Untersuchungen zur Enzym-Ligand-
Wechselwirkung bei tierischen Lipoxygenasen

Dissertation

zur Erlangung des akademischen Grades

doctor rerum naturalium
(Dr. rer. nat.)


im Fach Biologie

eingereicht an der

Mathematisch-Naturwissenschaftlichen Fakultät I
der Humboldt-Universität zu Berlin

Diplom-Chemiker Matthias Walther

geboren am 20. Juni 1970 in Berlin

Präsident der Humboldt-Universität zu Berlin
Prof. Dr. Jürgen Mlynek

Dekan der Mathematisch-Naturwissenschaftlichen Fakultät I
Prof. Dr. Michael Linscheid

Gutachter:
1. Prof. Dr. Andreas Herrmann
2. Prof. Dr. Hartmut Kühn
3. Prof. Dr. Ivo Feußner

eingereicht: 25.02.2003

Datum der Promotion: 28.05.2003

Zusammenfassung

Lipoxygenasen sind nichthämeisenhaltige Dioxygenasen, die die Bildung von Hydroperoxiden aus molekularem Sauerstoff und mehrfach ungesättigten Fettsäuren katalysieren. Diese Reaktion verläuft mit hoher Positions- und Stereospezifität. Entsprechend ihrer Eigenschaft, Arachidonsäure an unterschiedlichen Positionen zu oxygenieren, unterscheidet man bei Säugetieren 5-, 8-, 12- und 15-Lipoxygenasen. Die mechanistischen Ursachen dieser unterschiedlichen Positionsspezifität sind noch nicht vollständig aufgeklärt. Als Grundlage gelten spezifische Enzym-Substrat-Wechselwirkungen, zu denen auch die Orientierung der Substratfettsäure im aktiven Zentrum der Lipoxygenase gehört.

Normalerweise binden 12/15-Lipoxygenasen Fettsäuren mit dem hydrophoben Methylende in der Substratbindungstasche. Im Rahmen dieser Arbeit konnte erstmalig eine 15-Lipoxygenase katalysierte 5-Lipoxygenierung als Folge inverser Substratbindung (Bindung mit der Carboxylgruppe im aktiven Zentrum) nachgewiesen werden, obwohl strukturell eine 15-Lipoxygenierung möglich war. Hierzu ist eine gleichzeitige Modifikation beider Enden der Fettsäure nötig. Im Gegensatz dazu ist bei der humanen 5-Lipoxygenase keine inverse Substratbindung möglich. Die Positionsspezifität dieses Enzyms geht also nicht auf eine entgegengesetzte Orientierung des Substrats im Vergleich zu 12/15-Lipoxygenasen zurück, sondern auf eine größere Substratbindungstasche (Volumenhypothese).

Versuche mit dem Lipoxygenasehemmstoff Ebselen ergaben unterschiedliche Mechanismen für die Hemmung verschiedener Enzymzustände. Die Lipoxygenase im Grundzustand, d. h. mit einem zweiwertigen Eisen, wird durch Ebselen irreversibel nach einem nicht-kompetitiven Mechanismus gehemmt. Dies geschieht durch kovalente Bindung an die Lipoxygenase und Veränderung der Eisenligandensphäre. Das aktive Enzym mit einem dreiwertigen Eisen wird nur noch kompetitiv durch Ebselen gehemmt.

Zu der Aufklärung der Beteiligung der N-terminalen Enzymdomäne an der Membranbindung der Kaninchen-Retikulozyten 15-Lipoxygenase wurde eine Trunkationsmutante exprimiert, die nur die C-terminale katalytische Domäne enthielt. Diese Mutante war enzymatisch aktiv und vermochte noch an Biomembranen zu binden. Durch ortsgerichtete Mutagenese konnten verschiedene oberflächenexponierte, hydrophobe Aminosäuren sowohl in der N- als auch in der C-terminalen Domäne identifiziert werden, die für die Membranbindung entscheidend sind. Die Kaninchen-Retikulozyten 15-Lipoxygenase bindet also hauptsächlich über hydrophobe Wechselwirkungen an Biomembranen.

Inhaltsverzeichnis

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05.01.2007