Aus dem Institut für Biochemie
der Medizinischen Fakultät der Charité – Universitätsmedizin Berlin

Dissertation

Prozessierung des pp89 MCMV MHC Klasse I Epitops durch das Proteasom

Zur Erlangung des akademischen Grades
Doctor medicinae (Dr. med.)

vorgelegt der Medizinischen Fakultät der Charité
Universitätsmedizin Berlin

von
Antje Voigt
aus Stendal

Dekan: Prof. Dr. Martin Paul

Gutachter:
1. Prof. Dr. rer. nat. Peter M. Kloetzel
2. PD Dr. rer. nat. S. Stevanovic
3. PD Dr. rer. nat. R. Stohwasser

eingereicht: 01.10.2003

Datum der Promotion: 19.04.2004

Abstrakt

Das Proteasom ist eine ATP- abhängige Protease, die sich aus vielen Untereinheiten zusammensetzt. Es ist für die Generierung der MHC Klasse I- restringierten Peptide verantwortlich, die nach Komplexbildung mit MHC Klasse I- Haplotypen auf der Zelloberfläche präsentiert werden. Nicht- funktionelle Proteine, die als so genannte defective ribosomal products (DRIP) bezeichnet werden, stellen eine wichtige Quelle für die Generierung von antigenen Peptiden, insbesondere jedoch von viralen Peptiden dar. Generell wird die Lehrmeinung vertreten, dass der Abbau von polyubiquitinierten Proteinen durch das 26S Proteasom zur Generierung von MHC Klasse I- Liganden führt. Allerdings ist weiterhin unklar, ob virale Proteine Ubiquitin- abhängig vom Proteasom abgebaut werden. Im Rahmen dieser Arbeit sollte der Proteasom- abhängige Abbau des mCMV ie pp89 Proteins vor allem hinsichtlich einer potentiellen Ubiquitinierung untersucht werden. Dazu wurden zunächst Konstrukte sowohl für ein rekombinantes pp89 (rek pp89) als auch für ein ODCpp89 Fusionsprotein entworfen. Somit konnten sowohl der in vitro Abbau dieser Proteine als auch die Prozessierung des spezifischen MHC Klasse I- H-2L^d Epitops verfolgt werden. Experimente zum Nachweis von Ubiquitin- Protein- Konjugaten wurden in vivo mit pp89 cDNA stabil transfizierten Mausfibroblasten (B8 Zellen) durchgeführt.

Die experimentellen Daten sprechen für einen schnellen in vitro Abbau des rek pp89 durch das 20S Proteasom. Das MHC Klasse I- pp89 Epitop bzw. dessen 11mer Precursorpeptid wurden dabei mit hoher Präzision generiert. Spezifische CTL Assays weisen auf die Generierung des korrekten Epitops bzw. des Precursors hin. Nach Verdau des ODCpp89 Fusionsproteins durch 26S Proteasomen in Anwesenheit von Antizym konnten mit diesem Test ebenfalls das 9mer Epitop respektive der 11mer Precursor nachgewiesen werden. Eine potentielle Ubiquitinierung des pp89 wurde in vivo in Zellkulturen untersucht. Nach Gabe von Proteasomeninhibitoren zu Mausfibroblasten konnte eine starke Akkumulierung von Ubiquitin- Konjugaten beobachtet werden. Allerdings konnte in den verschiedenen Versuchsansätzen kein Nachweis von pp89- Ubiquitin- Konjugaten erbracht werden. Demzufolge ist für die Generierung von viralen Epitopen ein Proteasom- abhängiger, aber Ubiquitin- unabhängiger Abbauweg denkbar.

Eigene Schlagworte: Proteasomen, MHC Klasse I- Antigenprozessierung, MCMV pp89, Ubiquitin

Abstract

The proteasome, an ATP-dependent, multisubunit protease, is responsible for the generation of most MHC class I restricted epitopes presented on the cell surface. Non-functional proteins, also known as defectice ribosomal products (DRiP), represent an important source for the generation of antigenic peptides in general and of viral epitopes in particular. It is widely accepted that the degradation of polyubiquitinated proteins by the 26S proteasome is a prerequisite for the generation of MHC class I ligands. However, the ubiquitin dependence for the proteasomal degradation of viral proteins is an issue so far unresolved. Therefore, the aim of this study was to analyze the proteasomal degradation of the mCMV ie pp89 in respect to an anticipated ubiquitinylation. Thus, a recombinant pp89 (recpp89) as well as an ODCpp89 fusion protein were generated. The in vitro processing of these proteins and the generation of a MHC class I H-2L ^d epitope by proteasomes was further studied. Murine fibroblast cell lines (B8 cells) were used to analyze any in vivo evidence for potentially existing ubiquitin-protein conjugates.

The experiments show that the recpp89 protein is rapidly degraded in vitro by the 20S proteasomes and that the correct MHC class I pp89 epitope or its 11mer precursor are generated with high fidelity. Furthermore, CTL assays, indicating the generation of the specific pp89 epitope or the 11mer precursor, also suggested a 26S proteasome-dependent degradation of the mCMV pp89-ODC fusion protein in the presence of antizyme. Treating cell cultures with proteasome inhibitors resulted in a significant accumulation of ubiquitin-conjugates in vivo . However, higher molecular weight pp89-ubiquitin conjugates were not detectable throughout the entire experimental set-up. Consequently, a proteasome-dependent, but ubiquitin-independent pathway can be postulated for the generation of viral epitopes.

Keywords: Proteasomes, MHC class I antigen processing, MCMV pp89, Ubiquitin

Inhaltsverzeichnis

• 1.  Einleitung
  • 1.1. Das Proteasom
    • 1.1.1. Aufbau und katalytische Aktivität des 20S Proteasoms
    • 1.1.2.  Das Immunoproteasom
    • 1.1.3. Der Proteasomaktivator PA28
    • 1.1.4. Der 19S Regulator und das 26S Proteasom
    • 1.1.5. Das Ubiquitin- Proteasom- System
  • 1.2. Die Ubiquitin Kaskade
  • 1.3. ODC- Abbau durch das 26S Proteasom
  • 1.4.  Antigenprozessierung durch das 26S Proteasom
    • 1.4.1. Der MHC Klasse I- Weg der Antigenprozessierung
    • 1.4.2. Das Cytomegalievirus - Prozessierung eines spezifischen viralen Epitops
      • 1.4.2.1. Das humane Cytomegalievirus
      • 1.4.2.2. Das murine Cytomegalievirus und pp89
  • 1.5. Zielsetzung
• 2.  Material und Methoden
  • 2.1. Material
    • 2.1.1. Geräte
    • 2.1.2. Reagenzien, Lösungen, Verbrauchsmaterialien
    • 2.1.3. Kits
    • 2.1.4. Oligonucleotide / Primer
    • 2.1.5.  cDNA-Konstrukte
    • 2.1.6. Antikörper
  • 2.2. Methoden
    • 2.2.1. Molekularbiologische Methoden
      • 2.2.1.1. Amplifikation von DNA durch PCR
      • 2.2.1.2. Amplifikation von RNA durch RT-PCR
      • 2.2.1.3. DNA- Gelelektrophorese
      • 2.2.1.4. Extraktion von DNA- Fragmenten aus dem Agarosegel
      • 2.2.1.5. Bestimmung der DNA- und RNA- Konzentration
      • 2.2.1.6. Verdau von DNA mit Restriktionsenzymen
      • 2.2.1.7. Dephosphorylierung von DNA
      • 2.2.1.8. Ligation von Insert- DNA in Vektor- DNA
      • 2.2.1.9. Herstellen kompetenter Zellen (Rubidium- Chlorid- Methode)
      • 2.2.1.10. Transformation von E. coli mit Plasmid- DNA
      • 2.2.1.11. Plasmidisolation aus E. coli
    • 2.2.2. Proteinbiochemische Methoden
      • 2.2.2.1. Bestimmung der Proteinkonzentration
      • 2.2.2.2. TCA/ NaDoc- Fällung von Proteinen
      • 2.2.2.3. SDS- Polyacrylamidgelelektrophorese (SDS-PAGE)
      • 2.2.2.4. Elektrotransfer von Proteinen aus SDS- PAG auf Immobilon Membran
      • 2.2.2.5. Identifizierung von Proteinen mittels Immunodetektion (ECL)
      • 2.2.2.6. Coomassiefärbung von SDS- Minigelen
      • 2.2.2.7. Native Gelelektrophorese und Substrat- Overlay
      • 2.2.2.8. Aufreinigung von pp89 (56kDa)
      • 2.2.2.9.  Proteinsequenzierung
      • 2.2.2.10. CD- Spektrum
      • 2.2.2.11. Aufreinigung von ODC/pp89 Fusionsprotein (77kDa)
      • 2.2.2.12. Aufreinigung von Antizym
      • 2.2.2.13.  Aufreinigung von 20 S Proteasomen
      • 2.2.2.14. Aufreinigung von 26S Proteasomen
      • 2.2.2.15.  Aufreinigung von Immunoproteasomen und PA28
      • 2.2.2.16. Aufreinigung von His-Ubi mit Ni- NTA-Agarose aus B8 Zell- Lysaten
      • 2.2.2.17. Proteolytische Verdaus mit mCMV pp89
      • 2.2.2.18. Proteolytische Verdaus mit dem ODCpp89 Fusionsprotein
      • 2.2.2.19. Analytische HPLC
      • 2.2.2.20. Massenspektrometrie
    • 2.2.3. Zellkultur
      • 2.2.3.1. Verwendete murine Zelllinien
      • 2.2.3.2. Lösungen für die Zellkultur
      • 2.2.3.3. Kultur von adhärenten Zellen
      • 2.2.3.4.  Einfrieren und Auftauen
      • 2.2.3.5. Kalziumphosphat- Transfektion adhärenter Zellen
      • 2.2.3.6. Lyse der kultivierten Zellen
      • 2.2.3.7. Test der Transfektanten
      • 2.2.3.8. Pulse-Chase-Experimente
    • 2.2.4. Immunbiologische Methoden
      • 2.2.4.1. Kultivierung der pp89 spezifischen zytotoxischen T-Zellen
      • 2.2.4.2. Klonierung der pp89 spezifischen zytotoxischen T-Zellen
      • 2.2.4.3. Zytotoxischer T Zell Assay
      • 2.2.4.4. Immunopräzipitation
• 3.  Ergebnisse
  • 3.1. Abbau und Prozessierung des rekombinanten pp89
    • 3.1.1. Klonierung des rekombinanten pp89
    • 3.1.2. Expression und Aufreinigung des rekombinanten pp89
    • 3.1.3. In vitro Verdau des rekombinanten pp89 durch das Proteasom
    • 3.1.4. CD- Spektrum des rekombinanten pp89
  • 3.2. Polyubiquitinierung des pp89 Abbaus durch das 26S Proteasom in vivo
    • 3.2.1. Transiente Transfektion von HA- bzw. His- markiertem Ubiquitin in B8 Zellen
    • 3.2.2. Immunopräzipitation von pp89
  • 3.3. Abbau des ODCpp89 Fusionsproteins durch das 26S Proteasom
    • 3.3.1.  Klonierung des rekombinanten ODCpp89 Fusionsproteins
    • 3.3.2. Expression und Aufreinigung des rekombinanten ODCpp89Fusionsproteins
    • 3.3.3. Expression und Aufreinigung von Antizym
    • 3.3.4. In vitro Verdau des rekombinanten ODCpp89 durch das 26S Proteasom
• 4.  Diskussion
  • 4.1. Prozessierung des rekombinanten pp89
    • 4.1.1. Abbau des rekombinanten pp89 durch das 20S Proteasom
    • 4.1.2. Einfluss von PA 28 auf den Abbau von pp89 durch das 20S Proteasom
    • 4.1.3. Abbau des rekombinanten pp89 durch das Immunoproteasom
  • 4.2. Polyubiquitinierung als Abbausignal des pp89 in vivo?
    • 4.2.1. In vivo Analysen ergeben keinen Anhalt für eine Ubiquitinierung des pp89
    • 4.2.2. DRiPs - Ursprung antigener Peptide
    • 4.2.3. Polyubiquitinierung als essentielles Degradationssignal?
    • 4.2.4. Auf der Suche nach alternativen Degradationssignalen
  • 4.3.  Modulation der proteasomalen Aktivität- ein zweiseitiges Modifier Modell
  • 4.4. Alternative Therapieregime der CMV Erkrankung
• Abkürzungsverzeichnis
• Zusammenfassung
• Bibliographie
• Danksagung
• Tabellarischer Lebenslauf
• Erklärung an Eides Statt

Tabellen

• Tab. 1 : Katalytische Aktivitäten der einzelnen ß-Untereinheiten. PGPH: Peptidyl-glutamyl-peptid Hydrolase, ChT: Chymotrypsin- ähnlich, T: Trypsin- ähnlich, BrAAP: Branched chain aminoacid preference (Heinemeyer 1997, Orlowski 1993, 2000). Mit „i“ benannte Untereinheiten sind Bestandteile des Immunoproteasoms.
• Tab. 2 : Zusammenfassende Darstellung der einzelnen Effekte von hCMV- Proteinen auf die Umgehung der zellulären Immunantwort. Informationen aus Jones 1996, Lehner 1997, Wiertz 1996.
• Tab. 3 : CD- Dekonvolution: pp89 Sekundärstruktur. Die Berechnung der prozentualen Verteilung der einzelnen Anteile von Sekundärstrukturformen zeigt, dass das rekombinante Protein in einer partiell gefalteten Form (etwa 65% geordnete Struktur) vorliegt, 35% der Proteinsequenz liegen nicht gefaltet im Sinne denaturierter Abschnitte vor.

Bilder

• Abb. 1 : Dreidimensionales Modell des S. cerevisiae 20S Proteasoms. In grün dargestellt die 7 α-Untereinheiten, in blau und rot die 7 verschiedenen ß-Untereinheiten, wobei sowohl die Ringstruktur der zusammen gelagerten α- bzw. ß- Untereinheiten als auch die Fassform des Komplexes veranschaulicht werden. Rot hervorgehobene ß-Untereinheiten (vgl. Abb.2) weisen katalytische Aktivität auf (aus Kloetzel 2001).
• Abb. 2 : Anordnung der 28 Untereinheiten des eukariotischen 20S Proteasoms nach Kristallstrukturanalysen des Hefeproteasoms (Groll 1997) und Immunelektronenmikroskopie (Kopp 1997). In Mutationsanalysen wurden proteolytische Aktivitäten für ß1, ß2 und ß5 (rot markiert, siehe Tab.1) nachgewiesen. In blau die katalytisch inaktiven ß-Untereinheiten, in grün die α-Untereinheiten.
• Abb. 3 : Immunoproteasom. Der durch IFNγ induzierte Austausch der aktiven ß-Untereinheiten erfordert die de novo Assemblierung des 20S Core- Komplexes. In der linken Abbildung ist ein Intermediat, bestehend aus einem heptameren α-Ring und 7 ß-Untereinheiten, dargestellt. Die Immunountereinheiten sind rot mit ß1i, ß21 und ß5i gekennzeichnet, wobei gleichzeitig noch die Prosequenzen (rote Fäden) sichtbar sind, die während der Maturierung prozessiert werden. Rechts hingegen das reife 20S Immunoproteasom (in Anlehnung an Kloetzel 2001).
• Abb. 5 : Aufbau des 26S Proteasoms. Im Zentrum dargestellt sind die α- und ß-Ringe des 20S Kernkomplexes (vgl. Abb. 1). Die 19S Regulatoren bestehen aus 2 Subkomplexen, in orange die 9 nicht- ATPase- Untereinheiten des „lid“-Subkomplexes, der für die Substratbindung von Bedeutung ist. In violett abgebildet die AAA- ATPase- Untereinheiten, die mit weiteren nicht- ATPasen den „base“-Subkomplex formieren. Deutlich wird die Symmetrie des Komplexes (aus Kloetzel 2001).
• Abb. 6 : Ubiquitinkaskade à Freies Ubiquitin (Ub) wird ATP-abhängig aktiviert und formiert mit E1 (Ub- aktivierendes Enzym) eine Thiolesterbindung. Ub wird dann an E2 (Ub- konjugierendes Enzym) gebunden, welches mit E3 (Ub- Proteinligase) assoziiert. Bei RING E3- Enzymen wird Ub direkt von E2 an das Substrat transferiert, im Falle der HECT (homologous to E6-AP carboxy terminus) Domänen wird Ub zunächst an ein Cystein des E3- Komplexes gebunden, erst im Anschluss wird es an das Substrat übertragen (in Anlehnung an Weissmann 2001).
• Abb. 7 : PEST- Motive sind hydrophile Sequenzabschnitte, die wenigstens 12 Aminosäuren lang sind und zudem mindestens ein Prolin ( P ), ein Glutamat oder Aspartat ( E oder D ) und ein Serin oder Threonin ( S oder T ) enthalten (Abb. beruht auf Daten aus Rechsteiner 1996).
• Abb. 8 : Das ODC- Protein ist schematisch dargestellt (AS 1-461), farbig markiert sind funktionell relevante Abschnitte der Sequenz. Rot hervorgehoben ist der Bereich von Aminosäure 117 bis 140 mit positiver Oberflächenladung, der für die Antizymbindung verantwortlich ist. Grün und blau markiert sind PEST- Motive. Das PEST2- Motiv wurde als definitives proteolytisches Signal für den proteasomalen Abbau der Ornithindecarboxylase identifiziert (Murakami 2000, Rechsteiner 1996).
• Abb. 9 : MHC Klasse I- Peptidbindungstasche (a), in grün sind die antiparallelen ß-Faltblätter, in blau die α-Helices dargestellt. In die somit formierte Furche ist in diesem Fall das pp89 Epitop YPHFMPTNL (vgl. Abb. 12) mit dem spezifischen C- terminalen Ankerrest Leucin (b) gebunden (aus Kloetzel 2001).
• Abb. 10 : MHC Klasse I Assemblierung und Antigenpräsentation. Substrate, die MHC Klasse I - Epitope enthalten, werden an Polyubiquitin gebunden und somit vom 26S Proteasom erkannt und degradiert. Die generierten Peptide mit einer Länge von 7 bis 15 Aminosäuren werden über TAP (transporter associated with antigen processing) in das ER überführt. MHC Klasse I schwere Ketten werden kotranslational in das ER inseriert, dort wird die Assemblierung der MHC- Moleküle durch molekulare Chaperone wie a) Calretikulin, b) ERp57 und c) BiP koordiniert. Die MHC Klasse I- Heterodimere, bestehend aus der gefalteten schweren Kette und ß2-Mikroglobulin (ß2M), werden durch die Peptidbeladung stabilisiert und im Anschluss als Komplex via vesikulären Transport über den Golgi Apparat an die Zelloberfläche transportiert. Spezifische Haplotypen kodieren einzelne MHC- Moleküle, die wiederum charakteristische Peptide binden. Die peptidbeladenen MHC- Komplexe werden von spezifischen T-Zellrezeptoren der CD8+ zytotoxischen T-Lymphozyten erkannt, stimulieren deren Proliferation und initiieren somit die Zerstörung der infizierten Zielzellen. Antigen- präsentierende Zellen sind vor allem dendritische Zellen, Makrophagen und Monozyten (Abb. in Anlehnung an Kloetzel 2001).
• Abb. 11 : Zusammenfassende Darstellung des pleiotropen Zytokins Interferon γ (IFNγ). Das Protein wir vorwiegend von lymphatischen Zellen exprimiert und zeigt vielfältige regulierende Effekte auf die zelluläre Immunantwort. Einerseits übt es einen direkten Effekt auf die Replikation von Pathogenen aus, andererseits kann es die Immunantwort insofern beeinflussen, als dass die Replikation von Pathogenen indirekt limitiert wird. So stimuliert es die Synthese von TAP, ß2-Mikroglobulin, MHC Klasse I schweren Ketten, der Immunountereinheiten des Proteasoms und dessen Regulator PA28. Zytosolische Exopeptidasen wie Leucin-Aminopeptidase (ERAP1) unterliegen ebenfalls der Induktion durch IFNγ (Daten aus Geginat 1997, Beninga 1998).
• Abb. 12 : mCMV pp89 : murines Cytomegalievirus immediate early phosphoprotein 89kDa. Das pp89- Epitop (P1-P9) wird auf H-2Ld (murinen MHC KLasse I)- Molekülen präsentiert, dort in der Bindungstasche über spezifische Aminosäurereste (P1 und P8) sowie Wasserstoffbrückenbindungen verankert.
• Abb. 13 : PCR des rek pp89 (A) und Restriktionsverdau (B). A: Die DNA- Gelelektrophorese zeigt in Spur 1 die Positivkontrolle (pp89 1452bp). Nach PCR mit Bam H I- Forward- und Eco R I- Reverse- Primern Probenauftragung wie folgt: in Spur 2 der Leerwert, in Spalte 3 das PCR-Produkt rek pp89. B:In Spalte 1 sind das Insert pp89 (1452bp) und der linearisierte TOPO-Vektor (3900bp) dargestellt.
• Abb. 15 : pp89 im Expressionsvektor pRSET A. A: Restriktionsverdau des pp89/ pRSET A mit Bam H I, Eco R I. In Spur 1 ist das geschnittene Insert rek pp89 dargestellt, bei 2.9kb der linearisierte Vektor abgebildet. B: Insertion der pp89-Sequenz in den pRSET A Vektor: Ligation über Bam H I und Eco R I- Schnittstellen. Der Vektor beinhaltet den T7 Promoter, das exprimierte Protein trägt einen N- terminalen His-tag (His)6.
• Abb. 16 : Aufreinigung und Nachweis des pp89. In der Coomassiefärbung (Abb. A) sind nach SDS- PAGE jeweils 0.5 und 1.0 μg des gereinigten und dialysierten Proteins aufgetragen. Im Westernblot konnte pp89 sowohl mit dem polyklonalen αpp89- Antikörper (B) als auch mit dem monoklonalen αHis- Antikörper (C) nachgewiesen werden.
• Abb. 18 : In vitro Degradation des pp89 durch c20S und i20S in An- bzw. Abwesenheit von PA28. SDS-PAGE und Westernblot mit αpp89 b5/1. In Abb. A ist der Abbau des Proteins in Gegenwart von c20S dargestellt, wobei 3μg 20S und 50μg pp89 bei 37°C verdaut und jeweils 50μl Fraktionen mit 1% TFA inaktiviert wurden. Links oben ist der 0h-Wert ohne 20S zum Vergleich aufgetragen. Nach nur 4h zeigt sich ein nahezu vollständiger Abbau des pp89. In Gegenwart von PA28 (18µg)ist der Substratumsatz hingegen vermindert (B). Auch bei Einsatz von Immunoproteasomen (C) wird ein zeitlich verzögerter Abbau des pp89 deutlich, obwohl im Test mit fluorogenen Substraten die Aktivität von c20S und i20S identisch erschien. Bei Gabe von PA28 zum Ansatz mit i20S (D) zeigt sich ein mit C vergleichbarer Proteinumsatz, so dass der Effekt von PA28 auf die Proteindegradation zu diskutieren ist (vgl. 4.1.2).
• Abb. 19 : In vitro Abbau des rekombinanten pp89 durch das c20S Proteasom. Auftrennung in 12,5% Acrylamidgelen mittels SDS-PAGE, Westernblot mit αpp89 b5/1 und ECL. In Abb. A (ohne Proteasom) und B wird deutlich, dass der Abbau des Proteins dem c20S unterliegt. In Anwesenheit des Proteasoms ist pp89 bereits nach 4h im Westernblot nicht mehr nachweisbar. Dies wird durch den inhibitorischen Effekt von MG132 und Epoxomicin, einem sehr spezifischen Hemmstoff des Proteasoms, auf die Degradation bestätigt (Abb. C/D). Der Zusatz verschiedener Proteaseinhibitoren zeigt keinen Effekt auf den Abbau, das Protein ist unter diesen Bedingungen stabil und wird bei Zugabe von c20S, ähnlich wie in Abb. B zu sehen, proteasomabhängig abgebaut und ist nach 4h nicht mehr nachweisbar.
• Abb. 20 : RP-HPLC der Peptid- bzw. Proteinverdaus mit dem c20S Proteasom. Dargestellt sind zwei Chromatogramme, der 0-Stundenverdau entspricht dem roten Graphen, der 20-Stundenverdau dem schwarz gezeichneten. Links gezeigt ist der Verdau des pp89 25mers Kloe 1 (RLMYDM YPHFMPTNL GPSEKRVWMS). Bei 22.5min findet sich der Peak des 25mer und ist nach Verdau durch 20S nicht mehr nachweisbar, hingegen sind viele einzelne Peaks zu erkennen, die der prozessiven Aktivität des 20S Rechnung tragen. In der rechten Abb. wiederum kommen die Chromatogramme eines pp89 Verdaus zur Darstellung, das Laufverhalten ist uncharakteristisch. Nach 20 Stunden sind einzelne Peptidpeaks, die aus dem Abbau des rek 20S resultieren, zu sehen.
• Abb. 21 : Detektion des H-2L d restringierten pp89 Epitops YPHFMPTNL im CTL Assay. A: P815-Zellen (murine Mastozytomazellen) wurden mit 51Cr markiert und im Anschluss für 4 Stunden mit dem Verdauansatz (20h) des pp89 und des c20S (schwarze Quadrate) inkubiert. Die leeren Quadrate symbolisieren den Nullstundenwert des Verdauansatzes. B: Als Kontrollpeptid fungierte das synthetische 9mer YPHFMPTNL (schwarze Kreise), es wurde ebenfalls über 4 Stunden mit P815-Zellen inkubiert. Die Lyse von P815-Zellen ohne Peptidzusatz ist mit leeren Kreisen dargestellt. Die Lyserate wurde anhand der 51Cr Freisetzung ermittelt.
• Abb. 21 : Detektion des H-2L d restringierten pp89 Epitops YPHFMPTNL im CTL Assay. A: P815-Zellen (murine Mastozytomazellen) wurden mit 51Cr markiert und im Anschluss für 4 Stunden mit dem Verdauansatz (20h) des pp89 und des c20S (schwarze Quadrate) inkubiert. Die leeren Quadrate symbolisieren den Nullstundenwert des Verdauansatzes. B: Als Kontrollpeptid fungierte das synthetische 9mer YPHFMPTNL (schwarze Kreise), es wurde ebenfalls über 4 Stunden mit P815-Zellen inkubiert. Die Lyse von P815-Zellen ohne Peptidzusatz ist mit leeren Kreisen dargestellt. Die Lyserate wurde anhand der 51Cr Freisetzung ermittelt.
• Abb. 22 : CD Spektrum des rekombinanten pp89. Das im Bereich von 195-260nm gewonnene Spektrum zeigt eine Überlagerung verschiedener Sekundärstrukturen, die mit Hilfe eines Dekonvolutionsprogramms quantitativ bestimmt wurden (vgl. Tab. 3).
• Abb. 23 : Detektion von pp89 und Ubiquitin aus Zelllysaten im Westernblot. Murine Fibroblasten (C4 Zellen, jeweils Spur 1) wurden mit einem pp89 Konstrukt stabil transfiziert (B8 Zellen, jeweils Spur 2). Zellkulturen der B8 Zellen wurden transient (Kalziumphosphat- Transfektion) mit HA- markiertem Ubiquitin transfiziert. Die Inkubation erfolgte einerseits ohne MG132 (Spur 3, stattdessen DMSO- Kontrolle), in Spur 4 sind die Lysate dargestellt 2 Stunden nach Zugabe von 6μM MG132. Im linken Teil der Abb. sind die zugehörigen Blots (Immobilon®) nach Färbung mit Coomassie zu sehen, um die Äquivalenz der aufgetragenen Proteinmengen zu belegen (Proteinbestimmung nach Bradford). Abb. A: αHA- Antikörper; Abb. B: αUbiquitin- Antikörper; Abb. C: αpp89- Antiköper. Die am rechten Bildrand dargestellten Klammern deuten auf die polyubiquitinierten Produkte hin.
• Abb. 24 : Struktur der Vektoren, die markiertes Ubiquitin exprimieren. Die Vektoren bestehen aus der CMV Promoter/ Enhancer Region, die die Transkription der mRNA initiiert. Diese mRNA kodiert ein Molekül aus 8 N- terminal markierten (HA- tag bzw. His- tag) Ubiquitineinheiten. Die Proteinsequenzen des His6- und des HA- markierten Ubiquitins sind im unteren Abschnitt der Abbildung dargestellt (Treier 1994).
• Abb. 25 : Isolation von His- markierten Proteinen aus B8 Zellen. B8 Zellen (Spur 1) wurden einerseits mit His- Ubiquitin (His6- Ubi) transient transfiziert, zum anderen wurde pp89- und β- Catenin- cDNA (Spur 4 und 5) kotransfiziert. Zudem wurde das Proteasomsystem mit 10μM Lactacystin inhibiert (Spur 3 und 5), als Kontrolle diente DMSO (Spur 2 und 4). Die Zelllysate (Lyse in 8M Harnstoffpuffer) wurden an Ni- NTA- Agarose gebunden, mittels Imidazol- haltigem Puffer erfolgte die Isolation der an Ni- NTA- Agarose gebundenen, histidinreichen Proteine. Anschließende TCA- Fällung und Auftrennung der Eluate in 12,5%-igen Acrylamidgelen (SDS-PAGE). Blotting auf Immobilon® und Westernblot mit αpp89.
• Abb. 26 : Immunopräzipitation von pp89 aus B8 Zellen, als Kontrolle Immunopräzipitation des ubiquitinabhängigen Transkriptionsfaktors p53. A: C4 (Spur 1) und B8 Zellen (Spuren 2 bis 5) wurden über 30min mit 35S Methionin markiert (pulse) und nach 2 Stunden Inkubation geerntet (chase). Das proteasomale System der B8 Zellen wurde gleichzeitig mit 10μM MG132 (Spuren 3 und 5) inhibiert. Im Anschluss an die Lyse der Zellen erfolgte die Immunopräzipitation mit αpp89- Antikörpern, eine Auftrennung durch SDS- PAGE und Exposition des getrockneten Gels auf einem Röntgenfilm. In einem parallelen Ansatz wurde das Zelllysat mit einem monoklonalen αp53- Antikörper präzipitiert. Dieses Kontrollexperiment zeigt unter selbigen Versuchsbedingungen die Polyubiquitinierung des Substrats und den durch MG132 inhibierten Abbau des Proteins infolge Hemmung des Proteasoms (Daten aus experimenteller Zusammenarbeit mir Frau Dr. U. Kuckelkorn).
• Abb. 27 : Immunopräzipitation von pp89 aus B8 Zellen, Zeitverlauf. Sowohl C4 (Spur 1) als auch B8 (Spur 2) und mit His6- markiertem Ubiquitin transfizierte B8 Zellen (Spur 3, 4) wurden über 30min mit 35S Methionin markiert (pulse) und im Zeitverlauf nach 2, 4 und 8 Stunden geerntet (chase). Hemmung des Proteasoms für jeweils 2h mit 10μM MG132 (Spur 4). Immunopräzipitation mit αpp89- Antikörpern, Auftrennung in der SDS- PAGE. Der inhibierende Einfluss von MG132 wird deutlich, allerdings besteht hier kein Anhalt für eine Ubiquitinierung des pp89.
• Abb. 28 : ODCpp89 Fusionsprotein. Aminosäuresequenz des ODCpp89 Fusionsproteins. In grün dargestellt die murine ODC, daran anschließend in schwarz die pp89 Sequenz. Zwischengeschaltet sind 2 Linkeraminosäuren HG (schwarz kursiv), die zur Aufrechterhaltung des korrekten Leserasters eingefügt wurden. Schwarz und fett gedruckt ist das pp89 Epitop. In Position 39 (bzw. 502) lässt sich erneut ein Aminosäureaustausch nachweisen (F à S).
• Abb. 29 : Insertion des ODCpp89Fusionsproteins in den Expressionsvektor pRSET A. A: In Spur 1 ist das pp89 Insert (630bp) mit Kpn I und Eco R I Schnittstellen, in Spur 2 das ODC Insert (1383bp) mit Bam H I und Kpn I Schnittstellen jeweils nach Restriktionsverdau dargestellt. Der positive Klon A1 wurde einerseits mit Bam H I und Kpn I verdaut, in Spur 3 sind die entsprechenden Produkte ODC und Vektor pRSET A+pp89 zu sehen. Nach Inkubation der Plasmid- DNA mit Kpn I und Eco R I kann das pp89(630bp) und pRSET A+ODC (Spur 4) gezeigt werden.B: Die ODC- Sequenz wurde über Bam H I und Kpn I Schnittstellen in den zuvor identisch verdauten Vektor ligiert. Direkt im Anschluss des C- Terminus der ODC wurde über Kpn I und Eco R I eine 603 bp große pp89- Sequenz inseriert, so dass im Vektor letztendlich die Fusionssequenz vorliegt: Die Plasmid- DNA wurde initial in ΔDΗ5α—Zellen transformiert, amplifiziert und sequenziert sowie nach positiver Selektion für die Proteinexpression in BL21-Zellen transformiert.
• Abb. 30 : A ufreinigung das ODCpp89 Fusionsprotein, Coomassie- Färbung und Westernblot. Nach Isolation des getaggten Fusionsproteins nach beschriebenem Protokoll (vgl. 2.2.2.11) wurden die Proben in 12,5%igen Polyacrylamidgelen getrennt und mit Coomassie gefärbt. In Spur 1 und 2 sind jeweils 2 und 4 μg des Proteins mit zu erwartendem Molekulargewicht (77kDa) sichtbar. Nach Blotting der Proteine erfolgte der spezifische Proteinnachweis mit α(RGS)4His- (Spur 3) und αpp89- Antikörpern (Spur 4).
• Abb. 31 : Aufreinigung des Antizyms. Nach Expression des MBP- Antizym und Bindung an Amylose- Resin erfolgte die Elution mit dem Maltose- haltigen Puffer. Das Eluat wurde zweimal in der FPLC über einen NaCl-Gradienten getrennt (Proteinpeaks E6, E7). Nach Trennung der Eluate liegt das Antizym homogen vor. Die Peakfraktionen (E5), E6 und E7 in der Coomassiefärbung entsprechen den Fraktionen des Chromatogramms.
• Abb. 32 : Aktivität des 26S Proteasoms. Die aus humanen Erythrozyten isolierten 26S Proteasomen wurden in einer nativen Gelelektrophorese aufgetrennt und mit einem Substratoverlay (100μM Bz-VGA-AMC) nachgewiesen. In Spur 1 ist zur Kontrolle reines 20S Proteasom aufgetragen, in Spur 2 das in den Verdaus eingesetzte 26S. Im Anschluss wurde das Gel mit Coomassie gefärbt. Das 26S Proteasom (Spur 2) zeigt 26S Aktivität und darüber hinaus ist partiell zerfallenes 26S in Form des 20S Core- Komplexes sichtbar.
• Abb. 33 : In vitro Abbau des rekombinanten ODCpp89 Fusionsproteins durch das 26S Proteasom. Das Fusionsprotein (50nM (4μg)), wurde in folgendem Ansatz bei 37°C für 0, 4, 20 h inkubiert: 40mM Tris HCl, pH 7.4, 5mM MgCl2, 2mM DTT, 1mM ATP, 10mM Kreatinphosphat, 50ng/μl Kreatinkinase, 10nM 26S (13.4μg), 11μg Antizyme. Die Reaktionen wurden in SDS-PAGE und Westernblot (polyklonaler αpp89- Antiköper) analysiert. A: Kontrolle ODCpp89 + Antizym ohne 26S; B: ODCpp89 + Antizym + 26S; C: ODCpp89 + Antizym + 26S + 2μM Epoxomicin
• Abb. 34 : Detektion des H-2L d restringierten pp89 Epitops YPHFMPTNL im CTL Assay. A:P815-Zellen (murine Mastozytomazellen) wurden mit 51Cr markiert und im Anschluss für 4 Stunden mit dem Verdauansatz (20h) von ODCpp89 Fusionsprotein und 26S (schwarze Quadrate) inkubiert. Leere Quadrate symbolisieren den Nullstundenwert. B: Als Kontrollpeptid fungierte das 9mer YPHFMPTNL (schwarze Dreiecke), es wurde ebenfalls über 4 Stunden mit P815-Zellen inkubiert. Leere Dreiecke entsprechen dem Nullstundenwert. Die Lyserate wurde anhand der 51Cr Freisetzung ermittelt.