteasominhibitor lässt sich ebenfalls kein in diesem Verfahren nachweisbarer Effekt finden, wonach aus diesem Experiment zunächst kein Anhalt für den Abbau des ODCpp89 Fusionsproteins durch das 26S Proteasom besteht.

Abb. 33 : In vitro Abbau des rekombinanten ODCpp89 Fusionsproteins durch das 26S Proteasom. Das Fusionsprotein (50nM (4μg)), wurde in folgendem Ansatz bei 37°C für 0, 4, 20 h inkubiert: 40mM Tris HCl, pH 7.4, 5mM MgCl2, 2mM DTT, 1mM ATP, 10mM Kreatinphosphat, 50ng/μl Kreatinkinase, 10nM 26S (13.4μg), 11μg Antizyme. Die Reaktionen wurden in SDS-PAGE und Westernblot (polyklonaler αpp89- Antiköper) analysiert.
A: Kontrolle ODCpp89 + Antizym ohne 26S; B: ODCpp89 + Antizym + 26S; C: ODCpp89 + Antizym + 26S + 2μM Epoxomicin


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Den Literaturangaben entsprechend kann jedoch von quantitativ geringen Mengen des Substratumsatzes und einem prozessiven proteasomalen Abbau ausgegangen werden. Auch für das ODCpp89 Fusionsprotein konnte der hochsensitive CTL- Assay zum Nachweis geringer Mengen des generierten pp89 Epitops erfolgreich ausgenutzt werden. Der Test wurde analog zum Verdau des rek pp89 durchgeführt. Lediglich die Beladung der Targetzellen erfolgte mit dem 0- und 20Stundenwert des ODCpp89 Verdaus mit dem 26S Proteasom bzw. mit dem Kontrollpeptid YPHFMPTNL. Aus Abb. 34 A wird deutlich, dass 26S Proteasomen tatsächlich in Anwesenheit von Antizym in der Lage sind, das pp89 Epitop suffizient in für die CTL- Erkennung nötigen Mengen aus dem ODCpp89 Fusionsprotein zu generieren.

Abb. 34 : Detektion des H-2L d restringierten pp89 Epitops YPHFMPTNL im CTL Assay. A:P815-Zellen (murine Mastozytomazellen) wurden mit 51Cr markiert und im Anschluss für 4 Stunden mit dem Verdauansatz (20h) von ODCpp89 Fusionsprotein und 26S (schwarze Quadrate) inkubiert. Leere Quadrate symbolisieren den Nullstundenwert. B: Als Kontrollpeptid fungierte das 9mer YPHFMPTNL (schwarze Dreiecke), es wurde ebenfalls über 4 Stunden mit P815-Zellen inkubiert. Leere Dreiecke entsprechen dem Nullstundenwert. Die Lyserate wurde anhand der 51Cr Freisetzung ermittelt.


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08.09.2004