Untersuchungen zur Enzym-Ligand-
Wechselwirkung bei tierischen Lipoxygenasen

Dissertation

zur Erlangung des akademischen Grades

doctor rerum naturalium
(Dr. rer. nat.)

im Fach Biologie

eingereicht an der

Mathematisch-Naturwissenschaftlichen Fakultät I
der Humboldt-Universität zu Berlin

Diplom-Chemiker Matthias Walther

geboren am 20. Juni 1970 in Berlin

Präsident der Humboldt-Universität zu Berlin
Prof. Dr. Jürgen Mlynek

Dekan der Mathematisch-Naturwissenschaftlichen Fakultät I
Prof. Dr. Michael Linscheid

Gutachter:
1. Prof. Dr. Andreas Herrmann
2. Prof. Dr. Hartmut Kühn
3. Prof. Dr. Ivo Feußner

eingereicht: 25.02.2003

Datum der Promotion: 28.05.2003

Zusammenfassung

Lipoxygenasen sind nichthämeisenhaltige Dioxygenasen, die die Bildung von Hydroperoxiden aus molekularem Sauerstoff und mehrfach ungesättigten Fettsäuren katalysieren. Diese Reaktion verläuft mit hoher Positions- und Stereospezifität. Entsprechend ihrer Eigenschaft, Arachidonsäure an unterschiedlichen Positionen zu oxygenieren, unterscheidet man bei Säugetieren 5-, 8-, 12- und 15-Lipoxygenasen. Die mechanistischen Ursachen dieser unterschiedlichen Positionsspezifität sind noch nicht vollständig aufgeklärt. Als Grundlage gelten spezifische Enzym-Substrat-Wechselwirkungen, zu denen auch die Orientierung der Substratfettsäure im aktiven Zentrum der Lipoxygenase gehört.

Normalerweise binden 12/15-Lipoxygenasen Fettsäuren mit dem hydrophoben Methylende in der Substratbindungstasche. Im Rahmen dieser Arbeit konnte erstmalig eine 15-Lipoxygenase katalysierte 5-Lipoxygenierung als Folge inverser Substratbindung (Bindung mit der Carboxylgruppe im aktiven Zentrum) nachgewiesen werden, obwohl strukturell eine 15-Lipoxygenierung möglich war. Hierzu ist eine gleichzeitige Modifikation beider Enden der Fettsäure nötig. Im Gegensatz dazu ist bei der humanen 5-Lipoxygenase keine inverse Substratbindung möglich. Die Positionsspezifität dieses Enzyms geht also nicht auf eine entgegengesetzte Orientierung des Substrats im Vergleich zu 12/15-Lipoxygenasen zurück, sondern auf eine größere Substratbindungstasche (Volumenhypothese).

Versuche mit dem Lipoxygenasehemmstoff Ebselen ergaben unterschiedliche Mechanismen für die Hemmung verschiedener Enzymzustände. Die Lipoxygenase im Grundzustand, d. h. mit einem zweiwertigen Eisen, wird durch Ebselen irreversibel nach einem nicht-kompetitiven Mechanismus gehemmt. Dies geschieht durch kovalente Bindung an die Lipoxygenase und Veränderung der Eisenligandensphäre. Das aktive Enzym mit einem dreiwertigen Eisen wird nur noch kompetitiv durch Ebselen gehemmt.

Zu der Aufklärung der Beteiligung der N-terminalen Enzymdomäne an der Membranbindung der Kaninchen-Retikulozyten 15-Lipoxygenase wurde eine Trunkationsmutante exprimiert, die nur die C-terminale katalytische Domäne enthielt. Diese Mutante war enzymatisch aktiv und vermochte noch an Biomembranen zu binden. Durch ortsgerichtete Mutagenese konnten verschiedene oberflächenexponierte, hydrophobe Aminosäuren sowohl in der N- als auch in der C-terminalen Domäne identifiziert werden, die für die Membranbindung entscheidend sind. Die Kaninchen-Retikulozyten 15-Lipoxygenase bindet also hauptsächlich über hydrophobe Wechselwirkungen an Biomembranen.

Inhaltsverzeichnis

• 1 Einleitung
  • 1.1  Vorkommen und Nomenklatur von Lipoxygenasen
  • 1.2 Biologische Bedeutung der Lipoxygenasen
    • 1.2.1  Entzündungsreaktion und Asthma
    • 1.2.2 Zellreifung und Differenzierung
    • 1.2.3 Atherosklerose
    • 1.2.4 Karzinogenese
    • 1.2.5 Weitere Funktionen
  • 1.3 Die Lipoxygenasereaktion
  • 1.4 Regulation der zellulären Lipoxygenaseaktivität
  • 1.5  Struktur der Lipoxygenasen
    • 1.5.1  Primärstruktur
    • 1.5.2 Kristallstruktur der Kaninchen-Retikulozyten 15-Lipoxygenase
    • 1.5.3 Substratbindung und Determinanten der Positionsspezifität
    • 1.5.4 Hypothesen für die Ursachen der Positionsspezifität von Lipoxygenasen
  • 1.6  Lipoxygenase-Hemmstoffe
    • 1.6.1  Eigenschaften von Ebselen
  • 1.7 Ziele der Arbeit
• 2 Materialien und Methoden
  • 2.1  Materialien
    • 2.1.1  Chemikalien und Biochemikalien
    • 2.1.2 Nährmedien, Puffer und Lösungen
    • 2.1.3 Enzyme und Kits
    • 2.1.4 Plasmide und Oligonukleotide
    • 2.1.5 Bakterienstämme und Zelllinien
  • 2.2 Molekularbiologische Methoden
    • 2.2.1  Polymerasekettenreaktion
    • 2.2.2 Ortsgerichtete Mutagenese
  • 2.3 Expression der rekombinanten Lipoxygenase
    • 2.3.1  Ligation der 15-LOX-cDNA in pQE-9
    • 2.3.2 Transformation des 15-LOX-pQE-9 Plasmids und Expression des Enzyms
    • 2.3.3 Reinigung der (His)₆-15-LOX über Nickel-Agarose
    • 2.3.4 Weitere Reinigung der (His)₆-15-LOX über Q-Sepharose
    • 2.3.5 Einführung von Mutanten in das His-tag Expressionssystem
    • 2.3.6 Expression der 5-LOX
    • 2.3.7 Glyzerinkulturen
  • 2.4 Analytische Methoden
    • 2.4.1  Messung der Lipoxygenaseaktivität
      • 2.4.1.1  Photometrischer Aktivitätsassay
      • 2.4.1.2 HPLC Aktivitätsassay
    • 2.4.2  Produktanalyse
      • 2.4.2.1  Normalphasen-HPLC
      • 2.4.2.2 Chiralphasen-HPLC
      • 2.4.2.3 Massenspektrometrie
    • 2.4.3 Proteinbestimmung
    • 2.4.4 Polyacrylamid-Gelelektrophorese
    • 2.4.5 Western Blot
  • 2.5  Bestimmung von Enzymeigenschaften
    • 2.5.1  Kinetische Konstanten K_M und V_Max
    • 2.5.2 pH-Optimum
    • 2.5.3 Substratspezifität
  • 2.6  Untersuchungen mit Hemmstoffen
    • 2.6.1  Bestimmung von IC₅₀-Werten
    • 2.6.2 Untersuchungen zum Hemmmechanismus von Ebselen
    • 2.6.3 Bestimmung der Ebselen/LOX-Stöchiometrie und der Bindungsverhältnisse
    • 2.6.4 Dialyse
    • 2.6.5 Untersuchungen zur Strukturaufklärung
      • 2.6.5.1  Grundlagen der Röntgenabsorptionsspektroskopie
      • 2.6.5.2 Durchführung der EXAFS-Messungen
      • 2.6.5.3 Datenreduktion und Auswertung der EXAFS-Spektren
    • 2.6.6 Modellierung der Hemmkinetik
  • 2.7 Untersuchungen zu Membranbindungseigenschaften der 15-LOX
    • 2.7.1  Membranbindungsassay
    • 2.7.2 Umsatz von biologischen Membranen
    • 2.7.3 Bestimmung der Membranoxygenaseaktivität über Quantifizierung der Freisetzung luminaler Proteine
  • 2.8 Verschiedene Methoden
    • 2.8.1  Modellierung der Struktur der Kaninchen-Retikulozyten 15-LOX
    • 2.8.2 Anfertigen von Sequenzvergleichen und Erstellung von Restriktionskarten
    • 2.8.3 Darstellung von Diazomethan und Veresterung von Carboxylgruppen
• 3 Ergebnisse
  • 3.1  Enzymreinigung und Charakterisierung
    • 3.1.1  Die Reinigung der (His)₆-15-LOX führt zu einem mehr als 95% reinen Enzym
    • 3.1.2  Die Wildtyp-(His)₆-15-LOX hat die gleichen enzymatischen Eigenschaften, wie das native Enzym
  • 3.2  Untersuchungen zum aktiven Zentrum der 15-LOX
    • 3.2.1  Enzym-Substrat-Wechselwirkungen
      • 3.2.1.1  Die Positionsdeterminanten der Fettsäureoxygenierung bleiben bei der (His)₆-15-LOX erhalten
      • 3.2.1.2 Modifizierung des Substrats führt zu einer veränderten Postionsspezifität
      • 3.2.1.3 Inverse Orientierung des Substrats im aktiven Zentrum der Kaninchen-Retikulozyten 15-LOX erfolgt nach simultaner Modifikation des Carboxyl- und des  Methylterminus
      • 3.2.1.4 Untersuchungen mit Positionsspezifität verändernden Enzymmutanten bestätigen die inverse Substratbindung
      • 3.2.1.5 Bei der humanen 5-LOX ist keine inverse Substratbindung möglich
    • 3.2.2 Enzym-Hemmstoff-Wechselwirkungen
      • 3.2.2.1  Die katalytisch inaktive Eisen[II]-LOX wird durch Ebselen irreversibel gehemmt
      • 3.2.2.2 Ebselen bindet kovalent an die 15-LOX
      • 3.2.2.3 Ebselen verändert die Eisenligandensphäre der 15-LOX
      • 3.2.2.4 Die katalytisch aktive Eisen[III]-LOX wird durch Ebselen kompetitiv gehemmt
      • 3.2.2.5 Die kinetische Modellierung der Hemmung zeigt einen dualen Mechanismus
  • 3.3 Trunkationsexperimente und Membranbindungsstudien
    • 3.3.1  Deletion der N-terminalen β-Faltblatt-Domäne führt zu einer enzymatisch aktiven verkürzten LOX
    • 3.3.2 Die N-terminale Domäne ist nicht essentiell für die Membranbindung
    • 3.3.3 Der Austausch von oberflächenexponierten, hydrophoben zu geladenen Aminosäuren führt zu einer verringerten Membranbindungsfähigkeit
    • 3.3.4 LOX-Mutanten mit verringerter Membranbindungsfähigkeit sind weniger in der Lage, luminale Proteine aus Mikrosomen freizusetzen
• 4 Diskussion
  • 4.1  Enzymreinigung
  • 4.2 LOX-Substrat-Wechselwirkung und Reaktionsmechanismus
    • 4.2.1  Substratbindung bei 12/15-Lipoxygenasen
    • 4.2.2 Substratbindung bei der 5-Lipoxygenase
    • 4.2.3  Möglicher Einfluss einer positiv geladenen Aminosäure in der Substratbindungstasche auf die Substratorientierung
    • 4.2.4 Zusammenfassung der Erkenntnisse über die Substratbindung bei Lipoxygenasen
  • 4.3  Hemmung durch Ebselen und pharmakologische Relevanz
    • 4.3.1  Hemmmechanismen von Ebselen für die Lipoxygenase im Grundzustand und für die katalytisch aktive Form
    • 4.3.2 Bedeutung der Ergebnisse für einen Einsatz von Ebselen als LOX-Inhibitor in vivo
  • 4.4 Trunkationsexperimente und Membranbindung der LOX
    • 4.4.1  Trunkation der Lipoxygenase
    • 4.4.2 Bedeutung der N-terminalen Domäne für die Membranbindung
    • 4.4.3 Bedeutung der C-terminalen Domäne für die Membranbindung
    • 4.4.4 Zusammenfassung der Erkenntnisse zur Membranbindung der 15-LOX und Vergleich mit Ergebnissen zu anderen Lipoxygenasen
• Abkürzungsverzeichnis
• Literaturverzeichnis
• Erklärung
• Tabellarischer Lebenslauf
• Publikationen
• Danksagung

Tabellen

• Tab. 1 : Humane LOX-Gene und Verbreitung der entsprechenden LOX-Isoform (s. u.)
• Tab. 3 : Strukturen der untersuchten synthetischen Substrate. ASR=Arachidonsäure-Rest, der in allen Substraten identische Teil von der Carboxylgruppe bis zum C-18 der Fettsäuren. Für die Berechnung der Abstände wurde das am weitesten entfernte Atom am ω-Terminus verwendet.
• Tab. 4 : Gaschromatographie/Massenspektrometrie-Daten der LOX-Produkte aus dem Umsatz von Arachidonsäurederivaten. Hydroxygruppen wurden silyliert und Carboxylgruppen verestert. Die Nummerierung der C-Atome erfolgte jeweils wie für die freie Säure. Weitere Messungen erfolgten nach Hydrierung der Doppelbindungen. In Klammern: relative Häufigkeit des Ions in %. *: CH2-I wurde bei der Hydrierung zu CH3 reduziert. **: Die freie Carboxylgruppe wurde zu Unterscheidungszwecken mit Diazoethan ethyliert.
• Tab. 5 : Oxidation von Arachidonsäure-Derivaten verändert am Methylterminus durch die Kaninchen-Retikulozyten 15-LOX. Dargestellt sind die kinetischen Konstanten und die Anteile der Oxygenierungsprodukte. *: Zusätzlich zum 15-OH-Produkt wurden etwa 10% 5-Lipoxygenierung beobachtet.
• Tab. 6 : Auswirkungen der Carboxylgruppen-Veresterung auf die Oxygenierungsverhältnisse von Arachidonsäurederivaten durch die Kaninchen-Retikulozyten 15-LOX. Für die Berechnung der relativen K_M- und V_max-Werte wurden die für Arachidonsäure ermittelten (6,5 µM bzw. 22,8 s^-1) auf 1 bzw. auf 100 gesetzt. *: Keine C5=C6 Doppelbindung.
• Tab. 7 : Zusammensetzung der Produkte aus der Umsetzung von Arachidonsäurederivaten mit der WT-LOX und der I418A-Mutante.
• Tab. 8 : Oxygenierung verschiedener Fettsäuren durch die rekombinante humane 5-LOX und deren vierfach-MutanteF359W,A424I,N425M,A603I. Die jeweilige Oxygenierungsgeschwindigkeit von Arachidonsäure (C20:Δ5,8,11,14) wurde 100% gesetzt.
• Tab. 9 : Negative-Ionen-Massenspektrometrie-Daten der beiden Hauptprodukte aus der Umsetzung des Dicarbonsäure-Monomethylesters ASR-COOMe mit humaner 5-LOX und der WT-15-LOX nach Elektrospray-Ionisation. In Klammern: Relative Häufigkeit des Ions.
• Tab. 10 : Übersicht der Hemmwirkungen verschiedener gängiger LOX-Inhibitoren. Die 15-LOX (29 nM) und die jeweiligen Inhibitoren wurden in 1 ml Phosphatpuffer (0,1 M, pH 7,4) für 30 s vorinkubiert. Anschließend erfolgte eine spektrometrische Messung der Enzymaktivität mit  260 µM Linolsäure als Substrat. Die Zahlen entsprechen dem Mittelwert von mindestens zwei Messungen. ^*Der IC₅₀-Wert wurde übernommen aus (Schewe et al., 1986).
• Tab. 11 : Kinetische Parameter der LOX-Hemmung durch Ebselen ermittelt aus experimentellen Ergebnissen und dem Fit der Gleichungen (1) und (2) mit dem SIMFIT Software-Paket
• Tab. 12 : Kinetische Konstanten und pH-Optimum des WT-Enzyms und der Trunkationsmutante für den Umsatz von Arachidonsäure
• Tab. 13 : Relative Oxygenaseaktivität der WT-LOX und der Trunkationsmutante mit verschiedenen Substraten. Der Umsatz von Arachidonsäure wurde auf 100 gesetzt.
• Tab. 14 : Vergleich der Aktivitäten und Membranbindungseigenschaften der WT-LOX mit verschiedenen Mutanten lokalisiert in der N-terminalen Domäne. Für die Membranbindungseigenschaften sind die Mittelwerte dreier Experimente +/- Standardabweichung angegeben.
• Tab. 15 : Membranbindungsfähigkeit von Trp181-Mutanten im Vergleich zum Wildtyp (Mittelwerte dreier Experimente +/- Standardabweichung)
• Tab. 16 : Vergleich der Arachidonsäure- und Membranoxygenaseaktivitäten der Trp181-Mutanten mit dem Wildtyp
• Tab. 17 : Einfluss einer Doppelmutante in der N- und C-terminalen Domäne auf die Membranbindung
• Tab. 18 : Untersuchung des Einflusses weiterer oberflächenexponierter, hydrophober Aminosäuren auf die Membranbindung durch Mutation in ein Glutamat
• Tab. 19 : Vergleich der Membranbindungsfähigkeit von Mehrfachmutanten

Bilder

• Tab. 2 : Übersicht des Aufbaus der menschlichen LOX-Gene (Funk et al., 2002)
• Abb. 1 : Phylogenetischer Baum: Klassifizierung der LOXn aus Säugetieren nach (Furstenberger et al., 2002)
• Abb. 2 : Schematische Darstellung der Lipoxygenasereaktion 1. Wasserstoffabstraktion, 2. Umlagerung des Radikals, 3. Sauerstoffinsertion, 4. Reduktion des Peroxidradikals unter Wiederherstellung des aktivierten Enzymzustands (LOX-Fe[III])
• Abb. 3 : Kaninchen-Retikulozyten 15-LOX- (oben) und Sojabohnen-LOX-1-Struktur (unten) in der Backbone-Darstellung. Helix: rot, β-Faltblatt: gelb. Trotz des Größenunterschieds ist eine deutliche strukturelle Verwandtschaft zu erkennen.
• Abb. 4 : Die Eisenligandensphäre der Kaninchen-Retikulozyten 15-LOX gebildet aus vier Histidinen und dem C-terminalen Isoleucin. Der sechste Ligand ist vermutlich ein Wasser (nicht dargestellt).
• Abb. 5 : Darstellung der Positionsdeterminanten der Kaninchen-Retikulozyten 15-LOX (violett) mit dem katalytisch aktiven Eisen und der hineinmodellierten Arachidonsäure, aus (Borngraber et al., 1999).
• Abb. 6 : Produktverhältnisse der verschiedenen Kaninchen-Retikulozyten 15-LOX-Mutanten (HPLC-Chromatogramme) aus (Borngraber et al., 1999). Die jeweiligen Produkte verdeutlichen ein funktionelles Zusammenspiel der Positionsdeterminanten.
• Abb. 7 : Strukturen von 5S- und 15S-HPETE. Obwohl beide Produkte jeweils in der S-Konfigu-ration vorliegen, zeigen die Hydroperoxygruppen in entgegengesetzte Richtungen.
• Abb. 8 : Modelle der Substratbindung bei verschiedenen LOXn nach a) der Volumen-Hypothese und b) der Substrat-Orientierungs-Hypothese. Nach Wasserstoffabstraktion vom am Eisen lokalisierten doppelallylständigen C-Atom und Verschiebung des Radikals erfolgt Sauerstoffinsertion an den Pfeilen. Nach der Orientierungs-Hypothese wird das Substrat bei 5-LOXn invers, d.h. mit der Carboxylgruppe in der Bindungstasche, gebunden.
• Abb. 9 : Struktur von Ebselen
• Abb. 10 : Beispiel eines Absorptionsspektrums mit der Kantenregion. Der Bereich um die Absorptionskante wird in der XANES-Spektroskopie ausgewertet, die Feinstruktur der erweiterten Region ist für EXAFS-Untersuchungen wichtig.
• Abb. 11 : Entstehung der Röntgenabsorptions-Feinstruktur am Beispiel eines Eisenatoms mit Stickstoff-Liganden. Emittierte und zurückgestreute Welle überlagern sich, wodurch sich das Absorptionsmuster bildet.
• Abb. 12 : Instrumenteller Aufbau für EXAFS-Messungen (nach W. Meyer-Klaucke, EMBL).
• Abb. 13 : Coomassie-gefärbtes SDS-Polyacrylamid-Gel der Reinigung der (His)₆-15-LOX vom Bakterienlysat über Ni-Agarose bis zur Q-Sepharose-Elutionsfraktion. Auf jede Spur wurden 20 µg Protein aufgetragen.
• Abb. 14 : SDS-Gelelektrophorese der gereinigten (His)₆-15-LOX-Mutanten. Es wurden jeweils  5 µg Protein aufgetragen und mit Coomassie angefärbt. Alle Enzymfraktionen sind nahezu frei von Fremdproteinen. Die Trunkationsmutante (C-Term) besitzt ein geringeres Molekulargewicht, da ihr die N-terminale Domäne fehlt.
• Abb. 15 : RP-HPLC-Chromatogramm des Arachidonsäureumsatzes mit (His)₆-15-LOX. Einschub: Enantiomer-Zusammensetzung der Produkte 15-HETE und 12-HETE ermittelt über CP-HPLC. Die Ergebnisse sind identisch zu denen des WT (ohne Abb.).
• Abb. 16 : Positionsspezifität der (His)₆-15-LOX-Mutanten. Dargestellt sind Ausschnitte der RP-HPLC-Chromatogramme. Die Produkte des Arachidonsäureumsatzes entsprechen denen der Wildtyp-Mutanten.
• Abb. 17 : Oxygenierungsprodukte des Umsatzes der ω-Hydroxy-Fettsäure ASR-CH₂-OH und des Methylesters mit der 15-LOX. Vor Durchführung der HPLC wurden die Produkte der freien Säure methyliert. Insert: Die Absorptionsspektren der beiden Hauptprodukte sind sehr ähnlich und deuten auf ein konjugiertes Dien hin.
• Abb. 18 : Oxygenierungsprodukte des Umsatzes von ASR-CH₂-C-(CH₃)₃ (oben) und des Methylesters (unten) mit der Kaninchen-Retikulozyten 15-LOX. Produkte der freien Säure wurden vor der HPLC-Analyse methyliert.
• Abb. 19 : Produkte der Umsetzung des Methylesters von ASR-CH₂-C-(CH₃)₃ durch den Wildtyp und die I418A-Mutante. Unteres Insert: Fragmentierungsmuster und Schlüsselionen des Hauptproduktes der Wildtyp-Reaktion aus GC/MS. Oberes Insert: Analyse des zweiten Produktes aus der Umsetzung mit I418A mittels Elektrospray MS. Die beobachteten Ionen bestätigen das 8-OH-Produkt.
• Abb. 20 : Modelle der inversen Substratbindung bei der 15-LOX und der I418A-Mutante. Inverse Substratbindung tritt auf bei veresterter Carboxylgruppe und gleichzeitigem Vorhandensein großer oder polarer Reste am Methylterminus (R). Bei Vergrößerung der Bindungstasche durch Mutation von Ile418 zu dem kleineren Ala gelangt die Fettsäure tiefer hinein, so dass Wasserstoffabstraktion am C-10 statt am C-7 erfolgen kann. Daraus folgt statt 5-Lipoxygenierung die Bildung des  8-Lipoxygenierungsproduktes.
• Abb. 21 : HPLC-Chromatogramme der Produkte aus der Umsetzung von Arachidonsäure mit der rekombinanten humanen 5-LOX und deren vierfach Mutante F359W,A424I,N425M,A603I.
• Abb. 22 : HPLC-Chromatogramm der Umsetzung des Dicarbonsäure-Monomethylesters ASR-COOMe mit der rekombinanten humanen 5-LOX und der rekombinanten WT-15-LOX. Insert: Oxygenierungsgeschwindigkeiten des Substrats im Vergleich zu Arachidonsäure.
• Abb. 23 : Lineweaver-Burk-Diagramm der Hemmung der Fe[II]-LOX durch Ebselen nach Vorinkubation. Aufgetragen sind jeweils die Mittelwerte ± Standardabweichung dreier unabhängiger Messungen. Die Ebselen-Konzentration betrug 0-1 µM. Der gemeinsame Schnittpunkt der Geraden auf der Abszisse deutet auf eine nicht-kompetitive Hemmung hin.
• Abb. 24 : SDS-PAGE von LOX-Proben, die mit verschiedenen Mengen ¹⁴C-Ebselen inkubiert wurden (Coomassie-Färbung und Autoradiographie). Die Elektrophorese wurde in Abwesenheit von Merkaptoethanol durchgeführt. Die Radioaktivität komigriert zusammen mit der 15-LOX.
• Abb. 25 :Verlauf der Dialyse von LOX-Proben, die mit einem Überschuss an ¹⁴C-Ebselen inkubiert wurden, mit und ohne Glutathion im Dialysepuffer. Aufgetragen ist das Mengenverhältnis von Ebselen zu LOX in Abhängigkeit von der Dialysedauer.
• Abb. 26 : EXAFS-Spektren der nativen 15-LOX und des Ebselen-behandelten Enzyms. Es sind deutliche Unterschiede zwischen den beiden Spektren zu erkennen.
• Abb. 27 : Auswertung der EXAFS-Spektren der nativen LOX (a) und des LOX-Ebselen-Komplexes (b) mit dem Programm Excurve 92. Dargestellt ist jeweils die gewichtete Feinstruktur k und die entsprechende phasenkorrigierte Fourier-Transformation, aus der sich die Abstände ermitteln lassen. Rot: theoretisches Spektrum; gelb: experimentelle Daten
• Abb. 28 : Modelle der Eisenligandensphäre der nativen LOX (a) und des LOX-Ebselen-Komplex (b). Die Abstände in Å wurden aus den EXAFS-Messungen ermittelt. Für beide Modelle ergibt sich ein sechsfach koordiniertes Eisen mit leicht verzerrter oktaedrischer Anordnung. Das Wasser wurde durch Ebselen als sechsten Liganden ersetzt.
• Abb. 29 : Lineweaver-Burk-Diagramm der Hemmung der aktiven Fe[III]-LOX durch Ebselen. Die 15-LOX wurde zu einem Ansatz aus Substrat und Ebselen (verschiedene Konzentrationen) gegeben und die Enzymaktivität photometrisch bestimmt. Aufgetragen sind jeweils die Mittelwerte ± Standardabweichung dreier unabhängiger Messungen. Der Schnittpunkt der Geraden auf der Ordinate deutet auf eine kompetitive Hemmung hin.
• Abb. 30 : Semilogarithmische Darstellung der Hemmung der LOX durch unterschiedliche Ebselen-Konzentrationen. Aufgetragen sind die Restaktivitäten dreier LOX-Konzentrationen nach Vorinkubation mit Ebselen (Punkte: Mittelwerte dreier unabhängiger Messungen ± Standardabweichung, Kurven: Verlauf berechnet nach Gleichung (2))
• Abb. 31 : Restaktivitäten in Abhängigkeit vom Ebselen/LOX-Verhältnis. Ebselen und LOX wurden vorinkubiert und anschließend die spez. Aktivität der LOX anhand der Linolsäureoxygenierung photometrisch bestimmt. Die Punkte entsprechen den experimentellen Werten, der Kurvenverlauf wurde nach Gleichung (2) berechnet.
• Abb. 32 : Kinetisches Modell für die Hemmung der 15-LOX durch Ebselen. E₀: Grundzustandsenzym Fe[II]-LOX, E_a: katalytisch aktive Fe[III]-LOX, E^*: Ebselen-modifizierte LOX, K_i und K_Ma: Affinitätskonstanten der aktiven LOX für Ebselen und Substrat, K_i ^* und K_M ^*: Affinitätskonstanten der Ebselen-modifizierten LOX für Ebselen und Substrat, S: Substrat, P: LOX-Produkt, ebs: Ebselen, E_a-S und E^*-S: Enzym-Substrat-Komplexe (bilden das LOX-Produkt), E_a-ebs und E^*-ebs: Enzym-Ebselen-Komplexe (katalytisch inaktiv)
• Abb. 33 : HPLC-Chromatogramm der Arachidonsäure-Umsätze mit der rekombinanten WT-LOX und deren Trunkationsmutante (C-Terminus). Insert: Chiralität des Hauptproduktes 15-H(P)ETE.
• Abb. 34 : Reaktionsverlauf der Arachidonsäureumsetzung mit der WT-LOX und der Trunkationsmutante (C-Terminus)
• Abb. 35 : Produkte des Umsatzes von Biomembranen mit der WT-LOX (oben) und der Trunkationsmutante (C-Terminus, unten). Dargestellt sind SP-HPLC-Chromatogramme.
• Abb. 36 : Membranbindungsfähigkeit des Wildtyp-Enzyms (WT) und der Trunkationsmutante  (C-Term). Dargestellt ist der Röntgenfilm nach Western Blot analog dem Membranbindungsassay. Ü: Überstand (ungebundener LOX-Anteil), P: Pellet (membrangebundener LOX-Anteil).
• Abb. 37 : Oberflächenexponierte, hydrophobe Aminosäuren der Kaninchen-Retikulozyten 15-LOX (gelb). Blau: N-terminale Domäne, grau: C-terminale Domäne, orange: in die Bindungstasche modellierte Arachidonsäure.
• Abb. 38 : Membranbindungsfähigkeit verschiedener Mutationen von oberflächenexponierten, hydrophoben Aminosäuren in ein Glutamat. Dargestellt ist der Röntgenfilm nach Western Blot.  Ü: Überstand (ungebundener LOX-Anteil), P: Pellet (membrangebundener LOX-Anteil).
• Abb. 39 : Struktur der LOX mit den identifizierten Determinanten für die Membranbindungsfähigkeit in rot, untersuchte Aminosäuren ohne Einfluss in violett, weitere oberflächenexponierte, hydrophobe Aminosäuren in gelb (nicht untersucht). Blau: N-terminale Domäne, grau: C-terminale Domäne, orange: in die Bindungstasche modellierte Arachidonsäure.
• Abb. 40 : Membranbindungsfähigkeit verschiedener Mehrfachmutanten von oberflächenexponierten, hydrophoben Aminosäuren. Dargestellt ist der Röntgenfilm nach Western Blot analog dem Membranbindungsassay. Ü: Überstand (ungebundener LOX-Anteil), P: Pellet (membrangebundener LOX-Anteil).
• Abb. 41 : Zeitabhängigkeit der Freisetzung von PDI aus EKRM durch die WT-LOX und die Mutanten Y15E,F70H,L71K sowie Y15E,F70H,L71K,L195E. Die Freisetzung von PDI ist bei den beiden Mehrfachmutanten deutlich geringer als beim WT. In einem Kontrollexperiment ohne Enzymzusatz betrug der ermittelte Anteil an PDI im Überstand 13%.
• Abb. 42 : Linolsäure modelliert in die Bindungstasche der Gurken-13-LOX nach (Hornung et al., 1999). a) His608 schirmt die positiv geladene Aminosäure Arg758 von der Bindungstasche ab und verhindert eine Wechselwirkung mit der Carboxylgruppe der Linolsäure. b) Der Austausch His608Val lässt eine Wechselwirkung zwischen der Carboxylgruppe und Arg758 zu.