2. MATERIAL UND METHODEN

2.1. Versuchstiere

2.1.1. Systematik

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Die Untersuchungen zu Lern- und Gedächtnisprozessen wurden am Gesangssystem von Zebrafinken durchgeführt. Es wurden Nachzuchten vom australischen Wildtyp verwendet. Der australische Zebrafink (Taeniopygia guttata (Abbildung 6)) wird der Familie der Prachtfinken (Estrildidae) zugeordnet, welche der Unterordnung der Singvögel (Oscines) innerhalb der Ordnung der Sperlingsvögel (Passeriformes) angehören.

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Abb. 6: Zebrafinkenpaar; links: Männchen, rechts: Weibchen (Grzimek 1980).

2.1.2. Herkunft, Aufzucht, Haltung

Die Fragestellungen wurden an adulten, gesangsdepriviert und sozial aufgezogenen Männchen und Weibchen untersucht. Die sozial aufgezogenen Tiere wurden in einer Flugvoliere von 186 x 86 x 62 cm gehalten. Zur Nachzucht wurde jeweils ein Zebrafinkenpaar in einem Käfig von 28 x 40 x 51 cm gehalten. Wenn die Brut 100 Tage alt und somit adult war, wurde sie in die Flugvoliere gesetzt. Um ausreichend genetischen Austausch zu gewährleisten, wurde die eigene Nachzucht der Abteilung durch Tiere von der Firma JOKO Zoomarkt (Bramstedt / Bassum) ergänzt.

Die Gesangsdeprivation erfolgte nach einer üblichen Methode (Wallhäusser-Franke et al. 1995; Basham et al. 1996). Von einem Brutpaar wurde fünf Tage nach dem Schlupf der Jungtiere der Vater aus dem Aufzucht-Käfig entfernt, so dass die Jungtiere nur von

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der Mutter aufgezogen wurden. Die Tiere konnten keinen adulten männlichen Zebrafinken hören oder sehen. Die Tiere beider Aufzuchtgruppenwurden in einem Tag-Nacht Rhythmus von 14:10 Stunden mit Futter und Wasser ad libidum gehalten.

2.2. Gesangsaufnahmen und Sonagramme

Lautäußerungen adulter Tiere (sozial und gesangsdepriviert aufgezogener Männchen und Weibchen) wurden aufgezeichnet, und von diesen akustischen Aufnahmen wurden Sonagramme erstellt (siehe Abschnitt 2.2.3.: Abbildung 7, 8). Für die Tonaufnahmen wurde das jeweilige Tier in einen separaten Käfig gesetzt, der akustisch von den anderen Tieren getrennt war. Ein Mikrofon wurde etwa zehn Zentimeter vor dem Käfig aufgestellt. Es wurde ein Kondensormikrofon (ECM-959; Sony®) verwendet. Die Lautaufnahmen wurden auf einem digitalen Aufzeichnungsgerät (DAT-Recorder; TCD 08; Sony®) aufgezeichnet. Die Aufnahmen erfolgten in einem Frequenzbereich von 50 - 18 000 Hz.Die digitalisierten Gesangsaufnahmen der verschiedenen Untersuchungsgruppen wurden auf einen Computer überspielt. Mit Hilfe eines für Vogelgesangsanalysen entwickelten Programms (Canary 1.2.) wurden aus den digitalisierten Daten Zeit-Frequenz-Diagramme (Sonagramme) erstellt. Die Sonagramme wurden mit einer „fast fourier transformation” (FFT) von 256 Punkten erstellt. Für die Sonagramme ergibt sich bei einem Frequenzbereich von 11 kHz eine Frequenzauflösung von 86,13 Hz und eine Zeitauflösung von 5,80 ms.

2.2.1. Lautäußerungen sozial und gesangsdepriviert aufgezogener Tiere

Der Gesang adulter gesangsdepriviert aufgezogener Zebrafinkenmännchen unterscheidet sich von dem adulter sozial aufgezogener Zebrafinkenmännchen (Abbildung 7). Die Strophen gesangsdepriviert aufgezogener Männchen enthalten weniger Einleitungselemente als die Strophen sozial aufgezogener Männchen und die Länge der Pausen zwischen den Einleitungselementen unterscheidet sich bei gesangsdeprivert aufgezogenen Männchen von denen der sozial aufgezogenen Männchen (Nixdorf-Bergweiler et al. 1999b). Auch die einzelnen Motive setzten sich

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aus weniger Elementen zusammen, die Strophen sind tendenziell länger als bei sozial aufgezogenen Männchen, wie anderweitig schon beschrieben wurde (Eales 1985; Morrison and Nottebohm 1993).

Abb. 7: Oben: Sonagramm einer Strophe aus dem Gesang eines adulten sozial aufgezogenen Zebrafinkenmännchens; unten: Sonagramm einer Strophe aus dem Gesang eines adulten gesangsdepriviert aufgezogenen Zebrafinkenmännchens (modifiziert nach Nixdorf-Bergweiler et al. 1999a).

Abkürzungen: f: Frequenz, kHz: Kilohertz, t: Zeit, s: Sekunden

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Bei der Vokalisation der Weibchen konnte zwischen gesangsdepriviert aufgezogenen und sozial aufgezogenen Tieren kein Unterschied festgestellt werden (Abbildung 8). In beiden Gruppen waren die Kontaktrufe kurz und wurden von den einzelnen Tieren immer gleichartig geäußert. Die Kontaktrufe waren weder bei gesangsdepriviert noch

bei sozial aufgezogenen Weibchen frequenzmoduliert, wie es für die Kontaktrufe der Zebrafinkenmännchen typisch ist, da sie bei Weibchen angeboren sind (Simpson and Vicario 1990).

Abb. 8: Vergleich der Sonagramme eines Kontaktrufs eines adulten sozial (oben) und eines gesangsdepriviert (unten) aufgezogenen Zebrafinkenweibchens. Die Kontaktrufe der beiden unterschiedlich aufgezogenen Zebrafinkenweibchen unterscheiden sich nicht (Abkürzungen: f: Frequenz, kHz: Kilohertz, t: Zeit, s: Sekunden).

2.3. Methoden der Fasermarkierungsstudie

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Die Untersuchungen zu Faserverbindungen innerhalb der AFP wurden an sieben sozial aufgezogenen adulten Männchen und an acht sozial- und zwei gesangsdepriviert aufgezogenen adulten Weibchen durchgeführt. Die Tiere bekamen in vivo fluoreszente Marker („Tracer") appliziert (Tabelle 2), die einige Tage im lebenden Tier transportiert wurden. Die Markierung von Faserverbindungen wurde anhand von Gehirnschnittpräparaten am Fluoreszenzmikroskop untersucht.

Tab. 2: Tabellarische Übersicht zur Anzahl der in vivo Injektionen in die Gesangsareale HVC, DLM, LMAN und RA bei sozial aufgezogenen Männchen (M.soz.), sozial aufgezogenen Weibchen (W.soz.) und gesangsdepriviert aufgezogenen Weibchen (W.depr.); Abkürzungen: N = Anzahl der Tiere pro Gruppe; n = Anzahl der Injektionen pro Gehirnareal innerhalb einer Gruppe.

Gesangsareale

Injektionen

 

M.soz. (N = 7)

W.soz. (N = 8)

W.depr. (N = 2)

HVC

n = 5 (N = 3)

n = 1 (N = 1)

-

DLM

n = 6 (N = 3)

n = 6 (N = 3)

n = 2 (N = 1)

LMAN

n = 7 (N = 4)

n = 15 (N = 8)

n = 3 (N = 2)

RA

n = 2 (N = 2)

-

n = 1 (N = 1)

Als Marker von Faserverbindungen dientendie mit Fluoreszenzmolekülen gekoppelten DextranamineRhodamin-Dextranamin (RDA: Absorptionsmaximum: 541 nm, Emissionsmaximum: 572 nm, Lysin-gekoppelt; Molecular Probes Inc. USA) und Fluorescein-Dextranamin (FDA: Absorptionsmaximum: 491 nm, Emissionsmaximum: 518 nm, Lysin-gekoppelt; Molecular Probes Inc. USA). Beide Farbstoffe haben ein Molekulargewicht von 10 000. Die Farbstoffe wurden in kleinen Aliquots gelöst (siehe 6.2.), bei –18 °C tiefgefroren und lichtgeschützt aufbewahrt. Für die Applikation des Farbstoffes wurden mit Hilfe eines horizontalen Elektrodenziehgerätes (Micropipette-Puller P-97; Sutter Instruments) Glaskapillaren mit Öffnungen von etwa 0,2 µm hergestellt. Diese Glaskapillaren wurden mit Hilfe eines Nanoliterinjektors (World Precision Instruments) mit dem jeweiligen Fluoreszenzfarbstoff gefüllt.

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Für die Applikation der fluoreszenten Marker wurden die Tiere durch eine Equithesin-Injektion (siehe 6.2.) in den Brustmuskel betäubt und in einem stereotaktischen Kopfhalter fixiert. Anschließend wurden die Kopffedern entfernt. Somit konnte man die Stelle, an der beide Hemisphären und das Cerebellum aneinander grenzen, durch die Schädeldecke erkennen. Da diese Stelle aussieht wie ein auf dem Kopf stehendes Y, wird sie üblicherweise in Gehirnatlanten als „Y-point” bezeichnet. Dieser Punkt dient als Null-Koordinate. Von ihm ausgehend wurden die Koordinaten für die Gehirnregionen abgemessen und bestimmt. Als Grundlage zur Bestimmung der Koordinaten dienten persönliche Aufzeichnungen, die mir freundlicherweise von B. E. Nixdorf-Bergweiler zur Verfügung gestellt wurden. An den jeweiligen Koordinaten wurde mit einer Pinzette ein kleines Loch in die Schädeldecke präpariert. Mit Hilfe eines Mikromanipulators konnte die mit Farbstoff gefüllte Kanüle in der x-, y- und z-Ebene mit einer Feinsteuerung im Mikrometer-Bereich genau positioniert werden. Die Menge des applizierten Farbstoffs konnte mittels des Nanoliterinjektors genau dosiert werden (zwischen 13-27 Nanolitern). Nachdem der „Tracer" drei bis vier Tage im lebenden Tier transportiert worden war, wurde dieses mit Nembutal betäubt und, wie in Abschnitt 2.4.1. beschrieben, perfundiert. Als Fixativ wurde 4 % Paraformaldehyd in 0,125 M Phosphatpuffer (siehe 6.2.) benutzt. Die herauspräparierten Gehirne wurden im Fixativ bei 4 °C aufbewahrt und später für die Gefrierschnitttechnik aufgearbeitet.

2.3.1. Anfertigung von Gefrierschnitten

Für die Anfertigung von Gefrierschnitten wurden die im Fixativ aufbewahrten Gehirne zunächst für einige Stunden in eine bei 4 °C gekühlte 15 %ige Saccharose / Fixativ-Lösung (siehe 6.2.) überführt und anschließend in einer 30 %igen Saccharose / Fixativ-Lösung (siehe 6.2.) ebenfalls bei 4 °C aufbewahrt. Die Gehirne verblieben so lange in der jeweiligen Lösung, bis sie von dieser vollständig durchdrungen waren, was durch das Absinken des Gehirns auf den Boden erkennbar war. Diese Schritte dienen neben einer leichten Postfixierung auch dazu, ein Platzen der Zellen durch Kristallbildung während des Gefrierens beim nachfolgenden Gefrierschneiden zu verhindern. Die Gefrierschnitte wurden an einem Mikrotom (Jung RM2035; Leica), das mit einer

mobilen Gefriereinrichtung (Frigomobil; Jung RM2035; Leica) kombiniert war, angefertigt. Hierzu wurde der Schnittblock auf –22 °C gekühlt. Um das Präparat auf dem Schnittblock zu fixieren und ein vollständiges Schneiden ohne Verlust der Anschnittsfläche zu ermöglichen, wurde auf dem Schnittblock ein kleiner Podest aus „Tissue-Tek" (Miles) angefertigt, der am Mikrotom plan geschnitten wurde. Das postfixierte Gehirn wurde durch einen Schnitt in die zwei Hemisphären getrennt. Eine Gehirnhälfte wurde wieder in der 30 %igen Saccharose / Fixierlösung aufbewahrt, die andere Hemisphäre wurde auf dem Podest aufgefroren und durch Überschichtung mit „Tissue-Tek" eingebettet.Die eingebettete Hirnhälfte wurde für 30 Minuten bei – 22 °C auf- und durchgefroren. Im Anschluss wurden am Mikrotom mit einem Messerwinkel von 6 ° bei –18 °C 30 µm dicke Gefrierschnitte angefertigt. Die Serienschnitte wurden lichtgeschützt in mit Phosphatpuffer gefüllten Gewebekulturplatten gesammelt, um ein Ausbleichen des Fluoreszenzfarbstoffes zu verhindern.

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Die Schnitte wurden alternierend in drei Serien aufgeteilt, auf gelatinisierte Objektträger (siehe 6.2.) aufgezogen und luftgetrocknet. Eine Serie wurde einer Nissl-Färbung (siehe 6.2.) unterzogen und mit dem Einbettmedium Merckoglas (Merck) eingedeckelt. Die beiden anderen Serien wurden für nachfolgende fluoreszenzmikroskopische Analysen mit „Fluoromont" (Serva) eingedeckelt. Bei der anschließenden Analyse der Fluoreszenzschnittpräparate konnten im Fluoreszenzsmikroskop beobachtete Injektionsstellen, beziehungsweise gefärbte Zellen und Fasern durch den Vergleich mit den korrespondierenden Nissl-gefärbten Schnitten am Lichtmikroskop die Lage der beobachteten Fluoreszenzfärbungen im Gehirn bestimmt werden.

2.3.2. Auswertung und Dokumentation der Fluoreszenzpräparate

Die fluoreszenzmarkierten Schnittpräparatserien wurden an einem Fluoreszenzmikroskop (AHBT3 Research Photomicrographic Microscope System mit AH3-RFC Reflected Light Fluorescence Attachment; Olympus) fotografiert. An das Mikroskop war eine Videokamera (CCD-Kamera, Photonic Science Cool ColourView 3) angeschlossen, welche dazu benutzt wurde, digitalisierte Bilder in den Computer einzulesen. Mit Hilfe dieses Systems und unter Verwendung der Software Image Pro Plus (Image-Pro© Plus, Version 1.3 for Windows, Media Cybernetics) wurden digitale Bilder der Fluoreszenz-Präparate erstellt.

2.4. Methoden der morphometrischen Studie

Die morphometrischen Untersuchungen wurden an zwölf sozial und sieben gesangsdepriviert aufgezogenen Männchen und an sieben sozial und sieben gesangsdepriviert aufgezogenen Weibchen durchgeführt. Aus der Gruppe der sozial aufgezogenen Tiere war von fünf Männchen und vier Weibchen Schnittmaterial bereits vorhanden.

2.4.1. Betäubung, Perfusion und Gehirnentnahme

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Die Betäubung der Tiere erfolgte durch eine intramuskuläre Injektion von 0,03 ml reinem Nembutal (Sanofi CEVA) in die Brustmuskulatur. Anschließend wurden die Tiere über die linke Herzkammer wie folgt perfundiert: Zuerst wurde zwei Minuten mit physiologischer Kochsalzlösung (0,9 %) perfundiert, um blutfreies Gewebe zu erhalten. Danach wurde für 15 - 20 Minuten mit einem 3 %igem Glutardialdehyd- / Paraformaldehyd-Gemisch, dem zur besseren Konservierung der Membranen CaCl2 zugesetzt worden war ((Karnovsky 1965); siehe 6.2.), perfundiert, um eine vollständige Fixierung des Gewebes zu gewährleisten. Nach der Perfusion wurden die Tiere für etwa zwei Stunden bei 4 °C aufbewahrt, um die Entstehung von „post mortem Zellen" zu

verhindern (Cammermeyer 1978). Anschließend wurden die Gehirne herauspräpariert und in Fixativ bei 4 °C gelagert (3 %iges Glutardialdehyd / Paraformaldehyd-Gemisch; siehe 6.2.).

2.4.2. Anfertigung von Vibratomschnitten

Von den fixierten Gehirnen wurden an einem Vibratom (Leica VT 1000 E) 100 µm dicke Sagittalschnitte angefertigt. Hierfür wurden die Gehirne zunächst entlang der Medianfurche halbiert und mit der Schnittfläche mittels Cyanoacrylkleber (Uhu®) auf einer Halterung befestigt. Die Präparate wurden in 0,1 M Natriumcacodylatpuffer (siehe 6.2.) geschnitten und in mit Natriumcacodylatpuffer gefüllten Gewebekulturplatten gesammelt. Für eine bessere Identifizierung der Kernregionen wurden die Schnitte mit einer Methylenblau-Toluidinblau-Färbelösung (siehe 6.2.) gefärbt, indem dem Puffer ein bis drei Tropfen der Färbelösung zugesetzt wurden.

2.4.2.1. Volumenbestimmung

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Zur Volumenbestimmung der Gesangsareale wurden zunächst an einem Lichtmikroskop (Axioskop; Zeiss), das mit einem Zeichentubus ausgestattet war, die Umrisse der Areale abgezeichnet (Abbildung 9). Diese„Camera-Lucida"-Zeichnungen wurden mit Hilfe eines grafischen Tabletts (Summa Sketch III Professional; Summagraphics) in einen Computer eingelesen und so die jeweiligen Anschnittsflächen bestimmt. Zur Berechnung der Gesangsarealvolumina wurden alle Flächen eines Areals addiert und mit der Schnittdicke multipliziert.

Abb. 9: Umrisszeichnungen der Anschnittsflächen der Gesangsareale HVC, RA, LMAN und Area-X bei einem 60 Tage alten Zebrafinkenmännchen; links: rostral, oben: lateral (Nixdorf-Bergweiler 1996).

2.4.3. Anfertigung von Semidünnschnitten

Aus den Vibratomschnitten, an denen zuvor die Volumenbestimmung der Gesangsareale vorgenommen worden war (siehe 2.4.2.1.), wurden im Anschluss die Gesangsareale mit einer speziellen Rasierklinge herausgeschnitten. Diese Gewebeproben erhielten eine Markierung, anhand derer immer die ursprüngliche Orientierung des Gesangsareals im Gehirn nachvollzogen werden konnte (Abbildung 10).

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Abb.10: Abbildung zur Veranschaulichung der Vorgehensweise zur Anfertigung von Semidünnschnittpräparaten. Gezeigt wird die Lokalisation und das Herausschneiden einer Gewebeprobe mit dem Gesangsareal aus einem Vibratomschnittpräparat.

A: Nissl-gefärbter Vibratomschnitt (sagittal, 100 µm) eines adulten Zebrafinkenmännchens;
B: Vibratomschnitt nach Heraustrennen des LMAN;
C: ausgeschnittener LMAN; die Ecke mit dem spitzen Winkel diente als Markierung (*)
(d: dorsal, r: rostral).

Die Vibratomschnitte mit den ausgeschnittenen Gehirnregionen und alle übrigen Vibratomschnitte wurden auf gelatinisierte Objektträger (siehe 6.2.) aufgezogen und mit dem Einbettmedium „Merckoglas" (Merck) eingedeckelt.

Die ausgeschnittenen Gewebeproben der Gesangsareale wurden nachkontrastiert und in Kunstharz (Epon) eingebettet, um Semidünnschnitte anzufertigen. Zur

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Nachkontrastierung wurden die Gewebeproben zweimal für 15 Minuten in 0,1 M Natriumcacodylatpuffer gewaschen und anschließend für zwei Stunden in einer 1 %igen Osmiumtetroxid (OsO4) Lösung bei 4 °C aufbewahrt (siehe 6.2.). Nach dieser Nachkontrastierung, die zudem eine leichte Postfixierung des Gewebes bedingt, wurden die Gewebeproben dreimal zehn Minuten in Puffer gewaschen und in einer aufsteigenden Alkoholreihe dehydriert. Dazu wurden die Gewebeproben fünf Minuten in 30 %igem, fünf Minuten in 50 %igem, 45 Minuten in 70 %igem, 30 Minuten in 90 %igem und dreimal 20 Minuten in 100 %igem Methanol gewaschen Nach dem letzten Dehydrierungsschritt wurden die Proben zweimal 15 Minuten eisgekühltem Propylenoxid ausgesetzt und anschließend über Nacht mit einer 1:1 Mischung Propylenoxid / Epon (siehe 6.2.) infiltriert. Dadurch wurden die Präparate mit dem Kunstharz durchtränkt und gefestigt. Um die Gewebeproben in definierter Orientierung einzubetten, wurden sie einer Flacheinbettung unterzogen. Hierzu wurden die mit Kunstharzgemisch durchtränkten Gewebeproben aus dem Propylen / Epon-Gemisch gesammelt und jeweils mit einem Tropfen Epon auf Alufolie überführt und mit einer Spezialfolie (Melinex; L4103; Acar Scientific LTD) abgedeckt. Die Proben wurden über Nacht im Wärmeschrank zur Auspolymerisierung bei 60 °C inkubiert. Am folgenden Tag konnten die Gewebeproben, die nun an den Spezialfolien hafteten, von der Alufolie abgezogen werden. Die an der Spezialfolie haftenden Gewebeproben wurden mit einem Tropfen Epon auf zuvor hergestellte zylindrische Blöckchen aus Epon aufgeklebt. Die Blöckchen mit den Gewebeproben wurden zur Auspolymerisation des Kunstharzes bei 60 °C über Nacht im Wärmeschrank aufbewahrt. Im Anschluss daran konnte die noch am Präparat verbliebene Spezialfolie abgezogen werden.

Die säulenförmigen Kunstharzblöckchen wurden konisch zurechtgetrimmt, sodass die Gewebeprobe frei lag. Die Semidünnschnitte (1 µm) wurden an einem Ultramikrotom (Reichert-Jung) mit Glasmessern, die an einem Messerbrechgerät (LKB) hergestellt worden waren, angefertigt. Die erhaltenen Semidünnschnitte wurden jeweils in einem Wassertropfen auf gelatinebeschichteten Glasobjektträgern gesammelt, getrocknet und mit einer Methylenblaufärbelösung (2 C 180; Merck) nachkontrastiert. Nach dem Trocknen bei 40 °C auf der Heizplatte wurden die Semidünnschnitte mit dem Einbettmedium „Merckoglas” (Merck) eingedeckelt. An Semidünnschnitten der Hirnareale HVC, LMAN und RA wurden sowohl Soma- und Nukleusanschnittsflächen als auch die Neuronendichte der jeweiligen Hirnareale bestimmt.

2.4.3.1. Bestimmung der Soma- und Nukleusanschnittsflächen

Von den Gesangsarealen HVC, LMAN und RA wurden aus allen Untersuchungsgruppen anhand der Semidünnschnitte am Lichtmikroskop (Axioskop; Zeiss) die Anschnittsflächen der Somata und Nuklei untersucht. Das Lichtmikroskop war mit dem Neurolucida-System (MicroBrightField Version 2.0) gekoppelt. Dieses System ermöglicht es beim Blick durch das Mikroskop, sowohl das Präparat als auch den eingeblendeten Computermonitor zu sehen (Abbildung 11). Mit Hilfe eines grafischen Tabletts ist das genaue Abzeichnen der Umrisse von Somata und Nuklei möglich. Es wurden jeweils 50 Zellen pro Tier und Gesangsareal ausgemessen. Um bei allen gemessenen Zellen möglichst die gleiche Schnittebene für die Flächenberechnung heranzuziehen, wurden nur Zellen, in denen der Nukleolus sichtbar war, ausgewertet.

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Abb. 11: Soma- und Nukleusanschnittsflächenmessung; die Abbildung zeigt eine Bildschirmkopie der Neurolucida-Software mit eingeblendetem Videobild des Mikroskops. Die weißen Linien markieren die Umrisse vom Soma und Nukleus einer Nervenzelle im LMAN eines adulten sozial aufgezogenen Männchens (Semidünnschnitt: 1µm; Abkürzungen: S: Soma, N: Nukleus, n: Nukleolus, A: angeschnittenes Axon mit Myelinhülle).

2.4.3.2. Bestimmung der Neuronendichte und der Neuronenanzahl

Zur Bestimmung der Neuronendichte wurden die selben Schnittpräparate wie für die Somata- und Nuklei-Größenbestimmung verwendet. Die Analyse der Neuronendichte und die Berechnung der Neuronenanzahl pro Gehirnareal erfolgte mittels der physikalischen Disector-Technik nach Coggeshall (Coggeshall 1992; Coggeshall and Lekan 1996). Diese Technik basiert auf der ursprünglich von Sterio (Sterio 1984) beschriebenen Disector-Technik. Nach dieser Methode werden in einem bestimmten Volumen Objekte gezählt, die in einem Schnitt (Referenzschnitt) zu sehen sind, im anderen Schnitt (sogenannten „look-up” Schnitt) jedoch nicht. Hierfür wird ein ganz bestimmtes Objekt aus dem Referenz-Schnitt gewählt und dann überprüft, ob genau dieses gleiche Objekt im „look-up” Schnitt zu sehen ist. Ist das Objekt in einem Schnitt zu sehen, im anderen jedoch nicht, wird es gezählt. Die so gezählten Objekte werden als „top” (Q) bezeichnet. Des Weiteren wird die untersuchte Fläche im Referenzschnitt (aDis) bestimmt und die Höhe (h) jedes Disectors gemessen.

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Das Volumen des Disectors (VDis) wird nach folgender Formel bestimmt:

VDis = h * aDis.

Die Berechnung der Objektanzahl in dem Disector-Volumen erfolgt nach:

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NV = ΣQi / ΣVdis .

NV , die nummerische Neuronendichte, ist die Neuronenanzahl pro Volumeneinheit. ∑QI ist die Summe aller gezählten „tops". ∑Vdis ist die Summe der Disectorvolumen.

Die totale Neuronenanzahl (N) lässt sich nach folgender Formel berechnen:

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N = VRef * NV .

Dabei ist NV die Neuronenanzahl pro Volumeneinheit. VRef ist das entsprechende Referenzvolumen eines Hirnareals, welches zuvor, wie in 2.4.2.1 beschrieben, bestimmt wurde.

In dieser Studie wurden zur Bestimmung der Neuronendichte Nukleoli als „tops" gewählt. Ihr Durchmesser beträgt etwa ein bis zwei Mikrometer. Die untersuchten Schnittpräparate waren ein Mikrometer dicke Seriensemidünnschnitte. Von zwei benachbarten Schnitten (einem Disector-Paar) wurden nur die Zellen gezählt, bei denen im einen Schnitt der Nukleolus einer Zelle deutlich zu sehen war und von dieser Zelle im Nachbarschnitt der Nukleolus nicht zu sehen war. Pro Hirnareal und Tier wurden je vier Disector-Paare ausgewertet, nachdem in einer Pilotstudie ermittelt worden war, dass bei dieser Anzahl von Disector-Paaren der Fehlerkoeffizient (CE) kleiner war als die biologische Varianz (BV).

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Die Untersuchungsfläche pro Disector richtete sich nach der Größe des Gesangsareals und der Neuronengröße. Im LMAN der Weibchen und im HVC von Weibchen und Männchen betrug die Untersuchungsfläche des Disectors 4356 x 4356 µm2. Im LMAN der Männchen und im RA beider Geschlechter betrug die Untersuchungsfläche pro Disector 18360 x 18360 µm2. Die Zelldichte im jeweiligen Messareal wurde, wie oben beschrieben, bestimmt, und für alle Gehirnareale wurde die numerische Dichte pro 100000 µm3 berechnet.

Die Zellzählung wurde computergestützt an digitalen Bildern der Schnittpräparate durchgeführt. Hierfür wurden zunächst mit Hilfe einer Videokamera digitale Bilder der benachbarten Schnitte erzeugt, die genau den gleichen Ausschnitt zeigten. Zur Analyse

wurde das Programm Image Pro Plus (Image-Pro© Plus, Version 1.3 for Windows, Media Cybernetics) verwendet. Die Zellen, in denen ein Nukleolus in einem digitalisierten Bild eines Semidünnschnitts zu sehen war, im digitalisierten Bild des darauffolgenden (Nachbar-) Semidünnschnitts jedoch nicht, wurden markiert (Abbildung 12) und gezählt.

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Abb. 12: Die Abbildung zeigt lichtmikroskopisch erzeugte und digitalisierte Bilder eines Disectoren-Paares; exemplarisch sind zwei Zellen durch Pfeile markiert, die im Referenzschnitt (1) einen Nukleolus zeigen, im „look-up” Schnitt (2) jedoch nicht.

Daran anschließend wurde nach der Vorgehensweise der Disector-Technik die numerische Neuronendichte (NV) bestimmt. Mit den Daten, die mit Hilfe der Volumenbestimmung erhoben wurden, konnte für die diversen Hirnkerne der verschiedenen Zebrafinkengruppen die gesamte Neuronenanzahl der jeweiligen Struktur berechnet werden, da die Disector-Technik keine konstante Neuronendichte im Volumen voraussetzt (Sterio 1984; West 1993; Hedreen 1998a; West 1999).

Im Detail wurde mit Hilfe dieser Technik die Neuronendichte und die Neuronenanzahl der Gesangsareale HVC, LMAN und RA bei sozial und gesangsdepriviert aufgezogenen Männchen und Weibchen bestimmt.

2.4.4. Auswertung der morphometrischen Studien

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Für die jeweiligen Untersuchungsparameter wurden für jede Gruppe und jedes Hirnareal die Mittelwerte und die Standardabweichung berechnet. Der t-Test oder das

„general linear model” (GLM) wurden benutzt, um zu prüfen, ob zwischen den untersuchten Gruppen signifikante Unterschiede bezüglich eines untersuchten Parameters in den einzelnen Hirnarealen auftraten. Bei einem Vergleich zwischen zwei Gruppen wurde der t-Test verwendet, wenn mehrere Gruppen untereinander verglichen wurden, wurde das GLM benutzt. Als Signifikanzniveau wurde eine Irrtumswahrscheinlichkeit von p ≤ 0,05 angenommen. Die statistischen Berechnungen und Analysen erfolgten mit den Statistikprogrammen SAS (SAS; Germany) und Prism 3.0 (Graph Pad Inc.; USA). Bei der grafischen Darstellung der Daten wurde der Mittelwert (MW) ± die Standardabweichung (STD) der Mittelwerte dargestellt.


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23.11.2005