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4.  Diskussion

Das Potential zur Elimination von viralen Infektionen hängt in starkem Maß von der Fähigkeit der Organismen ab, Peptide aus viralen Proteinen zu generieren und diese nach Bindung an MHC Klasse I- Moleküle auf der Zelloberfläche den spezifischen zytotoxischen T- Lymphozyten (CD8+) zu präsentieren. Der überwiegende Teil der MHC Klasse I- Liganden findet seinen Ursprung in zellulären Proteinen, die durch das 26S Proteasom generiert werden. Ein Beispiel für einen proteasomal generierten MHC Klasse I- Liganden ist das Nonapeptid yphfmptnl, das vom immediate early Phosphoprotein 89 (pp89) des murinen Cytomegalievirus (mCMV) abstammt. Obwohl mehrere Proteasen und Peptidasen bekannt sind, die an der Generierung von MHC Klasse I- Liganden beteiligt sind, scheint die Prozessierung des korrekten C- Terminus, der für die meisten Proteine eine wichtige Ankerposition darstellt, hauptsächlich durch das Proteasom zu erfolgen. (Rock 1994, Kloetzel 2001, Rock & Goldberg 1999). Die virale Immunabwehr sowie das Potential des mCMV, diese Immunantwort zu umgehen, sind insbesondere im Mausmodell für das mCMV ausführlich untersucht. Die Präsentation des H-2Ld restringierten mCMV Epitops yphfmptnl des pp89 auf der Zelloberfläche hat eine Aktivierung spezifischer CTLs zur Folge (Reddehase 1989, del Val 1991, Reddehase 2002). Damit spielt das pp89 im Rahmen der Immunabwehr eine besondere Rolle und sollte in seiner proteasomabhängigen Degradation detailliert analysiert werden.

4.1. Prozessierung des rekombinanten pp89

4.1.1. Abbau des rekombinanten pp89 durch das 20S Proteasom

Mit Hilfe synthetischer pp89- Polypeptide (21-40mer Peptide), die das untersuchte Ld- Epitop enthalten, wurde gezeigt, dass 20S Proteasomen in vitro das korrekte H2-d restringierte Epitop yphfmptnl nur in geringen Mengen generieren. Allerdings entsteht das N- terminal extendierte 11mer Precursorpeptid des Epitops weitaus häufiger. Dieses wird auch vom TAP für den Transport in das ER gegenüber dem 9mer präferiert (Boes 1994; Dick 1996, Knühl 2001). Um der physiologischen Situation näher zu kommen, wurde ein rekombinantes pp89 synthetisiert und dessen proteasomaler Abbau untersucht. Das unter denaturierenden Bedingungen gereinigte rekombinante Protein mit einem errechneten Molekulargewicht von 56kDa weist in der SDS-PAGE ein unerwartetes Laufverhalten bei 75kDa auf. Das Protein zeigte aber im Westernblot sowohl mit dem monoklonalen αHis- und dem polyklonalen αpp89- Antikörper eine positive Reaktion. Des Weiteren wurde die pp89- Proteinsequenz in der ESI-MS/MS- und Edman- Sequenzierung identifiziert. Worauf dieses veränderte Molekulargewicht zurückzuführen ist, blieb letztendlich unklar, da weder native Reinigungsmethoden noch die gelelektrophoretische Auftrennung im Harnstoffsystem einen Einfluss auf das Laufverhalten zeigten. Eine Dimerisierung des pp89 ist aufgrund des [Seite 67↓]konstanten höhermolekularen Laufverhaltens unter denaturierenden Bedingungen als unwahrscheinlich anzusehen. Spezifische Merkmale innerhalb der Tertiärstruktur des Proteins, wie posttranslationale Modifizierungen, wären theoretisch denkbar und könnten einen Einfluss auf die Detektion im SDS- Gel ausüben. Des Weiteren sei auf die als Tag fungierenden Histidinreste verwiesen, deren pH- abhängiges Ladungsverhalten ebenfalls die Detektion des Proteins im Polyacrylamidgel bestimmen könnte. Auffallend ist die hohe Anzahl negativer Ladungen, der isoelektrischer Punkt (pI) beträgt nach theoretischen Berechnungen 4.73. Dies könnte ebenfalls Auswirkungen auf die Faltung und das Laufverhalten haben.

Zunächst wurde die Frage geklärt, ob gereinigte 20S Proteasomen in der Lage sind, in vitro das partiell gefaltete Protein (vgl. CD- Spektrum 3.1.4) abzubauen und dabei das korrekte 9mer Epitop bzw. den 11mer Precursor zu generieren. Die Verdauanalysen mit 20S Proteasomen wurden ohne Zusatz von Detergentien wie SDS oder anderen, das Proteasom stimulierenden Substanzen durchgeführt (Coux et al. 1996). Dies ist insbesondere deshalb hervorzuheben, da in bisherigen in vitro Verdaus SDS regelmässig verwendet wurde und dabei nicht nur die Interaktion mit dem Substrat von Bedeutung ist. SDS nimmt vielmehr direkt Einfluss auf das „gating“ und die Ladung des 20S Core- Komplexes, indem es Auswirkungen auf das Oberflächenmilieu vor allem der α- Ringe ausübt. Es scheint dabei den Effekt des PA28 bzw. von hydrophoben Peptiden (siehe unten) auf eine Öffnung der α- Ringe zu simulieren und kann damit den Substratzugang des 20S Core- Komplexes öffnen und eine Aktivierung des Substratabbaus bewirken (Kisselev 2002). Die Verdaus mit rekombinanten pp89 wurden jedoch ohne SDS durchgeführt. Das rekombinante pp89 wurde durch das 20S Proteasom unter diesen Bedingungen bemerkenswerterweise bereits nach 4h annähernd vollständig abgebaut (Abb. 18 A). Der proteasomale 20S Core- Komplex wurde in Kontrollexperimenten mit jeweils 10μM MG132 und 2μM Epoxomicin inhibiert, woraufhin sich der Abbau von pp89 im Falle des hochpotenten Epoxomicin nahezu vollständig, bei MG132 über mindestens 8h inhibieren ließ. Demnach ist der Abbau des rekombinanten Proteins eindeutig dem 20S zuzuschreiben. Ohne Zusatz des Proteasoms blieb das Protein stabil. Mit diversen Proteaseinhibitoren (vgl. 3.1.3) wurde gezeigt, dass keine weiteren Proteasen, die aus der Aufreinigung des rek pp89 oder des 20S Core- Komplexes weiterhin anwesend sein könnten, am in vitro Abbau des pp89 beteiligt sind. Insbesondere die Inhibition der Tripeptidyl Peptidase II (TTP II), einer möglichen Kontamination des aufgereinigten 20S Core- Komplexes, mit AAF- CMK erschien aufgrund des kürzlich beschriebenen endoproteolytischen Effekts des Enzyms und der Generierung des korrekten HIV- Nef (73-82) Epitops im Gegensatz zum 20S Proteasom bedeutend zu sein. Die TPP II kann sowohl unabhängig vom Proteasom, aber andererseits auch mit dem Proteasom gemeinsam für die [Seite 68↓]Herstellung spezifischer MHC Klasse I- Liganden verantwortlich sein (Seifert 2003).

In Schnittanalysen von antigenen Peptiden des Ovalbumins mit 26S Proteasomen berichteten die Autoren über Schwierigkeiten, die einzelnen Fragmente z.B. in der HPLC sicher identifizieren zu können. Die Größe der generierten Fragmente lag in der Mehrzahl der Fälle bei 7 bis 8 AS, die Anzahl der verschiedenen Produkte sei vermutlich zu groß, um individuelle Fragmente zuordnen zu können. 26S Proteasomen generierten in Ovalbuminverdaus nur in 2% der Fälle das entsprechende 8mer Epitop (Cascio 2001). Princiotta et al. kalkulierten die Generierung von MHC Klasse I- Liganden unter Zuhilfenahme des Ovalbuminepitops detaillierter. Bei einer ungefähren Anzahl von 8x105 funktionellen Proteasomen pro Zelle und unter Berücksichtigung von Synthese- und Abbaurate der intrazellulären Proteine wurde ein Substratumsatz des Proteasoms von 2.5 min-1 kalkuliert. Die Generierung von Komplexen aus MHC Klasse I (Kb) und SIINFEKL (8mer Epitop des Ovalbumins) bezogen auf die Zahl der durch das Proteasom degradierten Ovalbumin- Substrate erfolgte mit einer Effizienz zwischen 1/440-1/3000. Proteasomen generieren die entsprechenden Precursorpeptide in 2.5% der Fälle (1/40), nur 2% (1/2000) dieser Peptide überleben den Weg vom Zytosol ins ER und können an MHC Klasse I- Moleküle binden (Princiotta 2003). Auch das spezifische 9mer yphfmptnl des pp89 wurde von Dick et al. als seltenes Produkt der Peptidverdaus beschrieben (Dick 1996).
Die Analyse der in den Verdaus des rek pp89 generierten Peptidfragmente wurde zunächst mittels RP- HPLC und ESI- MS/MS durchgeführt. Dabei konnten in der HPLC unspezifische Peptidfragmente nach 20h Inkubation mit dem Proteasom nachgewiesen werden, das 9mer Epitop konnte jedoch nicht sicher gezeigt werden. Detaillierte Untersuchungen in der Massenspektrometrie hinsichtlich genauer Peptidsequenzen blieben ohne Erfolg. Aus den analysierten Proben ließ sich keine spezifische Sequenz sicher bestimmen. Neuere Analyseverfahren wie die Nano- HPLC oder Maldi Massenspektrometrie stellen viel versprechende alternative Nachweismethoden dar, die die Zuordnung von Peakmustern zu bestimmten Peptidsequenzen gestatten würden.

Der definitive Nachweis, dass konstitutive 20S Proteasomen aus dem rekombinanten Protein pp89 das pp89168-176 Ld restringierte MHC Klasse I- Epitop bzw. dessen 11mer Precursor generieren können, erfolgte mit spezifisch gegen dieses Epitop gerichteten zytotoxischen T- Lymphozyten (CTLs). Diese sind sowohl für das 9mer Epitop spezifisch, erkennen aber auch den Precursor. Bei einem Verhältnis von Effektor- zu Targetzellen von 1/27 zeigte sich für das in vitro verdaute Protein eine 59%ige Lyse (im Vergleich dazu in der Kontrolle mit dem antigenen Nonapeptid (100nM) 70% Lyse). Demnach ist der Nachweis eindeutig erbracht, dass konstitutive, nicht induzierte (d.h. ohne Zusatz von SDS) 20S Proteasomen in vitro [Seite 69↓]einerseits große, partiell gefaltete, lösliche Proteine abbauen und das gleiche antigene Peptid (9mer bzw. 11mer) generieren können wie im Falle der in vitro Prozessierung des 25mer Peptids oder von pp89 exprimierenden Fibroblasten (Eggers 1995, del Val 1989).

Aus der Literatur ist bereits bekannt, dass denaturiertes Ovalbumin ebenfalls ohne Ubiquitinierung in vitro abgebaut wird, allerdings war dafür eine Entfaltung des Substrats oder Aktivierung des 20S Proteasoms durch SDS notwendig. Unter den Produkten konnte durch Dick et al. das antigene Peptid SIINFEKL nachgewiesen werden (Dick 1994). Somit scheint eine Ubiquitinierung zumindest unter diesen unphysiologischen Bedingungen zunächst keine unabdingbare Voraussetzung für eine Degradation des Substrats durch den 20S Core- Komplex zu sein.Michalek et al. zeigten in vivo durch Mikroinjektion sowohl von chemisch denaturiertem und alkyliertem als auch von rekombinant synthetisiertem, gefaltetem Ovalbuminin Ubiquitinmutanten, dass insbesondere die Denaturierung der proteasomalen Substrate einen Effekt auf die MHC Klasse I- Antigenpräsentation ausüben kann. So wurde exogen synthetisiertes, natives Ovalbumin in der temperatursensitiven Ubiquitinkonjugationsmutante ts85 (E1- Inaktivierung) unter nicht- permissiven Bedingungen vermindert auf MHC Klasse I- Molekülen präsentiert, für das injizierte denaturierte Protein hingegen zeigten sich unter selben Bedingungen ähnliche Ergebnisse wie bei Wildtypzellen (Michalek 1996). Natives Ovalbumin bedarf einerseits einer Ubiquitinierung und demzufolge andererseits eines Abbaus durch das 26S Proteasom. Für anscheinend Ubiquitin- unabhängige Formen von Antigenen wie das denaturierte Ovalbumin ist jedoch sowohl die Aktivität des 20S als auch des 26S für eine Degradation und Epitopgenerierung denkbar. Denaturierte Substrate könnten von den Substratbindungsstellen des Proteasoms erkannt und im Anschluss direkt in das aktive Zentrum eingeschleust werden. Dies würde auch erklären, warum das rekombinante pp89 in vitro effektiv durch das 20S Proteasom abgebaut wird, da laut CD- Spektrum etwa 35% der Proteinstruktur in ungeordneter Knäuelstruktur vorliegen. Diese partielle Entfaltung scheint für den proteasomalen in vitro Abbau ausreichend zu sein.

Des Weiteren stellt sich die Frage, wie die entfalteten Proteinketten Zugang in das aktive Zentrum des zylinderförmigen 20S Core- Komplexes finden. Das „gating“ wird durch die α- Ringe reguliert, wobei durch Mutationsanalysen insbesondere die N- terminalen Extensionen der α3- UE für die Öffnung der äußeren α- Ringe verantwortlich gemacht werden konnten (Groll 2000). Kisselev et al. postulieren in vitro nicht-katalytische „modifier sites“ innerhalb oder an der Oberfläche der α- Ringe, die durch Bindung von hydrophoben Peptidabschnitten eine Öffnung des Ringsystems bewirken würden und damit den Substratzugang in den 20S Core- Komplex freigeben sowie die Freisetzung degradierter Peptidfragmente erleichtern [Seite 70↓]könnten. Gleichzeitig hätte die Bindung der hydrophoben Peptide eine Stimulierung der drei aktiven β- UE zur Folge. Die Experimente wurden mit synthetischen Tetrapeptiden durchgeführt, womit bislang ungeklärt ist, ob längere Peptide oder gar hydrophobe Domänen von Proteinen eine ähnliche regulierende Rolle spielen können. Gesetzt den Fall, dass diese im α- Ring lokalisierten „modifier sites“ hydrophobe Sequenzabschnitte bzw. Domänen binden können, wären derartige hydrophobe Elemente von denaturierten oder oxidativ zerstörten Proteinen in der Lage, in vitro die Öffnung der α- Ringe und damit ihren eigenen Abbau durch Zugang zu den gleichzeitig aktivierten, katalytisch aktiven β-UE und die Freisetzung der bei der Peptidhydrolyse entstandenen Produkte zu regulieren (Kisselev 2002). Benaroudj et al. vermuten, dass eine Denaturierung von Proteinen die Substraterkennung durch das konstitutive Proteasom erleichtern und damit die von ATPasen des 19S Komplexes katalysierte Entfaltung der Substrate simulieren könnte (Benaroudj 2000).

4.1.2. Einfluss von PA 28 auf den Abbau von pp89 durch das 20S Proteasom

Der Proteasomaktivator PA28 beiinflusst einerseits die Aktivität des Proteasoms, andererseits auch die Qualität der generierten Hydrolyseprodukte. Der genaue molekulare Mechanismus der Regulierung dieses ATP-unabhängigen Proteasomaktivators ist bislang nicht detailliert bekannt. Jedoch lassen in vitro Daten darauf schließen, dass PA28 einen positiven Einfluss auf die Substrattranslokation innerhalb des 20S Proteasoms ausübt. Der Substratumsatz scheint durch die Translokation des Proteins bzw. Peptids in das Proteasom limitiert zu sein. Sowohl die Bindung von homomeren als auch heteromeren rekombinanten PA28 Komplexen an Proteasomen führt zu einer gesteigerten Peptidtranslokation. Somit scheint PA28 einen allosterischen Effekt auf die Substratbindung auszuüben, damit das „channelling“ zu regulieren, ohne dass sich dadurch die maximale Aktivität des 20S Core Komplexes ändern würde (Stohwasser 2000). Strukturanalysen von Groll et al. zufolge sind die N-terminalen Peptidsequenzen der α3-UE für die geschlossene Konformation des 20S Proteasomes verantwortlich (Groll 2000). Eine Bindung von PA28 bewirkt die Umlagerung dieser Sequenzen, wodurch das „gate“ in den Core Komplex geöffnet wird (Whitby 2000, Kopp 2001). Somit scheint PA28 sowohl das „gating“ als auch das „channelling“ des Proteasomes zu beeinflussen.

Um den Einfluss des PA28 auf den Substratumsatz des rek pp89 zu verfolgen, wurde das rekombinante Protein mit 20S Proteasomen in Anwesenheit von PA28 in vitro verdaut. In Westernblots konnte kein stimulierender Effekt auf den proteasomalen Abbau des rekombinanten Proteins gezeigt werden. Vielmehr schien es unter Zugabe von PA28 zu einer reduzierten Effizienz des Substratumsatzes zu kommen.


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Demnach stellt sich die Frage, welchen Einfluss PA28 auf die Generierung anderer antigener Peptide ausübt bzw. wie dieser anscheinend inhibitorische Effekt auf den proteasomalen Abbau des rek pp89 zu erklären ist. Bislang konnte kein Nachweis erbracht werden, dass PA28 einen Effekt auf die MHC Klasse I Antigenexpression auf der Zelloberfläche im Sinne einer gesteigerten Epitoppräsentation ausüben würde. In verschiedenen Studien mit viralen Epitopen zeigten sich differente Auswirkungen des PA28 auf die Antigenpräsentation. In einigen Fällen (z.B. Adenovirus E1A, LCMV Nukleoprotein) hatte eine PA28 Überexpression keinerlei Veränderung der Immunantwort zur Folge (Sijts, 2002). Andererseits zeigten Sun et al., dass ein vom Melanoma- Differenzierungsantigen stammendes T- Zellepitop (TRP2- „tyrosinase related protein 2“) nur in Anwesenheit von PA28 generiert wird (Sun 2002). PA28 weist demnach offenbar Epitop- spezifische Effekte auf die Antigenpräsentation auf.

In Einklang mit den experimentellen Daten sind auch Ergebnisse von Ma et al. zu interpretieren, die zwar einen positiven allosterischen Effekt von PA28 auf die Peptidprozessierung des 20S Proteasoms nachweisen konnten, jedoch für den Abbau großer Proteine wie Casein und Lysozym keine Stimulierung des Proteasoms aufzeigten (Ma 1992). Wie bereits erläutert, könnte PA28 Änderungen der Konformation innerhalb des 20S Komplexes bewirken und somit „gating und „channelling“ beeinflussen. Der inhibitorische Effekt von PA28 auf den proteasomalen Abbau des rek pp89 könnte insofern erklärt werden, als dass durch die Bindung des Aktivators potentielle Bindungsstellen für hydrophobe Proteindomänen bzw. bereits generierte Peptide in den äußeren α- Ringen infolge der Ausbildung von Wechselwirkungen zwischen PA28 und α- UE blockiert werden würden, die für den schnellen Substratumsatz großer, denaturierter Proteine vonnöten zu sein scheinen. In Abwesenheit von PA28 wird rek pp89 schnell degradiert, die Regulierung des Substratzugangs innerhalb des 20S Core- Komplexes durch hydrophobe Peptide, respektive Proteindomänen ist unter 4.1.1 dargestellt (Kisselev 2002). Wird hingegen PA28 zum Reaktionsansatz hinzugegeben, scheinen diese regulatorischen „modifier sites“ blockiert zu sein. Der stimulatorische Effekt des PA28 auf den proteasomalen Proteinabbau scheint im Fall des rek pp89 nicht den indirekt hemmenden Einfluss ungebundener hydrophober Peptidsequenzen kompensieren zu können.

Untersuchungen intestinaler Mukosazellen im Vergleich mit anderen Geweben (Maus) zeigten sich ein gewebespezifisches Muster variierender α- Untereinheiten innerhalb des 20S Komplexes. Bemerkenswert erschien dabei, dass insbesondere bei den α4- und α6- Untereinheiten Differenzen, die auf eine posttranslationale Modifizierung hinweisen, beobachtet wurden. Da α- Untereinheiten mit PA28, aber auch mit anderen zellulären oder viralen Proteinen interagieren können, wird ihnen eine regulierende Funktion zugesprochen [Seite 72↓](Kuckelkorn 2002). Somit wäre eine Interaktion der α- Untereinheiten des 20S mit dem PA28 denkbar und könnte den verminderten Substratumsatz von Proteinen des Weiteren erklären.

4.1.3. Abbau des rekombinanten pp89 durch das Immunoproteasom

Immunoproteasomen fördern Peptidhydrolysen nach hydrophoben und basischen Aminosäuren (Sijts2000a, Sijts 2000b, Schwarz 2000) und schneiden vermindert nach sauren Aminosäuren (Gaczynska 1994). Die Oberflächeneigenschaften der dabei generierten Peptide korrelieren mit der Aminosäurepräferenz verschiedener MHC- Haplotypen. Demzufolge wurde der proteasomale Abbau des rekombinanten pp89 durch das Immunoproteasom untersucht. Die Aktivitäten des konstitutiven und des Immunoproteasoms waren in den Versuchen annähernd identisch (Daten nicht gezeigt). Trotzdem scheinen Immunoproteasomen das pp89 in vitro unter selben Verdaubedingungen langsamer abzubauen als konstitutive Proteasomen. Eine Aussage über die Generierung des spezifischen Epitops yphfmptnl lässt sich lediglich aus dem Westernblot nicht treffen. Die in der RP-HPLC analysierten Verdaus des pp89 durch das i20S zeigten ähnliche Chromatogramme mit unspezifischem Peakmuster wie für das c20S (Abb. 20). Eine Zuordnung zum Nonapeptid konnte aufgrund dieser Daten nicht erfolgen. Allerdings ist aufgrund der Ähnlichkeit der Westernblots und der HPLC- Daten im Vergleich zum konstitutiven 20S Proteasom ebenfalls von der Generierung des in den CTL Assays nachgewiesenen antigenen Epitops bzw. des 11mer Precursors auszugehen.

Die durch IFNγ induzierte Synthese der Immunountereinheiten β1i, β2i und β5i und die anschließende Inkorporation bedingt filigrane Änderungen der Gesamtstruktur des 20S Komplexes und könnte die Eigenschaften der Substratbindungsregion und so den Zugang zu den verschiedenen aktiven ß-Untereinheiten des 20S Komplexes beeinflussen (Sijts 2000a). Demnach würde sich, wie bereits ausgeführt, natürlich auch das zeitliche Schnittverhalten ändern können. Dadurch könnte der zeitlich verzögerte Abbau des rek pp89 durch Immunoproteasomen im Vergleich zu konstitutiven Proteasomen bedingt sein.

4.2. Polyubiquitinierung als Abbausignal des pp89 in vivo?

Aufgrund der Fähigkeit des 20S Proteasoms, aus dem rekombinanten pp89 Protein das pp89 Epitop zu generieren und der Tatsache, dass die Präsentation dieses MHC Klasse I- Liganden auf murinen Fibroblasten (B8 Zellen) vom Proteasom abhängig ist, stellte sich die Frage, ob der intrazelluläre Abbau des viralen Proteins der Polyubiquitinierung desselben bedarf. Folgende Gesichtspunkte können berücksichtigt werden, um den Abbau eines spezifischen Proteins durch das Ubiquitin- Proteasom- System zu bestimmen: 1) Reduktion des Substratumsatzes in den Zellen bedingt durch Inhibition des Systems mit chemischen Inhibitoren oder genetischen Mutationen, 2) Nachweis von Ubiquitin- Substrat- Konjugaten in den Zellen nach Hemmung des Proteasoms, 3) Rekonstruktion der in vivo Ergebnisse (d.h. [Seite 73↓]Ubiquitinierung und Degradation der Substrate durch das Proteasom) in in vitro Versuchen, 4) Assoziation von mutmaßlichen Substraten mit ubiquitinierenden Enzymen (Sheaff 2000).

In den im Folgenden zu diskutierenden Experimenten standen vor allem die unter 1) bis 3) aufgeführten Punkte im Vordergrund.

4.2.1. In vivo Analysen ergeben keinen Anhalt für eine Ubiquitinierung des pp89

Eine Inhibition des proteasomalen Systems mit dem Peptidaldehyd MG132 führte zu einem verminderten Abbau des rekombinanten pp89 in vitro, wodurch die Abhängigkeit der Herstellung des viralen Epitops vom Proteasom verdeutlicht wurde. Ähnliche Ergebnisse für die antigene Prozessierung von pp89 wurden in früheren Arbeiten auch in vivo erzielt. Die Gabe von IFNγ oder eine Überexpression von PA28α hatten eine erhöhte CTL- Antwort im Sinne einer vermehrten Peptidgenerierung durch das Proteasom zur Folge (Groettrup 1996). Die Akkumulation ubiquitinierter Proteine nach Gabe von MG132 konnte auch in allen im Rahmen dieser Arbeit durchgeführten Transfektionsexperimenten mit HA- bzw. His- markiertem Ubiquitin gezeigt werden, jedoch ließen sich in keinem der durchgeführten Experimente Ubiquitin-pp89-Konjugate nachweisen.

Für den in vivo Abbau des pp89 konnte hier gezeigt werden, dass er durch das Proteasom erfolgt. Der fehlende experimentelle Nachweis einer dazu notwendigen Ubiquitinierung des konstitutiv exprimierten Proteins schließt die Abhängigkeit der Degradation von einer Konjugation mit Ubiquitin jedoch nicht vollständig aus. Allerdings deuten die gewonnenen Resultate auf einen Proteasom- abhängigen Abbau des pp89 ohne Ubiquitinkonjugation hin. Auch das 20S Proteasom kann, wie in einigen anderen Beispielen, auch in vivo an der Prozessierung großer Proteine beteiligt sein. Um den Ubiquitin- abhängigen bzw. -unabhängigen Abbau von pp89 detaillierter darzustellen, wären Mutationsanalysen mit K48R oder K63R- Mutanten oder mit Konjugationsenzymmutanten denkbar (Michalek 1996, Zhang 2003). In Zell- bzw. Mausmodellen, die die Ubiquitinkonjugationsmutante K48R aufweisen, konnte kürzlich gezeigt werden, dass diese temperatursensitiven Mutanten keinen Einfluss auf den Substratumsatz bei Infektion mit Moloney murinen Leukämie Viren (MLV) haben. Dies deutet darauf hin, dass eine Ubiquitinierung nicht essentiell für den Abbau viraler Proteine sein könnte (Zhang 2003).

4.2.2. DRiPs - Ursprung antigener Peptide

Der überwiegende Teil der zurzeit identifizierten CTL- Epitope stammt von metabolisch stabilen Proteinen ab. Sie werden Proteasom- abhängig durch Degradation von defective ribosomal products (DRiPs) generiert, wobei DRiPs ubiquitiniert vorliegen oder mit einem alternativen Degradationssignal versehen sind. Die Formation solcher DRiPs kann durch Änderungen im zellulären Milieu induziert werden, wie sie z.B. infolge viraler Infektionen und Ausschüttung von Zytokinen im entzündeten Gewebe zu finden sind. Diese direkt an die [Seite 74↓]Ribosomen gebundenen Translationsprodukte können einerseits unreife Proteine im Sinne eines vorzeitigen Kettenabbruchs (tDRiP) oder Proteine falscher Konformation (mDRiP) sein (Schubert 2000). Demnach wäre auch zu diskutieren, ob überhaupt das native pp89 in der Zelle Vorläufer für das antigene Peptid yphfmptnl ist oder vielmehr gemäß obigen Ausführungen ein tDRiP oder mDRiP Ursprung dieses MHC Klasse I- Liganden sein könnte. Somit wäre eine Ubiquitinierung, wie sie im klassischen Weg des Ubiquitin- Proteasom- Systems beschrieben wird, für die Generierung des Epitops nicht zwingende Voraussetzung.

4.2.3. Polyubiquitinierung als essentielles Degradationssignal?

Der spezifische Nachweis, dass eine Polyubiquitinierung in vivo in einzelnen Fällen für den proteasomalen Abbau essentiell ist, lässt sich experimentell sehr schwierig erbringen. Ein großes Problem stellt die Vielzahl und Spezifität der einzelnen E2- und E3- Enzyme dar (vgl. 1.2). Andererseits sind diese experimentellen Schwierigkeiten auch auf das nur transiente Vorliegen von Ubiquitin- Protein- Konjugaten zurückzuführen, des Weiteren ist eine Inhibition der Ubiquitinierung bislang nur mit Ubiquitinaldehyden möglich (Tarsca 2000). Demzufolge erscheint es aufgrund der rapiden Degradation von Proteinketten durch deubiquitinierende Enzyme diffizil, diese potentiellen Konjugate von Mammaliaproteinen mit Ubiquitin zu detektieren (Sheaff 2000). Des Weiteren stellt sich nun die Frage nach der spezifischen Funktion des Ubiquitins im Rahmen der Antigenprozessierung durch das 26S Proteasom. Bisher wurde diskutiert, dass ubiquitinierte Proteine einerseits von verschiedenen Untereinheiten innerhalb des 19S Regulators erkannt und gebunden werden, andererseits die Ubiquitine durch die Isopeptidaseaktivität innerhalb des 19S Komplexes vom Substrat abgespalten und in der Zelle reutilisiert werden (Deveraux 1994, Bochtler 1999, Lam 1997). ATPase- Untereinheiten des 19S können wiederum bei der Entfaltung der Proteine mitwirken und somit Chaperon- artige Funktionen übernehmen (Braun 1999).

Wie lassen sich damit Beobachtungen in Einklang bringen, die den Abbau verschiedener Proteine als Ubiquitin- unabhängig beschreiben? Michalek et al. untersuchten den Abbau des Ovalbumins, das dem klassischen Degradationsweg mit Ubiquitinierung und Abbau durch das 26S Proteasom folgt (Ben-Shahar 1997, Michalek 1996). In Hinblick auf die Präsentation des korrekten MHC Klasse I- Liganden SIINFEKL wiesen endogen synthestisiertes Ovalbumin (mit Ovalbumin transfizierte Mutanten) als auch in das Zytosol mutierter Zellen injiziertes (Ubiquitin- Konjugationsmutante) chemisch denaturiertes, alkyliertes Ovalbumin bei nicht permissiver Temperatur ähnliche Ergebnisse wie Wildtypzellen auf. Im Gegensatz dazu führte die Injektion von nativem Ovalbumin zu einer verminderten Präsentation des Epitops (Michalek 1996). Wie bereits unter 4.1.1 erläutert, lassen diese Resultate auf einen Einfluss der Proteinstruktur des Substrats hinsichtlich des Ubiquitin- abhängigen Abbaus schließen. Modifizierungen innerhalb der Proteinstruktur im [Seite 75↓]Sinne einer Konformationsänderung können anscheinend die Notwendigkeit einer Ubiquitinierung aufheben. Somit kann eine Ubiquitinierung auch eine Denaturierung des Substrates zufolge haben, die wiederum den proteasomalen Abbau des falsch gefalteten bzw. entfalteten Proteins ermöglichen könnte. Die für das endogen exprimierte Ovalbumin postulierte Vermutung, dass es in einer falsch gefalteten Konformation vorläge, ließe sich auch auf das endogen exprimierte virale Protein pp89 übertragen, womit dessen Ubiquitin- unabhängiger Abbau durch das Proteasom im Einklang mit den Ergebnissen von Michalek et al. zu sehen wäre. Allerdings bleibt mit diesem Erklärungsansatz die Frage der Substraterkennung eines nicht- ubiquitinierten Proteins durch das Proteasom offen.

In Experimenten von Sheaff et al. wurde der proteasomale Abbau des CdK Inhibitors p21Cip1 analysiert. Obwohl die Inhibition des proteasomalen Systems eine Verlängerung der Halbwertszeit des Proteins bewirkt und unter selben Bedingungen p21Cip1- Ubiquitin- Konjugate in der Zelle akkumulieren, scheint der Abbau des Proteins Mutationsanalysen zufolge selbst nicht direkt der Ubiquitinierung zu bedürfen. Demnach kann nicht zwangsläufig im Falle des Vorliegens von Ubiquitinkonjugaten und proteasomalem Abbau eines Proteins darauf geschlossen werden, dass die beobachtete Ubiquitinierung eine Conditio sine qua non für den proteasomalen Abbau des Proteins sei (Sheaff 2000). Auch in dieser Arbeit wird erneut auf den entscheidenden Einfluss der Proteinstruktur hinsichtlich der Erkennung und Degradation durch das Proteasom verwiesen, nicht strukturierte Proteine werden vom Proteasom direkt gebunden und ohne Ubiquitinierung sowohl in vitro als auch in vivo abgebaut (Michalek 1996). Für p21 konnte gezeigt werden, dass das freie Protein nicht in einer genau definierten Tertiärstruktur vorliegt, woraufhin es eventuell direkt von den α- Ringen des 20S Core- Komplexes erkannt wird (Sheaff 2000).

In diesen Kontext seien auch nochmals die unter 4.2.2 erwähnten defective ribosomal products (DRiPs) erwähnt, für die unter anderem auch ein Ubiquitin- unabhängiger Abbauweg durch das Proteasom beschrieben wird (Schubert 2000). Sie stellen grundsätzlich Proteine mangelhafter Konformation dar, können aber auch verkürzte Proteine infolge vorzeitigen Kettenabbruchs sein. Die von Michalek und Sheaff durchgeführten Degradationsanalysen verschiedener Proteine sind auch in Einklang mit dieser DRiP- Hypothese zu sehen, woraufhin zusammenfassend auch in vivo der Abbau eines Proteins durch das 26S Proteasom nicht zwangsläufig der Ubiquitinierung desselben bedarf. Diese Aussagen bekräftigen einerseits die im Rahmen dieser Arbeit gewonnenen Ergebnisse hinsichtlich der in vivo Ubiquitinierung des pp89 als auch die in vitro durchgeführten Degradationsstudien des rekombinanten pp89.


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Der beschriebene Einfluss der Proteinstruktur auf den proteasomalen Abbau sei zusätzlich an einem weiteren Beispiel veranschaulicht. Tarsca et al. haben die Degradation von Calmodulin in seiner nativen Form, aber auch in der durch in vitro Ca++- Entzug „gealterten“ Variante in vivo untersucht und dabei festgestellt, dass das „gealterte“ Calmodulin wesentlich schneller abgebaut wird als das native Protein. Calcium- Ionen stabilisieren die native Konformation des Calmodulins. Eine Ca++- Zufuhr inhibierte den proteasomalen Abbau, stimulierte hingegen die Ubiquitinierung. In detaillierten in vitro Verdaus mit 26S Proteasomen konnte sowohl die native als auch die „gealterte“ Variante ohne Ubiquitinierung abgebaut werden. Der inhibierende Einfluss des Ca++ auf den Abbau ließ sich insbesondere für das native Calmodulin nachweisen, das „gealterte“ Protein zeigte ein ähnliches Degradationsverhalten wie ohne Ca++- Gabe. Somit schlussfolgern die Autoren dieser Arbeit, dass flexible Konformationen von Proteinen den proteasomalen Abbau auch ohne Ubiquitinierung initiieren könnten (Tarsca 2000).

4.2.4. Auf der Suche nach alternativen Degradationssignalen

Die bislang diskutierten Punkte bezüglich der Erkennung von potentiellen Substraten durch das 26S Proteasom legen den Verdacht nahe, dass neben der Polyubiquitinierung des abzubauenden Proteins auch andere Degradationsmarker vorliegen müssen. Andererseits ist die Rolle des Ubiquitins im Rahmen des Ubiquitin- 26S Proteasom- Systems, wie bereits erwähnt, nicht vollständig auf die eines Erkennungssignals für Untereinheiten des 19S Regulators innerhalb des 26S Komplexes einzuengen, sondern unter anderem auch auf eine denaturierende Wirkung auf Proteine auszudehnen, die einen suffizienten Abbau durch das Proteasom ermöglichen könnte (Michalek 1996). Inwieweit ein Nachweis von Ubiquitin- Protein- Konjugaten für einen Ubiquitin- abhängigen Abbau dieses Proteins durch das Proteasom spricht, ist in Anbetracht differierender Ergebnisse verschiedener Arbeitsgruppen kontrovers zu bewerten. So verfolgten Treier et al. zum Beispiel den Abbau des Onkoproteins cJUN; sie wiesen eine durch die δ Region vermittelte Ubiquitin- abhängige Degradation des Proteins nach (Treier 1994). Experimente einer anderen Arbeitsgruppe wiesen allerdings auf alternative Degradationssignale des cJUN hin. Das in vivo instabile Protein konnte im zellfreien System ATP- abhängig ohne Ubiquitinierung abgebaut werden. Demnach könnten auch in diesem Fall intrinsische Strukturmerkmale für die selektive Erkennung durch das Proteasom und den Abbau durch das 26S Proteasom verantwortlich sein (Jariel-Encontre 1995).

Der Abbau anderer nukleärer Onkoproteine wie cMYC und cFOS durch das Ubiquitin- System wurde von Chiechanover et al. in vitro in einem Ubiquitin- zellfreiem System untersucht. ATP stimulierte den in vitro Abbau dieser Onkoproteine, die Degradation konnte hingegen durch Gabe neutralisierender Antikörper gegen das Ubiquitin- aktivierende Enzym [Seite 77↓]E1 inhibiert werden. Nach Substitution Affinitäts- gereinigter E1 Enzyme ließ sich der ATP- abhängige Abbau wiederherstellen, was auf einen Ubiquitin- abhängigen in vitro Abbau dieser Proteine hindeutet (Chiechanover 1991). Hirai et al. konnten hingegen für den in vitro und in vivo Abbau von cJUN und cFOS nachweisen, dass diese Transkriptionsfaktoren Substrate der Ca2+- abhängigen Protease Calpain sind. Calpain ist insbesondere für den Abbau von Proteinen mit PEST- Motiven von Relevanz (Hirai 1991).

Inzwischen liegen auch Daten zur Ubiquitin- Abhängigkeit des Abbaus eines viralen Proteins vor. Miller et al. haben den Abbau des NS2 Phosphoproteins, eines nicht- strukturellen Proteins des murinen Parvovirus Minute Virus, durch das Proteasom analysiert (Miller 2001). Dies ist insbesondere von Interesse, da antigene Peptide viraler Proteine typische MHC Klasse I- Liganden darstellen. Der durch MG132, Lactacystin und Epoxomicin gehemmte proteasomale Abbau des NS2 Proteins unterliegt anscheinend keiner Ubiquitinierung. In Anwesenheit der Inhibitoren ließen sich keine höher molekularen Ubiquitin- Konjugate nachweisen. Da eine Elongationsmutante für die Ubiquitinketten (UbR7; Mutation der Lysine) und eine E1- Mutante (Ub- aktivierendes Enzym) nahezu keinen Einfluss auf die Stabilität des Proteins hatten, wurde auf einen Ubiquitin- unabhängigen Abbau des viralen NS2 Phoshoproteins geschlossen. Aufgrund dieser Ergebnisse stellte sich die Frage nach alternativen Degradationssignalen. Mutationen innerhalb bestimmter Regionen des NS2 Proteins zeigten zwei kritische Regionen (Nukleotidposition 2125-2175 und 2175-2268), die für die Stabilität des Proteins von Bedeutung zu sein scheinen. Diese „cis-acting elements“ partizipieren jedoch nur bedingt in der Stabilisierung des Proteins, zusätzlich müssen weitere Elemente existieren (Miller 2001). In Hinblick auf den Abbau des mCMV Proteins pp89 und die Suche nach Degradationssignalen wurde nach Übereinstimmungen zwischen den Proteinsequenzen des rekombinanten bzw. des endogen exprimierten pp89 mit dem NS2 Protein gesucht, wobei sich allerdings keine signifikanten Sequenzhomologien finden ließen. Allerdings können die beschriebenen Sequenzabschnitte des NS2 Proteins auch bestimmte Domänen bilden. Ein Vergleich zur Tertiärstruktur des pp89 ist jedoch aufgrund der unbekannten Proteinstruktur nicht möglich.

Kalejta et al. zeigten für den proteasomalen Abbau der Retinoblastoma- Familie von Tumorsuppressoren (Rb Proteine p105, p107 und p130), dass dieser nicht einer Konjugation an Ubiquitin unterliegt, sondern vielmehr das Phosphoprotein pp71 des hCMV (UL 82 Gen) Einfluss auf die Degradation der Rb Proteine nimmt. Dies trifft allerdings nur für mit hCMV infizierte Zellen zu, da p130 in Abwesenheit von pp71 Ubiquitin- abhängig vom Proteasom abgebaut wird. Das hCMV pp71 reguliert den Zellzyklus und stimuliert infizierte Zellen nach Arrest zwischen G1- und S-Phase des Zyklus, erneut in den Zellzyklus einzutreten und in die [Seite 78↓]S- Phase (DNA- Replikation) überzugehen. Der zugrunde liegende Mechanismus dafür ist eine Bindung des pp71 an die hypophosphorylierte Form des Rb Tumorsuppressor Proteins und die anschließende Ubiquitin- unabhängige Degradation des Rb Proteins p130. Welchen strukturellen Einfluss das pp71 auf das Rb Protein p130 nimmt oder wie es den Abbau des p130 durch das Proteasom steuert, wird von den Autoren jedoch nicht näher analysiert. Es wird lediglich darauf verwiesen, dass sowohl das Papillomavirus E7 Protein als auch das Simian Virus 40 T- Zellantigen (SV40) ähnliche Auswirkungen auf den Abbau der Rb Proteine haben können (Kalejta 2003).

Neben dem Ubiquitin sind so genannte PEST- Motive (Abb.7), die hydrophile Sequenzabschnitte mit entsprechenden Aminosäuren (P, E oder B, S, T) darstellen, als Degradationssignale von Proteinen bekannt (Rechsteiner 1996, Jariel-Encontre 1995). In der Proteinsequenz des pp89 kommen laut Vorhersageprogrammen PEST- Motive (AS 54-76, AS 386-423, AS 423-513 und AS 513-535) vor (www.expasy.org ; 19.08.2003). Diese können als potentielle Degradationssignale für den Abbau durch das Proteasom diskutiert werden. Ein Abschnitt des pp89, der keine PEST-Motive enthält, wurde im Rahmen dieser Arbeit mit der Ornithindecarboxylase (ODC) fusioniert, deren Sequenz zwei PEST- Motive aufweist (Abb.8). Die ODC wird vom 26S Proteasom Ubiquitin- unabhängig degradiert. Ähnlich wie im Falle des Ovalbuminepitops SIINFEKL (Ben-Shahar 1999) ist es auch für das pp89 9mer Epitop yphfmptnl gelungen, dieses aus einem Fusionsprotein mit ODC durch das 26S Proteasom ATP- abhängig zu generieren. Hierbei ist allerdings hervorzuheben, dass nicht wie in vorherigen Experimenten eine Epitop- flankierende Region mit der ODC fusioniert wurde, sondern vielmehr ein Protein (210AS) an die ODC gebunden wurde. Der CTL- Test zeigt eine deutlich gesteigerte Lyserate nach Beladung der Targetzellen mit dem 26S Verdau des Fusionsproteins. Damit konnte die Prozessierung eines physiologischen Substrats mit einem viralen Protein und Generierung eines authentischen MHC Klasse I- Liganden durch das 26S Proteasom in vitro gezeigt werden. Dieser beschriebene Abbau sollte den in vivo Bedingungen sehr nahe kommen, da die zelluläre Regulierung und damit der Metabolismus der ODC genau bekannt sind und die Versuchsbedingungen dementsprechend adaptiert wurden. Folglich scheinen 26S Proteasomen in ähnlicher Weise wie 20S Core- Komplexe in der Lage zu sein, unabhängig von der Proteingröße Epitope bzw. Precursor zu generieren. Seifert et al. konstruierten ein ODC/Ovalbumin- Fusionsprotein mit einem Epitop- tragenden HIV- Nef- Protein (AS 64-100) und verdauten dieses Fusionsprotein mit 26S Proteasomen unter Bedingungen, wie sie für das ODCpp89 Protein beschrieben sind. In Analogie zu in vitro Verdaus eines HIV Nef- Proteins (AS 64-100) mit 20S Proteasomen konnte auch in den Verdaus des NEF-ODC-Ovalbumin Fusionsproteins mit 26S Proteasomen keine Generierung des korrekten Epitops bzw. eines N- terminal elongierten Precursors [Seite 79↓]nachgewiesen werden. Jedoch zeigte sich in beiden Versuchsansätzen die Generierung eines ähnlichen Peptidmusters, was mit den Verdauanalysen des pp89 und des ODCpp89 Fusionsproteins korreliert (Seifert 2003). Hier wurden in beiden Fällen das 9mer Epitop bzw. der 11mer Precursor vom Proteasom generiert. Somit werden offenbar gemeinsame Struktur- und Sequenzmerkmale von den katalytisch aktiven Zentren des 20S Core- Komplexes der Proteasomen erkannt. Die Epitopgenerierung für das Nef- Protein ist hingegen, wie bereits aufgeführt, der Tripeptidyl- Peptidase II (TPPII) zuzuschreiben (Seifert 2003).

Die Primärstruktur von Proteinen und die daraus resultierende Konformation insbesondere in Hinblick auf die Oberflächenladung und Oberflächenhydrophobizität der Proteine scheinen beim Abbau von Proteinen eine wichtige Rolle zu spielen. Anhand der proteasomalen Degradation und MHC Klasse I- Epitopgenerierung des Nef Proteins, eines regulatorischen Proteins des HIV, und anschließender Sequenzanalysen fiel auf, dass die vom Proteasom prozessierten CTL- Epitope in so genannten Cluster Regionen vorkommen und weitaus häufiger generiert werden als Peptide aus Non- Cluster Regionen. Die Epitop- tragenden Cluster Regionen beinhalten vorwiegend hydrophobe Proteinabschnitte, wohingegen die Non- Cluster Regionen hydrophile Bereiche ausmachen. Somit lässt sich für das Nef Protein eine Korrelation zwischen Grad der Hydrophobizität, proteasomaler Prozessierung und der Dichte von CTL- Epitopen demonstrieren (Lucchiari-Hartz 2003). Die Bevorzugung hoch konservierter, hydrophober Sequenzabschnitte durch das Proteasom steht im Einklang mit der Schnittpräferenz des Proteasoms für hydrophobe P1 Reste, wie sie auch im Falle des pp89 Epitops (P1: Leucin) zu beobachten ist. Hydrophobe Interaktionen der Substrate mit der hydrophoben Innenseite des Proteasoms sind einerseits für die Translokation der Substrate, andererseits für die Stabilisierung des entfalteten Proteins von Bedeutung. Die für das HIV- Nef Protein charakteristischen Epitop Cluster lassen sich auch bei anderen Viren wie HBV, HCV oder den Tumorantigenen Melanoma Antigen gp100, PRAME Protein oder Her-2_neu nachweisen. Somit scheint zumindest für klassische MHC Klasse I- Liganden die Hydrophobizität einer Proteinsequenz eine Art Degradationssignal für das Proteasom darzustellen (Lucchiari-Hartz 2003). Hydrophobe Proteinabschnitte innerhalb der Region des mCMV pp89 Epitops könnten somit für die Prozessierung des viralen Proteins zum spezifischen 9mer eine Rolle spielen. Hydrophobizitätsanalysen (Kyte & Doolittle) zufolge befinden sich 30 AS vor und etwa 15AS nach der Epitopregion des 9mers yphfmptnl hydrophobe Sequenzabschnitte. Die Epitopregion selbst ist nicht als hydrophob beschrieben worden (www.expasy.org ; 19.08.2003).


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4.3.  Modulation der proteasomalen Aktivität- ein zweiseitiges Modifier Modell

Wie die aktiven Untereinheiten des 20S Proteasoms (β1, β2, β5 in zwei Kopien) untereinander während der Proteindegradation koordiniert sind und vielmehr die Produktion der MHC Klasse I- Liganden steuern, stellt eine bislang nicht beantwortete Frage dar. Die Interaktionen zwischen den vermutlich kooperativen Untereinheiten werden zum gegenwärtigen Zeitpunkt im Sinne eines zweiseitigen Modifier Modells interpretiert (Schmidtke 2000). Der Einfluss des HIV Typ1 Proteaseninhibitors Ritonavir, ein seit mehreren Jahren in der Therapie des AIDS erfolgreich etabliertes Medikament, wurde auch bezüglich der Wirkung auf das Immunsystem, insbesondere der Produktion von viralen MHC Klasse I- Liganden untersucht. In mehreren Fällen wurde eine verminderte Antigenpräsentation unter Ritonavirapplikation beobachtet. So hemmt Ritonavir den Abbau des immediate early gen product pp89 des mCMV bei einer Konzentration von 50μM, bei 10μM waren diese Auswirkungen auf den Substratumsatz jedoch nicht nachzuweisen. Analysen über die Interaktion von Ritonavir und dem Proteasom, das für die Synthese dieser viralen Epitope verantwortlich ist, zeigten einerseits einen hemmenden Effekt von Ritonavir auf die Chymotrypsinaktivität (β5), andererseits eine Stimulierung der Trypsinaktivität (β2) (Schmidtke 1996). Das Ritonavir bindet nicht wie bisher beschriebene Proteasomeninhibitoren direkt an die katalytisch aktiven Untereinheiten, sondern vielmehr an eine katalytisch inaktive „modifier site“. Somit wurde ein zweiseitiges Modifier Modell postuliert, wobei ein Bindungsort durch das aktive Zentrum verkörpert ist, die zweite Bindungsregion hingegen als so genannte „modifier site“ an anderer, zurzeit noch unbekannter Lokalisation inner- oder außerhalb der α- Ringe des 20S Core- Komplexes zu suchen ist. Von Interesse in diesem Kontext ist insbesondere die physiologische Rolle eines derartigen Modifier Modells. Potentielle Liganden wie SDS, Cardiolipin, Polykationen oder Fettsäuren, für die ein regulierender Effekt auf die Proteasomaktivität beschrieben wurde, könnten im Rahmen dieses Modells ebenso wie der PA28 oder 19S Regulator einen Einfluss auf die proteasomale Aktivität haben. Die Auswirkungen von Ritonavir im Sinne einer verminderten MHC Klasse I- Antigenpräsentation und folglich reduzierter zytotoxischer T- Zellantwort legen einen pharmakologischen Angriffspunkt der so genannten „modifier sites“ nahe (Schmidtke 2000). Würde es gelingen, diese Bindungsorte näher zu charakterisieren und entsprechende die Peptidhydrolyse steuernde Liganden ausfindig zu machen, könnte man therapeutischen Einfluss auf die Generierung von MHC Klasse I- Liganden nehmen. Dies wäre einerseits im Sinne eines inhibitorischen Effekts auf die Epitopgenerierung insbesondere zur Verhinderung von Transplantatrejektionen denkbar. Eine regulierte Hemmung des Proteasoms könnte diese Rejektionen reduzieren, andererseits könnte durch kontrollierte Inhibition des Proteasoms die notwendige immunsupprimierende Therapie dezimiert und das Risiko von Infektionen vielfältiger Natur vermindert werden. Konzipiert man den konkreten Fall eines Allograft- Patienten genauer, wäre eine Hemmung durch [Seite 81↓]spezifische Liganden der „modifier sites“ wünschenswert, wodurch die Präsentation von Fremdantigenen gegenüber körpereigenen T- Lymphozyten wesentlich reduziert wäre. Demgegenüber würde im Fall einer weiterhin notwendigen immunsuppressorischen Therapie bei Organtransplantierten vielmehr eine Stimulierung der proteasomalen Aktivität in Anbetracht der potentiellen Infektionskrankheiten, auch gerade hinsichtlich der klinischen Relevanz einer hCMV- Infektionen bei prädisponierten Patienten, gewollt sein. Die CID (cytomegalic inclusion disease) ist klinisch charakterisiert durch eine interstitielle Pneumonie, gastrointestinale Manifestationen, Hepatitis und ein Transplantatversagen, die therapeutisch auch gerade angesichts der oftmals parallel notwendigen Immunsuppression schwer zu beherrschen sind. Die unter diesen Bedingungen apparente Infektionskrankheit ist des Weiteren durch zahlreiche Mechanismen zur Umgehung der iatrogen schon massiv eingeschränkten Immunantwort charakterisiert (vgl. 1.4.2.1). Somit wäre ein zu den klassischen Medikamenten wie Ganciclovir konträrer Therapieansatz denkbar, wobei ein Ligand einer bislang unbekannten „modifier site“ des Proteasoms die intrazelluläre Produktion von MHC Klasse I- Liganden z.B. des pp72 (humanes Pendant zum mCMV pp89) oder pp65 hoch regulieren könnte und somit die Effizienz der antiviralen Immunantwort stiege.

4.4. Alternative Therapieregime der CMV Erkrankung

Neben dem beschriebenen Therapieansatz ist des Weiteren eine antivirale Zytoimmuntherapie denkbar, die in klinischen Studien nach Gabe von antiviralen CD8+ T- Lymphozyten eine reduzierte Inzidenz der Posttransplantations- CMV- Erkrankung bewirkte (Riddell 1992). Selbstverständlich ist auch eine klassische Vakzinierung zur Induktion einer spezifischen T- Zellantwort in Erwägung zu ziehen. Eine Deletion von Immunescape Genen könnte in Form eines neuen Impfvirus eine erhöhte Präsentation antigener Peptide nach sich ziehen (Reddehase 2002). Das im Rahmen dieser Arbeit benutzte Mausmodell sollte auch für die aufgezählten Ausblicke wissenschaftlicher Untersuchungen die notwendige Grundlage darstellen.


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08.09.2004