Das Proteasom ist eine ATP- abhängige Protease, die sich aus vielen Untereinheiten zusammensetzt. Es ist für die Generierung der MHC Klasse I- restringierten Peptide verantwortlich, die nach Komplexbildung mit MHC Klasse I- Haplotypen auf der Zelloberfläche präsentiert werden. Nicht- funktionelle Proteine, die als so genannte defective ribosomal products (DRIP) bezeichnet werden, stellen eine wichtige Quelle für die Generierung von antigenen Peptiden, insbesondere jedoch von viralen Peptiden dar. Generell wird die Lehrmeinung vertreten, dass der Abbau von polyubiquitinierten Proteinen durch das 26S Proteasom zur Generierung von MHC Klasse I- Liganden führt. Allerdings ist weiterhin unklar, ob virale Proteine Ubiquitin- abhängig vom Proteasom abgebaut werden. Im Rahmen dieser Arbeit sollte der Proteasom- abhängige Abbau des mCMV ie pp89 Proteins vor allem hinsichtlich einer potentiellen Ubiquitinierung untersucht werden. Dazu wurden zunächst Konstrukte sowohl für ein rekombinantes pp89 (rek pp89) als auch für ein ODCpp89 Fusionsprotein entworfen. Somit konnten sowohl der in vitro Abbau dieser Proteine als auch die Prozessierung des spezifischen MHC Klasse I- H-2Ld Epitops verfolgt werden. Experimente zum Nachweis von Ubiquitin- Protein- Konjugaten wurden in vivo mit pp89 cDNA stabil transfizierten Mausfibroblasten (B8 Zellen) durchgeführt.
Die experimentellen Daten sprechen für einen schnellen in vitro Abbau des rek pp89 durch das 20S Proteasom. Das MHC Klasse I- pp89 Epitop bzw. dessen 11mer Precursorpeptid wurden dabei mit hoher Präzision generiert. Spezifische CTL Assays weisen auf die Generierung des korrekten Epitops bzw. des Precursors hin. Nach Verdau des ODCpp89 Fusionsproteins durch 26S Proteasomen in Anwesenheit von Antizym konnten mit diesem Test ebenfalls das 9mer Epitop respektive der 11mer Precursor nachgewiesen werden. Eine potentielle Ubiquitinierung des pp89 wurde
in vivo
in Zellkulturen untersucht. Nach Gabe von Proteasomeninhibitoren zu Mausfibroblasten konnte eine starke Akkumulierung von Ubiquitin- Konjugaten beobachtet werden. Allerdings konnte in den verschiedenen Versuchsansätzen kein Nachweis von pp89- Ubiquitin- Konjugaten erbracht werden. Demzufolge ist für die Generierung von viralen Epitopen ein Proteasom- abhängiger, aber Ubiquitin- unabhängiger Abbauweg denkbar.
The proteasome, an ATP-dependent, multisubunit protease, is responsible for the generation of most MHC class I restricted epitopes presented on the cell surface. Non-functional proteins, also known as defectice ribosomal products (DRiP), represent an important source for the generation of antigenic peptides in general and of viral epitopes in particular. It is widely accepted that the degradation of polyubiquitinated proteins by the 26S proteasome is a prerequisite for the generation of MHC class I ligands. However, the ubiquitin dependence for the proteasomal degradation of viral proteins is an issue so far unresolved. Therefore, the aim of this study was to analyze the proteasomal degradation of the mCMV ie pp89 in respect to an anticipated ubiquitinylation. Thus, a recombinant pp89 (recpp89) as well as an ODCpp89 fusion protein were generated. The
in vitro
processing of these proteins and the generation of a MHC class I H-2L
d
epitope by proteasomes was further studied. Murine fibroblast cell lines (B8 cells) were used to analyze any
in vivo
evidence for potentially existing ubiquitin-protein conjugates.
The experiments show that the recpp89 protein is rapidly degraded
in vitro
by the 20S proteasomes and that the correct MHC class I pp89 epitope or its 11mer precursor are generated with high fidelity. Furthermore, CTL assays, indicating the generation of the specific pp89 epitope or the 11mer precursor, also suggested a 26S proteasome-dependent degradation of the mCMV pp89-ODC fusion protein in the presence of antizyme. Treating cell cultures with proteasome inhibitors resulted in a significant accumulation of ubiquitin-conjugates
in vivo
. However, higher molecular weight pp89-ubiquitin conjugates were not detectable throughout the entire experimental set-up. Consequently, a proteasome-dependent, but ubiquitin-independent pathway can be postulated for the generation of viral epitopes.
Eine der wichtigsten zellulären Funktionen ist zweifelsohne der regulierte und kontrollierte Abbau von endogen Proteinen, um einerseits die Homeostase der Zelle zu gewährleisten, andererseits auch Proteine zu definierten Zeitpunkten regulieren zu können. Eine grundlegende Voraussetzung dazu ist eine Kompartimentierung in zellulären Substrukturen, wobei die Autokompartimentierung, die geordnete Zusammenlagerung von verschiedenen Proteasen zu einem zylinderförmigen Komplex, sich als evolutionär stabiles Konzept des kontrollierten Proteinabbaus herauskristallisiert hat. In allen Domänen des Lebens, in Bakterien, Archaebakterien und Eukaryonten konnte dieses Konzept bestätigt werden. In Archaebakterien und Eukaryonten ist es vielmehr gelungen, eine „multikatalytische Proteinase“ zu identifizieren, die wenige Jahre später in „Proteasom“ umbenannt wurde (Dahlmann 1988, Arrigo 1988, Dahlmann 1989, Baumeister 1998).
20S Proteasomen setzen sich aus vier aneinander gelagerten Ringen zusammen, die wiederum jeweils aus einem Konglomerat von 7 evolutionär verwandten, aber nicht identischen Untereinheiten (UE) bestehen. Eukaryonten weisen 2 Kopien von 14 verschiedenen Untereinheiten auf, die aufgrund ähnlicher Sequenzen α- und ß- UE zugeordnet sind. Die α-Untereinheiten (α1-α7) bilden die beiden äußeren, die ß-Untereinheiten (ß1-ß7) die beiden inneren Ringe. Durch diese α7ß7ß7α7- Anordnung formiert sich ein Zylinder von 15nm Länge, der einen Durchmesser von 11nm aufweist. Der Zylinder schließt 3 interne Kavitäten ein (vgl. Abb. 1), wobei die innere durch die beiden benachbarten ß-Ringe, die äußeren Vorkammern jeweils durch Anteile eines α- und ß-Rings eingeschlossen werden (Kopp 1993, 1997)
Die katalytischen Zentren befinden sich innerhalb der zentralen Kammer des 20S Proteasoms. Das Proteasom ist als N- terminale nukleophile Hydrolase charakterisiert worden (Brannigan 1995). Nach autokatalytischer Entfernung der Prosequenzen befindet sich ein Threonin am N-Terminus der aktiven ß-Untereinheiten (Thr-1), das als essentielles Nukleophil und Protonenakzeptor fungiert (Löwe 1995, Seemüller 1995). Lactazystin, ein in seiner aktiven Form an Thr-1 kovalent bindendes Antibiotikum, führt zu einer Hemmung der proteolytischen Aktivität des Proteasoms, insbesondere der Spaltung nach hydrophoben Aminosäuren (Fenteany 1995, Rock & Goldberg 1999). Neben dem Thr-1 sind weitere AS in den katalytischen Zentren der β-UE erforderlich, um eine effiziente Proteolyse zu gewährleisten: Lysin an Position 33 und Glutamat an Position 17. Dem Lys-33, respektive der N- terminalen Aminogruppe des Thr-1 werden eine Protonendonor- bzw. Protonenakzeptorrolle zugeschrieben, das Glu-17 dürfte die protonierte Form dieser Gruppen stabilisieren (Schmidtke 1996). In Mutationsanalysen (Thr1àAla1 bzw. Lys33àAla33) führten die T1A- bzw. K33A-Mutanten zu einer unvollständigen Prozessierung der aktiven ß-Untereinheiten, woraus verschiedene Primärstrukturen der ß-Untereinheiten mit deutlich reduzierter katalytischer Funktion resultierten (Schmidtke 1996, Heinemeyer 1997, Dick 1998).
Im Gegensatz zu Archaebakterien (T. acidophilum), bei denen alle ß-Untereinheiten proteolytische Aktivität zeigen, ist die katalytische Funktion bei Eukaryonten auf die 3 ß-UE, ß1, ß2 und ß5 restringiert (vgl. Abb. 1, 2).
Mit Hilfe von fluorogenen Peptidsubstraten konnten diesen aktiven ß-Untereinheiten bestimmte Präferenzen der Peptidhydrolyse in Abhängigkeit von den AS an Position 1 zugeschrieben werden (vgl. Tab.1). Hingegen ist die Enzymspezifität bei Proteinen, also physiologischen Substraten in Mammalia- Proteasomen weitaus geringfügiger ausgeprägt (Kisselev 1999, Akopian 1997).
Eine der Funktionen des Proteasoms besteht in der Antigenprozessierung. In dieser Eigenschaft ist es direkt in den MHC Klasse I- abhängigen Weg der Immunabwehr integriert. Interferon γ, ein pleiotropes Zytokin, induziert unter anderem einen Austausch der aktiven ß-Untereinheiten gegen die Immunountereinheiten LMP2, LMP7 und MECL-1 (vgl. Abb. 3; Rock & Goldberg 1999). Der konsekutive Einbau dieser Immunountereinheiten ß1i, ß2i und ß5i bedarf jedoch der de novo Assemblierung des Proteasoms (vgl. Abb. 3). Die Untereinheiten stehen dabei in Wechselwirkung untereinander, so ist die Integration der ß2i-UE von der Inkorporation der ß1i-UE in den Präproteasomenkomplex abhängig. Die effiziente Reifung des Immunoproteasoms in Form des ß1i-, ß2i-Präproteasomenkomplexes wiederum erfordert die Anwesenheit bzw. Inkorporation von ß5i (Groettrup 1996, Griffin 1998, Schmidt 1997, Tanaka 1998).
Das Proteasom schneidet Proteine bzw. Peptide in einer prozessiven Weise. Es entstehen dabei hauptsächlich Peptidfragmente einer Länge von 4 bis 24 Aminosäuren. So generiert das 26S Proteasom in 10% der Fälle Octapeptide, in 70% kleinere und in 20% der Fälle größere Fragmente. Die durchschnittliche Länge der Fragmente bei konstitutiven 20S Proteasomen beträgt 7.4 AS, die der von Immunoproteasomen generierten Fragmente dagegen 8.6 AS. Der Proteinabbau erfolgt zufällig, bis die Produkte eine Größe erreicht haben, die die Diffusion aus dem 20S Core-Komplex zulässt. Einige Proteine werden jedoch nicht vollständig abgebaut. Als Ausnahme sei der Transkriptionsfaktor NFκB erwähnt, dessen N- terminales Fragment (50kDa) nach dem proteasomalem Abbau des p105
Eine weitere durch IFNγ induzierbare Komponente des proteasomalen Systems, die die Antigenprozessierung des MHC Klasse I- Wegs beeinflusst, ist der Proteasomaktivator PA28, auch 11S Regulator oder REG genannt (Dubiel 1992, Ma 1992, Realini 1994). Dieser 180-200kDa große Regulator ist aus PA28 α- und ß-Untereinheiten zusammengesetzt, die im Zytosol eine hexamere Ringstruktur PA28(αß)3 bilden. Im Zellkern wurden hexamere Ringe aus 6 γ-Untereinheiten, PA28(γ)6, identifiziert (Ahn 1996, Kuehn 1996, Tanaka 1998). Rekombinant exprimierte PA28α-Untereinheiten wiederum formieren heptamere Ringe PA28(α)7, die entsprechende in vivo Komplexe suggerieren (Knowlton 1997, Kloetzel 2001).
Der in Mammalia vorkommende PA28-Komplex hat selbst keine hydrolytische Aktivität, vermag hingegen in in vitro Studien in Anwesenheit von 20S Proteasomen den Abbau von fluorogenen Peptiden ATP- unabhängig zu beschleunigen. Das Peptidrepertoire nimmt ebenso zu. Andererseits wird der Abbau von Proteinen oder Ubiquitin- Protein- Konjugaten nicht stimuliert (Ustrell 1995, Groettrup 1995). Für bestimmte Peptidsubstrate (JAK 1 Protein) zeigte sich, dass in Anwesenheit von PA28 Doppelschnitte im Gegensatz zu Einfachschnitten präferiert werden (Dick 1996). Andere Studien implizieren jedoch, dass sich nach Bindung von PA28 die Substrataffinität bei gleich bleibender enzymatischer Aktivität des Komplexes erhöht. Weiterhin werden sowohl die Substrataufnahme als auch die Freisetzung der generierten Fragmente durch PA28 in ihrer Rate beschleunigt (Stohwasser 2000). Der Effekt von PA28 auf die Antigenprozessierung viraler Epitope zeigte einerseits eine vermehrte Generierung verschiedener Epitope, die Rate des Proteinumsatzes hingegen blieb konstant. Jedoch konnte dieser Effekt für andere virale Epitope nicht nachgewiesen werden (van Hall 2000). In Kristallstrukturanalysen wurden PA26-20S Proteasomenkomplexe analysiert (PA26: zum PA28 homologer Komplex aus Trypanosomen) (Whitby 2000). Der Regulator Komplex bindet ATP-unabhängig an die äußeren α-Ringe des 20S Proteasoms und kann den 19S Regulator an mindestens einer Seite verdrängen, so dass Hybrid- Proteasomen, d.h. asymmetrische Komplexe aus 19S, 20S und PA28, entstehen können.
Wie bereits ausgeführt, sind die N- terminalen Peptidsequenzen der α-Untereinheiten des 20S Kernkomplexes, insbesondere α3, für den verschlossenen Zugang des Proteinasekomplexes verantwortlich (Groll 2000). Nach Bindung von PA28 an das Proteasom werden die aminoterminalen Sequenzen der α-Untereinheiten des 20S Proteasoms in den Hohlraum des PA28-Zylinders umgelagert und somit der Zugang für
Der kontrollierte Proteinabbau durch Proteasomen wird durch einen anderen Regulator Komplex, den so genannten 19S Regulator oder PA700 (Proteasomaktivator 700 kDa) vermittelt. 19S Regulatoren, die haubenartig mit dem 20S Komplex assoziiert sind, binden ubiquitinierte Proteine, deubiquitinieren diese, assistieren bei der Entfaltung und schleusen die Proteine in das Proteasom ein, wo im Anschluss der proteolytische Abbau stattfindet. Jeweils ein 19S Regulator interagiert in einer determinierten Position mit den α-Ringen des 20S Proteasoms, wobei sich die C2-Symmetrie des 20S Proteasoms durch die entgegengesetzte Orientierung der 19S Einheiten manifestiert (vgl. Abb. 4). Der resultierende proteolytische Komplex ist als 26S Proteasom beschrieben worden (Coux 1996, Glickman 1998a, Walz 1998).
Der 19S Regulator setzt sich aus bis zu 20 verschiedenen Untereinheiten mit einem Molekulargewicht zwischen 25 und 110kDa zusammen, welche wiederum zwei Subkomplexe, „base“ und „lid“ genannt, bilden (vgl. Abb. 4). Den “base”- Subkomplex bilden sechs ATPasen (S7, S4, S6, S10b, S6´, S8), die zur Triple-A Familie (ATPases associated with a variety of cellular activities) zählen und die Nicht- ATPasen S1, S2 und S5a. Die ATPase- Untereinheiten formieren einen hexameren Ring, der offenbar direkt mit dem heptameren Ring der α-Untereinheiten des 20S Proteasoms interagiert. Der „lid“- Subkomplex besteht aus nicht- ATPase- Untereinheiten, deren jeweilige Anzahl und Zusammensetzung speziesabhängig ist (bei höheren Eukaryonten: S3, p55, S9, S10, S12, S11, S14, S5b, S15, Poh1). Für diese Untereinheiten wurden starke Sequenzhomologien mit dem COP 9-Signalosom und dem eIF3 (eucaryotic translational initiation factor 3) aufgezeigt (Glickman 1998b).
Die ATPase- Untereinheiten fungieren ähnlich wie molekulare Chaperone. Sie können in ATP-abhängigen Zyklen nicht gefaltete Proteine und partiell gefaltete Intermediate stabilisieren und sie vor Aggregationen schützen. Des Weiteren agieren sie als qualitativer Selektionsmechanismus, um falsch gefaltete oder defekte Proteine (so genannte DRiPs) zu eliminieren. Es wurde postuliert, dass die ATPasen des 19S Komplexes bei der Entfaltung der Proteine mitwirken und somit den Zugang in das enzymatisch aktive Zentrum des 20S Proteasoms ermöglichen und kontrollieren können (Braun 1999).
Wie oben beschrieben, ist der Zugang in den katalytischen Zylinder durch die N- terminalen Peptidsequenzen der α-Untereinheiten verschlossen. Mehrere Autoren diskutieren, dass das Zentrum durch Interaktion mit den 19S Regulatoren, insbesondere mit den „base“-Subkomplexen für die Substrate zugängig wird (Groll 1997, 2000, Glickman 1998a). Dafür spricht sowohl der unmittelbare Kontakt zwischen „base“ und α-Ring, als auch die denkbare Energieabhängigkeit eines Öffnungsmechanismus, der durch ATP-Hydrolyse Rechnung getragen würde.
Ferner spielt der 19S Regulator eine wesentliche Rolle bei der Bindung von polyubiquitinierten Proteinen, wobei Ubiquitin als Degradationssignal in der Zelle fungiert. Für die AAA- ATPase- Untereinheit S5a wurde in vitro eine spezifische Affinität für Polyubiquitin nachgewiesen (Deveraux 1994), hingegen konnte S5a in späteren Arbeiten in vivo nicht als derartiger Rezeptor definiert werden (van Nocker 1996, Fu 1998). In S. cerevisiae ist Rpn 10 (Homolog zu S5a) für den Proteinabbau ubiquitinierter Substrate nicht essentiell (Rubin 1997). Somit muss also mindestens eine weitere Bindungsstelle für Ubiquitin innerhalb des 19S vorhanden sein. So führten zum Beispiel in weiteren Analysen Mutationen der „base“- Untereinheiten Rpn 2 (S1) und Rpn 1 (S2) zu einer Akkumulation von ubiquitinierten Proteinen (Bochtler 1999).
Ergänzend sei erwähnt, dass innerhalb des 19S Regulators auch eine 37kDa Isopeptidase nachgewiesen wurde. Durch deren enzymatische Aktivität können Ubiquitinketten vom jeweiligen Substrat abgespalten und im Zytosol reutilisiert werden (Lam 1997).
Dem Proteasom wird generell der Abbau von bis zu 90% der zellulären Proteine zugeschrieben (Rock 1994). Durch kovalente Bindung von Ubiquitin an kurzlebige Proteine werden diese für den Ubiquitin- abhängigen Abbau durch das 26S Proteasom markiert, wobei einzelne Untereinheiten des 19S Regulators für die Substratbindung und
Viren können direkt mit der Antigenprozessierungsmaschinerie interagieren. So initiiert beispielsweise das E6 Onkoprotein, das von mit humanen Papillomaviren 16 oder 18 infizierten Keratinozyten des Zervixepithels exprimiert wird, nach Bindung an den Tumorsuppressor p53 dessen Ubiquitin- abhängigen Abbau durch das 26S Proteasom. Dies führt zu einer verminderten intrazellulären Konzentration von p53 und beeinträchtigt somit den kontrollierten Zellzyklus (Coux 1996, Scheffner 1990).
Zum anderen ist das 26S Proteasom für die Degradation von falsch gefalteten Proteinen, von Transkriptionsfaktoren, Zellzyklusregulatoren und Onkogenen verantwortlich. Ubiquitin bindet während des Zellzyklus phasenabhängig an Zyklin B und initiiert dessen Degradation. Dadurch wird simultan Cdk1 (cyclin-dependent kinase) abgeschaltet. Maligne Transformationen von kolorektaler Mukosa werden hingegen mit ß- Catenin assoziiert. Der Abbau dieses Proteins erfolgt ebenfalls nach vorgegangener Ubiquitinierung (Hochstrasser 1996, Hershko 1998). Für das Onkoprotein cJun wurde der Ubiquitin- abhängige Abbau durch das 26S Proteasom in vitro und in vivo beschrieben (Treier 1994). Andere Beispiele Ubiquitin- abhängiger Proteine stellen Ionenkanäle wie der CFTR (cystic fibrosis transmembrane regulator) und der Wachstumshormonrezeptor dar (Ciechanover 1998).
Signaltransduktionskaskaden unterliegen komplexen Regulationsmechanismen. Das Proteasom ist für die Spaltung des p105-Vorläuferproteins des Transkriptionsfaktors NFκB und die folgende Freisetzung der aktiven p50- Untereinheit verantwortlich (Coux 1996). Unter Zuhilfenahme von Proteasomeninhibitoren wie MG132 konnte die beschriebene Aktivierung von NFκB durch das Proteasom in Restenosestudien verhindert werden. Der antiinflammatorische, antiproliferative und proapoptotische Effekt dieser Inhibitoren des Proteasoms reduziert die Neointimaformation von traumatisierten Gefäßwänden und impliziert einen therapeutischen Ansatz in der Prävention von vaskulären Restenosen nach Angioplastien (Meiners 2002).
Für viele Membranproteine stellt Ubiquitin wiederum ein Signal für die Endozytose und
Trotz der ausführlich dargestellten Zusammenhänge zwischen Ubiquitin und dem 26S Proteasom stellt sich die Frage, ob sich die Funktion des Ubiquitins auf ein Erkennungssignal für den Proteasekomplex beschränkt. Einerseits wurde postuliert, dass es die Proteinentfaltung initiiere, andererseits wurde ein indirekter Einfluss auf die Denaturierung von Proteinen im Wechselspiel mit dem 19S Regulator diskutiert. So könnte Ubiquitin insofern unterstützend wirken, als dass es schwierig zu entfaltenden Proteinen einen längeren Kontakt zum 19S gewährt, bis die völlige Denaturierung den Abbau durch das 26S Proteasom gestattet (Hochstrasser 1996). Diese These korreliert auch mit den experimentellen Daten, nach denen chemisch denaturierte oder modifizierte Proteine ohne Ubiquitinierung vom Proteasomabgebaut werden können (Michalek 1996).
Gleichzeitig stellt sich die Frage, ob eine Ubiquitinierung in jedem Fall für den proteasomalen Abbau essentiell ist. So konnte für verschiedene Proteine wie den Cdk Inhibitor p21CIP21 oder oxidiertes Calmodulin nachgewiesen werden, dass sie nicht der Ubiquitinierung bedürfen (Sheaff 2000, Ferrington 2001). Ein weiteres, detailliert charakterisiertes Beispiel ist die Ornithindecarboxylase, deren Abbau in Gegenwart von Antizym ohne Ubiquitinierung vom 26S Proteasom vollzogen und im Folgenden näher erläutert wird (Murakami 1992).
Ubiquitin ist ein hoch konserviertes, globuläres Protein, das aus nur 76 Aminosäuren besteht. In der evolutionären Entwicklung zeigen sich zwischen Hefe- und humanem Ubiquitin lediglich 3 Aminosäureaustausche. Die Ubiquitinierung löslicher zytosolischer und nukleärer Proteine unterliegt einem komplexen Mechanismus, dem verschiedene Enzyme angehören. Initial wird das C- terminale Glycin (G76) des Ubiquitins ATP- abhängig zu einem hochenergetischen Thioesterintermediat aktiviert. Diese Reaktion wird durch E1 (ubiquitin activating enzyme) beschleunigt. Dem schließt sich der Transfer des Intermediates an E2 (ubiquitin conjugating enzyme oder ubiquitin carrier protein) an, wobei eine Vielzahl derartiger Enzyme charakterisiert werden konnten. E3 (ubiquitin protein ligase) katalysiert den finalen Schritt des Konjugationsprozesses, die kovalente Bindung von Ubiquitin an das Substrat. Ubiquitin, speziell G76, bildet mit der ε- Aminogruppe (ε-NH2) eines Lysinrests des Proteinsubstrats eine Isopeptidbindung. Es existieren verschiedene ligierende E3 Enzyme. So sind HECT (homologous to E6-associated protein carboxy terminus) Domänen
Die Bindung von Polyubiquitin an Substrate stimuliert die Proteolyse, obwohl in vitro in Retikulozytenlysaten auch Monoubiquitin den Proteinabbau suffizient initiierte (Shaeffer 1995). Allgemein gültig ist jedoch, dass zwischen Lysin 48 und Glycin 76 durch Isopeptidbindungen verknüpfte Polyubiquitinketten das entscheidende Abbausignal darstellen (Chau 1989). Mutanten dieser Lysinreste oder methyliertes Ubiquitin hingegen führen zu einem Kettenabbruch und inhibieren die Proteolyse (Ciechanover 1998).
Die Ornithindecarboxylase (ODC) besteht aus insgesamt 461 Aminosäuren und hat mit wenigen Minuten bis zu einer Stunde eine der kürzesten Halbwertszeiten aller Enzyme überhaupt. ODC katalysiert die Synthese von Diaminoputrescin aus Ornithin, einem Intermediat in der Polyaminsynthese und stellt als induzierbares Enzym den wichtigsten Regulationsfaktor dieses Zyklus dar. Diaminoputrescin wird über weitere Zwischenstufen zu Spermidin und Spermin umgebaut. Polyamine wie Spermin sind multivalente organische Kationen, deren Interaktion mit negativ geladenen Polyanionen wie RNA und DNA einen neutralisierenden Effekt und ergo eine Stabilisierung derselben zur Folge hat. Sie können andererseits die RNA- bzw. DNA- Biosynthese stimulieren, werden auch als Wachstumsfaktoren beschrieben. Die Ornithindecarboxylase unterliegt vielfältigen Regulationsmechanismen. So bewirkt die Zugabe von Somatotropin, Kortikosteroiden oder Testosteron zu Mammalierzellkulturen einen 10- bis 200-fachen Anstieg der ODC- Konzentration in der Zelle. Dies impliziert unter anderem das Potential der Ornithindecarboxylase, ein klinisch relevanter Angriffspunkt einer antimitotischen Chemotherapie zu sein.
Neben der Synthese ist aber auch der Abbau des Enzyms einer besonderen physiologischen Kontrolle unterlegen. So wurde ein Anti-Enzym für ODC, das Antizym, als notwendiges Protein für die Degradation identifiziert. Es handelt sich dabei um ein 227 Aminosäuren langes Protein, dessen C- terminale Reste spezifisch an die Aminosäuren 117-140 der ODC binden (vgl. Abb. 8). Antizym weist eine hohe Affinität zum inaktiven ODC- Monomer auf, bindet hingegen auch an das katalytisch aktive Homodimer der ODC. Im letzten Fall interagieren zwei Antizymmoleküle mit einem ODC- Homodimer und bilden inaktive Antizym- ODC- Heterodimere (Coffino 2001). Die Bindung an ODC bewirkt eine Konformationsänderung des Enzyms, welche das C- terminale Degradationssignal der ODC für das 26S Proteasom zugänglich macht. Dieses Abbausignal ist das für Aminosäure 423 bis 449 beschriebene PEST- Motiv (vgl. Abb. 7). PEST- Sequenzen sind hydrophile Sequenzabschnitte einer Proteinsequenz mit einer Länge von mindestens zwölf
Diese spezifischen Sequenzelemente werden als alternative Degradationssignale zum Ubiquitin diskutiert (Rechsteiner 1996, Jariel-Encontre 1995). Die Abspaltung des C-Terminus der murinen ODC an Position 424, also unmittelbar vor Beginn des PEST- Motivs, führte zum Beispiel zu einer Zunahme der Stabilität des Proteins um den Faktor zehn (Ghoda 1989). Demnach initiiert Antizym nach Bindung an ODC deren ATP- abhängige Sequestration an und in das 26S Proteasom, dadurch kommt es zu einer irreversiblen Inaktivierung des Enzyms. Der direkte Nachweis dafür wurde in Immunopräzipitationen erbracht.
Zusammenfassend kann durch ergänzende Studien mit Proteasomeninhibitoren wie MG132 postuliert werden, dass sowohl Energie in Form der Phoshoanhydridbindung des ATP als auch Antizym für die irreversible Inaktivierung der Ornithindecarboxylase durch das 26S Proteasom notwendig sind, die proteolytische Aktivität des 20S Komplexes hingegen für die Degradation des Enzyms unerlässlich ist. Antizym wird infolge der Bindung von ODC an das 26S Proteasom ähnlich dem Ubiquitin vom Substrat abgespalten und kann intrazellulär reutilisiert werden. Die somit inaktivierte ODC unterliegt im Weiteren dem prozessiven proteolytischen Abbau durch die katalytisch aktiven ß-Untereinheiten des 20S Core- Komplexes (Murakami 1992, 1999).
Die Fähigkeit des Immunsystems höherer Eukaryonten, fremde Proteine spezifisch zu erkennen und daraufhin entsprechend zu reagieren, bedarf im Allgemeinen der Aktivierung von T- Lymphozyten. Die Antigen- spezifischen Rezeptoren dieser T- Zellen können Fremdproteine hingegen nicht direkt erkennen, erfordern vielmehr die Bindung von Antigenen an bestimmte körpereigene Oberflächenmoleküle. Diese Moleküle werden von einer Gruppe verbundener Genabschnitte namens major histocompatibility complex (MHC) kodiert; für den humanen MHC wird synonym humanes Leukozyten- Antigensystem (HLA) gebraucht. Zwei Subklassen von T- Lymphozyten (CD4+ und CD8+) erkennen die Peptide im Zusammenhang mit der Bindung an strukturell verwandte MHC- Moleküle, MHC Klasse II und MHC Klasse I. Die an diese beiden Klassen von MHC- Molekülen gebundenen Peptide entstammen zwei verschiedenen intrazellulären proteolytischen Systemen, dem Klasse I oder endogenem und dem Klasse II oder exogenem Weg.
Antigene Peptide mit hoher Affinität gegenüber MHC Klasse I- Molekülen entstammen überwiegend aus dem zellulären Proteinumsatz, wobei etwa 40% aller neu synthetisierten Proteine unmittelbar nach der Translation degradiert werden. Diese nicht funktionellen Proteine, auch als DRiPs (defective ribisomal products) bezeichnet, werden teilweise ubiquitiniert und vom Proteasom abgebaut. Sie dürften demnach die entscheidende Quelle von MHC Klasse I- Peptiden sein (Schubert 2000, Turner 2000). Die vom Proteasom generierten antigenen Peptide werden ATP- abhängig mittels TAP (transporter associated with antigen processing) aus dem Zytosol in das ER (Endoplasmatische Retikulum) transferiert. TAPs gehören der ABC-Familie von ATP- abhängigen Transporterproteinen an, sie sind Heterodimere, die aus TAP.1- sowie TAP.2- UE bestehen. In der Regel transferieren sie Peptide mit einer Länge von 7 bis 15 Aminosäuren, wobei humane TAPs Peptide mit hydrophoben oder basischen C- terminalen Resten präferieren. MHC Klasse I- Epitope weisen in der überwiegenden Zahl der Fälle eine Länge von 9 Aminosäuren auf, woraus einerseits auf ein zusätzliches Schneiden von Vorläuferpeptiden innerhalb des ER, das so genannte ER- trimming, als auch auf eine Retranslokation einiger Peptidfragmente in das Zytosol geschlossen werden kann (Rock&Goldberg 1999, Pamer&Cresswell 1998). Es wurden inzwischen zahlreiche Aminopeptidasen charakterisiert, die für die Hydrolyse N- terminal elongierter Peptidepitope verantwortlich gemacht werden konnten. Erwähnt seien die IFNγ- induzierbare ERAP 1 (ER Aminopeptidase 1), die Thimet Oligopeptidase sowohl die Puromycin- sensitive Aminopeptidase und die Bleomycin- Hydrolase (Beninga 1998, Koetzel 2001, Stoltze 2000).
Die Expression von Peptidtransportern (TAP) ist unmittelbar mit der Synthese von MHC
MHC Klasse I- Moleküle setzen sich strukturell aus einer glykosylierten schweren Kette (Domänen: α1, α2 und α3) und dem nicht- kovalent assoziierten ß2-Mikroglobulin zusammen. Die extrazellulären Domänen α1, α2 weisen in ihrer Struktur eine lange Furche auf, die als spezifische Peptidbindungstasche identifiziert werden konnte. Sie stellt das Charakteristikum der einzelnen MHC- Haplotypen dar, die sich hauptsächlich durch einzelne Aminosäurenaustausche innerhalb der α1 -und α2- Domänen unterscheiden. Daraus resultieren dramatische Unterschiede in der Struktur der Peptidbindungstasche. Die polymorphen MHC- Moleküle weisen verschiedene Präferenzen für Aminosäurereste in spezifischen Positionen, so genannte Ankerreste auf (vgl. Abb. 9; Madden 1995).
Die Assemblierung der schweren Ketten und MHC- Dimere (bestehend aus schwerer Kette und ß2M) wird durch Chaperone wie Calnexin, Calretikulin und BiP unterstützt. Nach Peptidbindung an die MHC- Heterodimere wird dieser stabilisierte Komplex über den Golgi Apparat an die Zelloberfläche transportiert und von spezifischen T- Zellrezeptoren (TZR) CD8+ zytotoxischer Lymphozyten erkannt (vgl. Abb. 10). Die Interaktion zwischen TZR, CD3 und CD8 mit dem peptidbeladenen MHC- Komplex sowie von kostimulatorischen Proteinen wie CD28 mit dem B7-1-Ligand bewirkt die Aktivierung und Proliferation von Antigen-spezifischen T- Lymphozyten, die wiederum lytisch und toxisch auf Antigen- präsentierende Zellen wirken (Kloetzel 2001, Rock & Goldberg 1999, Yewdell 1999).
Das Protein wir vorwiegend von lymphatischen Zellen exprimiert und zeigt vielfältige regulierende Effekte auf die zelluläre Immunantwort. Einerseits übt es einen direkten Effekt auf die Replikation von Pathogenen aus, andererseits kann es die Immunantwort insofern beeinflussen, als dass die Replikation von Pathogenen indirekt limitiert wird. So stimuliert es die Synthese von TAP, ß2-Mikroglobulin, MHC Klasse I schweren Ketten, der Immunountereinheiten des Proteasoms und dessen Regulator PA28. Zytosolische Exopeptidasen wie Leucin-Aminopeptidase (ERAP1) unterliegen ebenfalls der Induktion durch IFNγ (Daten aus Geginat 1997, Beninga 1998).
Das Proteasom spielt, wie oben beschrieben, die entscheidende Rolle in der Generierung antigener Peptide. Im Folgenden sei nun ein spezielles Augenmerk auf ein sehr detailliert studiertes Protein des murinen Cytomegalievirus geworfen, dessen Abbaumechanismus durch das Proteasom jedoch nicht vollständig aufgeklärt ist.
Das Cytomegalievirus (CMV) ist ein doppelstrangiges DNA-Virus, das durch ein enges Wirtsspektrum und eine langsame Vermehrung gekennzeichnet ist. Pathophysiologisch charakteristisch ist in der Regel eine inapparente Erstinfektion. Bis zum mittleren Erwachsenalter sind bis zu 90% der Population mit dem Virus infiziert. Eine Reaktivierung dieser latenten Infektion kann zu mononukleoseartigen Krankheitsbildern, milden Hepatitiden und fieberhaften Allgemeinsymptomen führen. In der Gruppe Immunsupprimierter wie AIDS-, Transplantations- oder Malignompatienten hingegen manifestiert sich die CMV-Infektion als ein schweres generalisiertes Krankheitsbild in Form einer CID (cytomegalic inclusion disease) mit potentiell letalem Ausgang. Neben der Hepatotoxizität dominieren Retinitiden
Wie auch für weitere Herpesviren gezeigt wurde (Fruh 1995, Hill 1995), weist das Cytomegalievirus zahlreiche Mechanismen zur Umgehung einer adäquaten Immunantwort des Wirts auf. Während der Latenzphase ist die Transkription viraler Proteine deutlich reduziert. Weiterhin kommt es zur Modulation spezifischer Immunfunktionen. Das hCMV (humanes Cytomegalievirus) kodiert 4 Gene, deren funktionelle Proteine mit dem MHC Klasse I- Weg der Antigenpräsentation interagieren (Rensch 1999). Das US3 Gen (gp23 Protein) wird während der Infektion sehr früh exprimiert. Dieses Glykoprotein bindet an MHC Klasse I- Moleküle und führt zu deren Retention und Akkumulation im endoplasmatischen Retikulum (ER) der infizierten Zellen (Jones 1996). Das Glykoprotein 21 (gp21, US6 Gen) wiederum stellt ein Transmembranprotein dar, das durch Interaktion mit TAP an der luminalen Seite im ER dessen Transportfunktion inhibiert und somit die Antigenpräsentation reduziert (Lehner 1997). Glykoproteine 24 und 33 sind Produkte späterer Phasen der Infektion. Diese Proteine bewirken den retrograden Transport neu synthetisierter MHC- Moleküle aus dem ER in das Zytoplasma und damit einen rapiden Abbau dieser körpereigenen Proteine durch das Proteasom (Wiertz 1996). Insgesamt führen diese variablen Mechanismen zu einer dramatisch reduzierten Präsentation von viralen Peptiden gegenüber spezifischen zytotoxischen T- Zellen.
Detaillierte Daten hinsichtlich des Proteinabbaus durch das Proteasom und damit der Antigenprozessierung liegen hingegen hauptsächlich für das murine Cytomegalievirus (mCMV) vor. Nach Infektion von Fibroblasten mit mCMV führt die Expression von sehr frühen Genen zur Präsentation eines Peptids auf einem MHC Klasse I H-2Ld Molekül. Dieses antigene Peptid stammt vom mCMV IE pp89 (immediate early phosphoprotein 89kDa) und wurde als das Nonapeptid yphfmptnl charakterisiert (vgl. Abb. 9, 12; Reddehase 1989,
Das Epitop beinhaltet mit dem Prolin an Position 8 (P8: P) und dem Leucin an Position 1 (P1: L) für das H-2Ld- Molekül spezifische Ankeraminosäuren, die für die MHC- Bindung des Peptids in die Bindungstasche des MHC Klasse I- Moleküls von Bedeutung sind. Proline innerhalb eines viralen Epitops fördern die Präsentation desselben, sie werden für einen verminderten proteasomalen Abbau der Epitope und der daraus folgenden Stabilisierung verantwortlich gemacht (Shimbara 1998).
Das an Position 6 (P6) befindliche Phenylalanin hingegen ist für den Kontakt zum peptid-spezifischen T- Zellrezeptor der CD8+ T- Lymphozyten von Relevanz. In Mutationsanalysen wurden die Aminosäuren Y1 und L9 gegen A (Alanin)ausgetauscht, wodurch die antigene Potenz des viralen Epitops (APHFMPTNA) verloren ging. Dies ist insbesondere auf die durch den Aminosäureaustausch hervorgerufene Konformationsänderung des Peptids zu erklären (Reddehase 1991, Rock & Goldberg 1999, Knuehl 2001).
Das Proteasom als Proteasekomplex spielt, wie bereits mehrfach erwähnt, eine entscheidende Rolle in der Prozessierung von MHC Klasse I- Liganden (Rock 1994, Chiechanover 1998). Um einen näheren Einblick in die Antigenprozessierung zu erhalten, wurden verschiedene epitopflankierende Polypeptide synthetisiert und deren Abbau durch Proteasomen untersucht. Auf diesem Wege konnte gezeigt werden, dass 20S Proteasomen in vitro aus 25-40mer Peptiden spezifische Epitope prozessieren. Dieses Resultat wurde durch mehrere experimentelle Ansätze in seiner Gültigkeit bekräftigt, in denen Polypeptide durch Minigene in Mauszellen transfiziert wurden. Die peptidspezifische zytotoxische T- Zellantwort dieser Zellen war der mit spezifischen Peptidsequenzen (durch 20S in vitro generierte Epitope) von extern beladenen Zellen annähernd identisch (Eggers 1995). In
IFNγ stimuliert im Rahmen der Immunantwort, wie in Abb. 11 dargestellt, einerseits die Synthese von PA28, andererseits die Umwandlung von konstitutiven 20S Proteasomen in Immunoproteasomen. Das pp89-Epitop wird in Anwesenheit von PA28 beschleunigt vom Proteasom generiert, jedoch ändert sich das Verhältnis der verschiedenen Abbauprodukte unter diesen Bedingungen nicht wesentlich (Dick 1996, Groettrup 1996). In Anwesenheit von Proteasomeninhibitoren hingegen wurde eine verminderte Präsentation von pp89-Epitopen auf MHC Klasse I- Molekülen auf der Zelloberfläche infizierter Zellen beobachtet.
In verschiedenen Experimenten wurde gezeigt, dass einige der MHC- Liganden präzise vom Proteasom generiert werden, also keiner zusätzlichen enzymatischen Peptidabspaltung bedürfen (Lucchiari-Hartz 2000, Niedermann 1999). Allerdings demonstrieren Analysen des Transports von Peptiden in das ER, dass zum Beispiel das immunodominante Epitop des mCMV pp89 lediglich in Form eines N- terminal elongierten 11mers vom TAP ins ER transportiert wird. Die epitoptragenden 11mere werden demnach ebenfalls vom Proteasom generiert. Ursache für den nicht erfolgenden Transport des 9mer Epitops ins ER ist anscheinend das Prolin an Position 2 (Knuehl 2001, Neisig 1995, Neefjes 1995, van Endert 1995). Die Identifizierung einer IFNγ- abhängigen Peptidase, der Leucin- Aminopeptidase (Synonym ERAP1) unterstützt diese Vermutung (vgl. Abb. 11). Dieses Bestatin- empfindliche Enzym ist für die N- terminale Hydrolyse von Aminosäuren im ER verantwortlich, unter IFNγ- Zusatz zu Zellen kann eine beschleunigte Prozessierung von 8mer- aus 11mer-Peptiden beobachtet werden (Beninga 1998).
Des Weiteren zeigten Analysen der Generierung des Ovalbuminepitops SIINFEKL, dass hauptsächlich N- terminal verlängerte Varianten als Precursor dieses 8mers nach proteasomalem Verdau entstehen. Das Proteasom ist damit für den Schnitt am C- Terminus verantwortlich. Somit wird die entsprechende AS des spezifischen MHC Klasse I- Haplotyps, die als Ankerrest bezeichnet wird, vom Proteasom am C-Terminus generiert. Die proteasomale Funktion beruht vielmehr auf einem schnellen Abbau von Proteinen zu Aminosäuren als in einer genauen Generierung von spezifischen MHC Klasse I- Liganden. Diese werden vom Proteasom als 10-12mer Peptide generiert und überwiegend durch im ER lokalisierte Amino- Exopeptidasen hydrolysiert (Cascio 2001, Lauvau 1999).
Ein weiterer Mechanismus des „viralen Escape“ ist durch die Charakterisierung des murinen Glykoproteins gp48 (m06 Gen) aufgezeigt worden. Dieses Protein bildet einen festen Komplex mit dem peptidbeladenen MHC Klasse I- Molekül und bewirkt einen raschen lysosomalen Abbau des MHC Klasse I/gp48- Komplexes. gp48 inhibiert auch die Antigenpräsentation gegenüber pp89-spezischen, H-2Ld-restringierten zytotoxischen T-Lymphozyten (Rensch 1999).
Im Rahmen der zellulären Immunabwehr präsentieren körpereigene Zellen intrazelluläre Pathogene, die an spezifische MHC Klasse I- Moleküle binden und auf der Zelloberfläche der Erkennung durch spezifische zytotoxische T-Lymphozyten zugängig werden. Diese intrazellulären Pathogene sind endogenen Ursprungs. Von besonderer Bedeutung für den Organismus sind virale Proteine, die im Allgemeinen Syntheseprodukte infizierter Zellen sind. Deren Prozessierung zum antigenen Peptid, d.h. dem spezifischen Epitop, wird in starkem Maße einer ATP-abhängigen Protease, dem Proteasom zugeschrieben, dessen Inhibition zu einer Blockade der MHC- Assemblierung infolge reduzierter Peptidgeneration führt (Rock 1994). Die optimale Antigenprozessierung bedarf vielfältiger regulatorischer Ereignisse wie der Assemblierung von Immunoproteasomen oder dem Einfluss von PA28- und 19S-Komplexen.
Ein vom mCMV abstammendes, durch das Proteasom generiertes antigenes, virales Peptid ist das 9mer Epitop yphfmptnl des pp89. Seine Präsentation auf der Zelle wird unter Einfluss von PA28 verstärkt, jedoch bewirken Immunoproteasomen und PA28 keine drastische Änderung der Peptidqualität bzw. des Verhältnisses der generierten Peptide (Dick
Die Zugabe von Proteasomeninhibitoren zu Zellkulturen resultierte in einer verringerten Präsentation des H-2Ld- restringierten Epitops. Dies führt unter anderem zur Akkumulation von ubiquitinierten Substraten. Ubiquitin stellt ein konserviertes Abbausignal von Proteinen dar, seine Bindung an den 19S Regulator des 26S Proteasoms initiiert die Degradation des Substrats. Bisher konnte jedoch kein Nachweis erbracht werden, dass der Abbau von pp89 in vivo Ubiquitin- abhängig abläuft. Dementsprechend sollte der zelluläre Abbau des Proteins in Zellen, die stabil mit pp89 transfiziert wurden, analysiert werden. Dabei sollte insbesondere die Rolle von Ubiquitin im proteasomalen Substratabbau des pp89 untersucht werden und der Nachweis potentiell vorliegender Ubiquitin-Protein-Konjugate erbracht werden.
Die Möglichkeit eines zum Ubiquitin alternativen Degradationsignals konnte unter anderem für den Antizym- abhängigen Abbau der Ornithindecarboxylase nachgewiesen werden (Murakami 1992). In der Sequenz der ODC sind so genannte PEST- Motive enthalten, die als alternative Abbausignale diskutiert werden. Im Rahmen dieser Arbeit wurde deshalb alternativ auch ein ODCpp89- Fusionsprotein exprimiert und dessen ATP-abhängiger Abbau durch das 26S Proteasom besonders bezüglich der Generierung des 9mer Epitops untersucht.
Material:
PCR-Maschine UNO Block (Biometra), Oligonukleotide (BioTeZ Berlin-Buch GmbH)
PCR-Ansatz (50µl):
1µl DNA (10ng/µl)
je 1µl Oligonukleotid (100pmol/µl)
5µl 10 x PCR-Puffer + MgCl2
2.5µl dNTP (2.5mM)
8µl Betain (10mM)
0.5µl Taq-Polymerase
Ansatz in 0.5ml Eppendorf- Tubes, mit 50µl Mineralöl überschichtet
PCR-Bedingungen: Denaturierung der DNA und der Oligonukleotide für 5min bei 95°C,
30 Zyklen: 1min 95˚C; 1min 60˚C; 1.5min 72˚C; im Anschluss 10min 72˚C.
Im ersten Schritt wird die isolierte RNA mittels der reversen Transkription von mRNA in cDNA umgeschrieben und dann in einer Standard PCR amplifiziert. Diese Methode erlaubt die indirekte Quantifizierung der RNA.
Material:
PCR-Maschine UNO Block (Biometra), High Pure RNA Isolation Kit (Roche),
M-MuLV (Moloney Murine Leukemia Virus) Reverse Transkriptase (Promega),
2μg RNA (in DEPC-H2O)
1μl Oligo- dT- Primer (50pmol/μl)
DEPC-H2O auf 14.5μl
Denaturierung der RNA für 10min bei 65°C, danach für 2min in Eis abkühlen.
5µl First Strand Buffer
0.5µl rRNasin
5µl 10mM dNTPs
2.5µl 100mM DTT
1µl M-MuLV RT
Der RT- Ansatz wurde für 1h bei 42°C inkubiert und die M-MuLV Reverse Transkriptase anschließend für 2min bei 95°C denaturiert. Die einsträngige cDNA wurde direkt in der anschließenden PCR- Reaktion eingesetzt.
DNA-Fragmente wurden elektrophoretisch im Agarosegel (1% Agarose in TBE) aufgetrennt. Unter Zugabe von Ethidiumbromid konnte die DNA mittels UV-Licht visualisiert werden.
Lösungen:
10 x TBE: 108g Tris, 55g Borsäure, 20ml 0.5M EDTA pH 8, Milli Q ad 1l
Für die Isolation von DNA-Fragmenten aus dem Agarosegel wurde der QIAquick Gel Extraction Kit (Qiagen) bzw. der GFXTMPCR DNA and Gel Band Purification Kit (Amersham) verwendet.
Die Bestimmung der DNA- bzw. RNA-Konzentration einer Probe erfolgte durch Messung der Absorption bei 260nm. A260=1 Doppelstrang- DNA entsprechen 50mg/ml DNA, A260=1 Einzelstrang- RNA entsprechen 40mg/ml RNA.
Die Restriktionsverdaus wurden mit Enzymen und entsprechenden 10 x Puffern der Firma Biolabs durchgeführt. Eine Einheit Enzym verdaut 1µg DNA in einer Stunde (bei optimalen Temperatur- und Pufferbedingungen). Es wurden 30μl, 50μl oder 100μl Verdauansätze durchgeführt. Die Restriktionsenzyme wurden einer Hitzeinaktivierung nach Protokoll unterzogen oder die DNA- Fragmente aus dem Agarosegel (vgl. 2.2.1.4) extrahiert.
Bei ungerichteten Klonierungen (Schnittstelle am 5´- und 3´-Ende identisch) wurde die Vektor- DNA nach dem Restriktionsverdau an den 5'-Enden dephosphoryliert. Hierzu wurden 20µl Restriktionsansatz in 100µl Volumen in 2 sequentiellen Zyklen mit je 2 Einheiten
Äquimolare Mengen Insert- und Vektor- DNA (ca. 250ng) wurden in einem Volumen von 20µl (2µl 10 x Ligationspuffer, 2U T4 DNA- Ligase (Roche)) für 16h bei 14°C ligiert oder mit Hilfe von LigaFastTM Rapid DNA Ligation System (Promega) 1h bei Raumtemperatur.
Lösungen:
TFB1 (pH 5.8): 100mM RbCl, 50mM MnCl2, 30mM KAc, 10mM CaCl2, 15% Glycerol
Einstellung des pH-Wertes mit 0.2M Essigsäure auf pH 5.8, steril filtriert
TFB2 (pH 6.5): 10mM MOPS, 10mM RbCl, 75mM CaCl
2
, 15% Glycerol
Einstellung des pH-Wertes mit KOH auf pH 6.5, steril filtriert
Durchführung:
Aus einem DH5α- bzw. BL21-Glycerinstock wurde auf eine LB- Agarplatte ausgestrichen, Inkubation bei 37˚C über Nacht. Am nächsten Tag wurden 5ml LB mit einer Einzelkolonie beimpft und über Nacht bei 37˚C geschüttelt. 100ml LB wurden auf 37˚C vorgewärmt und mit 2ml Übernachtkultur angeimpft. Die Kultur wurde bis zu einer A600 von 0.5 unter Schütteln bei 37˚C inkubiert. Dann wurde die Kultur 5min auf Eis gekühlt und anschließend 5min bei 4000 rpm und 4˚C in der Sorvall zentrifugiert (SS-34 Rotor). Im Anschluss Resuspendieren der Zellen in 40ml eiskaltem TFB, 1.5 min auf Eis stehengelassen, 5min bei 4000 rpm und 4˚C in der Sorvall zentrifugiert. Entfernen des Überstandes, resuspendieren des Pellets in 4ml eiskaltem TFB2. Inkubation 15min auf Eis. Die Zellen wurden in gekühlte Eppendorf-Tubes á 50µl aliquotiert auf Trockeneis schock gefroren und dann bei -70˚C gelagert.
Material:
Lösungen:
LB Medium (1l): 10g Baktotrypton, 5g Hefeextrakt, 10g NaCl
LB Agar (1l): 10g Baktotrypton, 5g Hefeextrakt, 10g NaCl, 15g Agar
Ampicillin- Stammlösung: 50mg/ml Ampicillin
Durchführung:
Die Zellen wurden auf Eis aufgetaut. Nach Zugabe von 5-10µl Ligationsansatz oder anderer Plasmid- DNA (2ng), wurde der Transformationsansatz 20min auf Eis inkubiert. Anschließend wurde ein Hitzeschock von 2min bei 42˚C durchgeführt und nochmals 5min auf Eis inkubiert. Es wurde 1 ml LB Medium zugegeben und 1 h bei 37˚C leicht geschüttelt. Dann wurden die Zellen bei 2000rpm 3min pelletiert und in einem Volumen von 100 bis 200µl auf einer LB- Amp- Agarplatte ausplattiert. Inkubation über Nacht bei 37
°
C.
„Mini-Präp”
Zur Analyse der Klone aus der Transformation wurden von LB- Amp- Agarplatten Einzelkolonien gepickt und über Nacht in 3ml LB- Amp- Medium bei 37˚C unter Schütteln kultiviert. Die Plasmidisolation erfolgte mit dem QIAGEN Spin Kit. Die Plasmid- DNA aus 1.5ml Kultur wurde in 50µl Aqua dest. aufgenommen, 5-10µl wurden für die Analyse im Restriktionsverdau eingesetzt.
„Easy-Präp“
Alternativ wurde die Aufreinigung der Plasmid- DNA nach folgendem Protokoll realisiert: Das Zellpellet einer 1.5ml E. coli Kultur wurde in 50μl Lysepuffer: 15mM Tris HCl pH 8.0, 1mM EDTA pH 8.0, 15% Sucrose, 2mg/ml Lysozym, 0.2 mg/ml RNase A, 0.1mg/ml BSA für 5min bei Raumtemperatur resuspendiert. Nach einminütigem Kochen wurden die Proben für 1min im Eis gekühlt, woran sich 20min Zentrifugation bei 14000rpm anschloss. Der Überstand wurde in ein frisches Eppendorfgefäß transferiert, die DNA mit 50 μl Isopropanol für 5min gefällt und 15min bei 14000rpm pelletiert. Daraufhin erfolgte ein Waschschritt mit 70% Ethanol und eine erneute Zentrifugation. Das DNA- Pellet wurde in 50μl A. dest. gelöst.
„Midi Präp”
Für die Amplifizierung von Vektor- DNA wurde eine Einzelkolonie in 5ml LB- Amp- Medium über Nacht bei 37˚C unter Schütteln inkubiert. 100ml LB- Amp- Medium wurden mit 100μl der Kultur beimpft und über Nacht bei 37˚C inkubiert. Die Isolation der Plasmid- DNA erfolgte mit dem Qiagen Plasmid Midi Kit.
Die Bestimmung der Proteinkonzentration erfolgte durch Absorptionsmessung bei 280 nm. Dabei wurde eine Absorptionseinheit mit 1µg/µl Protein kalkuliert.
Alternativ kam die Proteinbestimmung nach Bradford zur Anwendung, die Eichkurve wurde mit BSA hergestellt.
Photometer
Lösungen:
Bradford- Reagenz (BioRad), Proteinstandardlösung: BSA (10mg/ml),
0.9% NaCl in A. dest., pH7.5
Durchführung:
5μl der zu untersuchenden Probe wurden mit 795μl 0.9% NaCl verdünnt und 200μl Bradford- Reagenz hinzu gegeben. Die Proben werden gemixt (Vortexer) und bei 595 nm die Extinktion gemessen. Mit Hilfe der Eichkurve wurden die finalen Proteinkonzentrationen ermittelt.
Die Präzipitation von Proteinen erfolgte durch Zugabe von 50% Trichloressigsäure (w/v; Endkonzentration 10%) und 1% Natriumdesoxycholat (Endkonzentration 0.1%). Die Proben wurden anschließend auf Eis für 30min inkubiert. Nach 15min Zentrifugation bei 4˚C und 14000rpm, wurde zweimal mit je 1ml eiskaltem 70% Ethanol gewaschen und jeweils 10min zentrifugiert. Anschließend wurden die Proteinpellets in SDS-Probenpuffer resuspendiert.
Material:
Minigelsystem BIORAD
Lösungen:
10 x SDS-Laufpuffer: 30.25g Tris HCl, 142.5g Glycin, 10g SDS
2 x SDS Probenpuffer: 40% Glycerol, 6% w/v SDS, 0.02M Tris HCl pH 7, 0.1% w/v Bromphenolblau, 6% β- Mercaptoethanol
Acrylamidlösung: "rotiphorese Gel 30" (30% Acrylamid, 0.8% Bisacrylamid, w/v) Roth
4 x Sammelgelpuffer: 250mM Tris HCl pH 6.8, 0.8% w/v SDS
4 x Trenngelpuffer: 150mM Tris HCl pH 8.8, 0.4 % w/v SDS
Elektrophoresepuffer: 25mM Tris, 190mM Glycin, 0.1% w/v SDS
Molekulargewichtsstandard
Rainbowmarker (Amersham):
„high molecular weight marker”, 14.3 – 21.5 – 30 – 46 – 66 – 97.4 – 220 kDa
Prestained Marker (Biolabs):
„prestained protein marker, broad range“, 6.5 – 16.5 – 25 – 32.5 – 47.5 – 62 – 83 – 175kDa
Durchführung:
Die gelelektrophoretische Auftrennung von Proteinen erfolgte in unterschiedlich konzentrierten Acrylamidgelen.
15%iges Trenngel (Ansatz für 2 x 0.75mm Gele):
5.6ml Acrylamidlösung, 2.8ml 4x Trenngelpuffer, 2.8ml A. dest., 30µl 10% APS,
8%iges Trenngel (Ansatz für 1 großes 0.75 mm dickes Gel):
9.9ml Acrylamidlösung, 7.5ml 4x Trenngelpuffer, 12.6ml A. dest., 180µl 10% APS, 18µl TEMED
4.5%iges Sammelgel:
0.75ml Acrylamidlösung, 1.25ml 4x Sammelgelpuffer, 1.75ml A. dest., 15µl 10% APS, 1.5µl TEMED
Nach Zugabe von 2x Probenpuffer wurden die Proben für 5min bei 95˚C im Heizblock erhitzt und anschließend 1min bei 13000rpm zentrifugiert.
Die Gelelektrophorese erfolgte bei einer Spannung von maximal 120 V.
Material:
Semi dry- Blotkammer (pEQLAB)
WHATMAN Papier
Immobilon® Membran (Millipore)
Lösungen:
Transferpuffer: 2,4g Tris; 11,3g Glycin; 200ml Methanol; 800ml A. dest. (pH 8.1)
Coomassiefärbung für Immobilon Membran: 1% Coomassie R250 in 50% MetOH
Ponceau- Rot: 0.2% w/v in 3% TCA (Sigma), Entfärbung mit Wasser
Transfer-Aufbau (Semidry):
Durchführung:
Der Proteintransfer erfolgte innerhalb 1h bei 400mA. Die Transfereffizienz wurde durch Färbung der Membran entweder mit Ponceau- Rot- Lösung oder Coomassiefärbung nachgewiesen, Entfärbung im Anschluss mit A. dest., respektive Entfärber (50% Methanol). Der Molekulargewichtsstandard wurde zur späteren Identifizierung markiert.
Lösungen:
1 x PBS: 140mM NaCl, 2.7mM KCl, 10mM Na2HPO4, 1.8mM KH2PO4, pH 7.3
TBS-Tween/Triton-Puffer: 1 x TBS, 500mM NaCl, 0.05% Tween20, 0.2% TritonX-100, pH 7.5 (Waschpuffer für His-Antikörper)
Blocklösung: PBS, 5% w/v Magermilchpulver, 10% Pferdeserum, 0.2% TWEEN-20, für His- Antikörper: TBS, 3% w/v BSA
Waschlösung (PBS/T): PBS, 0.1% TWEEN-20
1. Antikörper (PBS/T): entsprechende Verdünnung in PBS, 5% w/v Magermilchpulver, 0.1% TWEEN-20, anti-His Antikörper wurden in TBS, 3% w/v BSA suspendiert
2. Antikörper: Peroxidase- gekoppelter Antikörper „Ziege anti Kaninchen IgG" (DIANOVA) 1:10000 verdünnt in PBS/T, 5% w/v Magermilchpulver; Peroxidase- gekoppelter Antikörper „Kaninchen anti Maus IgG“ (DIANOVA) 1:10000 in TBS, 10% w/v Magermilchpulver
ECL- Reagens: 20ml 100mM Tris HCl pH 8.5 + 44µl 90mM Coumarinsäure + 100µl 250mM Luminol (3-Aminophtalhydrazid in DMSO) + 6µl 30% H2O2
Durchführung:
Zur Absättigung der unspezifischen Bindungsstellen wurde die Immobilon Membranen für 1h in Blocklösung bei Raumtemperatur inkubiert. Die Inkubation der Membran mit der 1. Antikörperlösung erfolgte über Nacht bei 4 °C oder über 1h bei Raumtemperatur. Nach viermaligem Waschen der Membran für je 10min mit PBS/T erfolgte die Inkubation mit der 2. Antikörperlösung während 1h bei Raumtemperatur. Danach wurde wiederum viermal mit PBS/T je 10min gewaschen. Ein zehnminütiger Waschschritt mit 1 x PBS schloss sich an. Die Peroxidasereaktion wurde in der Dunkelkammer durchgeführt. Dazu wurde die Membran 1min in ECL- Reagens inkubiert und anschließend luftblasenfrei in Folie verpackt. Die Reaktion wurde mittels Röntgenfilm (XOMAT-UV von KODAK) detektiert.
Lösungen:
Färbelösung: 10% Methanol, 40% Eisessig, 0.25% w/v Coomassie R250, (Farbstoff in Methanol über Nacht lösen, filtrieren)
Entfärber: 10% Eisessig, 40% Methanol
Durchführung:
Nach der elektrophoretischen Auftrennung der Proteine wurden die SDS- Polyacrylamidgele 30min gefärbt, anschließend für 60min entfärbt. Die Gele wurden innerhalb von 2h bei 60°C getrocknet.
Zur Überprüfung der Aktivität der gereinigten 20S- bzw. 26S-Proteasoms wurde je 1μg Proteasom mit Bromphenolblau versetzt und anschließend auf ein PhastGel aufgetragen. Die Proteine wurden bei 110Vh getrennt, die Gele im Verlauf einem Substrat- Overlay mit 100μM Bz-VGR-AMC in 50mM Tris HCl pH 8.5 unterzogen (2ml overlay, Inkubation für
Material:
Bioradsäule 20ml, Spectra Por® Membrane (Spectrum), Ni- NTA- Agarose (Qiagen)
Lösungen:
LB-Medium, 50mg/ml Ampicillin- Stammlösung, 1M IPTG, 100mM PMSF (in 100% Isopropanol), Proteinaseinhibitor- Cocktail Complete® (Roche), Nickel- NTA- Agarose (Qiagen)
PBS: 140mM NaCl, 2.7mM KCl, 10mM Na2HPO4, 1.8mM KH2PO4, pH 7.3
Lysepuffer: 6M Gua HCl, 0.1M NaH2PO4, 0.01M Tris HCl, 15mM β- Mercaptoethanol, 1% Tween 20, pH 8.0
Waschpuffer A: 8M Harnstoff, 0.1M NaH2PO4, 0.01M Tris HCl, pH 6.3
Waschpuffer B: 8M Harnstoff, 0.1M NaH2PO4, 0.01M Tris HCl, 1.5M NaCl,1% Tween 20, pH 6.3
Elutionspuffer: 8M Harnstoff, 0.1M NaH2PO4, 0.01M Tris HCl, pH 4.5
Dialysepuffer: 0.5M Harnstoff, 0.01M Tris HCl, pH 7.5
Durchführung:
Von einer LB- Amp- Agarplatte wurden transformierte Einzelkolonien gepickt und über Nacht in 3 ml LB- Amp- Medium bei 37 ˚C unter Schütteln kultiviert. Danach wurde eine 500ml LB-Lösung mit der Kultur angeimpft und bei 37°C bis zu einer OD von etwa 0.4-0.5 geschüttelt. Nun erfolgte die Induktion der Genexpression durch Zugabe von 1mM IPTG, weiterhin wurde 1mM PMSF zur Inhibition von Proteasen hinzu gegeben. Nach 2stündiger Expression bei 37°C wurden die Zellen durch eine Zentrifugation für 10min, bei 4°C und 6000rpm pelletiert, im Anschluss mit 10ml PBS gewaschen und erneut zentrifugiert. Die Lyse der Bakterien erfolgte bei Raumtemperatur für 30min durch Resuspension in 14 ml Lysepuffer unter gleichzeitiger Zugabe von 1.5ml Proteinaseinhibitor- Cocktail. Nach 25min Zentrifugation bei 12500rpm wurde der Überstand zu 2ml 50% Ni- NTA- Agarose Suspension transferiert. Die Bindung des His- getaggten Proteins erfolgte innerhalb 1h bei Raumtemperatur. Dieses Gemisch wurde in eine Bioradsäule überführt. Die ungebundenen Proteine wurden mittels SDS-PAGE analysiert. Die Nickelagarose wurde wie folgt gewaschen, um unspezifisch gebundene Proteine zu entfernen: 15ml Waschpuffer A, 15ml Waschpuffer B, 2 x 15ml Waschpuffer A. Das His- getaggte Protein wurde unter Zugabe von 10ml Elutionspuffer von der Nickelagarose eluiert. Das Eluat wurde dann gegen 2l Puffer für 16h bei 4°C dialysiert.
Die N- terminalen Proteinsequenzierungen (Edman- Abbau) sowie der tryptische Verdau des rekombinanten pp89 mit anschließender Massenspektrometrie wurden von Frau Dr. R. Kraft (MDC, Berlin-Buch) durchgeführt.
Das CD- Spektrum für das rekombinante pp89 wurde in Zusammenarbeit mit Frau Dr. M. Dathe und Frau H. Nikolenko aus der AG Peptidchemie am FMP in Berlin- Buch aufgenommen (Jasco J-720 Spektrometer). Das Protein wurde dazu erneut gegen 10mM Tris HCl, pH 7.5 dialysiert und bei einer Endkonzentration von 1.8·10-5M analysiert. Die Sekundärstruktur wurde mit dem Deconvolutionsprogramm CDNN bestimmt (Böhm 1992).
Material:
French® Pressure Cell Press (SLM-Aminco) , Bioradsäule 20ml, S&S Biotrap® Elektroelutionskammer (Schleicher & Schnell), Centricon® Plus-50 (Millipore), Ni- NTA- Agarose (Qiagen)
Lösungen:
LB-Medium, 50mg/ml Ampicillin- Stammlösung, 1M IPTG, 100mM PMSF (in 100% Isopropanol), Proteinaseinhibitor- Cocktail Complete® (Roche), Nickel- NTA- Agarose (Qiagen), 0.3M CuCl2 in A. dest., PBS pH 7.3
Lysepuffer: 8M Harnstoff, 0.1M NaH2PO4, 0.01M Tris HCl, pH 8.0
Waschpuffer: 8M Harnstoff, 0.1M NaH2PO4, 0.01M Tris HCl, pH 6.3
Elutionspuffer:8M Harnstoff, 0.1M NaH2PO4, 0.01M Tris HCl, pH 5.0
Elektroelutionspuffer: 25mM Tris HCl, 192mM Glycin, 0.025% SDS, 0.5M Harnstoff, pH 8.6
Durchführung:
Die Kultur der Bakterien und Expression des Fusionsproteins erfolgten wie oben erläutert (insgesamt 1500ml Bakteriensuspension, 3h Expression bei 37°C). Nach dem Waschen des Pellets mit 1 x PBS wurde unter Zugabe von Proteaseinhibitoren selbiges mit 20ml Puffer lysiert und die Zellen zusätzlich drei aufeinander folgenden Zyklen eines Aufschlusses mittels French Press unterzogen. Nach Zentrifugation (13000rpm, 15 min) erfolgte die Bindung des Fusionsprotein für 1.5h an 2ml Ni- NTA- Agarose. Das Gel wurde im Verlauf mit 4 x 15ml Waschpuffer von unspezifisch gebundenen Proteinen gereinigt. Das His- getaggte Protein wurde mit 20ml Elutionspuffer extrahiert. Das Eluat wurde mit Hilfe eines Centricon® Plus-50 (Millipore) auf ein Volumen von etwa 1ml eingeengt, wobei niedrigmolekulare koeluierte Proteine bereits abgetrennt wurden. Das konzentrierte Eluat wurde dann vollständig in einer SDS-PAGE (10%ige Gele) aufgetrennt und die Gele im Anschluss mit CuCl2 gefärbt. Dazu wurde das Gel in A. dest. 3min gewaschen, dann für 5min in 0.3M CuCl2-Lösung inkubiert und anschließend mit A. dest. gespült. Die entsprechenden
Material:
French® Pressure Cell Press (SLM-Aminco), Bioradsäule 20ml, FPLC Äkta (Amersham Pharmacia), MonoQ- Säule (Pharmacia), Amylose- Resin (Biolabs)
Lösungen:
LB-Medium, 50mg/ml Ampicillin- Stammlösung, 1M IPTG, 100mM PMSF (in 100% Isopropanol), Amylose- Resin (Biolabs), PBS pH 7.3
Phosphatpuffer: Na2HPO4/ NaH2PO4 pH 7.0, 1mM PMSF, 1mM EDTA
Elutionspuffer: Na2HPO4/ NaH2PO4 pH 7.0, 1mM PMSF, 1mM EDTA, 10mM Maltose
Puffer A: 25mM Tris HCl, 100mM NaCl, 1mM DTT ad 1000ml Milli Q, pH 7.6, steril filtriert, entgast
Puffer B: 25mM Tris HCl, 1M NaCl, 1mM DTT ad 1000ml Milli Q pH 7.6, steril filtriert, entgast
Dialysepuffer: 10mM Phosphatpuffer, 100mM NaCl, 1mM EDTA, pH 7.4
Durchführung:
Die Proteinexpression erfolgte wie bereits bei unter 2.2.2.8 beschrieben. Für die Expression des Antizyms wurden 300ml Bakteriensuspension für 20h bei Raumtemperatur inkubiert. Nach Ernte der Zellen wurde das Pellet in 5ml Phosphatpuffer resuspendiert und einer Lyse in 4 konsekutiven Zyklen mittels French Press unterzogen. Dann erfolgte die Inkubation des zuvor zentrifugierten Überstands (10.000rpm, 4°C, 10min) mit 2ml eines 50%igen Amylose- Gels für 1h bei Raumtemperatur. Nach Überführung des Gemischs in eine Säule wurde das Gel mit 20ml Phosphatpuffer gewaschen. Durch Zugabe des Elutionspuffers (10ml) konnte das Antizym isoliert werden. Das Eluat wurde gegen 2l Puffer für 16h bei 4°C dialysiert. Das Dialysat wurde dann 1:2 mit Puffer A verdünnt und filtriert. Die Probe wurde über einen Superloop auf die MonoQ- Säule HR5/5 geladen und getrennt. Das Antizym wurde durch steigende Salzkonzentration (Puffer B bis 100%) mit einer Flussrate von 1ml/min eluiert. Die Peakfraktionen wurden gepoolt und rechromatographiert.
Material:
Erythrozytenkonzentrate (280-320ml), DEAE- Sephacel 17-0500-01 (Pharmacia)
Chromatographie-Säule Ø 2.5cm x 20cm (Biorad)
96-well Mikrotiterplatten (Greiner), Fluoreszenz - Mikrotiterplatten - Reader (SLT)
Diaflo Membranen XM300 AMICON Ausschlussgröße 300 kDa, Ø 43 mm (Millipore)
MonoQ- Säule HR5/5, FPLC Äkta (Amersham Pharmacia)
Lösungen:
1 x PBS: 140mM NaCl, 2.7mM KCl, 10mM Na2HPO4, 1.8mM KH2PO4, pH 7.3
10 x TEA:200mM Tris HCl, pH 7.2 (20°C), 10mM EDTA, 10mMNaAzid
Arbeitspuffer (= TEAD- Puffer): 1 x TEA,1mM DTT
Arbeitspuffer A: 1 x TEAD, 100mM NaCl, filtriert und entgast
Arbeitspuffer B: 1 x TEAD, 500mM NaCl, filtriert und entgast
Ammoniumsulfat, 10% Triton X-100
Saccharosegradient A: 10% Saccharose in 1 x TEAD-Puffer, 50mM NaCl
Saccharosegradient B: 40% Saccharose in 1 x TEAD-Puffer, 50mM NaCl
Assay- Puffer: 50mM TrisHCl, pH 7.8, 1mM DTT, 0.5mM EDTA
10mM Z-GGL-AMC (Substrat für chymotrypsinähnliche Aktivität) in DMF (Bachem)
Durchführung:
Die Präparation von 20 S Proteasomen erfolgte aus humanen Erythrozyten.
1. Zellaufschluss:
Die Erythrozytenkonzentrate wurden dreimal mit 1 x PBS gewaschen (Zentrifugation 12min, 980rcf, 4°C). Nach dem letzten Waschschritt wurde das Pellet im Verhältnis 1:2 in 1 x TEAD resuspendiert und 0.1% Triton X-100 zugegeben. Zur vollständigen Lyse der Zellen wurde die Suspension für 1h bei 4°C gerührt. Anschließend wurden die Membranen durch Zentrifugation abgetrennt (90min, 10000rpm, 4°C).
2. DEAE-Ionenaustauschchromatographie:
Etwa 50 ml des äquilibrierten DEAE- Sephacels wurden mit dem Lysat (dekantierter Überstand) über Nacht bei 4°C inkubiert. Die Gel-Suspension wurde in eine Chromatographie-Säule gefüllt und mit Puffer A (1 x TEAD, 100mM NaCl) gewaschen bis kein Protein mehr im Durchlauf erschien (Kontrolle mit Ponceau S). Im Anschluss wurden die noch gebundenen Proteine mit Puffer B (1 x TEAD, 500mM NaCl) in 15ml Fraktionen eluiert. Der Proteinnachweis erfolgte wiederum mit Ponceau S auf Nitrocellulose.
3. Proteasomen- Aktivitätsbestimmung (Mikrotiterplatten)
Das Substrat (Z-GGL-AMC) wurde frisch in den Assay- Puffer gegeben (20µM Endkonzentration). Jeweils 10µl Probe bzw. 10µl Wasser (Referenzwert) wurden in die Kavitäten einer schwarzen Mikrotiterplatte pipettiert. Dazu wurden 100µl Assay- Substrat-Puffer gegeben. Nach Inkubation dieses Reaktionsansatzes für 60 min bei 37°C erfolgte die Messung der Fluoreszenz der freigesetzten AMC- Gruppe bei einer Emissions-Wellenlänge von 460nm (Anregung bei 390nm) in einem Fluostar- Platten- Reader (SLT).Fraktionen hoher Aktivität wurden vereinigt und, wie unter 4. beschrieben, weiter bearbeitet.
Das 20S Proteasom fällt zwischen 38-75% Sättigung an Ammoniumsulfat aus. Zunächst wurde die Probe mit festem Ammoniumsulfat auf eine 35%ige Sättigung an Ammoniumsulfat eingestellt. Die Probe wurde in ein Eisbad gestellt und das Salz sehr langsam unter ständigem Rühren zugegeben. Anschließend wurde die Probe weitere 15min zur Gleichgewichtseinstellung gerührt und der Niederschlag bei 17000rpm für 10min abzentrifugiert. Das Proteasom wurde durch Zugabe von Ammoniumsulfat bis zu einer 75%igen Sättigung aus dem Überstand gefällt. Das gefällte Protein wurde durch Zentrifugation präzipitiert und der Niederschlag durch Zugabe von 750µl 1 x TEAD- und 50mM NaCl- Puffer gelöst (im Eisbad unter vorsichtigem Schwenken).
5. Saccharose- Dichtegradienten- Ultrazentrifugation und SDS-PAGE
Der Saccharosegradient wurde aus 10%- und 40%igen Saccharoselösungen (je 6.5ml) hergestellt. Der Gradient wurde vorsichtig mit der vollständig gelösten Probe (1ml) überschichtet. Die Ultrazentrifugation erfolgte über 16h bei 40000rpm, 4°C (SW 40-Rotor (Beckman-Coultern)). Die Gradienten wurden in 0.6ml Fraktionen in Eppendorf- Gefäße fraktioniert und die proteolytische Aktivität bestimmt. Die proteolytisch aktiven Fraktionen wurden vereinigt und einer Dialyse für 16h bei 4°C unterzogen (Dialysepuffer: 1 x TEAD, 100mM NaCl).
6. FPLC
Die dialysierten Proben wurden in Puffer A verdünnt und nicht- gelöstes Protein durch Filtration mit einem 0.2µm Filter entfernt. Die Probe wurde auf eine äquilibrierte Anionenaustauschersäule (MonoQ- Säule) mit einer Flussrate von 1ml/min aufgetragen. Anschließend wurde die Säule mit Puffer A gewaschen und die Proteine mit einem linearen NaCl- Gradienten eluiert (5ml: 0- 20% B, 20ml: 20-40% B, 2ml: 40-100% B, 5ml: 100% B, 2ml: 100-0% B, 5ml: 0% B). Während der Elution mit 20-40% Puffer B wurden 1ml Fraktionen gesammelt. Das 20S Proteasom befindet sich in den Fraktionen mit 30% des Puffers B (ca. 270mM NaCl). Die proteinhaltigen Fraktionen wurden erneut, wie unter 3. beschrieben, auf ihre proteolytische Aktivität getestet und bei 280nm (für Proteasom: OD280nmvon 1 entspricht 720μg/ml) quantifiziert. Die proteasomhaltigen Fraktionen wurden gepoolt. Die Reinheit des isolierten Proteasoms wurde in einer 15%igen SDS-PAGE mit anschließender Coomassiefärbung kontrolliert.
Die Aufreinigung von 26S Proteasomen erfolgte aus humanen Erythrozyten. An dieser Stelle sei Dr. B. Braun herzlich gedankt, die die Aufreinigung vorgenommen hat und das 26S Proteasom zur Verfügung stellte (Braun 1999, 65). 26S Proteasomen wurden aliquotiert und in flüssigem Stickstoff Schock gefroren und bei -70°C gelagert:
Puffer: 20mM Tris HCl, pH 7.2, 5mM MgCl2, 50mM KCl, 10% Glycerin, 0.5mM ATP
Die Aufreinigung von Immunoproteasomen und dem Proteasomaktivator PA28 erfolgte nach Kuckelkorn et al. (Kuckelkorn 2002). An dieser Stelle sei herzlich Frau Dr. U. Kuckelkorn und Frau I. Drung gedankt, die diese Proteasomkomponenten freundlicherweise zur Verfügung gestellt haben.
Material:
Ni- NTA- Agarose (Qiagen), Biorad- Säulen
Lösungen:
Lysepuffer: 8M Harnstoff, 0.1M Phosphatpuffer (Na2HPO4/ NaH2PO4),
pH 8.0, 5mM Imidazol
Waschpuffer: 8MHarnstoff, 0.1M Phosphatpuffer (Na2HPO4/ NaH2PO4),
pH 6.1, 5mM Imidazol
Proteinpuffer: 50mM Phosphatpuffer (Na2HPO4/ NaH2PO4), pH 8.0, 100mM KCl,
20% Glycerol, 0,2% NP40
Durchführung:
B8- Zellpellets wurden in 6ml Lysepuffer resuspendiert und 1h bei Raumtemperatur rotiert. Nach Trennung des Überstandes durch Zentrifugation wurde diesem 1.5ml Ni- NTA- Agarose zugegeben und dieser Ansatz für 16h bei 4°C geschüttelt. Nach Transfer in Säulen wurde das Gel wie folgt gewaschen: 3ml Lysepuffer, 8ml Waschpuffer, 4ml Lysepuffer, 3ml Lysepuffer/Proteinpuffer 1:1, 3ml Lysepuffer/Proteinpuffer 1:2, 3ml Lysepuffer/Proteinpuffer 1:3, 3ml Proteinpuffer + 10mM Imidazol. Eluiert wurden 4 Fraktionen á 1ml mit Proteinpuffer + 250mM Imidazol. Die Eluate wurden mit 10% TCA gefällt und mittels SDS-PAGE und Western blot analysiert.
Material:
pp89 Peptid (2µg/µl) 25mer Kloe 1: RLMYDM
YPHFMPTNL
GPSEKRVWMS
rekombinantes pp89
Lösungen:
10 x Verdaupuffer: 200mM HEPES, 20mM MgAc, pH 7.8
für 26S Proteasom Verdaus zusätzlich:40mM DTT, 25mM Mg-ATP, 400mM Kreatininphosphat, 50μg/ml Kreatininkinase
Durchführung:
Verdau von pp89 25mer (300 μ l Verdauansatz):
1µg 20S Proteasom, 10µg pp89 (25mer), 1 x Verdaupuffer, 2mM DTT
Inkubation bei 37˚C; Entnahme von je 40µl nach 0, 1h, 2 h, 8h und 20h, Stopp durch Zugabe von 3µl 1% TFA
3µg c20 S bzw. i20S Proteasom, 50µg pp89 (56kDa), 18µg PA 28,
1 x Verdaupuffer, 2mM DTT
Inkubation bei 37˚C; Entnahme von je 50µl nach 0, 0.5, 1, 2, 4, 8 und 20 h, Stopp durch Zugabe von 5µl 1% TFA
Wiederholung der Ansätze mit Inhibitoren: 1mM PMSF, 10µM MG132, 2µM Epoxomicin, 10µM AAF-CMK (Ala-Ala-Phe-Carboxymethylketon), je 1µl Pepstatin (0.7mg/ml), Leupeptin (1mg/ml), Aprotinin (2mg/ml), Bestatin (4mg/ml), Hemin (1mg/ml), Trypsininhibitor (10mg/ml), 50μM N-Ethylmaleinamid.
Verdau von rekpp89 mit 26S (450 μ l Verdauansatz):
4µg 26S Proteasom, 50µg pp89 (56kDa),1 x Verdaupuffer, 2mM DTT, 5mM Mg-ATP, 5mM Kreatinphosphat, 50ng/µl Kreatinkinase
Inkubation bei 37˚C; Entnahme von je 50µl nach 0, 0.5, 1, 2, 4, 8 und 20 h, Stopp durch Zugabe von 5µl 1% TFA
Lösungen:
1M Tris HCl, pH 7.4, 1M MgCl2, 0.2M DTT, 100mM ATP, 0.5M Kreatinphosphat,
50μg/ml Kreatinkinase
Durchführung:
Für den Verdau und die anschließende massenspektrometrische Analyse des ODCpp89-Fusionsproteins soll die finale Glycerolkonzentration unter 2%, die finale Salzkonzentration unter 50mM liegen und das stöchiometrisches Verhältnis von Antizym zu ODC etwa 5:1 betragen. Das 26S Proteasom wurde in Tris HCl Puffer und 10% Glycerol bei -80°C gelagert.
Verdauansatz: 40mM Tris HCl, pH 7.4, 5mM MgCl2, 2mM DTT, 1mM ATP,
10mM Kreatinphosphat, 50ng/μl Kreatinkinase,
10nM 26SProteasom (13.4μg), 50nM ODCp89 Fusionsprotein (4μg), 11μg Antizym
Die Wiederholung der Ansätze erfolgte unter Zugabe von 10μM MG132 oder 2μM Epoxomicin. Insgesamt hatten die Proben ein Volumen von 80μl pro Ansatz. Der Verdau wurde bei 37°C durchgeführt. Nach 0, 4 und 20h wurden jeweils 25μl entnommen und die Reaktion mit 2.5μl 1% TFA gestoppt.
Material:
HPLC System Gold, Detektor 166 (Beckman-Coulter),
HPLC Säule: Micra NPS ODS-I 1,5 μm Säule, PC 33x4.6 mm (Bischoff chromatography)
Lösungen:
Puffer A: 0.1% Trifluoressigsäure (TFA) in Wasser (v/v), entgast
Puffer B: 0.1% TFA in Acetonitril (v/v), entgast
Ein 20µl Aliquot der jeweiligen proteasomalen Verdaus (0 bzw. 20h) wurde mittels einer RP-HPLC über eine NPS RP18 1.5µm Säule (MICRA) getrennt.
Flussgeschwindigkeit: 0.2ml/min auf 1ml/min (2min), dann 1ml/min;
Gradient: 0-5min 5% B; 5-20min linear auf 30% B; 20-22min von 30% auf 100% B;
22-24min 100% B; 24-26min linear auf 0% B;
26-30min Reäquilibrierung bei 0% B
Die Detektion erfolgte bei 220 nm.
Die Analyse der Proben wurde freundlicherweise von Dr. K. Janek durchgeführt. 30μl der Verdauansätze wurden mittels RP-HPLC aufgetrennt (Hewlett Packard 1100 ausgestattet mit einer μRPC C2/C18 SC 2.1/10 Säule, PHARMACIA). Eluent A: 0.05% TFA in Wasser; Eluent B: 70% Acetonitril in Wasser, 0.05% TFA; Gradient: 5-95% Eluent B in 15min; Flussrate 70 μl/min; die aufgetrennten Peptidfragmente wurden direkt am Tandemquadrupol Massenspektrometer (ESI electrospray ion source TSQ 7000, Finnigan MAT) gemessen (m/z=300-1300 in 3 s).
C4: embryonale Fibroblastenzelllinie aus BALB/c Mäusen generiert
B8: C4 Zellen, stabil transfiziert mit MCMV IE1-Gen, Expression von pp89,
Antibiotikaresistenz: 250 µg/ml G-418 Sulfat (Gibco BRL)
P815: Tumormastzelllinie mit H-2d Hintergrund
Basal Iscove Medium, RPMI- Methionin- freies Medium, Trypsin/EDTA- Lösung, Kalzium-Magnesium freies Medium (Ca++- Mg++- freies Medium)
Iscove Medium komplett: 10% FCS, 100mg/ml Penicillin/Streptomycin, 2mM L-Glutamin
Einfriermedium: Iscove Medium mit 30% FCS, 10% DMSO
2 x HBS Puffer: 280mM NaCl, 10mM KCl, 1.5mM Na2HPO4, 12mM Dextrose, 50mM Hepes pH 7.05, steril filtriert, Aliquots bei -20°C gelagert
Antibiotikastammlösungen: G-418 Sulfat 100mg/ml (GibcoBRL)
Die Zellen wurden im Brutschrank bei 37ºC, 5% CO2 und 95% Wasserdampf kultiviert. Das Ablösen der Zellen vom Boden der Kulturschale erfolgte nach einmaligem Waschen mit 1 x PBS durch Trypsinierung mit Trypsin / EDTA- Lösung (GibcoBRL) oder durch Zugabe von Kalzium-, Magnesium- freiem Medium. Zentrifugationen wurden bei 200 x g und 4ºC für 5min ausgeführt.
1-2 x 106 Zellen/ml wurden pelletiert und in eiskaltes Einfriermedium aufgenommen, anschließend in Einfrierröhrchen überführt und in einer eisgekühlten Isopropanol- Einfrierbox (Nalgen) für mindestens 2h bei -70ºC progressiv (1ºC/min) gefroren. Die Langzeitlagerung erfolgte in flüssigem Stickstoff. Das Auftauen erfolgte unter leichtem Schwenken im 37ºC Wasserbad. Die Zellen wurden in ein Röhrchen (15ml) überführt, tropfenweise wurden 10ml eiskaltes Iscove Medium zugegeben, anschließend zentrifugiert und die Zellen in frischem Medium in 6 oder 10cm Schalen kultiviert.
Jeweils 10µg Plasmid- DNA, die das zu transfizierende Gen kodieren (bei transienten Transfektionen ohne Resistenzgen, bei stabilen in Anwesenheit eines Resistenzgens für die spätere Selektion), wurden mit 2.5Vol 96%igem Ethanol und 0.1Vol 3M NaCl für 30 min bei
-20 °C gefällt und 10min bei 4°C, 14000rpm zentrifugiert. Danach wurden die Pellets mit 1.5ml 70%igem Ethanol gewaschen und einem weiteren Zentrifugationsschritt unterzogen. Nach Dekantieren des Ethanols erfolgte eine Lufttrocknung der Pellets unter der sterilen Arbeitsbank. Anschließend wurde die DNA in 219µl sterilem A. dest. resuspendiert und nach Zugabe von 31µl 2M CaCl2 in ein 5ml Polypropylenröhrchen überführt. Danach wurden unter sehr langsamem Mischen auf dem Vortexer 250µl 2 x HBS- Puffer zugetropft (innerhalb 1min, die Tropfen wurden gegen die Röhrcheninnenwand pipettiert). Das Gemisch wurde 30min bei Raumtemperatur inkubiert und dann tropfenweise in das Medium der Zielzellen gegeben. Die Zielzellen wurden am Vortag von einer exponentiell wachsenden Kultur in eine 10 cm Schale ausplattiert, so dass die Zellen am Tag der Transfektion etwa 50% konfluent waren (ca. 1 x 106 Zellen). Nach 4 bis 6h erfolgte ein Glycerolschock (das Medium wurde abgesaugt, 2ml 10% Glycerol in 1 x PBS für 1.5min hinzu gegeben, im Anschluss 2 x mit 5ml PBS gewaschen und 10ml frisches Iscove Medium hinzu pipettiert). Alternativ zur Glycerolgabe wurde das Medium nach 16h Kultivierung gewechselt. Je nach Fragestellung wurden 6μM MG132 (10mM stock in DMSO) bzw. DMSO (Kontrolle) 2h vor dem Ernten der Zellen ins Medium hinein pipettiert. Nach 48h wurden die Zellen (transiente Transfektion) geerntet und lysiert.
Lysepuffer: 50mM Tris HCl pH 8.0, 5mM MgCl2, 1mM EDTA, 0.1% Triton X-100, steril filtriert pro ml Lysepuffer folgende Proteaseinhibitoren: 5μl 100mM PMSF, 3,3μl Aprotinin (2mg/ml), 1μl Leupeptin (1mg/ml), 1μl Pepstatin (0.7mg/ml), 1μl Hemin (1mg/ml), 1μl Bestatin (4mg/ml), 50μM N- Ethylmaleinamid, 10μM AAF-CMK, 10μM MG132
Die Zellpellets wurden in Lysepuffer resuspendiert und 3 alternierenden Zyklen Schockfrieren in flüssigem Stickstoff und Erwärmen auf 37°C ausgesetzt. Im Anschluss wurde das Lysat bei 14000rpm, 4°C für 15min zentrifugiert und der Überstand
mittels RT-PCR (transiente Transfektanten):
Die Aufreinigung und Isolation der Gesamt- RNA erfolgte entsprechend des Protokolls „High Pure RNA Isolation Kit“ (Roche), etwa 2 x 106 Zellen wurden in 400μl PBS resuspendiert. Weiteres Procedere wie unter 2.2.1.2 beschrieben.
Material:
Schwefel Nuklid 35S Translabel (ICN) 0.2mCi/ml in Iscove Medium
Lösungen:
50mM Tris HCl pH 8.0, 5mM MgCl2, 1mM EDTA, 0.5% Triton X-100, steril filtriert
Durchführung:
Mit His- Ubi bzw. HA- Ubi transfizierte Zellen wurden 36h nach Transfektion mit 1.4mCi 35S markiert (pulse). Dazu wurden die Kulturschalen (Ø 10cm) mit den adhärenten Zellen mit 1 x PBS gewaschen und für 30min mit 2ml Methionin- freiem RMPI- Medium bei 37°C inkubiert. Danach wurde das Medium abgesaugt und die Zellen mit 7ml 35S (0.2mCi/ml) in Iscove Medium (Gesamtaktivität 1.4mCi) für 30min bei 37°C inkubiert. Im Anschluss wurde das radioaktive Medium entfernt und die Zellen mit Iscove Medium bei 37°C inkubiert (chase). Nach entsprechenden Zeiten (chaseà0, 1, 2, 4, 8h) wurden die Zellen mit 5ml 1 x PBS gewaschen und unter Zugabe von 1ml Lysepuffer (2min stehen lassen) geerntet und gleichzeitig lysiert. Die Lysate wurden in flüssigem Stickstoff schock gefroren und bei -20°C gelagert. Die Immunopräzipitation ist unter 2.2.4.4 erläutert.
Die Herstellung, Kultivierung und Klonierung der pp89 spezifischen zytotoxischen T- Zellen wurde von Frau Dr. U. Salzmann durchgeführt (Dissertation „Untersuchungen zur antigenprozessierenden Funktion des Proteasoms,“ 2003). Sie hat diese CTLs freundlicherweise zur Verfügung gestellt, meinen herzlichsten Dank an dieser Stelle.
Die eingefrorenen CTLs wurden vor dem Experiment expandiert und restimuliert. Von einer murinen Milz (BALB/c Mäuse) wurden Zellsuspensionen hergestellt. Hierzu wurde das Organ durch ein Edelstahlnetz gestrichen und zweimal mit 10ml Iscove Medium gewaschen (1200rpm, 7min, 4°C). Für die Restimulierung wurden Milzzellen nicht immunisierter BALB/c Mäuse mit 10nM pp89-9mer (YPHFMPTNL) 1h bei 37°C beladen und anschließend mit 3000rad gamma bestrahlt. Pro Kavität wurden 5 x 107 peptidbeladene Milzzellen sowie 10nM pp89-9mer zugesetzt. Nach Expansion der spezifischen CTLs erfolgte die wöchentliche Restimulierung mit 1 x 107 CTLs und 1 x 107 peptidbeladenen Stimulatorzellen pro Kavität in
Aus den expandierten polyklonalen CTL- Kulturen wurden Zelllinien durch limitierte Verdünnung angelegt. Es wurden 104, 5x103, 103 bzw. 5x102 CTLs pro well in je eine 24-well-Platte gegeben und wöchentlich mit je 105 peptidbeladenen Milzzellen restimuliert.
Mit Hilfe des zytotxischen T Zell Assays lässt sich eine Aussage darüber gewinnen, wie effizient die spezifischen zytotoxischen T- Lymphozyten bestimmte Zielzellen erkennen und lysieren. Das Prinzip des chromium release assays besteht darin, dass die mit radioaktivem Chrom markierten Zielzellen durch die spezifischen T- Zellen lysiert werden, die Radioaktivität in das Medium freigesetzt wird und im Zellüberstand gemessen werden kann.
Die prozentuale spezifische Lyse berechnet sich wie folgt:
100% x [(spezifische Lyse – spontane Lyse) / (maximale Lyse – spontane Lyse)]
= % spezifische Lyse
Der Wert der maximalen Lyse ist die freigesetzte Radioaktivität nach 100%iger Lyse der markierten Zellen in Anwesenheit von 1% Triton X im Medium. Der Wert der spontanen Lyse ist die freigesetzte Radioaktivität ins Medium in Abwesenheit zytotoxischer T-Zellen.
Durchführung:
2 x 105 Zielzellen (P815) wurden in 100µl Medium mit 50 µCi radioaktivem Chrom 2h bei 37ºC inkubiert. Für die Kontrolle der zytotoxischen Aktivität der T-Zellen wurden P815 Zellen während dieser Zeit mit und ohne 100nM YPHFMPTNL- Peptid (pp89-Epitop) inkubiert. Anschließend wurden die Zellen mit 2 x 5ml Medium gewaschen (5min, 2000rpm). In einer 96-Loch-Rundbodenplatte wurden jeweils 2000 Zielzellen mit dem Proteasomverdauansatz und den spezifischen T-Zellen z. B. im Verhältnis 1/27, 1/9, 1/3 und 1/1 über 4h bei 37ºC inkubiert. Für jeden Messwert wurden Dreifachansätze pipettiert. Nach der vierstündigen Inkubationszeit wurden von den 200µl Medium pro well jeweils 100µl Überstand in Messröhrchen pipettiert und im Gammacounter (Cobra Packard) gemessen.
Material:
Normales Kaninchenserum (Dr. J. Pinda Antikörperservice)
Protein A- Sepharose (Pharmacia Biotech), Protein G- Agarose (Boehringer Mannheim),
anti pp89-Antikörper b5/4 (Dr. H. Hengel), anti Penta- His- Antikörper (Qiagen), WHATMAN- Papier, Phosphoimager
Lösungen:
NET-T: 150mM NaCl, 5mM EDTA, 50mM Tris HCl, pH 8.0, 0.5% Triton X-100
NET-TO: 150mM NaCl, 5mM EDTA, 50mM Tris HCl, pH 8.0, 0.5% Triton X-100,
NET-TON: 500mM NaCl, 5mM EDTA, 50mM Tris HCl, pH 8.0, 0.5% Triton X-100,
1mg/ml Ovalbumin
Durchführung:
Mit His- getaggtem Ubiquitin transfizierte Zellen wurden nach einem Pulse- Chase mit 35S Met (vgl. 2.2.3.8) immunopräzipitiert. In einem Vorreinigungsschritt wurde zu 100μl Zelllysat 5μl normales Kaninchenserum gegeben und für 30min unter wiederholtem Vortexen auf Eis inkubiert. Im Anschluss wurden 20μl gequollene Protein- A- Sepharose in NET-TO äquilibriert, zu den Lysaten hinzu pipettiert und für weitere 30min unter wiederholtem Vortexen auf Eis gelagert. Zu diesem von unspezifisch bindenden Proteinen gereinigten Überstand wurde der präzipitierende Antikörper hinzu gegeben (5μl anti-pp89 b5/4 bzw. 3μl anti-Penta-His (0.2μg/μl) bzw. 2μl anti-HA (0.4μg/μl)), und dieser Ansatz auf einem End- zu- End- Schüttler für 16h bei 4°C inkubiert.
Danach wurden 40μl gequollene Protein A- Sepharose/ Protein G- Agarose (Verhältnis 3:1) beigemischt und dieser Ansatz für 1h bei 4°C auf dem Schüttler rotiert. Die Gelsuspension wurde zentrifugiert (2000rpm, 2min), dann 2mal mit 1ml kaltem NET-TON gewaschen und für 20min auf Eis gelagert. Nach erneuter Zentrifugation wurde das Gel in 1ml NET-T aufgenommen, zentrifugiert und wiederholt mit 1ml NET-T gewaschen. Das Gel wurde in 25μl 1 x SDS-Probenpuffer und 5μl β- ME gelöst, für 5min bei 96°C erhitzt und kurz abzentrifugiert. Der Überstand wurde in 8% Polyacrylamidgelen elektrophoretisch getrennt und auf WHATMAN- Papier getrocknet. Daraufhin wurden die getrockneten Gele auf Phosphoimagerplatten gelagert, die nach drei Tagen analysiert wurden. Dann wurden Biomax- MR Filme (Kodak) aufgelegt und für 2 bis 3 Wochen bei -70°C aufbewahrt und später entwickelt.
Das pp89 ist das durch differentielles Splicing der (IE1) major immediate- early Region des mCMV hervorgehendes immediate early Protein 1, das durch sein antigenes Potential von besonderem Interesse ist. Der Abbau dieses Proteins durch das 20S Proteasom sollte zunächst in vitro analysiert werden, da bisher lediglich unphysiologische Substrate in Form von Peptidfragmenten (25mer) untersucht wurden. Dazu wurde eine Teilsequenz des pp89, die für 484 Aminosäuren kodiert, in den Expressionsvektor pRSET A kloniert. Das resultierende Protein hat ein Molekulargewicht von 55kDa und wird im Folgenden als rek pp89 bezeichnet.
Die verwendeten Primer trugen die Schnittstellen für die Restriktionsenzyme Bam H I (5’-Primer) und Eco R I (3’-Primer). Mittels PCR erfolgte die Amplifikation der cDNA mit den entsprechenden terminalen Schnittstellen. Die PCR- Fragmente wurden anschließend in den pCRII-TOPO-Vektor kloniert. Positive Klone (Insert vorhanden) wurden nach Plasmid- Aufreinigung mittels Restriktionsverdaus mit Bam H I und Eco R I in der DNA- Gelelektrophorese nachgewiesen (Abb. 13). Die isolierte Plasmid- cDNA wurde sequenziert, unter Berücksichtigung der bekannten Nukleotidsequenz erfolgte ein Alignement. Trotz mehrfacher Wiederholungen der PCR und Verwendung von Pfu DNA Polymerase konnten zwei Aminosäureaustausche nicht unterbunden werden. Da die Aminosäureaustausche nicht im Bereich des Epitops liegen, wurde mit diesem Konstrukt im Weiteren gearbeitet. Außerdem wurden in der pp89 Sequenz zwei stumme Mutationen nachgewiesen (Abb. 14).
Das Plasmid mit dem pp89- Insert, das in TOPO10F--Zellen transfiziert wurde (K13), wurde mit Bam H I und Eco R I geschnitten und das Insert in den ausgewählten Expressionsvektor pRSET A, der analog mit den genannten Enzymen geschnitten und anschließend dephosphoryliert wurde, umkloniert. Dieses Plasmid wurde zunächst in ΔDΗ5α—Zellen transfiziert, folglich amplifiziert und charakterisiert. Anschließend wurde die Plasmid- DNA (rek pp89/pRSET A) für die Proteinexpression in BL21-Zellen transfiziert.
Das His- getaggte rekombinante Protein wurde, wie in 2.2.2.8 erläutert, unter Zugabe von Proteaseinhibitoren exprimiert und mit Hilfe von Nickel- NTA- Agarose (Qiagen) aufgereinigt.
Das Molekulargewicht des aus 484 Aminosäuren bestehenden Proteins ist mit etwa 55kDa kalkuliert worden, wobei unter Einbeziehung des His- tags ungefähr von einem Molekulargewicht von 56kDa auszugehen ist. Aus der Abbildung wird hingegen ersichtlich, dass das Protein in der elektrophoretischen Auftrennung in einem höhermolekularen Bereich nachzuweisen ist (etwa 75kDa). Das Laufverhalten des pp89 änderte sich auch nach nativer Reinigung des Proteins (Imidazolgradient) nicht. Allerdings konnte durch native Reinigungsbedingungen nur eine stark reduzierte Proteinausbeute realisiert werden. Auch die Gelelektrophorese im Tris HCl- gepufferten Harnstoffsystem, dass der Bestimmung des Molekulargewichts dienen kann, zeigte kein verändertes Laufverhalten des Proteins. Zur exakten Identifizierung des pp89 wurde die beschriebene Proteinbande isoliert und von Frau Dr. R. Kraft (MDC Berlin) wie folgt analysiert. Nach reduktiver Alkylierung mit Jodacetamid und tryptischem Verdau wurden sowohl ESI-MS/MS- als auch Edman- Sequenzierungen durchgeführt. Die so gewonnenen Peptidfragmente konnten als Teile der Aminosäuresequenz des pp89 zugeordnet werden (vgl. Abb. 17). Ein kopurifiziertes Protein (Laufverhalten bei etwa 55kDA) entspricht einem Elongationsfaktor von E. coli.
In Analysen zur Antigenprozessierung des Proteasoms konnte mit Hilfe synthetischer Polypeptide (das Epitop beinhaltende Sequenzen) gezeigt werden, dass 20S Proteasomen in vitro aus 21-40mer Peptiden spezifische Epitope prozessieren können. So konnte unter anderem demonstriert werden, dass 20S Proteasomen in in vitro Verdaus aus einem synthetischen epitoptragenden pp89-25mer Peptid das entsprechende 9mer, das korrekte
H-2Ld restringierte Epitop yphfmptnl mit hoher Präzision generieren (Boes 1994, Dick 1996). Allerdings stellt sich die Frage, ob diese Resultate auch der physiologischen in vivo Situation entsprechen. Um diesem Punkt näher zu kommen, wurden sowohl der Abbau des rek pp89 durch das 20S Proteasom als auch der Einfluss von PA28 und des Immunoproteasoms auf diesen Prozess untersucht. Die aus humanen Erythrozytenkonzentraten gewonnenen 20S Proteasomen wurden einerseits mit pp89, andererseits zur Kontrolle der Aktivität des 20S mit dem 25mer RLMYDM
YPHFMPTNL
GPSEKRVWMS (Kloe1) inkubiert (vgl. 2.2.2.17). So konnte der zeitliche Verlauf des Proteinabbaus beobachtet werden. Die Verdauprodukte wurden in der SDS-PAGE aufgetrennt und pp89 im Westernblot analysiert. Die Aktivität des eingesetzten c20S und i20S wurde nach Inkubation mit Kloe 1 in der HPLC analysiert. Es konnte sowohl das charakteristische Peakmuster, das bei den Verdaus entsteht, gezeigt werden als auch der Peak, dessen Retentionszeit dem 9mer zugeordnet werden konnte, nachgewiesen werden (vgl. Abb. 18).
Trotz der nicht erfolgten Verwendung von Detergentien lässt sich in der Coomassiefärbung sowie im Westernblot (αpp89) bei Verdau mit dem konstitutiven 20S Proteasom innerhalb von 4 Stunden der nahezu komplette Abbau des rekombinanten, partiell gefalteten pp89 beobachten. Um einen Einfluss von kopurifizierten Proteasen auszuschließen, wurden während der gesamten Isolierung des pp89 Proteinaseinhibitor- Cocktail Complete® (Roche) hinzu gegeben, der ein sehr breites Spektrum proteolytischer Aktivität inhibiert. Der Abbau des Proteins wurde weiterhin in Anwesenheit von PA28 und bei Inkubation mit Immunoproteasomen verfolgt, da in Abhängigkeit davon Aktivitätsänderungen und verschiedene Schnittmuster des 20S beschrieben sind (Dick 1996, Groettrup 1996,
Wie bereits beschrieben, erfolgte die gesamte Aufreinigung des rekombinanten Proteins unter Zusatz von Proteinaseinhibitoren (Proteinaseinhibitor- Cocktail Complete®), womit die Stabilität des Proteins gewährleistet werden konnte. Um den Einfluss derartiger Proteasen auf den Proteinabbau auch während des Verdaus sicher auszuschließen, wurden diverse Kontrollversuche durchgeführt, in denen sich bei Zugabe von Inhibitoren kein verändertes Verhalten des Proteinabbaus beobachten ließ. Folgende Inhibitoren wurden verwendet: Pepstatin*, Leupeptin*, Aprotinin* (* inhibieren Aspartat- und Serinproteasen), Bestatin (inhibiert Aminopeptidasen), Trypsininhibitor, PMSF, AAF-CMK (AAF- Carboxymethylketon inhibiert Tripeptidylpeptidase II). In Abb. 19 E/F wird deutlich, dass der Abbau des rekombinanten Proteins eindeutig dem 20S Proteasom zuzuschreiben ist, erst durch Zugabe des c20S erfolgt die Proteindegradation. Wird hingegen lediglich der zeitliche Verlauf des rek pp89 in Abwesenheit jeglicher Proteaseinhibitoren und ohne Zusatz von 20S dargestellt
Des Weiteren wurde die Abhängigkeit des Proteinabbaus von charakteristischen Proteasomeninhibitoren veranschaulicht. Sowohl im Falle des reversibel inhibierenden Peptidaldehyds MG132 (Endkonzentration=10μM) als auch nach Zugabe des potenten irreversiblen Inhibitors Epoxomicin (ein Epoxyketon isoliert aus Aktinomyzeten, Endkonzentration=2μM) konnte ein stark verminderter Proteinabbau beobachtet werden (Abb. 19 C/D). Diese Tatsache unterstreicht die bereits postulierte Abhängigkeit der Proteindegradation vom 20S Proteasom.
Die bisher dargelegten Daten sprechen für einen Abbau des rekombinanten pp89 durch das Proteasom. Diese Annahme wurde in weiteren Experimenten bekräftigt. Das Interesse richtete sich dabei insbesondere auf den Nachweis prozessierter Peptidfragmente, wie sie einerseits in der RP-HPLC nachgewiesen werden können und sich in der ESI- MS/MS spezifischen Aminosäuresequenzen zuordnen lassen. Zunächst wurden die einzelnen Verdaufraktionen (Kloe1 und rek pp89 jeweils als Substrat) über ein HPLC System (siehe 2.2.2.19) mittels Wasser/ Acetonitrilgradienten getrennt und die Peakmuster der 0- und 20-Stundenverdaus verglichen. Da das pp89 Epitop YPHFMPTNL nur einen geringen Prozentsatz der Abbauprodukte darstellt, konnte ein sicher zuzuordnender Peptidpeak nicht gefunden werden (Dick 1996). Demnach kann mit diesem analytischen Verfahren kein konkreter Anhaltspunkt für die Generierung des Epitops bzw. von Epitop- Precursorfragmenten gefunden werden. Allerdings lassen sich im Vergleich mit dem 0-Stundenwert einzelne Peptidpeaks nachweisen, die aus dem Abbau des pp89 resultieren (Abb. 20).
In weiteren Experimenten wurden die einzelnen HPLC- Fraktionen einer Analyse durch die ESI- MS/MS unterzogen. Diese Untersuchungen wurden freundlicherweise von Frau Dr. K. Janek (Institut für Biochemie, Charité Berlin) durchgeführt. Auch in der Auswertung der ermittelten Daten war das zuvor erwähnte Problem hinsichtlich der geringen Menge und großen Vielzahl der generierten Fragmente des Proteins deutlich, es ließen sich keine konkreten Peptidsequenzen identifizieren. Deshalb stellte sich die Frage nach einem alternativen Analytikverfahren, um die Prozessierung des rek pp89 durch das Proteasom und insbesondere die Generierung des 9mer Epitops in diesem Zusammenhang zu charakterisieren.
Ein sehr sensitives Verfahren stellt der CTL- Assay dar, der mittels spezifischen zytotoxischen T-Lymphozyten (CTL) eine selektive Erkennung des Epitops des pp89 (YPHFMPTNL) erlaubt. Als antigenpräsentierende Zellen (so genannte Targetzellen) fungierten murine P815 Mastozytomazellen, die zunächst mit 51Cr markiert und dann von außen mit dem Verdauansatz beladen wurden. Von spezifischen CTLs erkannte Mastozytomazellen wurden lysiert, setzten 51Cr frei. Die Zelllyserate ist ein Maß dafür, ob und wie viele der Targetzellen durch die CTLs erkannt werden. An dieser Stelle sei Frau Dr. U. Salzmann (ehemals Institut für Biochemie, Charité Berlin) sehr herzlich gedankt. Sie hat die CTLs generiert und stand bei den Experimenten unterstützend zur Seite.
Wie in Abb. 21 ersichtlich ist, führt die Beladung von P815-Zellen mit den vom c20S generierten Peptiden (Verdauansatz: pp89 + c20S nach 20h Inkubation) zu einer spezifischen Lyse dieser Targetzellen durch die für das pp89 Epitop spezifischen zytotoxischen T- Lymphozyten (A). Daher kann zusammenfassend aus den unter 3.1 dargestellten Daten geschlussfolgert werden, dass konstitutive 20S Proteasomen große, nur partiell gefaltete Proteine abbauen können. Sie können das gleiche Epitop generieren, das während des Abbaus des synthetischen pp89 25mers entsteht oder wie es in Zellkulturen
Das isolierte rekombinante pp89 (vgl. 2.2.2.8) wurde unter denaturierenden Bedingungen gereinigt und in weiteren Schritten gegen einen Puffer (0.5M Harnstoff, 0.01M Tris HCl,
pH 7.5) dialysiert und in dieser Form in den Verdaus eingesetzt. Bei einer Harnstoffkonzentration von 0.5M kann bereits von einer partiellen Rückfaltung des Proteins ausgegangen werden. Um diese Vermutung mit experimentellen Daten zu untermauern, wurde in Zusammenarbeit mit Frau Dr. M. Dathe und Frau H. Nikolenko (FMP Berlin- Buch) ein CD- Spektrum des Proteins aufgenommen. Da Harnstoff das Absorptionsverhalten während der Messung stark beeinträchtigt, wurde das Protein erneut gegen ein Tris- Puffer- System (0.01M Tris HCl pH 7.5) dialysiert und das entsprechende Spektrum aufgenommen. Das Spektrogramm wies eine deutliche Überlagerung verschiedener Sekundärstrukturen auf, wobei jedoch aufgrund charakteristischer Bandenmuster auf das Vorliegen zahlreicher β- Faltblätter und damit einer partiellen Faltung geschlossen werden konnte.
Mit Hilfe eines Dekonvolutionsprogramms konnte unter Berücksichtigung der Aminosäuren des Proteins die prozentuale Verteilung der einzelnen Sekundärstrukturen ermittelt werden (vgl. Tab. 3), wobei über das gesamte Spektrum antiparallele β- Faltblätter dominieren. Alle anderen möglichen Sekundärstrukturelemente sind jedoch auch vorhanden. Etwa 35% der Sekundärstrukturen werden der Gruppe ungeordneter Strukturen (random coil) zugerechnet, die auf partiell entfaltete Sequenzbereiche innerhalb des pp89 hindeuten. Insgesamt stellt sich das rekombinante Protein somit als partiell gefaltetes Protein dar, das vom 20S Kernkomplex in dieser Form degradiert wird. Ein Einfluss des restlichen Harnstoffs (0.5M in Dialysepuffer 1) auf die Rückfaltung konnte primär nicht ausgeschlossen werden. Kontrollverdaus mit dem gegen Puffer 2 (0.01M Tris HCl pH 7.5) dialysiertem Protein zeigten jedoch ein annähernd identisches kinetisches Verhalten wie in Abb. 21 A dargestellt. Somit ist der Effekt der restlichen Harnstoffkonzentration von 0.5M auf die Sekundärstruktur als minimal anzusehen, insbesondere scheint er ohne Auswirkung auf den proteasomalen Abbau des rek pp89 zu sein.
In 3.1 wurde die Fähigkeit des 20S Proteasoms, aus dem partiell gefalteten pp89 das entsprechende antigene Peptid YPHFMPTNL bzw. den Precursor in vitro zu generieren, ausführlich dargelegt. Diese Erkenntnis und die Tatsache, dass die Präsentation dieses viralen MHC Klasse I- Epitops in vivo vom Proteasom abhängig ist, implizieren gleichzeitig die Frage, ob der proteasomale intrazelluläre Abbau dieses viralen Proteins einer intrazellulären Polyubiquitinierung bedarf. Wie bereits unter 1.1.5 detailliert erläutert, unterliegen viele Proteine einer Polyubiquitinierung und werden danach durch das 26S Proteasom erkannt und abgebaut. In den folgenden Experimenten wurde zur Analyse einer potentiellen Polyubiquitinierung die murine Fibroblastenzelllinie B8 verwandt, die durch eine stabile Transfektion mit pp89 in C4 Zellen generiert wurde (Boes 1994).
C4 und B8 Zelllysate wurden zunächst im Westernblot mit Ubiquitin-, pp89- und HA- Antikörpern analysiert, wobei einerseits das pp89 in den B8 Zellen (mit pp89 cDNA stabil transfizierte Zellen) nachgewiesen werden konnte (Abb. 23), sich jedoch unter selben Bedingungen kein Hinweis auf eine Ubiquitinierung in Form höhermolekularer Proteinbanden zeigte (Abb. 23 B, C, Spur 2). Um eine Limitierung des Ubiquitins auszuschließen, wurden die B8 Zellen transient mit HA- bzw. His- getaggtem Ubiquitin (HA- bzw. His- Ubi Plasmide, Abb. 24) transfiziert. Die Zellen wurden nach der Transfektion für 48 Stunden inkubiert. Zusätzlich wurden 2 Stunden vor der Ernte der Zellen jeweils 6μM MG132 (respektive als Kontrolle die volumenäquivalente Menge DMSO) als spezifischer Proteasomeninhibitor zu den Zellen gegeben. Nach der Transfektion von HA- Ubiquitin konnten in den Westernblots vermehrt polyubiquitinierte Substrate sowohl mit dem Ubiquitin- Antikörper (Abb. 23 B, Spur 3) als auch mit dem monoklonalen HA- Antikörper nachgewiesen werden (Abb. 23 A, Spur 3). Im Gegensatz dazu wurde mit dem pp89- Antikörper kein polyubiquitiniertes pp89 detektiert (Abb. 23 C, Spur 3). Obwohl eine quantitativ ausreichende Menge an freiem
Der inhibierende Effekt des MG132 auf das Proteasom spiegelt sich in der quantitativen Zunahme der polyubiquitinierten Substrate wider, die insbesondere mit dem Ubiquitin- Antikörper, der sowohl endogen als auch transfiziertes Ubiquitin nachweist, deutlich werden (Abb. 23 B, Spur 4). Allerdings führte die Inhibition der Proteasomen ebenfalls zu keinem Nachweis von ubiquitiniertem pp89 (Abb. 23 C, Spur 4). Somit ergab sich aus diesem Experiment kein Hinweis auf eine Ubiquitinierung des viralen Proteins.
Parallel wurde die Polyubiquitinierung des viralen pp89 in einem ähnlichen Experiment untersucht, wobei murine B8 Zellen mit His- markiertem Ubiquitin (His6- Ubi) transient transfiziert wurden. Neben dem Ubiquitin- Plasmid wurden zusätzlich pp89 und β- Catenin cDNA cotransfiziert. Für β- Catenin, das im Zusammenhang mit der malignen Transformation kolorektaler Mukosa steht, ist ein ubiquitinabhängiger Abbauweg durch das 26S Proteasom bekannt (Hochstrasser 1996, Hershko 1998). Damit wäre eine Akkumulation von His- Ubi- markierten Proteinen in der Zelle zu erwarten gewesen. Auch in diesem Experiment wurde das proteasomale System inhibiert, in diesem Falle wurden 10μM Lactacystin eingesetzt. Die ubiquitinierten Proteine sollten mit dem His- tag über das exprimierte Ubiquitin- Plasmid versehen sein. Nach Lyse der Zellen können die His- Proteine mittels Ni- NTA- Agarose isoliert werden. Die an Ni- Agarose gebundenen Proteine werden dann mittels eines imidazolhaltigen Puffers von der Ni- Agarose eluiert, die desorbierten Proteine mit TCA gefällt und in einer 12,5%igen SDS-PAGE aufgetrennt. Der folgende Westernblot mit dem polyklonalen αpp89- Antikörper (Abb. 25) zeigt in allen Spuren das virale Protein mit dem korrekten Molekulargewicht von 89kDa, unabhängig von der Transfektion mit His- markiertem Ubiquitin oder kotransfiziertem His-Ubi, pp89 und β-Catenin. Möglicherweise bindet das virale Protein unspezifisch an Nickelagarose und ein spezifischer Nachweis von geringen Mengen an His- markiertem Protein ist somit nicht möglich. Es stellte sich die Frage, ob das pp89 ein besonders histidinreiches Protein ist. Laut Sequenzanalyse beinhaltet das Protein 25 Histidine bei einer Gesamtzahl von 669 Aminosäuren, was einen prozentualen Anteil von 3,7% darstellt. Dies ist nicht als besonders histidinreich zu werten. Cluster von Histidinen, die eine Bindung an Ni- NTA bewirkten, bestehen nicht. Über die Proteinstruktur, die ebenfalls ein derartig spezifisches Bindungsverhalten von pp89 gegenüber Ni- NTA- Agarose erklären könnte, ist nichts bekannt. Auffallend ist jedoch der hohe Anteil an Glutamatresten (9,6%) innerhalb des Proteins, der theoretisch berechnete isoelektrische Punkt des vollständigen Phosphoproteins liegt bei 4.53. Dies könnte eine unspezifische Bindung an die positiv geladene Ni- Agarose erklären.
Da aus den bisher dargestellten Versuchen keine Ubiquitinierung des viralen pp89 nachgewiesen werden konnte, wurde im folgenden Experiment versucht, die Empfindlichkeit der Detektion ubiquitinierter Substrate durch die metabolische Markierung der murinen Fibroblasten mit 35S Methionin / Zystein zu erhöhen. Im Anschluss an die 30minütige Inkubation mit den radioaktiv markierten Aminosäuren und konsekutiver Zugabe des Standardmediums wurden die Zellen zunächst nach einer Zeitspanne von zwei Stunden geerntet. Zum Vergleich wurde erneut das proteasomale System der Fibroblasten für 2 Stunden mit 10μM MG132 inhibiert, um eine Akkumulation eventuell ubiquitinierter Substrate zu erreichen. Aus den Zelllysaten wurde mit dem polyklonalen Antikörper αpp89 b5/4 immunopräzipitiert. Die pp89- IgG- Komplexe wurden mittels Protein A- Sepharose präzipitiert und nach Solubilisierung elektrophoretisch in 8%igen Polyacrylamidgelen
In einem Versuchsansatz wurde p53 als Positivkontrolle immunopräzipitiert. Wie bereits in 1.1.5 beschrieben, erfolgt der Abbau dieses Tumorsuppressors Ubiquitin- abhängig durch das 26 S Proteasom (Scheffner 1990). In Abb. 26 B erkennt man sowohl das markierte Protein bei etwa 53kDa nach 30minütiger Inkubation als auch höhermolekulare Proteine, die durch den monoklonalen Antikörper präzipitiert werden und die polyubiquitiniertem p53 entsprechen. Bereits während der 30minütigen Markierung ist der Effekt des Proteasomeninhibitors MG132 deutlich, die Hemmung des Proteasoms hat die erwartete Akkumulation ubiquitinitierter Substrate zur Folge (Spur 2). Ein ähnlicher Verlauf ist auch nach 2stündiger Inkubation der Zellen im Standardmedium zu beobachten, lediglich ist insgesamt eine Abnahme der Proteinkonzentration zu verzeichnen (Abb. 26 B Spur 3 und 4), was durch die kurze Halbwertszeit von p53 zu erwarten war.
Aus dem beschriebenen Experiment wird auch deutlich, dass B8 Zellen genügend intrazelluläres Ubiquitin aufweisen, das den kontrollierten Proteinabbau gewährleistet. Dies wird durch die Positivkontrolle (Immunopräzipitation mit αp53- Antikörpern) veranschaulicht, der Tumorsuppressor wird ubiquitiniert und akkumuliert bei Inhibition des proteasomalen Systems. Somit ist im Grunde ein quantitativ limitierender Effekt des intrazellulären Ubiquitins auf den kontrollierten Proteinabbau eher unwahrscheinlich. Da es sich im Falle der stabil transfizierten B8 Zellen jedoch um gentechnisch veränderte Zellen handelt und infolge Selektion der pp89- produzierenden Zellen mit G418 von einer unphysiologischen Überexpression des immediate early gen product pp89 auszugehen ist, wäre hypothetisch auch ein quantitativer Mangel intrazellulären Ubiquitins zu diskutieren. Um einen derartig limitierenden Effekt auszuschließen, erfolgte erneut eine radioaktive Markierung (30min) von B8 Zellen und die folgende Immunopräzipitation mit dem αpp89- Antikörper, wobei diese B8 Zellen im Vorfeld transient mit His6 markiertem Ubiquitin transfiziert wurden (Abb. 27). In diesem Ansatz wurde insbesondere auch das Verhalten des viralen Proteins im Zeitverlauf über mehrere Stunden beobachtet, auch nach 8 Stunden Inkubation lassen sich keine Veränderungen im Vergleich zum 30 Minutenwert bzw. 2 Stundenwert feststellen. Zum Vergleich sind jeweils C4 Zelllysate (Abb. 27 Spur 1) präzipitiert worden, die kein pp89 exprimieren. Mit Ubiquitin cDNA transfizierte B8 Zellen (Abb. 30, Spur 3 und 4) weisen jedoch keine präzipitierten Substrate auf, die höhermolekular als das pp89 sind. Auch in Zellen, die mit dem spezifischen Proteasominhibitor MG132 behandelt wurden, wurden keine
Auch diesem Experiment zufolge liegt keine Polyubiquitinierung des pp89 vor. Somit ergibt sich aus sämtlichen durchgeführten Experimenten kein Indiz für einen Ubiquitin- abhängigen Abbau des viralen Proteins pp89.
Wie bereits mehrfach ausgeführt, werden höhermolekulare Proteine normalerweise durch das 26S Proteasom abgebaut, andererseits ist dafür in der Regel eine Polyubiquitinierung des Substrates erforderlich. Hingegen wurde für die ODC der Ubiquitin- unabhängige Abbau durch das 26S Proteasom in Anwesenheit von Antizym beschrieben (vgl. 1.3). Ben-Shahar et al. charakterisierten diesen Abbauweg für eine Reihe von Epitopen, indem sie eine 12mer Aminosäuresequenz an den C- Terminus der ODC fusionierten. Diese Sequenz beinhaltete das H-2Kb- restringierte Ovalbuminepitop SIINFEKL. Mittels dieses Konstruktes konnten sowohl das Epitop als auch Precursorpeptide durch das 26S generiert werden (Ben-Shahar 1999). In einem ähnlichen Ansatz sollte der Abbau für ein ODCpp89 Fusionsprotein analysiert werden. Dabei galt es, die Frage zu klären, ob das 26S Proteasom in der Lage ist, das korrekte pp89 Epitop (YPHFMPTNL) ohne Zusatz von Ubiquitin zu generieren.
Das Fusionsprotein besteht einerseits aus der vollständigen Sequenz der murinen Ornithindecarboxylase (461 Aminosäuren) und einer Teilsequenz des pp89 (210 Aminosäuren), wodurch insgesamt ein Protein von etwa 77kDa zu erwarten ist.
A: In Spur 1 ist das pp89 Insert (630bp) mit Kpn I und Eco R I Schnittstellen, in Spur 2 das ODC Insert (1383bp) mit Bam H I und Kpn I Schnittstellen jeweils nach Restriktionsverdau dargestellt. Der positive Klon A1 wurde einerseits mit Bam H I und Kpn I verdaut, in Spur 3 sind die entsprechenden Produkte ODC und Vektor pRSET A+pp89 zu sehen. Nach Inkubation der Plasmid- DNA mit Kpn I und Eco R I kann das pp89(630bp) und pRSET A+ODC (Spur 4) gezeigt werden.
B: Die ODC- Sequenz wurde über Bam H I und Kpn I Schnittstellen in den zuvor identisch verdauten Vektor ligiert. Direkt im Anschluss des C- Terminus der ODC wurde über Kpn I und Eco R I eine 603 bp große pp89- Sequenz inseriert, so dass im Vektor letztendlich die Fusionssequenz vorliegt: Die Plasmid- DNA wurde initial in ΔDΗ5α—Zellen transformiert, amplifiziert und sequenziert sowie nach positiver Selektion für die Proteinexpression in BL21-Zellen transformiert.
Nach Amplifikation der DNA und gleichzeitiger Einführung der Restriktionsschnittstellen Bam H I, Kpn I und Eco R I wurden jeweils Klone der einzelnen Fragmente in pCRII-TOPO- Vektoren isoliert. Nach erfolgtem Restriktionsverdau wurden aus den geschnittenen Inserten
Die Plasmid- DNA des Klons A1 wurde zur Expression in BL21- Zellen transformiert. Die Expression des Fusionsproteins, die anschließende Lyse der Bakterien und die Aufreinigung des His- getaggten Proteins erfolgte wie in 2.2.2.11 beschrieben. Das Protein wurde unter denaturierenden Bedingungen isoliert, da im Falle eines nativen Reinigungsverfahrens eine extrem geringe Proteinausbeute beobachtet wurde. Da trotz zahlreicher Waschschritte des Ni- NTA- Agarosematerials mit verschiedenen Puffern (Zusatz von 1.5M NaCl, 1% Tween 20 und mit variablen pH- Werten) immer eine Kopurifikation diverser Proteine in geringer Konzentration beobachtet wurde, erfolgte die Auftrennung des gesamten eluierten Proteins in der SDS-PAGE. Anschließend wurde die spezifische Bande des ODCpp89 Fusionsproteins ausgeschnitten und aus dem Gel elektroeluiert. Dadurch wurde eine hohe Reinheit erzielt.
Nach Isolation des getaggten Fusionsproteins nach beschriebenem Protokoll (vgl. 2.2.2.11) wurden die Proben in 12,5%igen Polyacrylamidgelen getrennt und mit Coomassie gefärbt. In Spur 1 und 2 sind jeweils 2 und 4 μg des Proteins mit zu erwartendem Molekulargewicht (77kDa) sichtbar. Nach Blotting der Proteine erfolgte der spezifische Proteinnachweis mit α(RGS)4His- (Spur 3) und αpp89- Antikörpern (Spur 4).
Der Abbau der ODC erfolgt durch das 26S Proteasom in Abhängigkeit eines regulierenden Proteins, dem Antizym. Die Plasmid- DNA des Antizyms wie auch für ODC wurde uns freundlicherweise von Frau Dr. Y. Murakami (Tokio, Japan) zur Verfügung gestellt. Das mit MBP (maltose binding protein) assoziierte Antizym wurde exprimiert (vgl. 2.2.2.12) und entsprechend dem Protokoll isoliert (Abb. 31).
Ähnlich wie unter 3.1.3 für das rekombinantes pp89 beschrieben, wurde der Abbau des ODCpp89 Fusionsproteins analysiert. Das eingesetzte 26S Proteasom stammt aus humanen Erythrozyten und wurde freundlicherweise von Frau Dr. B. Braun (Charité Berlin) zur Verfügung gestellt. Zunächst sollte die Aktivität des 26S Proteasoms überprüft werden, da während der Lagerung bei -80°C mit einem Zerfall in den 20S Core- Komplex und die 19S Regulatoren zu rechnen ist. Dazu wurde eine native Gelelektrophorese durchgeführt, die eine Trennung von 20S und 26S Fraktionen gestattet. Die Aktivität des Proteasoms konnte nach Inkubation (Overlay) mit 100μM Bz-VGA-AMC durch die fluoreszierende Eigenschaft der abgespaltenen AMC- Gruppe detektiert werden.
In den Verdauanalysen wurde das ODCpp89 Fusionsprotein mit Antizym, 1mM ATP und 26S Proteasomen in einem ATP- generierenden System (1mM ATP, 10mM Kreatinphosphat, 50ng/μl Kreatinkinase) bei 37°C inkubiert und die Reaktion nach 0, 4 und 20 Stunden mit 1% TFA gestoppt. Zunächst wurden die Verdauprodukte in einer SDS-PAGE analysiert und das spezifische Protein im Westernblot (αpp89 -Antikörper) nachgewiesen. Zur Kontrolle wurde dieselbe Inkubation ohne 26S Proteasom untersucht (Abb. 33 A), in einem weiteren Ansatz hingegen neben dem Proteasom der spezifische Inhibitor Epoxomicin (2μM, Abb. 33 C) zugesetzt. In dem dargestellten Westernblot (Abb. 33) zeigt sich im Zeitverlauf ein stabiles ODCpp89 Fusionsprotein in Anwesenheit von 26S. Für den Proteasominhibitor lässt sich ebenfalls kein in diesem Verfahren nachweisbarer Effekt finden, wonach aus diesem Experiment zunächst kein Anhalt für den Abbau des ODCpp89 Fusionsproteins durch das 26S Proteasom besteht.
A: Kontrolle ODCpp89 + Antizym ohne 26S; B: ODCpp89 + Antizym + 26S; C: ODCpp89 + Antizym + 26S + 2μM Epoxomicin
Das Potential zur Elimination von viralen Infektionen hängt in starkem Maß von der Fähigkeit der Organismen ab, Peptide aus viralen Proteinen zu generieren und diese nach Bindung an MHC Klasse I- Moleküle auf der Zelloberfläche den spezifischen zytotoxischen T- Lymphozyten (CD8+) zu präsentieren. Der überwiegende Teil der MHC Klasse I- Liganden findet seinen Ursprung in zellulären Proteinen, die durch das 26S Proteasom generiert werden. Ein Beispiel für einen proteasomal generierten MHC Klasse I- Liganden ist das Nonapeptid yphfmptnl, das vom immediate early Phosphoprotein 89 (pp89) des murinen Cytomegalievirus (mCMV) abstammt. Obwohl mehrere Proteasen und Peptidasen bekannt sind, die an der Generierung von MHC Klasse I- Liganden beteiligt sind, scheint die Prozessierung des korrekten C- Terminus, der für die meisten Proteine eine wichtige Ankerposition darstellt, hauptsächlich durch das Proteasom zu erfolgen. (Rock 1994, Kloetzel 2001, Rock & Goldberg 1999). Die virale Immunabwehr sowie das Potential des mCMV, diese Immunantwort zu umgehen, sind insbesondere im Mausmodell für das mCMV ausführlich untersucht. Die Präsentation des H-2Ld restringierten mCMV Epitops yphfmptnl des pp89 auf der Zelloberfläche hat eine Aktivierung spezifischer CTLs zur Folge (Reddehase 1989, del Val 1991, Reddehase 2002). Damit spielt das pp89 im Rahmen der Immunabwehr eine besondere Rolle und sollte in seiner proteasomabhängigen Degradation detailliert analysiert werden.
Mit Hilfe synthetischer pp89- Polypeptide (21-40mer Peptide), die das untersuchte Ld- Epitop enthalten, wurde gezeigt, dass 20S Proteasomen in vitro das korrekte H2-d restringierte Epitop yphfmptnl nur in geringen Mengen generieren. Allerdings entsteht das N- terminal extendierte 11mer Precursorpeptid des Epitops weitaus häufiger. Dieses wird auch vom TAP für den Transport in das ER gegenüber dem 9mer präferiert (Boes 1994; Dick 1996, Knühl 2001). Um der physiologischen Situation näher zu kommen, wurde ein rekombinantes pp89 synthetisiert und dessen proteasomaler Abbau untersucht. Das unter denaturierenden Bedingungen gereinigte rekombinante Protein mit einem errechneten Molekulargewicht von 56kDa weist in der SDS-PAGE ein unerwartetes Laufverhalten bei 75kDa auf. Das Protein zeigte aber im Westernblot sowohl mit dem monoklonalen αHis- und dem polyklonalen αpp89- Antikörper eine positive Reaktion. Des Weiteren wurde die pp89- Proteinsequenz in der ESI-MS/MS- und Edman- Sequenzierung identifiziert. Worauf dieses veränderte Molekulargewicht zurückzuführen ist, blieb letztendlich unklar, da weder native Reinigungsmethoden noch die gelelektrophoretische Auftrennung im Harnstoffsystem einen Einfluss auf das Laufverhalten zeigten. Eine Dimerisierung des pp89 ist aufgrund des
Zunächst wurde die Frage geklärt, ob gereinigte 20S Proteasomen in der Lage sind, in vitro das partiell gefaltete Protein (vgl. CD- Spektrum 3.1.4) abzubauen und dabei das korrekte 9mer Epitop bzw. den 11mer Precursor zu generieren. Die Verdauanalysen mit 20S Proteasomen wurden ohne Zusatz von Detergentien wie SDS oder anderen, das Proteasom stimulierenden Substanzen durchgeführt (Coux et al. 1996). Dies ist insbesondere deshalb hervorzuheben, da in bisherigen in vitro Verdaus SDS regelmässig verwendet wurde und dabei nicht nur die Interaktion mit dem Substrat von Bedeutung ist. SDS nimmt vielmehr direkt Einfluss auf das „gating“ und die Ladung des 20S Core- Komplexes, indem es Auswirkungen auf das Oberflächenmilieu vor allem der α- Ringe ausübt. Es scheint dabei den Effekt des PA28 bzw. von hydrophoben Peptiden (siehe unten) auf eine Öffnung der α- Ringe zu simulieren und kann damit den Substratzugang des 20S Core- Komplexes öffnen und eine Aktivierung des Substratabbaus bewirken (Kisselev 2002). Die Verdaus mit rekombinanten pp89 wurden jedoch ohne SDS durchgeführt. Das rekombinante pp89 wurde durch das 20S Proteasom unter diesen Bedingungen bemerkenswerterweise bereits nach 4h annähernd vollständig abgebaut (Abb. 18 A). Der proteasomale 20S Core- Komplex wurde in Kontrollexperimenten mit jeweils 10μM MG132 und 2μM Epoxomicin inhibiert, woraufhin sich der Abbau von pp89 im Falle des hochpotenten Epoxomicin nahezu vollständig, bei MG132 über mindestens 8h inhibieren ließ. Demnach ist der Abbau des rekombinanten Proteins eindeutig dem 20S zuzuschreiben. Ohne Zusatz des Proteasoms blieb das Protein stabil. Mit diversen Proteaseinhibitoren (vgl. 3.1.3) wurde gezeigt, dass keine weiteren Proteasen, die aus der Aufreinigung des rek pp89 oder des 20S Core- Komplexes weiterhin anwesend sein könnten, am in vitro Abbau des pp89 beteiligt sind. Insbesondere die Inhibition der Tripeptidyl Peptidase II (TTP II), einer möglichen Kontamination des aufgereinigten 20S Core- Komplexes, mit AAF- CMK erschien aufgrund des kürzlich beschriebenen endoproteolytischen Effekts des Enzyms und der Generierung des korrekten HIV- Nef (73-82) Epitops im Gegensatz zum 20S Proteasom bedeutend zu sein. Die TPP II kann sowohl unabhängig vom Proteasom, aber andererseits auch mit dem Proteasom gemeinsam für die
In Schnittanalysen von antigenen Peptiden des Ovalbumins mit 26S Proteasomen berichteten die Autoren über Schwierigkeiten, die einzelnen Fragmente z.B. in der HPLC sicher identifizieren zu können. Die Größe der generierten Fragmente lag in der Mehrzahl der Fälle bei 7 bis 8 AS, die Anzahl der verschiedenen Produkte sei vermutlich zu groß, um individuelle Fragmente zuordnen zu können. 26S Proteasomen generierten in Ovalbuminverdaus nur in 2% der Fälle das entsprechende 8mer Epitop (Cascio 2001). Princiotta et al. kalkulierten die Generierung von MHC Klasse I- Liganden unter Zuhilfenahme des Ovalbuminepitops detaillierter. Bei einer ungefähren Anzahl von 8x105 funktionellen Proteasomen pro Zelle und unter Berücksichtigung von Synthese- und Abbaurate der intrazellulären Proteine wurde ein Substratumsatz des Proteasoms von 2.5 min-1 kalkuliert. Die Generierung von Komplexen aus MHC Klasse I (Kb) und SIINFEKL (8mer Epitop des Ovalbumins) bezogen auf die Zahl der durch das Proteasom degradierten Ovalbumin- Substrate erfolgte mit einer Effizienz zwischen 1/440-1/3000. Proteasomen generieren die entsprechenden Precursorpeptide in 2.5% der Fälle (1/40), nur 2% (1/2000) dieser Peptide überleben den Weg vom Zytosol ins ER und können an MHC Klasse I- Moleküle binden (Princiotta 2003). Auch das spezifische 9mer yphfmptnl des pp89 wurde von Dick et al. als seltenes Produkt der Peptidverdaus beschrieben (Dick 1996).
Die Analyse der in den Verdaus des rek pp89 generierten Peptidfragmente wurde zunächst mittels RP- HPLC und ESI- MS/MS durchgeführt. Dabei konnten in der HPLC unspezifische Peptidfragmente nach 20h Inkubation mit dem Proteasom nachgewiesen werden, das 9mer Epitop konnte jedoch nicht sicher gezeigt werden. Detaillierte Untersuchungen in der Massenspektrometrie hinsichtlich genauer Peptidsequenzen blieben ohne Erfolg. Aus den analysierten Proben ließ sich keine spezifische Sequenz sicher bestimmen. Neuere Analyseverfahren wie die Nano- HPLC oder Maldi Massenspektrometrie stellen viel versprechende alternative Nachweismethoden dar, die die Zuordnung von Peakmustern zu bestimmten Peptidsequenzen gestatten würden.
Der definitive Nachweis, dass konstitutive 20S Proteasomen aus dem rekombinanten Protein pp89 das pp89168-176 Ld restringierte MHC Klasse I- Epitop bzw. dessen 11mer Precursor generieren können, erfolgte mit spezifisch gegen dieses Epitop gerichteten zytotoxischen T- Lymphozyten (CTLs). Diese sind sowohl für das 9mer Epitop spezifisch, erkennen aber auch den Precursor. Bei einem Verhältnis von Effektor- zu Targetzellen von 1/27 zeigte sich für das in vitro verdaute Protein eine 59%ige Lyse (im Vergleich dazu in der Kontrolle mit dem antigenen Nonapeptid (100nM) 70% Lyse). Demnach ist der Nachweis eindeutig erbracht, dass konstitutive, nicht induzierte (d.h. ohne Zusatz von SDS) 20S Proteasomen in vitro
Aus der Literatur ist bereits bekannt, dass denaturiertes Ovalbumin ebenfalls ohne Ubiquitinierung in vitro abgebaut wird, allerdings war dafür eine Entfaltung des Substrats oder Aktivierung des 20S Proteasoms durch SDS notwendig. Unter den Produkten konnte durch Dick et al. das antigene Peptid SIINFEKL nachgewiesen werden (Dick 1994). Somit scheint eine Ubiquitinierung zumindest unter diesen unphysiologischen Bedingungen zunächst keine unabdingbare Voraussetzung für eine Degradation des Substrats durch den 20S Core- Komplex zu sein.Michalek et al. zeigten in vivo durch Mikroinjektion sowohl von chemisch denaturiertem und alkyliertem als auch von rekombinant synthetisiertem, gefaltetem Ovalbuminin Ubiquitinmutanten, dass insbesondere die Denaturierung der proteasomalen Substrate einen Effekt auf die MHC Klasse I- Antigenpräsentation ausüben kann. So wurde exogen synthetisiertes, natives Ovalbumin in der temperatursensitiven Ubiquitinkonjugationsmutante ts85 (E1- Inaktivierung) unter nicht- permissiven Bedingungen vermindert auf MHC Klasse I- Molekülen präsentiert, für das injizierte denaturierte Protein hingegen zeigten sich unter selben Bedingungen ähnliche Ergebnisse wie bei Wildtypzellen (Michalek 1996). Natives Ovalbumin bedarf einerseits einer Ubiquitinierung und demzufolge andererseits eines Abbaus durch das 26S Proteasom. Für anscheinend Ubiquitin- unabhängige Formen von Antigenen wie das denaturierte Ovalbumin ist jedoch sowohl die Aktivität des 20S als auch des 26S für eine Degradation und Epitopgenerierung denkbar. Denaturierte Substrate könnten von den Substratbindungsstellen des Proteasoms erkannt und im Anschluss direkt in das aktive Zentrum eingeschleust werden. Dies würde auch erklären, warum das rekombinante pp89 in vitro effektiv durch das 20S Proteasom abgebaut wird, da laut CD- Spektrum etwa 35% der Proteinstruktur in ungeordneter Knäuelstruktur vorliegen. Diese partielle Entfaltung scheint für den proteasomalen in vitro Abbau ausreichend zu sein.
Des Weiteren stellt sich die Frage, wie die entfalteten Proteinketten Zugang in das aktive Zentrum des zylinderförmigen 20S Core- Komplexes finden. Das „gating“ wird durch die α- Ringe reguliert, wobei durch Mutationsanalysen insbesondere die N- terminalen Extensionen der α3- UE für die Öffnung der äußeren α- Ringe verantwortlich gemacht werden konnten (Groll 2000). Kisselev et al. postulieren in vitro nicht-katalytische „modifier sites“ innerhalb oder an der Oberfläche der α- Ringe, die durch Bindung von hydrophoben Peptidabschnitten eine Öffnung des Ringsystems bewirken würden und damit den Substratzugang in den 20S Core- Komplex freigeben sowie die Freisetzung degradierter Peptidfragmente erleichtern
Der Proteasomaktivator PA28 beiinflusst einerseits die Aktivität des Proteasoms, andererseits auch die Qualität der generierten Hydrolyseprodukte. Der genaue molekulare Mechanismus der Regulierung dieses ATP-unabhängigen Proteasomaktivators ist bislang nicht detailliert bekannt. Jedoch lassen in vitro Daten darauf schließen, dass PA28 einen positiven Einfluss auf die Substrattranslokation innerhalb des 20S Proteasoms ausübt. Der Substratumsatz scheint durch die Translokation des Proteins bzw. Peptids in das Proteasom limitiert zu sein. Sowohl die Bindung von homomeren als auch heteromeren rekombinanten PA28 Komplexen an Proteasomen führt zu einer gesteigerten Peptidtranslokation. Somit scheint PA28 einen allosterischen Effekt auf die Substratbindung auszuüben, damit das „channelling“ zu regulieren, ohne dass sich dadurch die maximale Aktivität des 20S Core Komplexes ändern würde (Stohwasser 2000). Strukturanalysen von Groll et al. zufolge sind die N-terminalen Peptidsequenzen der α3-UE für die geschlossene Konformation des 20S Proteasomes verantwortlich (Groll 2000). Eine Bindung von PA28 bewirkt die Umlagerung dieser Sequenzen, wodurch das „gate“ in den Core Komplex geöffnet wird (Whitby 2000, Kopp 2001). Somit scheint PA28 sowohl das „gating“ als auch das „channelling“ des Proteasomes zu beeinflussen.
Um den Einfluss des PA28 auf den Substratumsatz des rek pp89 zu verfolgen, wurde das rekombinante Protein mit 20S Proteasomen in Anwesenheit von PA28 in vitro verdaut. In Westernblots konnte kein stimulierender Effekt auf den proteasomalen Abbau des rekombinanten Proteins gezeigt werden. Vielmehr schien es unter Zugabe von PA28 zu einer reduzierten Effizienz des Substratumsatzes zu kommen.
In Einklang mit den experimentellen Daten sind auch Ergebnisse von Ma et al. zu interpretieren, die zwar einen positiven allosterischen Effekt von PA28 auf die Peptidprozessierung des 20S Proteasoms nachweisen konnten, jedoch für den Abbau großer Proteine wie Casein und Lysozym keine Stimulierung des Proteasoms aufzeigten (Ma 1992). Wie bereits erläutert, könnte PA28 Änderungen der Konformation innerhalb des 20S Komplexes bewirken und somit „gating und „channelling“ beeinflussen. Der inhibitorische Effekt von PA28 auf den proteasomalen Abbau des rek pp89 könnte insofern erklärt werden, als dass durch die Bindung des Aktivators potentielle Bindungsstellen für hydrophobe Proteindomänen bzw. bereits generierte Peptide in den äußeren α- Ringen infolge der Ausbildung von Wechselwirkungen zwischen PA28 und α- UE blockiert werden würden, die für den schnellen Substratumsatz großer, denaturierter Proteine vonnöten zu sein scheinen. In Abwesenheit von PA28 wird rek pp89 schnell degradiert, die Regulierung des Substratzugangs innerhalb des 20S Core- Komplexes durch hydrophobe Peptide, respektive Proteindomänen ist unter 4.1.1 dargestellt (Kisselev 2002). Wird hingegen PA28 zum Reaktionsansatz hinzugegeben, scheinen diese regulatorischen „modifier sites“ blockiert zu sein. Der stimulatorische Effekt des PA28 auf den proteasomalen Proteinabbau scheint im Fall des rek pp89 nicht den indirekt hemmenden Einfluss ungebundener hydrophober Peptidsequenzen kompensieren zu können.
Untersuchungen intestinaler Mukosazellen im Vergleich mit anderen Geweben (Maus) zeigten sich ein gewebespezifisches Muster variierender α- Untereinheiten innerhalb des 20S Komplexes. Bemerkenswert erschien dabei, dass insbesondere bei den α4- und α6- Untereinheiten Differenzen, die auf eine posttranslationale Modifizierung hinweisen, beobachtet wurden. Da α- Untereinheiten mit PA28, aber auch mit anderen zellulären oder viralen Proteinen interagieren können, wird ihnen eine regulierende Funktion zugesprochen
Immunoproteasomen fördern Peptidhydrolysen nach hydrophoben und basischen Aminosäuren (Sijts2000a, Sijts 2000b, Schwarz 2000) und schneiden vermindert nach sauren Aminosäuren (Gaczynska 1994). Die Oberflächeneigenschaften der dabei generierten Peptide korrelieren mit der Aminosäurepräferenz verschiedener MHC- Haplotypen. Demzufolge wurde der proteasomale Abbau des rekombinanten pp89 durch das Immunoproteasom untersucht. Die Aktivitäten des konstitutiven und des Immunoproteasoms waren in den Versuchen annähernd identisch (Daten nicht gezeigt). Trotzdem scheinen Immunoproteasomen das pp89 in vitro unter selben Verdaubedingungen langsamer abzubauen als konstitutive Proteasomen. Eine Aussage über die Generierung des spezifischen Epitops yphfmptnl lässt sich lediglich aus dem Westernblot nicht treffen. Die in der RP-HPLC analysierten Verdaus des pp89 durch das i20S zeigten ähnliche Chromatogramme mit unspezifischem Peakmuster wie für das c20S (Abb. 20). Eine Zuordnung zum Nonapeptid konnte aufgrund dieser Daten nicht erfolgen. Allerdings ist aufgrund der Ähnlichkeit der Westernblots und der HPLC- Daten im Vergleich zum konstitutiven 20S Proteasom ebenfalls von der Generierung des in den CTL Assays nachgewiesenen antigenen Epitops bzw. des 11mer Precursors auszugehen.
Die durch IFNγ induzierte Synthese der Immunountereinheiten β1i, β2i und β5i und die anschließende Inkorporation bedingt filigrane Änderungen der Gesamtstruktur des 20S Komplexes und könnte die Eigenschaften der Substratbindungsregion und so den Zugang zu den verschiedenen aktiven ß-Untereinheiten des 20S Komplexes beeinflussen (Sijts 2000a). Demnach würde sich, wie bereits ausgeführt, natürlich auch das zeitliche Schnittverhalten ändern können. Dadurch könnte der zeitlich verzögerte Abbau des rek pp89 durch Immunoproteasomen im Vergleich zu konstitutiven Proteasomen bedingt sein.
Aufgrund der Fähigkeit des 20S Proteasoms, aus dem rekombinanten pp89 Protein das pp89 Epitop zu generieren und der Tatsache, dass die Präsentation dieses MHC Klasse I- Liganden auf murinen Fibroblasten (B8 Zellen) vom Proteasom abhängig ist, stellte sich die Frage, ob der intrazelluläre Abbau des viralen Proteins der Polyubiquitinierung desselben bedarf. Folgende Gesichtspunkte können berücksichtigt werden, um den Abbau eines spezifischen Proteins durch das Ubiquitin- Proteasom- System zu bestimmen: 1) Reduktion des Substratumsatzes in den Zellen bedingt durch Inhibition des Systems mit chemischen Inhibitoren oder genetischen Mutationen, 2) Nachweis von Ubiquitin- Substrat- Konjugaten in den Zellen nach Hemmung des Proteasoms, 3) Rekonstruktion der in vivo Ergebnisse (d.h.
In den im Folgenden zu diskutierenden Experimenten standen vor allem die unter 1) bis 3) aufgeführten Punkte im Vordergrund.
Eine Inhibition des proteasomalen Systems mit dem Peptidaldehyd MG132 führte zu einem verminderten Abbau des rekombinanten pp89 in vitro, wodurch die Abhängigkeit der Herstellung des viralen Epitops vom Proteasom verdeutlicht wurde. Ähnliche Ergebnisse für die antigene Prozessierung von pp89 wurden in früheren Arbeiten auch in vivo erzielt. Die Gabe von IFNγ oder eine Überexpression von PA28α hatten eine erhöhte CTL- Antwort im Sinne einer vermehrten Peptidgenerierung durch das Proteasom zur Folge (Groettrup 1996). Die Akkumulation ubiquitinierter Proteine nach Gabe von MG132 konnte auch in allen im Rahmen dieser Arbeit durchgeführten Transfektionsexperimenten mit HA- bzw. His- markiertem Ubiquitin gezeigt werden, jedoch ließen sich in keinem der durchgeführten Experimente Ubiquitin-pp89-Konjugate nachweisen.
Für den in vivo Abbau des pp89 konnte hier gezeigt werden, dass er durch das Proteasom erfolgt. Der fehlende experimentelle Nachweis einer dazu notwendigen Ubiquitinierung des konstitutiv exprimierten Proteins schließt die Abhängigkeit der Degradation von einer Konjugation mit Ubiquitin jedoch nicht vollständig aus. Allerdings deuten die gewonnenen Resultate auf einen Proteasom- abhängigen Abbau des pp89 ohne Ubiquitinkonjugation hin. Auch das 20S Proteasom kann, wie in einigen anderen Beispielen, auch in vivo an der Prozessierung großer Proteine beteiligt sein. Um den Ubiquitin- abhängigen bzw. -unabhängigen Abbau von pp89 detaillierter darzustellen, wären Mutationsanalysen mit K48R oder K63R- Mutanten oder mit Konjugationsenzymmutanten denkbar (Michalek 1996, Zhang 2003). In Zell- bzw. Mausmodellen, die die Ubiquitinkonjugationsmutante K48R aufweisen, konnte kürzlich gezeigt werden, dass diese temperatursensitiven Mutanten keinen Einfluss auf den Substratumsatz bei Infektion mit Moloney murinen Leukämie Viren (MLV) haben. Dies deutet darauf hin, dass eine Ubiquitinierung nicht essentiell für den Abbau viraler Proteine sein könnte (Zhang 2003).
Der überwiegende Teil der zurzeit identifizierten CTL- Epitope stammt von metabolisch stabilen Proteinen ab. Sie werden Proteasom- abhängig durch Degradation von defective ribosomal products (DRiPs) generiert, wobei DRiPs ubiquitiniert vorliegen oder mit einem alternativen Degradationssignal versehen sind. Die Formation solcher DRiPs kann durch Änderungen im zellulären Milieu induziert werden, wie sie z.B. infolge viraler Infektionen und Ausschüttung von Zytokinen im entzündeten Gewebe zu finden sind. Diese direkt an die
Der spezifische Nachweis, dass eine Polyubiquitinierung in vivo in einzelnen Fällen für den proteasomalen Abbau essentiell ist, lässt sich experimentell sehr schwierig erbringen. Ein großes Problem stellt die Vielzahl und Spezifität der einzelnen E2- und E3- Enzyme dar (vgl. 1.2). Andererseits sind diese experimentellen Schwierigkeiten auch auf das nur transiente Vorliegen von Ubiquitin- Protein- Konjugaten zurückzuführen, des Weiteren ist eine Inhibition der Ubiquitinierung bislang nur mit Ubiquitinaldehyden möglich (Tarsca 2000). Demzufolge erscheint es aufgrund der rapiden Degradation von Proteinketten durch deubiquitinierende Enzyme diffizil, diese potentiellen Konjugate von Mammaliaproteinen mit Ubiquitin zu detektieren (Sheaff 2000). Des Weiteren stellt sich nun die Frage nach der spezifischen Funktion des Ubiquitins im Rahmen der Antigenprozessierung durch das 26S Proteasom. Bisher wurde diskutiert, dass ubiquitinierte Proteine einerseits von verschiedenen Untereinheiten innerhalb des 19S Regulators erkannt und gebunden werden, andererseits die Ubiquitine durch die Isopeptidaseaktivität innerhalb des 19S Komplexes vom Substrat abgespalten und in der Zelle reutilisiert werden (Deveraux 1994, Bochtler 1999, Lam 1997). ATPase- Untereinheiten des 19S können wiederum bei der Entfaltung der Proteine mitwirken und somit Chaperon- artige Funktionen übernehmen (Braun 1999).
Wie lassen sich damit Beobachtungen in Einklang bringen, die den Abbau verschiedener Proteine als Ubiquitin- unabhängig beschreiben? Michalek et al. untersuchten den Abbau des Ovalbumins, das dem klassischen Degradationsweg mit Ubiquitinierung und Abbau durch das 26S Proteasom folgt (Ben-Shahar 1997, Michalek 1996). In Hinblick auf die Präsentation des korrekten MHC Klasse I- Liganden SIINFEKL wiesen endogen synthestisiertes Ovalbumin (mit Ovalbumin transfizierte Mutanten) als auch in das Zytosol mutierter Zellen injiziertes (Ubiquitin- Konjugationsmutante) chemisch denaturiertes, alkyliertes Ovalbumin bei nicht permissiver Temperatur ähnliche Ergebnisse wie Wildtypzellen auf. Im Gegensatz dazu führte die Injektion von nativem Ovalbumin zu einer verminderten Präsentation des Epitops (Michalek 1996). Wie bereits unter 4.1.1 erläutert, lassen diese Resultate auf einen Einfluss der Proteinstruktur des Substrats hinsichtlich des Ubiquitin- abhängigen Abbaus schließen. Modifizierungen innerhalb der Proteinstruktur im
In Experimenten von Sheaff et al. wurde der proteasomale Abbau des CdK Inhibitors p21Cip1 analysiert. Obwohl die Inhibition des proteasomalen Systems eine Verlängerung der Halbwertszeit des Proteins bewirkt und unter selben Bedingungen p21Cip1- Ubiquitin- Konjugate in der Zelle akkumulieren, scheint der Abbau des Proteins Mutationsanalysen zufolge selbst nicht direkt der Ubiquitinierung zu bedürfen. Demnach kann nicht zwangsläufig im Falle des Vorliegens von Ubiquitinkonjugaten und proteasomalem Abbau eines Proteins darauf geschlossen werden, dass die beobachtete Ubiquitinierung eine Conditio sine qua non für den proteasomalen Abbau des Proteins sei (Sheaff 2000). Auch in dieser Arbeit wird erneut auf den entscheidenden Einfluss der Proteinstruktur hinsichtlich der Erkennung und Degradation durch das Proteasom verwiesen, nicht strukturierte Proteine werden vom Proteasom direkt gebunden und ohne Ubiquitinierung sowohl in vitro als auch in vivo abgebaut (Michalek 1996). Für p21 konnte gezeigt werden, dass das freie Protein nicht in einer genau definierten Tertiärstruktur vorliegt, woraufhin es eventuell direkt von den α- Ringen des 20S Core- Komplexes erkannt wird (Sheaff 2000).
In diesen Kontext seien auch nochmals die unter 4.2.2 erwähnten defective ribosomal products (DRiPs) erwähnt, für die unter anderem auch ein Ubiquitin- unabhängiger Abbauweg durch das Proteasom beschrieben wird (Schubert 2000). Sie stellen grundsätzlich Proteine mangelhafter Konformation dar, können aber auch verkürzte Proteine infolge vorzeitigen Kettenabbruchs sein. Die von Michalek und Sheaff durchgeführten Degradationsanalysen verschiedener Proteine sind auch in Einklang mit dieser DRiP- Hypothese zu sehen, woraufhin zusammenfassend auch in vivo der Abbau eines Proteins durch das 26S Proteasom nicht zwangsläufig der Ubiquitinierung desselben bedarf. Diese Aussagen bekräftigen einerseits die im Rahmen dieser Arbeit gewonnenen Ergebnisse hinsichtlich der in vivo Ubiquitinierung des pp89 als auch die in vitro durchgeführten Degradationsstudien des rekombinanten pp89.
Die bislang diskutierten Punkte bezüglich der Erkennung von potentiellen Substraten durch das 26S Proteasom legen den Verdacht nahe, dass neben der Polyubiquitinierung des abzubauenden Proteins auch andere Degradationsmarker vorliegen müssen. Andererseits ist die Rolle des Ubiquitins im Rahmen des Ubiquitin- 26S Proteasom- Systems, wie bereits erwähnt, nicht vollständig auf die eines Erkennungssignals für Untereinheiten des 19S Regulators innerhalb des 26S Komplexes einzuengen, sondern unter anderem auch auf eine denaturierende Wirkung auf Proteine auszudehnen, die einen suffizienten Abbau durch das Proteasom ermöglichen könnte (Michalek 1996). Inwieweit ein Nachweis von Ubiquitin- Protein- Konjugaten für einen Ubiquitin- abhängigen Abbau dieses Proteins durch das Proteasom spricht, ist in Anbetracht differierender Ergebnisse verschiedener Arbeitsgruppen kontrovers zu bewerten. So verfolgten Treier et al. zum Beispiel den Abbau des Onkoproteins cJUN; sie wiesen eine durch die δ Region vermittelte Ubiquitin- abhängige Degradation des Proteins nach (Treier 1994). Experimente einer anderen Arbeitsgruppe wiesen allerdings auf alternative Degradationssignale des cJUN hin. Das in vivo instabile Protein konnte im zellfreien System ATP- abhängig ohne Ubiquitinierung abgebaut werden. Demnach könnten auch in diesem Fall intrinsische Strukturmerkmale für die selektive Erkennung durch das Proteasom und den Abbau durch das 26S Proteasom verantwortlich sein (Jariel-Encontre 1995).
Der Abbau anderer nukleärer Onkoproteine wie cMYC und cFOS durch das Ubiquitin- System wurde von Chiechanover et al. in vitro in einem Ubiquitin- zellfreiem System untersucht. ATP stimulierte den in vitro Abbau dieser Onkoproteine, die Degradation konnte hingegen durch Gabe neutralisierender Antikörper gegen das Ubiquitin- aktivierende Enzym
Inzwischen liegen auch Daten zur Ubiquitin- Abhängigkeit des Abbaus eines viralen Proteins vor. Miller et al. haben den Abbau des NS2 Phosphoproteins, eines nicht- strukturellen Proteins des murinen Parvovirus Minute Virus, durch das Proteasom analysiert (Miller 2001). Dies ist insbesondere von Interesse, da antigene Peptide viraler Proteine typische MHC Klasse I- Liganden darstellen. Der durch MG132, Lactacystin und Epoxomicin gehemmte proteasomale Abbau des NS2 Proteins unterliegt anscheinend keiner Ubiquitinierung. In Anwesenheit der Inhibitoren ließen sich keine höher molekularen Ubiquitin- Konjugate nachweisen. Da eine Elongationsmutante für die Ubiquitinketten (UbR7; Mutation der Lysine) und eine E1- Mutante (Ub- aktivierendes Enzym) nahezu keinen Einfluss auf die Stabilität des Proteins hatten, wurde auf einen Ubiquitin- unabhängigen Abbau des viralen NS2 Phoshoproteins geschlossen. Aufgrund dieser Ergebnisse stellte sich die Frage nach alternativen Degradationssignalen. Mutationen innerhalb bestimmter Regionen des NS2 Proteins zeigten zwei kritische Regionen (Nukleotidposition 2125-2175 und 2175-2268), die für die Stabilität des Proteins von Bedeutung zu sein scheinen. Diese „cis-acting elements“ partizipieren jedoch nur bedingt in der Stabilisierung des Proteins, zusätzlich müssen weitere Elemente existieren (Miller 2001). In Hinblick auf den Abbau des mCMV Proteins pp89 und die Suche nach Degradationssignalen wurde nach Übereinstimmungen zwischen den Proteinsequenzen des rekombinanten bzw. des endogen exprimierten pp89 mit dem NS2 Protein gesucht, wobei sich allerdings keine signifikanten Sequenzhomologien finden ließen. Allerdings können die beschriebenen Sequenzabschnitte des NS2 Proteins auch bestimmte Domänen bilden. Ein Vergleich zur Tertiärstruktur des pp89 ist jedoch aufgrund der unbekannten Proteinstruktur nicht möglich.
Kalejta et al. zeigten für den proteasomalen Abbau der Retinoblastoma- Familie von Tumorsuppressoren (Rb Proteine p105, p107 und p130), dass dieser nicht einer Konjugation an Ubiquitin unterliegt, sondern vielmehr das Phosphoprotein pp71 des hCMV (UL 82 Gen) Einfluss auf die Degradation der Rb Proteine nimmt. Dies trifft allerdings nur für mit hCMV infizierte Zellen zu, da p130 in Abwesenheit von pp71 Ubiquitin- abhängig vom Proteasom abgebaut wird. Das hCMV pp71 reguliert den Zellzyklus und stimuliert infizierte Zellen nach Arrest zwischen G1- und S-Phase des Zyklus, erneut in den Zellzyklus einzutreten und in die
Neben dem Ubiquitin sind so genannte PEST- Motive (Abb.7), die hydrophile Sequenzabschnitte mit entsprechenden Aminosäuren (P, E oder B, S, T) darstellen, als Degradationssignale von Proteinen bekannt (Rechsteiner 1996, Jariel-Encontre 1995). In der Proteinsequenz des pp89 kommen laut Vorhersageprogrammen PEST- Motive (AS 54-76, AS 386-423, AS 423-513 und AS 513-535) vor (
Die Primärstruktur von Proteinen und die daraus resultierende Konformation insbesondere in Hinblick auf die Oberflächenladung und Oberflächenhydrophobizität der Proteine scheinen beim Abbau von Proteinen eine wichtige Rolle zu spielen. Anhand der proteasomalen Degradation und MHC Klasse I- Epitopgenerierung des Nef Proteins, eines regulatorischen Proteins des HIV, und anschließender Sequenzanalysen fiel auf, dass die vom Proteasom prozessierten CTL- Epitope in so genannten Cluster Regionen vorkommen und weitaus häufiger generiert werden als Peptide aus Non- Cluster Regionen. Die Epitop- tragenden Cluster Regionen beinhalten vorwiegend hydrophobe Proteinabschnitte, wohingegen die Non- Cluster Regionen hydrophile Bereiche ausmachen. Somit lässt sich für das Nef Protein eine Korrelation zwischen Grad der Hydrophobizität, proteasomaler Prozessierung und der Dichte von CTL- Epitopen demonstrieren (Lucchiari-Hartz 2003). Die Bevorzugung hoch konservierter, hydrophober Sequenzabschnitte durch das Proteasom steht im Einklang mit der Schnittpräferenz des Proteasoms für hydrophobe P1 Reste, wie sie auch im Falle des pp89 Epitops (P1: Leucin) zu beobachten ist. Hydrophobe Interaktionen der Substrate mit der hydrophoben Innenseite des Proteasoms sind einerseits für die Translokation der Substrate, andererseits für die Stabilisierung des entfalteten Proteins von Bedeutung. Die für das HIV- Nef Protein charakteristischen Epitop Cluster lassen sich auch bei anderen Viren wie HBV, HCV oder den Tumorantigenen Melanoma Antigen gp100, PRAME Protein oder Her-2_neu nachweisen. Somit scheint zumindest für klassische MHC Klasse I- Liganden die Hydrophobizität einer Proteinsequenz eine Art Degradationssignal für das Proteasom darzustellen (Lucchiari-Hartz 2003). Hydrophobe Proteinabschnitte innerhalb der Region des mCMV pp89 Epitops könnten somit für die Prozessierung des viralen Proteins zum spezifischen 9mer eine Rolle spielen. Hydrophobizitätsanalysen (Kyte & Doolittle) zufolge befinden sich 30 AS vor und etwa 15AS nach der Epitopregion des 9mers yphfmptnl hydrophobe Sequenzabschnitte. Die Epitopregion selbst ist nicht als hydrophob beschrieben worden (
Wie die aktiven Untereinheiten des 20S Proteasoms (β1, β2, β5 in zwei Kopien) untereinander während der Proteindegradation koordiniert sind und vielmehr die Produktion der MHC Klasse I- Liganden steuern, stellt eine bislang nicht beantwortete Frage dar. Die Interaktionen zwischen den vermutlich kooperativen Untereinheiten werden zum gegenwärtigen Zeitpunkt im Sinne eines zweiseitigen Modifier Modells interpretiert (Schmidtke 2000). Der Einfluss des HIV Typ1 Proteaseninhibitors Ritonavir, ein seit mehreren Jahren in der Therapie des AIDS erfolgreich etabliertes Medikament, wurde auch bezüglich der Wirkung auf das Immunsystem, insbesondere der Produktion von viralen MHC Klasse I- Liganden untersucht. In mehreren Fällen wurde eine verminderte Antigenpräsentation unter Ritonavirapplikation beobachtet. So hemmt Ritonavir den Abbau des immediate early gen product pp89 des mCMV bei einer Konzentration von 50μM, bei 10μM waren diese Auswirkungen auf den Substratumsatz jedoch nicht nachzuweisen. Analysen über die Interaktion von Ritonavir und dem Proteasom, das für die Synthese dieser viralen Epitope verantwortlich ist, zeigten einerseits einen hemmenden Effekt von Ritonavir auf die Chymotrypsinaktivität (β5), andererseits eine Stimulierung der Trypsinaktivität (β2) (Schmidtke 1996). Das Ritonavir bindet nicht wie bisher beschriebene Proteasomeninhibitoren direkt an die katalytisch aktiven Untereinheiten, sondern vielmehr an eine katalytisch inaktive „modifier site“. Somit wurde ein zweiseitiges Modifier Modell postuliert, wobei ein Bindungsort durch das aktive Zentrum verkörpert ist, die zweite Bindungsregion hingegen als so genannte „modifier site“ an anderer, zurzeit noch unbekannter Lokalisation inner- oder außerhalb der α- Ringe des 20S Core- Komplexes zu suchen ist. Von Interesse in diesem Kontext ist insbesondere die physiologische Rolle eines derartigen Modifier Modells. Potentielle Liganden wie SDS, Cardiolipin, Polykationen oder Fettsäuren, für die ein regulierender Effekt auf die Proteasomaktivität beschrieben wurde, könnten im Rahmen dieses Modells ebenso wie der PA28 oder 19S Regulator einen Einfluss auf die proteasomale Aktivität haben. Die Auswirkungen von Ritonavir im Sinne einer verminderten MHC Klasse I- Antigenpräsentation und folglich reduzierter zytotoxischer T- Zellantwort legen einen pharmakologischen Angriffspunkt der so genannten „modifier sites“ nahe (Schmidtke 2000). Würde es gelingen, diese Bindungsorte näher zu charakterisieren und entsprechende die Peptidhydrolyse steuernde Liganden ausfindig zu machen, könnte man therapeutischen Einfluss auf die Generierung von MHC Klasse I- Liganden nehmen. Dies wäre einerseits im Sinne eines inhibitorischen Effekts auf die Epitopgenerierung insbesondere zur Verhinderung von Transplantatrejektionen denkbar. Eine regulierte Hemmung des Proteasoms könnte diese Rejektionen reduzieren, andererseits könnte durch kontrollierte Inhibition des Proteasoms die notwendige immunsupprimierende Therapie dezimiert und das Risiko von Infektionen vielfältiger Natur vermindert werden. Konzipiert man den konkreten Fall eines Allograft- Patienten genauer, wäre eine Hemmung durch
Neben dem beschriebenen Therapieansatz ist des Weiteren eine antivirale Zytoimmuntherapie denkbar, die in klinischen Studien nach Gabe von antiviralen CD8+ T- Lymphozyten eine reduzierte Inzidenz der Posttransplantations- CMV- Erkrankung bewirkte (Riddell 1992). Selbstverständlich ist auch eine klassische Vakzinierung zur Induktion einer spezifischen T- Zellantwort in Erwägung zu ziehen. Eine Deletion von Immunescape Genen könnte in Form eines neuen Impfvirus eine erhöhte Präsentation antigener Peptide nach sich ziehen (Reddehase 2002). Das im Rahmen dieser Arbeit benutzte Mausmodell sollte auch für die aufgezählten Ausblicke wissenschaftlicher Untersuchungen die notwendige Grundlage darstellen.
Das Proteasom ist eine ATP- abhängige Protease, die sich aus vielen Untereinheiten zusammensetzt. Es ist unter anderem für die Generierung der MHC Klasse I- restringierten Peptide verantwortlich, die nach Komplexbildung mit spezifischen MHC Klasse I- Molekülen auf der Zelloberfläche präsentiert werden. Nicht- funktionelle Proteine, die als so genannte defective ribosomal products (DRIP) bezeichnet werden, stellen eine wichtige Quelle für die Generierung von antigenen Peptiden, insbesondere jedoch von viralen Peptiden dar. Der Abbau von polyubiquitinierten Proteinen durch das 26S Proteasom ist Grundlage für die Generierung von MHC Klasse I- Liganden. Allerdings ist weiterhin unklar, ob virale Proteine zwingend einer Ubiquitinierung bedürfen, um vom 26S Proteasom erkannt und abgebaut zu werden. Im Rahmen dieser Arbeit sollte der Proteasom- abhängige Abbau des mCMV ie pp89 Proteins vor allem hinsichtlich einer potentiellen Ubiquitinierung untersucht werden. Die Generierung des pp89 Epitops bzw. des 11mer Precursors wurde bislang für synthetische pp89 Peptide (21-40mere) untersucht. Um den physiologischen Bedingungen näher zu kommen, wurden Konstrukte sowohl für ein rekombinantes pp89 (rek pp89) als auch für ein ODCpp89 Fusionsprotein entworfen. Somit konnten der in vitro Abbau dieser Proteine durch das Proteasom und die Prozessierung des spezifischen MHC Klasse I- restringierten H-2Ld Epitops bzw. des 11mer Precursors verfolgt werden. Experimente zum in vivo Abbau des endogen exprimierten pp89 und zum Nachweis einer potentiellen Ubiquitinierung wurden mit stabil transfizierten Mausfibroblasten (B8 Zellen) durchgeführt.
Die experimentellen Daten sprechen für einen schnellen in vitro Abbau des rek pp89 durch das 20S Proteasom. Das rekombinante Protein weist eine partielle Faltung auf, etwa 41% der Sekundärstrukturelemente lassen sich antiparallelen β- Faltblättern zuordnen. Für das pp89 Epitop spezifische CTL Assays weisen auf die Generierung des korrekten MHC Klasse I- Epitops bzw. dessen 11mer Precursorpeptids hin. Das ODCpp89 Fusionsprotein wurde in Anwesenheit von Antizym durch 26S Proteasomen verdaut. Auch in diesem Falle konnten mit dem CTL Assay das 9mer Epitop bzw. das 11mer Peptid des pp89 nachgewiesen werden. Eine mögliche Ubiquitinierung des pp89 wurde
in vivo
in Zellkulturen untersucht. Nach Gabe von Proteasomeninhibitoren zu Mausfibroblasten konnte eine starke Akkumulierung von Ubiquitin- Konjugaten beobachtet werden. Allerdings wurden auch nach radioaktiver Markierung des pp89 mit
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S Methionin und anschließender Immunopräzipitation mit polyklonalen αpp89- Antikörpern keine pp89- Ubiquitin- Konjugate beobachtet. Demzufolge ist für die Generierung des viralen MHC Klasse I- restringierten Epitops des mCMV pp89 ein Proteasom- abhängiger, aber Ubiquitin- unabhängiger Abbauweg denkbar.
Zunächst gilt mein herzlicher Dank Herrn Prof. Dr. Peter M. Kloetzel, der mir einerseits die Möglichkeit eröffnet hat, in seiner Arbeitsgruppe diese Dissertation anzufertigen. Andererseits möchte ich mich auf diesem Wege auch für seine ständige Diskussionsbereitschaft und Toleranz hinsichtlich meiner durch das parallele Studium bedingten zeitlichen Einschränkungen erkenntlich zeigen.
Mein persönlicher Dank richtet sich aber auch im Besonderen an Frau Dr. Ulrike Kuckelkorn, die mir als Betreuerin über die Jahre mit viel Engagement, Zeit und Geduld zur Seite stand, ohne ihre aufopferungsvolle Hilfe wäre diese Arbeit nicht möglich gewesen. Ihre zahlreichen Ideen und praktischen Tipps waren zu jeder Zeit von herausragendem Wert.
Des Weiteren richtet sich mein Dank an das gesamte Team der Arbeitsgruppe, das ich aufgrund der freundlichen Umgangsformen und ausgesprochenen Hilfsbereitschaft sehr schätzen gelernt habe. Exemplarisch sei an dieser Stelle Frau Ilse Drung und Herrn Dirk Licht für ihre experimentellen Hilfestellungen, Frau Dr. Beate Braun für die Bereitstellung der 26S Proteasomen, Frau Dr. Ulrike Salzmann und Dr. Ulrike Seifert für die Einführung in den pp89 CTL assay, Frau Dr. Katharina Janek für die MS- Analysen und Frau Dr. Andrea Soza für die praktische Einarbeitung in das Thema gedankt.
Des Weiteren sei auch dankend auf Herrn Dr. Hartmut Hengel für die Bereitstellung der pp89 Antikörper, auf Dr. Bohmann und Dr. Murakami für die Überlassung der Plasmide und Herrn Dr. Peter Henklein für die Synthese der Peptide verwiesen.
Hiermit erkläre ich, dass ich die vorliegende Arbeit selbständig und ohne fremde Hilfe angefertigt habe. Die benutzten Hilfsmittel sowie die Literatur sind vollständig angegeben, die vorliegende Dissertation stellt keine Kopie anderer Arbeiten dar.
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Antje Voigt