1 Einleitung

1.1  Vorkommen und Nomenklatur von Lipoxygenasen

Lipoxygenasen (LOXn) sind nichthämeisenhaltige Dioxygenasen. Sie katalysieren den stereospezifischen Einbau von molekularem Sauerstoff in mehrfach ungesättigte Fettsäuren unter Bildung von Hydroperoxyverbindungen. Sie sind sowohl im Tier- (Brash, 1999;Kuhn und Thiele, 1999) als auch im Pflanzenreich (Grechkin, 1998;Mack et al., 1987;Oliw, 2002) weit verbreitet und kommen auch in Pilzen (Bisakowski et al., 1997;Oliw, 2002;Su und Oliw, 1998), sowie in niederen Meeresorganismen (Brash et al., 1996;Brash et al., 1991;Hada et al., 1997;Hawkins und Brash, 1987) vor. Kürzlich wurden LOX-Gene sogar in zwei Bakterienstämmen gefunden wobei die Möglichkeit eines horizontalen Gentransfers diskutiert wurde (Porta und Rocha-Sosa, 2001).

Alle LOXn sind relativ eng miteinander verwandt. So unterscheiden sich die pflanzliche Sojabohnen LOX-1 und die 15-LOX aus unreifen roten Blutzellen (Retikulozyten) des Kaninchens zwar durch ihre Größe (95 kDa vs 75 kDa), die Raumstruktur ist jedoch sehr ähnlich. Auf der Aminosäureebene besteht zwischen diesen beiden Enzymen noch eine Sequenzhomologie von 31%, die jedoch im Bereich des aktiven Zentrums deutlich höher ist. Im Folgenden wird vor allem näher auf die LOXn aus Säugetieren eingegangen, die Gegenstand dieser Arbeit sind.

Allgemein werden LOXn nach ihrer Positionsspezifität klassifiziert, d.h. nach dem Kohlenstoffatom des Substrats Arachidonsäure ([5Z,8Z,11Z,14Z]-Eicosa-5,8,11,14-tetraensäure), an dem der Einbau des molekularen Sauerstoffs erfolgt (Smith und Weidemann, 1980;Webb, 1992;Yamamoto, 1992). Dementsprechend unterscheidet man bei Säugetieren 5-, 8-, 12- und 15-LOXn, die die folgenden primären Produkte bilden:

(5S,6E,8Z,11Z,14Z)-5-Hydroperoxyeicosa-6,8,11,14-tetraensäure (5S-HPETE) (8S,5Z,9E,11Z,14Z)-8-Hydroperoxyeicosa-5,9,11,14-tetraensäure (8S-HPETE) (12S,5Z,8Z,10E,14Z)-12-Hydroperoxyeicosa-5,8,10,14-tetraensäure (12S-HPETE) (12R,5Z,8Z,10E,14Z)-12-Hydroperoxyeicosa-5,8,10,14-tetraensäure (12R-HPETE) (15S,5Z,8Z,11Z,13E)-15-Hydroperoxyeicosa-5,8,11,13-tetraensäure (15S-HPETE).

Die gebildeten Hydroperoxide werden in zellulären Systemen schnell zu den entsprechenden Hydroxyverbindungen (HETEs) reduziert. In tierischen Zellen spielen dabei Glutathionperoxidasen (Funk, 1993;Schnurr et al., 1996) eine große Rolle. Die Lipoxygenasereaktion wird in Abschnitt 1.3 besprochen.

Die erste LOX wurde bereits 1932 beschrieben (Andre und Hou, 1932). Sie stammt aus Sojabohnen und wurde damals noch als Lipoxidase bezeichnet. 1947 gelang die Isolierung und Kristallisation des Enzyms (Theorell et al., 1947), die ersten Röntgenstrukturdaten der Sojabohnen-LOX-1 wurden jedoch erst 1993 erhalten (Boyington et al., 1993). Auch in tierischen Geweben wurden seit langer Zeit Lipidperoxidationen beobachtet, die jedoch zunächst als Häminkatalyse gedeutet wurden (Boyd und Adams, 1955;Tappel, 1953). Erst in den 70er Jahren wurden die ersten LOXn in tierischen Zellen beschrieben: in Thrombozyten (Hamberg und Samuelsson, 1974;Nugteren, 1975), Retikulozyten (Schewe et al., 1975) und polymorphkernigen Leukozyten (Borgeat et al., 1976). Seitdem steigt die Zahl der identifizierten LOXn ständig an. So wurden sie u. a. in menschlichen eosinophilen Granulozyten (Sigal et al., 1988;Turk et al., 1982), Bronchialepithelzellen (Hunter et al., 1985;Sigal und Nadel, 1988) und in der Uteruszervix (Flatman et al., 1986) beschrieben.

Durch die Fertigstellung des humanen Genomprojektes sind heute alle Gene für menschliche LOX-Isoformen bekannt. Es konnten sechs funktionelle LOX-Gene identifiziert werden, die mit Ausnahme des 5-LOX-Gens auf Chromosom 17 lokalisiert sind (Funk et al., 2002). In Tab. 1 sind die funktionellen humanen LOX-Gene zusammengefasst und die entsprechende LOX-Isoform sowie deren Verbreitung in Zellen bzw. Gewebearten angegeben.

Tab. 1 : Humane LOX-Gene und Verbreitung der entsprechenden LOX-Isoform (s. u.)

Darüber hinaus existieren mindestens drei Pseudogene. Vermutlich führten Genduplikationen, von denen man weiß, dass sie gehäuft auf Chromosom 17 vorkommen, zu der Vielzahl der LOX-Gene (International Human Genome Sequencing Consortium, 2001). In
Tab. 2 sind die Lokalisation und die Strukturen der humanen LOX-Gene dargestellt (Funk et al., 2002). Für fast alle Gene ist die Exon-Intron-Struktur identisch, obwohl sie sich in der Größe unterscheiden.

	Tab. 2 : Übersicht des Aufbaus der menschlichen LOX-Gene (Funk et al., 2002)

In der Maus wurden sieben funktionelle LOX-Gene gefunden, die sehr ähnlich zu den menschlichen organisiert sind. Sie befinden sich zum Großteil auf Chromosom 11. Zusätzlich zu den humanen Orthologen besitzen Mäuse noch eine Epidermis-Typ 12-LOX (Aloxe). Das entsprechende Gen existiert auch beim Menschen (ALOX12P2), allerdings nur als Pseudogen.

Drei der sieben Maus-LOXn konnten bereits gezielt ausgeschaltet werden (Chen et al., 1994;Johnson et al., 1998;Sun und Funk, 1996). Die entsprechenden Maus-Stämme zeigten unter Normalbedingungen keine phenotypischen Veränderungen. Auffälligkeiten konnten jedoch unter Stressbedingungen beobachtet werden, was zur Aufklärung der biologischen Rolle der LOXn beitrug.

Die oben beschriebene Einteilung der LOXn entsprechend der Oxygenierungsstelle der Arachidonsäure hat sich durch verschiedene Aspekte als unzureichend herausgestellt. Hierauf wird im Folgenden näher eingegangen:

• Der Vergleich von Sequenz und Enzymeigenschaften der beiden 15-LOXn aus Kaninchen-Retikulozyten und menschlichen eosinophilen Granulozyten legte nahe, dass es sich bei diesen LOXn um orthologe Enzyme in unterschiedlichen Spezies
  handelt. Die Suche nach weiteren 15-LOXn dieser Art in anderen Spezies ist bisher erfolglos geblieben. Es gibt jedoch eine Reihe von Hinweisen, dass es sich bei den Leukozyten-Typ-12-LOXn der Maus (Chen et al., 1994), des Schweins (Yoshimoto et al., 1991), der Ratte (Watanabe et al., 1993) und des Rinds (De Marzo et al., 1992) um das Funktionsäquivalent der Kaninchen-Retikulozyten 15-LOX handelt. So ist z. B. die Sequenzhomologie zwischen diesen Enzymen wesentlich höher als die zu anderen
  12-LOXn (Plättchen-Typ, Epidermis-Typ) (Kuhn und Thiele, 1999). Weiterhin haben sie ähnliche Enzymeigenschaften wie Substratspezifität und Reaktionskinetik. Die menschliche Retikulozyten-Typ-15-LOX und die Maus-Leukozyten-Typ-12-LOX zeigen einen ähnlichen Mechanismus der Regulation der Genexpression durch Zytokine (Conrad et al., 1992;Heydeck et al., 1998;Nassar et al., 1994).
• Eine zweite menschliche 15-LOX wurde 1997 in Haarwurzeln gefunden, die u. a. auch in der Haut, der Prostata und der Lunge exprimiert wird (Brash et al., 1997). Diese Epidermis-Typ-15-LOX oder 15-LOX-2 besitzt nur geringe Homologie zu der
  15-LOX-1 und fundamental andere Enzymeigenschaften. So wird Arachidonsäure ausschließlich zu 15-HPETE oxygeniert (Typ 1-15-LOX hat eine duale Positionsspezifität, 12/15 (Bryant et al., 1982;Funk et al., 1990;Kuhn et al., 1990)) und Linolsäure wird weniger effektiv umgesetzt (für Typ 1-15-LOX ist Linolsäure ein besseres Substrat als Arachidonsäure).
• In der Maus gibt es vier verschiedene 12-LOXn mit grundlegend unterschiedlichen Eigenschaften und zum Teil nur geringer Sequenzhomologie.

Aus diesen Punkten ergibt sich, dass LOX-Isoformen mit gleicher Positionsspezifität der Arachidonsäureoxygenierung nicht zwangsläufig ähnlich in ihren sonstigen Eigenschaften sein müssen. Andererseits scheinen LOXn unterschiedlicher Positionsspezifität durchaus sehr nahe miteinander verwandt sein zu können. Aus diesen Gründen wurde eine weitere Unterteilung der LOXn hinsichtlich des Vorkommens in bestimmten Zelltypen eingeführt, die zum einen der Sequenzhomologie entspricht, zum anderen auch den enzymatischen Eigenschaften und damit der biologischen Relevanz Rechnung trägt (Furstenberger et al., 2002;Kuhn und Thiele, 1999): in Retikulozyten-Typ oder auch 12/15-Lipoxygenasen (enthalten die LOXn aus Retikulozyten und Leukozyten), Plättchen-Typ (bisher nur
12-LOXn) und Epidermis-Typ (8-, 12- und 15-LOXn). Die 5-LOXn bilden eine eigene Gruppe (Abb. 1).

	Abb. 1 : Phylogenetischer Baum: Klassifizierung der LOXn aus Säugetieren nach (Furstenberger et al., 2002)

Trotz der steigenden Zahl an charakterisierten LOXn ist die Frage ihrer physiologischen Signifikanz noch zu weiten Teilen unklar. Im Folgenden wird eine Übersicht der bisher gefundenen physiologischen und pathophysiologischen Bedeutungen der tierischen LOXn, vor allem der 12/15-LOXn, aufgeführt.

1.2.1  Entzündungsreaktion und Asthma

Am besten aufgeklärt ist die Funktion der 5-LOX bei der Synthese von bioregulatorischen Verbindungen auf dem Lipoxygenase-Weg der Arachidonsäurekaskade. Dieses Enzym nimmt eine Schlüsselrolle in der Biosynthese der Leukotriene (LT) ein, die als Mediatoren bei inflammatorischen und anaphylaktischen Prozessen beteiligt sind (Lewis et al., 1990;Samuelsson et al., 1987). Damit ist die 5-LOX auch pharmakologisch von großem Inter-esse. Allerdings ist ihre proinflammatorische Rolle nur ein Aspekt, da das Enzym auch in Zellen exprimiert wird, die an entsprechenden Prozessen nicht beteiligt sind, so zum Beispiel in reifenden Keratinozyten (Janssen-Timmen et al., 1995). In ruhenden alveolaren Makrophagen ist die 5-LOX im Nukleus lokalisiert, weswegen eine Beteiligung an der Regulation der Genexpression diskutiert wird (Brock et al., 1994;Woods et al., 1995).

15-LOX Produkte besitzen sowohl pro- als auch antiinflammatorische Wirkung:
15-HPETE bewirkt eine Entzündungsreaktion in der Haut von Kaninchen (Higgs et al., 1981), 13-HODE und 5-Oxo-15-HETE induzieren Chemotaxis (Henricks et al., 1991;Schwenk et al., 1992). Auf der anderen Seite hemmt 15-HETE die Leukotrien B4 Synthese und dessen Chemotaxis (Fischer et al., 1992;Herlin et al., 1990;Vanderhoek et al., 1980). Ein in vivo Nachweis der entzündungshemmenden Aktivität der 15-LOX erfolgte in Ratten. Nieren, in die das 15-LOX Gen transfiziert wurde, sind geschützt gegen experimentelle Glomerulonephritis (Munger et al., 1999).

Ein großer Teil der antiinflammatorischen Eigenschaften der 15-LOX geht möglicherweise auf deren Beteiligung an der Bildung von Lipoxinen (LX) zurück (Übersichtsartikel: (Fierro und Serhan, 2001;Serhan, 2002)). Diese Trihydroxytetraen-Verbindungen (z. B. LXA4: 5S,6R,15S-Trihydroxy-7,9,13-trans-11-cis-eicosatetraensäure, LXB4: 5S,14R,15S-Trihydroxy-6,10,12-trans-8-cis-eicosatetraensäure) werden offensichtlich über einen transzellulären Mechanismus (Edenius et al., 1990;Edenius et al., 1991;Serhan und Sheppard, 1990) unter Beteiligung verschiedener LOX-Isoformen gebildet. Zum einen setzt die 5-LOX das 15-LOX Produkt 15-H(P)ETE zu Lipoxinen um, womit eine Hemmung der eigentlichen 5-LOX-Reaktion einhergeht (Serhan, 1994). Zum anderen kann das über die 5-LOX gebildete LTA4, die Vorstufe des pro-inflammatorischen LTB4, durch die 15-LOX (auch durch 12-LOXn) in Lipoxine umgewandelt werden. Darüber hinaus hemmen Lipoxine die Chemotaxis von polymorphkernigen neutrophilen Granulozyten (Lee et al., 1989) und deren Interaktion mit Endothelzellen (Papayianni et al., 1996), während sie die Chemotaxis und Adhäsion von Monozyten stimulieren (Maddox et al., 1997). Insgesamt sind Lipoxine also lokale, endogene Botenstoffe, die eine Hemmung der Entzündungsreaktion und Stimulation der Wundheilung bewirken können (Fierro und Serhan, 2001).

Eine Reihe von Hinweisen deutet auf eine Beteiligung der 15-LOX an bronchialem Asthma hin. So ist z. B. die 15-LOX Expression und die Zahl der 15-LOX exprimierenden Zellen in Patienten mit Asthma signifikant erhöht (Profita et al., 2000).

Viele Hinweise deuten auf eine Beteiligung der Retikulozyten-Typ 15-LOX an Zellreifungs- und Differenzierungsprozessen hin. Bereits 1975 vermuteten Schewe et al. eine entscheidende Rolle während der Erythropoese, was zunächst vor allem durch zwei experimentelle Ergebnisse gestützt wurde (Schewe et al., 1975):

1. Diese LOX besitzt die Fähigkeit, komplexe Substrate wie veresterte Fettsäuren und biologische Membranen zu oxygenieren (Murray und Brash, 1988;Schewe et al., 1975;Takahashi et al., 1993). Entsprechende Produkte wurden in der Mitochondrienmembran und zu einem geringeren Teil auch in der Plasmamembran nachgewiesen (Kuhn et al., 1990).
2. Die 15-LOX wird in den Retikulozyten des Kaninchens (Rapoport et al., 1979), der Ratte (Kroschwald et al., 1986;Schewe et al., 1990) und des Menschen (Kroschwald et al., 1989) exprimiert. Diese Expression ist zeitlich limitiert und fällt mit dem Abbau der Mitochondrien zusammen (Rapoport und Schewe, 1986). Darüber hinaus ist die ubiquitinabhängige Proteolyse der Mitochondrien in dieser Phase der Retikulozytenreifung durch 15-LOX Inhibitoren hemmbar, was für eine direkte Beteiligung der 15-LOX an diesem Vorgang spricht (Dubiel et al., 1981;Grullich et al., 2001).

Es muss allerdings betont werden, dass die 12/15-LOX nicht essentiell ist für den Mitochondrienabbau in Retikulozyten. So zeigen 12/15-LOX knock-out Mäuse unter Normalbedingungen keine signifikanten Störungen in der Erythropoese (Sun und Funk, 1996).

Ebenfalls könnten LOXn beim Abbau der Organellen während der Reifung von Fiber-Zellen in der Augenlinse eine Rolle spielen. Dies wurde aus dem Vorhandensein von LOX-Signalen in immunohistochemischen Untersuchungen der Maus-Augenlinse geschlossen (van Leyen et al., 1998). Miller et al. berichteten von einer Beteiligung der 12/15-LOX an der Interaktion von Makrophagen mit apoptotischen Zellen und an deren Phagozytose (Miller et al., 2001). Es muss allerdings betont werden, dass in vielen Phagozyten keine Expression der 12/15-LOX nachgewiesen werden konnte, weshalb das Enzym kaum als für den Prozess der Phagozytose essentiell angesehen werden kann.

Ein Schlüsselereignis in der Entstehung von atherosklerotischen Plaques ist die Bildung von lipidbeladenen Schaumzellen. Diese entstehen aus Makrophagen oder glatten Muskelzellen durch die unkontrollierte Aufnahme von modifiziertem LDL über Scavenger-Rezeptoren, welche, im Gegensatz zur LDL-Aufnahme über den LDL-Rezeptor, nicht rückkopplungshemmbar ist (Henriksen et al., 1981). Die Ablagerung dieser Schaumzellen im subendothelialen Raum der Arterien ist der erste Schritt bei der Ausbildung atherosklerotischer Läsionen.

Bereits 1985 wurde 15-HETE in der atherosklerotischen Gefäßwand nachgewiesen (Henriksson et al., 1985). Der erste direkte Hinweis auf eine Beteiligung der 15-LOX an der Entstehung atherosklerotischer Läsionen in vivo stammt von Ylä-Herttuala et al. aus dem Jahr 1990. Sie fanden 15-LOX-1 mRNA und Protein zusammen mit oxidiertem LDL in Makrophagen-reichen Regionen von atherosklerotischen Läsionen, während die normalen Gefäßwände keine LOX enthielten (Yla-Herttuala et al., 1990). Lipidextrakte von atherosklerotischen Läsionen aus Kaninchen enthielten spezifische 15-LOX-Produkte, die zeitlich mit der Lipidablagerung in der Aortenwand zusammentrafen (Kuhn et al., 1994). Ähnliche Ergebnisse ergaben sich für entsprechende menschliche Läsionen. Während Folcik et al. in allen Läsionen über einen spezifischen Anteil an 15-LOX-Produkten berichteten (Folcik et al., 1995), wurde dieser von Kühn et al. nur in den frühen Läsionen gefunden (Kuhn et al., 1997). Obwohl der Anteil der spezifischen 15-LOX Produkte relativ klein war, deutet deren Nachweis auf eine in vivo abgelaufene LOX-Reaktion hin, ohne sie jedoch zu beweisen.

Die in Endothelzellen, aktivierten menschlichen Monozyten und Maus-Makrophagen exprimierte LOX oxidiert LDL und diese Reaktion kann in vitro durch LOX-Inhibitoren gehemmt werden (McNally et al., 1990;Parthasarathy et al., 1989;Rankin et al., 1991). Genauer untersucht wurde die Reaktion der 15-LOX mit LDL im isolierten Zustand (Belkner et al., 1998) und im menschlichen Plasma (Yamashita et al., 1999). Neben der direkten Oxygenierung von LDL-Lipidestern kann die LOX auch die zuvor aus den Lipidestern enzymatisch freigesetzten Fettsäuren oxygenieren (Neuzil et al., 1998).

Weitere Hinweise auf eine proatherosklerotische Wirkung der LOX ergeben sich aus folgenden Studien: Makrophagen, bei denen das Gen für die 12/15-LOX zerstört ist, sind weniger in der Lage, LDL zu oxygenieren (Sun und Funk, 1996), während 15-LOX überexprimierende Fibroblasten und Monozyten dies verstärkt tun (Benz et al., 1995). Allerdings gilt dies nicht für alle Transfektanten, was darauf hinweist, dass die Expression der 12/15-LOX allein für ein erhöhtes zelluläres Potential zur LDL-Oxidation nicht ausreicht. Die Überexpression der 15-LOX im vaskulären Endothel führte bei transgenen Mäusen, denen der LDL-Rezeptor fehlt, zu einer Beschleunigung der Entstehung von Atherosklerose (Harats et al., 2000). Die funktionelle Zerstörung der Maus-Makrophagen-12-LOX in Apolipoprotein-E- oder LDL-Rezeptor-knock-out Mäusen führte zu einer signifikanten Verringerung der atherosklerotischen Ablagerungen (Cyrus et al., 1999;George et al., 2001). Des Weiteren hemmen 15-LOX-Inhibitoren die Entwicklung von atherosklerotischen Läsionen in Kaninchen, die mit einer cholesterolreichen Nahrung gefüttert wurden (Bocan et al., 1998;Sendobry et al., 1997).

Im Gegensatz zu den o. g. Ergebnissen gibt es aber auch einige Untersuchungen, die eine anti-atherosklerotische Wirkung der LOX nahe legen. So sind transgene Kaninchen, die die menschliche Retikulozyten-Typ-15-LOX makrophagenspezifisch überexprimieren, gegen Atherosklerose geschützt. Bei ihnen ist die Menge der Lipidablagerungen in der Aorta signifikant geringer als bei Kontrolltieren (Shen et al., 1996). Auch die durch eine experimentelle Anämie induzierte Expression der 12/15-LOX in Kaninchen und Mäusen führte zu einer verringerten Entwicklung von atherosklerotischen Plaques (Paul et al., 1999;Trebus et al., 2002).

Grundsätzlich ist die Rolle der 12/15-LOX in der Atherosklerose noch nicht ausreichend geklärt und es bedarf weiterer Studien. Vorstellbar sind z. B. Unterschiede zwischen den Ergebnissen aus Tiermodellen (Maus, Kaninchen) und den Gegebenheiten beim Menschen. Möglicherweise ist die Expression der 12/15-LOX in atherosklerotischen Läsionen auch ein Schutzmechanismus (Simon et al., 1990). Demnach könnte die Wirkung der LOX zunächst, d.h. im frühen Stadium der Entwicklung von atherosklerotischen Plaques, eine antiatherogene Funktion haben, die im späteren Verlauf aber in eine proatherogene Wirkung umschlagen kann (Kuhn und Chan, 1997).

Kürzlich wurde auch über eine mögliche Beteiligung der 5-LOX an der Atherosklerose bei Mäusen berichtet (Mehrabian et al., 2002). Mäuse, bei denen die Expression der 5-LOX nur etwa 1/5 des normalen Levels beträgt (CON6-Mäuse), sind trotz LDL-Rezeptor knock outs gegen Atherosklerose geschützt. Die Züchtung heterozygoter 5-LOX-knock-out Mäuse, die auch LDL-Rezeptor defizient waren (5-LOX^+/-/LDL-Rezeptor^-/-), bestätigten diesen Zusammenhang. In diesen Tieren entsprach die 5-LOX-Expression etwa dem Level der CON6-Mäuse, auch sie zeigten drastisch verringerte atherosklerotische Läsionen gegenüber LDL-Rezeptor-defizienten Mäusen (5-LOX^+/+/LDL-Rezeptor^-/-).

Die Beteiligung von Lipoxygenasen an der Entstehung bzw. Metastasierung von Karzinomen ist zurzeit ein weit verbreitetes Thema in der Forschung, wobei zum Teil widersprüchliche Ergebnisse existieren. Während Gupta et al. über eine verstärkte Expression und Aktivität der 5-LOX in menschlichen Prostata-Tumoren berichteten (Gupta et al., 2001), fanden Shappell et al. keinerlei 5-LOX-Aktivität in dem Tumorgewebe, d.h. sie konnten kein 5-HETE nachweisen (Shappell et al., 1999). 5-LOX Inhibitoren (z. B. MK886) leiteten Apoptose in Prostatakrebszellen ein (Anderson et al., 1998;Ghosh und Myers, 1998). Ob dies auf die Hemmung der 5-LOX zurückzuführen ist, bleibt allerdings noch unklar, da die benötigte Hemmstoff-Konzentration den IC50-Wert um ein Vielfaches übersteigt (Dixon et al., 1990). Darüber hinaus leitete MK886 auch in Zellen, die keine 5-LOX exprimieren, Apoptose ein (Datta et al., 1999).

Viele Ergebnisse zeigen eine pro-karzinogene Wirkung der Plättchen-Typ-12-LOX (Übersichtsartikel: (Honn et al., 1994)). Diese wird u. a. exprimiert im Prostatakarzinom (Gao et al., 1995), Pankreaskarzinom (Ding et al., 1999), Mammakarzinom (Connolly und Rose, 1998;Natarajan et al., 1997;Natarajan und Nadler, 1998) und Bronchialkarzinom (Chen et al., 1994). 12(S)-HETE bewirkt eine Reihe von Effekten, die die Metastasierung von Tumoren beeinflussen, darunter die Verstärkung der Mobilität (Liu et al., 1994;Timar et al., 1993) und des Adhäsionsvermögens von Tumorzellen an das Epithel und die Ausbreitung in der Subepithel-Matrix (Honn et al., 1989), sowie die Sekretion von lysosomalen Proteinasen (Ulbricht et al., 1996). Die Bedeutung von 12-HETE für die Tumor-Metastasierung wurde auch in vivo nachgewiesen (Chen et al., 1994;Connolly und Rose, 1998;Liu et al., 1994;Nie et al., 1998). Bisher ließ sich jedoch aus den Daten noch kein Therapiekonzept ableiten.

Auch die 15-LOXn werden mit der Karzinogenese in Verbindung gebracht, allerdings ist ihre Rolle weniger klar als die der 12-LOX. Während Ikawa et al. eine erhöhte Expression der 15-LOX-1 in Dickdarmkrebszellen beobachteten (Ikawa et al., 1999), berichteten Shureiqi et al. eine signifikant geringere Expression und geringere Konzentration von
13-HODE in Tumorzellen im Vergleich zu normalem Gewebe (Shureiqi et al., 1999). Sie folgerten daraus eine Herunterregulation der 15-LOX-1 Expression in Dickdarmtumorgewebe und eine anti-Tumor-Wirkung von 13(S)-HODE durch Hemmung der Zellteilung und Einleitung der Apoptose.

Eine Beteiligung der 15-LOXn in Prostatakarzinomen wird ebenfalls diskutiert. Spindler et al. fanden 13(S)-HODE im Tumorgewebe, jedoch nicht im benachbarten gesunden Gewebe (Spindler et al., 1997). Kelavkar et al. zeigten einen signifikanten Zusammenhang zwischen der Expression der 15-LOX-1 und einer mutierten Form des Tumor-Suppressor-Gens p53 (Kelavkar und Badr, 1999). Darüber hinaus fanden sie eine Korrelation zwischen der Expression und der Malignität des Tumors (nach ‚Gleason staging’), was eine Rolle der 15-LOX-1 in der Tumorentwicklung nahe legt (Kelavkar et al., 2000). Überexpression von 15-LOX-1 in PC-3 Zellen bewirkte eine verstärkte Zellteilung, die durch einen 15-LOX-1-Inhibitor dosisabhängig gehemmt werden konnte (Kelavkar et al., 2001). Während des Fortschreitens von Prostatakarzinomen werden die Expression der 15-LOX-2 und die Bildung von 15-HETE immer mehr reduziert (Shappell et al., 1999), was indirekt zu einer verstärkten Zellteilung und reduzierten Differenzierung in Prostatakarzinomzellen führen kann (Shappell et al., 2001). Auch Tang et al. wiesen den Verlust der 15-LOX-2 Expression in allen getesteten Prostatakarzinom-Zelllinien nach und schlussfolgerten eine hemmende Wirkung der 15-LOX-2 auf die Entwicklung von Prostatakarzinomen (Tang et al., 2002). Demgegenüber ist allerdings die Rolle von 15-HETE, dem Produkt der 15-LOX-2 und auch der 15-LOX-1, noch umstritten. So gibt es Studien, aus denen geschlossen wurde, dass 15S-HETE die Apoptose unterdrückt (Herrmann et al., 1997;Tang et al., 1996) oder keinen Einfluss auf die Apoptose in Tumorzellen hat (Bortuzzo et al., 1996;Desplat et al., 1999), bzw. dass 15S-HPETE Apoptose in Lymphozyten einleitet (Sandstrom et al., 1994).

Zusammenfassend muss man sagen, dass weitere Forschung nötig ist, um die Rollen der verschiedenen LOXn bei der Karzinogenese eindeutig zu bestimmen und Widersprüche aufzuklären.

Neben den bereits genannten Leukotrienen (u. a. Entzündungsreaktion) und 12-HETE
[u. a. Beteiligung an der Proliferation verschiedener Zellen wie epidermale Keratinozyten (Chan et al., 1985) und vaskulären Endothelzellen (Tang et al., 1995) sowie Tumormetastase (s. o.)] spielen weitere LOX-Produkte eine Rolle als bioaktive Botenstoffe. So ist die
15-LOX an der Synthese von Lipoxinen (Serhan et al., 1984) und Hepoxilinen (Anton und Vila, 2000) beteiligt, und deren Produkte 15-HETE, 13-HODE und 12-HETE regulieren
u. a. Wechselwirkungen zwischen Endothelzellen und Thrombozyten (Buchanan et al., 1998). Verschiedene Studien deuten auf eine Beteiligung von LOXn an der Apoptose hin. Allerdings gibt es sowohl Ergebnisse, die für eine pro-apoptotische Rolle der LOX sprechen (Gu et al., 2001;Maccarrone et al., 2000;O'Donnell et al., 1995), als auch Versuche, bei denen Apoptose nach Hemmung von LOXn eingeleitet wurde (Avis et al., 2001;Ding et al., 1999;Tang et al., 1996;Tang und Honn, 1997). Zurzeit ist noch unklar, inwieweit ein direkter Zusammenhang zwischen LOXn und Apoptose besteht. Denkbar ist auch, dass die beobachteten Effekte auf unspezifische Hemmstoffe, sehr hohe (physiologisch irrelevante) Konzentrationen von Hemmstoffen, Arachidonsäure oder LOX-Produk-ten, oder nur auf eine Störung des zellulären Redox-Gleichgewichtes zurückzuführen sind.

Ein weiterer nicht zu vernachlässigender Effekt beruht auf dem Vermögen von
12/15-LOXn, in Membranen oder Lipoproteinen veresterte mehrfachungesättigte Fettsäuren zu oxygenieren. Da einige Phospholipasen (Chaitidis et al., 1998) und neutrale Cholesterolesterhydrolasen (Belkner et al., 2000) oxidierte Esterlipide als Substrat bevorzugen, kann die LOX so, unabhängig von der konventionellen Arachidonsäure-Kaskade, zu einer Erhöhung der zellulären Konzentration an freien Hydro(pero)xyfett-säuren beitragen. Kürzlich wurde auch gefunden, dass erhöhte Konzentrationen an unveresterter Arachidonsäure, möglicherweise auch deren oxygenierte Formen, in Zellen Apoptose auslösen können (Cao et al., 2000).

Die Reaktion der LOX, die Synthese von Hydroperoxyfettsäuren aus molekularem Sauerstoff und mehrfach ungesättigter Fettsäure, verläuft über die Bildung radikalischer Intermediate. Ein aktives Enzym erfordert zunächst die Oxidation des Nichthämeisens zum Eisen[III] durch Peroxide. Hierzu sind auch die LOX-Produkte selbst, die Hydro-peroxyfettsäuren in der Lage (Autokatalyse) (Yamamoto, 1989). Dies erklärt eine kurze kinetische lag-Phase zu Beginn der Reaktion, die durch Zusatz von Hydroperoxyfettsäuren zum Reaktionsansatz unterdrückt werden kann (de Groot et al., 1975;Rouzer und Samuelsson, 1986;Schilstra et al., 1992;Yokoyama et al., 1986).

Man kann bei der LOX-Reaktion vier Schritte unterscheiden (Abb. 2):

1. Wasserstoffabstraktion von einer doppelallylständigen Methylengruppe des Substrats:
   Dies geschieht sowohl regio- als auch stereospezifisch. Bei Arachidonsäure gibt es drei doppelallylständige Methylengruppen, die Wasserstoffabstraktion erfolgt jedoch gezielt nur an einer, bzw. zu geringerem Anteil auch an einer zweiten Methylengruppe (LOXn mit dualer Positionsspezifität). Darüber hinaus wird immer das pro-S Wasserstoffatom (bzw. pro-R bei R-LOXn) abstrahiert. Diese Selektivität wird vor allem durch die Lage des Substrats in der Bindungstasche des Enzyms bestimmt (s. u.). Wie unter anderem aus dem Vergleich von kinetischen Konstanten mit Wasserstoffisotopen (Deuterium, Tritium) ermittelt wurde, erfolgt diese Wasserstoffabstraktion ausschließlich nach einem Tunnelmechanismus (Knapp und Klinman, 2002;Rickert und Klinman, 1999). Nach diesem quantenmechanischen Phänomen erfolgt der Transfer eines Wasserstoffatoms nicht wie beim klassischen Weg über sondern durch eine Energiebarriere hindurch. Somit können Prozesse ablaufen, die nach dem klassischen Ansatz energetisch verboten wären.
   Nach homolytischer Spaltung der C-H Bindung entsteht ein mesomeriestabilisiertes Fettsäure-Radikal. Das Radikal-Elektron ist dabei entweder über alle fünf möglichen C-Atome delokalisiert (Pentadienylradikal (Schewe et al., 1986)) oder nur über einen Teil (Allylradikal (Nelson et al., 1994)), was weniger sterische Probleme verursachen würde. Die Wasserstoffabstraktion ist geschwindigkeitsbestimmend für die ganze Reaktion (Egmond et al., 1973;Rickert und Klinman, 1999), mit ihr einher geht die Reduktion des Nichthämeisens zum Fe[II].
2. Umlagerung des Radikals:
   Für das radikalische Elektron gibt es die Möglichkeiten einer Verschiebung in Richtung Methylende der Fettsäure ([+2], es wandert zwei C-Atome weiter) oder zum Carboxylende ([-2]-Verschiebung) (Kuhn et al., 1986). In beiden Fällen folgt die Ausbildung eines konjugierten Z-E-Dien-Systems. Prinzipiell erfolgt eine Verschiebung nur in eine Richtung, deren Kontrolle aber noch ungeklärt ist. Ausgehend von einem Allylradikal wird wieder die Konformation der Fettsäure im aktiven Zentrum als entscheidend angenommen.
3. Sauerstoff-Insertion:
   Auch die Insertion des molekularen Sauerstoffs erfolgt stereospezifisch und zwar von der der Wasserstoffabstraktion gegenüberliegenden Seite der von den Doppelbindungen gebildeten Ebene (antarafacialer Charakter) (3). Wie der Sauerstoff zum aktiven Zentrum gelangt, ist noch Gegenstand der Forschung. Diskutiert werden eine diffusionskontrollierte Bewegung durch die Substratbindungstasche bzw. ein separater Sauerstoffkanal von der Enzymoberfläche zum aktiven Zentrum (Knapp et al., 2001).
4. Reduktion des Peroxidradikals:
   Unter Oxidation des Eisens zum Eisen[III] (Wiederherstellung des katalytisch aktiven Zustands) erfolgt die Übertragung eines Elektrons auf das radikalische Peroxy-Intermediat und damit die Reduktion zum Peroxid-Anion. Die letztendliche Kontrolle der Regio- und Stereospezifität der Reaktion unterliegt möglicherweise vor allem diesem letzten Schritt, da das Elektron wahrscheinlich nur in einer ganz bestimmten sterischen Anordnung übertragen werden kann.
   Das Produkt, die Hydroperoxyfettsäure, entsteht durch Reaktion des Peroxid-Anions mit einem Proton (4).

	Abb. 2 : Schematische Darstellung der Lipoxygenasereaktion 1. Wasserstoffabstraktion, 2. Umlagerung des Radikals, 3. Sauerstoffinsertion, 4. Reduktion des Peroxidradikals unter Wiederherstellung des aktivierten Enzymzustands (LOX-Fe[III])

Die kürzliche Kristallisation der Sojabohnen-LOX-3 mit einer Hydroperoxyfettsäure im aktiven Zentrum zeigte einen Fettsäureperoxid-Eisen-Komplex, der die Reduktion des Fettsäureperoxidradikals mit gleichzeitiger Regeneration des Eisen[III] gut erklären könnte (Skrzypczak-Jankun et al., 2001).

Eine weitere Eigenschaft der tierischen LOXn ist ihre Multifunktionalität. Die primären Produkte aus der Arachidonsäureoxygenierung können aufgrund weiterer doppelallylständiger Methylengruppen erneut oxygeniert werden (Bryant et al., 1985;Maas et al., 1982;Ueda und Yamamoto, 1988;Yokoyama et al., 1986). Hierbei entstehen Dihydroperoxyverbindungen (Di-HPETE) oder bei dreifacher Oxygenierung die biologisch relevanten Lipoxine (Kuhn et al., 1987). Tierische Lipoxygenasen sind darüber hinaus zur Synthese von Epoxy-Verbindungen in der Lage. Die 5-LOX katalysiert die Dehydratisierung von
5-HPETE zu Leukotrien A4 (LTA4) (Rouzer et al., 1986;Shimizu et al., 1984). Sie spielt damit eine duale Rolle in der Leukotrienbiosynthese. Bei der Dehydratisierung von
15-HPETE durch 12/15-LOXn entsteht das 14,15-LTA4 (Bryant et al., 1985;Maas et al., 1982;Yokoyama et al., 1986).

Unter anaeroben oder hypoxischen Bedingungen zeigen LOXn auch Hydroperoxidaseaktivität (Verhagen et al., 1978). Dabei entstehen durch homolytische Spaltung der
O-O-Bindung zunächst Alkoxy- und Hydroxylradikale, die dann zu Aldehyden und Alkanen umgelagert werden oder dimerisieren können (Salzmann et al., 1984;Verhagen et al., 1978).

Die LOXn verschiedener Gruppen (s. o.) besitzen unterschiedliche Substratspezifitäten. Während 5-LOXn und 12-LOXn vom Plättchentyp nur Arachidonsäure als Substrat akzeptieren, (Hada et al., 1991;Ochi et al., 1983;Takahashi et al., 1988;Yokoyama et al., 1986) metabolisieren die 12/15-LOXn alle mehrfach ungesättigten Fettsäuren mit Kettenlängen zwischen C₁₈ und C₂₂ darunter Linolsäure (Hauptprodukt: (13S,9Z,11E)-13-Hydroperoxy-octadeca-9,11-diensäure, 13-HPODE) und α- und γ-Linolensäure (Bryant et al., 1982;Claeys et al., 1985;Yamamoto, 1991;Yokoyama et al., 1986). Darüber hinaus sind die 12/15-LOXn aber auch die 15-LOX-2 in der Lage, Phospholipide zu verstoffwechseln, selbst wenn diese in Biomembranen oder Lipoproteinen enthalten sind (Belkner et al., 1993;Kozak et al., 2002;Murray und Brash, 1988;Schewe et al., 1975;Takahashi et al., 1993). Hierzu ist eine Bindung der LOX an entsprechende Strukturen notwendig. Brinckmann et al. zeigten, dass die 15-LOX in vitro und in vivo an die Membranen von Zellorganellen bindet. Diese Bindung ist kalziumabhängig und geht mit einer Steigerung der LOX-Aktivität einher (Brinckmann et al., 1998). Weiterführende Studien mit Sedimentations-Versuchen zeigten eine 15-LOX-Bindung an die Membranen von Mitochondrien, Peroxysomen, Golgi und Endoplasmatischem Retikulum (ER). Dabei wurden bei längerer Inkubation luminale Proteine freigesetzt, während integrale Membranproteine im Pellet des Sedimentations-Versuchs verblieben (van Leyen et al., 1998). Daraus wurde auf eine Permeabilisierung der Organellmembran geschlossen. Diese Annahme konnte durch elektronenmikroskopische Aufnahmen unterstützt werden, in denen porenartige Strukturen in Liposomen und der ER-Membran nach einer Inkubation mit LOX zu sehen waren, deren Größe für die Freisetzung luminaler Proteine ausreichte. Des Weiteren fanden van Leyen et al., dass die Bindung des Enzyms an Membranen unabhängig von Membranproteinen erfolgt.

Ein Enzym, das u. a. an dem Abbau von Zellorganellen beteiligt ist, muss einer starken Kontrolle unterliegen. Für die 15-LOX wurden Regulationselemente auf transkriptioneller und translationaler sowie der posttranslationalen Ebene beschrieben.

Ein Element der transkriptionellen Regulation sind Interleukine (IL). So wurde für verschiedene Zellen wie periphere Monozyten (Conrad et al., 1992), A549- (Brinckmann et al., 1996) und Caco-2-Zellen (Kamitani et al., 2000) nach Behandlung mit IL-4 bzw.
IL-13 eine verstärkte Expression der 15-LOX gefunden. Die Signaltransduktions-Kaskade erfordert einen funktionalen IL-4 Rezeptor (Brinckmann et al., 1996), den Transkriptionsfaktor STAT6 (Signal Transducer and Activator of Transcription) (Conrad und Lu, 2000;Heydeck et al., 1998) sowie verschiedene Phosphorylierungs- und Azetylierungsprozesse (Kamitani et al., 2001;Shankaranarayanan et al., 2001).

Während einer experimentellen Anämie beim Kaninchen wird die Expression der 15-LOX in vielen Zellen und Geweben stark hochreguliert (Berger et al., 1998). Der auslösende Mechanismus ist noch unbekannt, es wird jedoch die Beteiligung von Zytokinen
angenommen.

Im frühen Entwicklungsstadium von Kaninchen-Retikulozyten sind in diesen Zellen große Mengen 15-LOX-mRNA enthalten, jedoch kein Enzym nachweisbar (Thiele et al., 1982). Inzwischen wurde der Mechanismus dieser Translationshemmung weitgehend aufgeklärt. Verantwortlich ist die Bindung zweier regulativer Proteine, hnRNP K und hnRNP E₁ (Ostareck et al., 1997), an repetitive Sequenzen im 3’-untranslatierten Bereich der
15-LOX-mRNA (differentiation control elements, DICE) (Ostareck-Lederer et al., 1994), was offensichtlich eine Bindung der 60S-Ribosomen-Untereinheit verhindert (Ostareck et al., 2001).

Obwohl es bei der 15-LOX nicht zu posttranslationalen Veränderungen wie Glykosylierung oder Phosphorylierung kommt, gibt es einige Elemente, die die spezifische Aktivität des Enzyms beeinflussen. So erfordert die Aktivierung des Enzyms eine Oxidation des Eisen[II] zum Eisen[III], was u. a. durch intrazelluläre Peroxide initiiert werden kann (de Groot et al., 1975). Daher spielt der Peroxidtonus in der Zelle eine wichtige regulative Rolle. Dementsprechend kann man Peroxid-reduzierende Enzyme wie vor allem die Phospholipidhydroperoxid-Glutathionperoxidase (PHGPx) als posttranslationalen LOX-Regulator betrachten (Thomas et al., 1990). Dies gilt auch für die Oxygenierung von Biomembranen durch die 15-LOX. Es wurde gezeigt, dass die Oxidation durch Vorinkubation mit der PHGPx verhindert werden kann (Schnurr et al., 1996).

Ein weiteres regulatives Element ist die zytosolische Kalzium-Konzentration. Die 15-LOX bindet in Gegenwart von Kalzium an Membranen und diese Bindung geht mit einer bis zu 10fachen Steigerung der Enzymaktivität einher (Brinckmann et al., 1998). Beim Entfernen des Kalziums durch Komplexion mit EDTA dissoziiert das Enzym wieder von der Membran, was eine Reversibilität der Membranbindung anzeigt.

Ein wichtiger Regulationsmechanismus der LOX-Aktivität ist die irreversible Selbstinaktivierung. Sie erfolgt bereits nach wenigen Reaktionszyklen oder bei einer hohen Produktkonzentration (Gan et al., 1995;Hartel et al., 1982;Kishimoto et al., 1996;Rapoport et al., 1984;Rapoport et al., 1986). Der Mechanismus dieser Inaktivierung ist noch zu weiten Teilen unklar, es scheint jedoch die kovalente Bindung von radikalischen Reaktionsintermediaten an das Enzym eine Rolle zu spielen (Wiesner et al., 2003).

1.5  Struktur der Lipoxygenasen

1.5.1  Primärstruktur

Alle LOXn bestehen aus einer einzelnen Polypeptid-Kette. Die bisher identifizierten tierischen LOXn setzen sich aus 662 bis 711 Aminosäuren zusammen und sind damit ca. 200 Aminosäuren kürzer als die meisten pflanzlichen Enzyme. Zum Beispiel besitzen die Kaninchen-Retikulozyten 15-LOX und die Schweine 12-LOX vom Leukozyten-Typ 663 Aminosäuren (Fleming et al., 1989;Yoshimoto et al., 1990), die humane 15-LOX vom Retikulozyten-Typ 662 (Sigal et al., 1988) und die humane 5-LOX 674 Aminosäuren (Matsumoto et al., 1988), während die beiden 12R-LOXn vom Epidermis-Typ 711 Aminosäuren besitzen (Boeglin et al., 1998;Sun et al., 1998). Die Sequenzhomologie der tierischen LOXn variiert sehr stark und liegt zwischen 28 und 99% (Kuhn und Thiele, 1999), wobei wiederum die 12R-LOXn die größten Unterschiede zu den anderen LOXn aufweisen. Allerdings unterscheiden sich einzelne Bereiche der Primärstruktur hinsichtlich ihrer Homologie. So gibt es beispielsweise hochkonservierte Bereiche im Zentrum und am C-Terminus, während die N-terminalen Bereiche nur relativ geringe Sequenzhomologie aufweisen. Innerhalb der zentralen konservierten Region konnten bereits vor der Aufklärung von Kristallstrukturen mehrere Histidinreste als Eisenliganden durch ortsgerichtete Mutagenese bei verschiedenen LOXn identifiziert werden (Chen und Funk, 1993;Ishii et al., 1992;Nguyen et al., 1991;Zhang et al., 1992).

Die erste komplette Kristallstruktur einer LOX konnte im Jahr 1993 für die Sojabohnen-LOX-1 aufgeklärt werden (Boyington et al., 1993), deren Auflösung später auf 1,4 Å verbessert wurde (Minor et al., 1996). In jüngerer Zeit folgte die Aufklärung der Strukturen der Sojabohnen-LOX-3 (Skrzypczak-Jankun et al., 1997) und von Sojabohnen-LOX-3-Liganden-Komplexen (Pham et al., 1998;Skrzypczak-Jankun et al., 2001).

Die erste Kristallisation einer tierischen LOX wurde bereits 1990 beschrieben (Sloane et al., 1990), die Struktur konnte jedoch erst 7 Jahre später aufgeklärt werden (Gillmor et al., 1997). Dabei handelt es sich um einen Enzym-Inhibitor-Komplex mit einer Auflösung von 2,4 Å. Obwohl die Kristallstrukturdaten nicht ganz komplett sind, geben sie einen guten Einblick in die strukturellen Gegebenheiten bei tierischen LOXn und zeigen eine deutliche strukturelle Verwandtschaft zu der Sojabohnen-LOX-1 (Abb. 3).

	Abb. 3 : Kaninchen-Retikulozyten 15-LOX- (oben) und Sojabohnen-LOX-1-Struktur (unten) in der Backbone-Darstellung. Helix: rot, β-Faltblatt: gelb. Trotz des Größenunterschieds ist eine deutliche strukturelle Verwandtschaft zu erkennen.

Wie in Abb. 3 deutlich zu erkennen, besitzen LOXn zwei Domänen: Eine kleinere N-terminale β-Faltblatt-Domäne und eine größere C-terminale helikale Domäne. Bei der Kaninchen-Retikulozyten LOX besteht die N-terminale Domäne aus einem 8-strängigen
β-Faltblatt und reicht von Aminosäure 1 bis etwa 115. Sie ist sehr ähnlich zu der
C-terminalen β-Faltblatt-Domäne in tierischen Lipasen und könnte somit analog dieser eine Rolle bei der Anlagerung des Enzyms an Lipoproteine bzw. Biomembranen spielen (Gillmor et al., 1997). Diese Annahme wird unterstützt durch zwei oberflächenexponierte hydrophobe Aminosäuren in der 15-LOX, Phe70 und Leu71, die im Sequenzvergleich mit der humanen Lipoprotein Lipase mit zwei Tryptophanen übereinstimmen, die als Bindungsdeterminanten an Lipoproteine identifiziert wurden (Williams et al., 1994).

Die größere C-terminale Domäne ist über eine 1600 Ų große Kontaktfläche mit der
N-terminalen Domäne assoziiert. Sie besteht aus 18 Helices unterbrochen von einer β-Faltblatt-Subdomäne und drei weiteren kleinen β-Faltblatt-Strukturen in loops an der Proteinoberfläche. Sie enthält das katalytisch aktive Nichthämeisen.

Zwei der zentralen Helices nehmen über eine Länge von jeweils sieben Aminosäuren eine π-Helix-Konformation ein (Aminosäurereste 360 bis 366 und 537 bis 543), wodurch eine zur Eisenkomplexierung nötige Anordnung der in diesem Bereich liegenden vier Protein-Eisen-Liganden (His 361, His 366, His 541 und His 545) ermöglicht wird. Den fünften Eisenliganden bildet das in fast allen LOXn konservierte C-terminale Isoleucin (Ile 663 bei der Kaninchen-Retikulozyten LOX). Eine Veränderung des C-Terminus, z. B. durch Deletion oder Verknüpfung mit Proteinen wie GFP (Green Fluorescence Protein), sollte daher zu einem Verlust des Eisens und somit zu einer inaktiven Enzymspezies führen (Borngraber, 1996;Zhang et al., 1992). Die Kristallstruktur der Soja-LOX-1 zeigte ein Wassermolekül als sechsten Eisenliganden (Minor et al., 1996) trans zu His 691 (entspricht His 541 in der Kaninchen-Retikulozyten LOX), was aus Röntgenabsorptionsspektroskopie auch für die Kaninchen-Retikulozyten LOX geschlossen wurde (Kuban et al., 1998). Diese Position liegt an einem großen Hohlraum, der Substratbindungstasche, so dass das Wasser durch Substrate oder kompetitive Inhibitoren verdrängt werden könnte. Es ist auch möglich, dass dieser sechste Eisenligand ein OH^- ist und als starke Base für die Wasserstoff-Abstraktion Bedeutung hat (Minor et al., 1996). Die sechs Eisenliganden sind in der Kristallstruktur in einem annähernd regelmäßigen Oktaeder angeordnet (Abb. 4).

	Abb. 4 : Die Eisenligandensphäre der Kaninchen-Retikulozyten 15-LOX gebildet aus vier Histidinen und dem C-terminalen Isoleucin. Der sechste Ligand ist vermutlich ein Wasser (nicht dargestellt).

Bevor und auch nachdem die Kristallstrukturen der Soja-LOX und des Kaninchen Retikulozyten 15-LOX-Inhibitor-Komplexes bekannt waren, wurden diverse spektroskopische Methoden angewandt, um die Eisenumgebung näher zu charakterisieren (Dunham et al., 1990;Kuban et al., 1998;Pavlosky et al., 1995;Scarrow et al., 1994;Solomon et al., 1997). Insbesondere durch Röntgenabsorptionsspektroskopie und Interpretation der Feinstruktur der Spektren konnte die Eisenligandensphäre genauer beschrieben werden. Dabei wurden die Anzahl und der jeweilige Abstand der Eisenliganden bestimmt, wobei sich eine Verzerrung des Oktaeders in der Lösungsstruktur sowohl bei der Soja-LOX-1 als auch bei der Kaninchen Retikulozyten 15-LOX nachweisen ließ (Kuban et al., 1998;Scarrow et al., 1994). Auch hier wurden sechs Eisenliganden für die aktiven Enzymzustände ermittelt, deren Abstände zwischen 0,188 nm und etwa 0,3 nm liegen. Eine detaillierte Beschreibung der Röntgenabsorptionsspektroskopie, die auch Gegenstand dieser Arbeit ist, erfolgt in Abschnitt 2.6.5.1.

Wie bereits erwähnt, existiert in LOXn ein großer Hohlraum, an dessen einer Seite das katalytisch aktive Eisen lokalisiert ist. Dieser Hohlraum hat eine trichterförmige Öffnung an der Proteinoberfläche und macht etwa in Höhe des Eisens eine Krümmung, so dass eine stiefelähnliche Form entsteht. Die diese Tasche begrenzenden Aminosäuren sind bis auf zwei Ausnahmen hydrophob und hochkonserviert. Am Eingang der Tasche liegt eine positiv geladene Aminosäure, Arg 403, die mit der Carboxylgruppe der Substratfettsäure eine Wechselwirkung eingehen könnte. Die Mutagenese der äquivalenten Position in der humanen 15-LOX zu einem Leucin führte zu einer starken Verringerung von Substrataffinität und Reaktivität (Gan et al., 1996).

Die Existenz eines weiteren Kanals, der Sauerstoff den Zugang zum aktiven Zentrum ermöglichen soll, wird gegenwärtig noch diskutiert. Ein solcher Kanal könnte die Stereospezifität der LOX-Reaktion erklären, da der Sauerstoff kontrolliert nur von einer Seite herangeführt würde. In der ersten Kristallstruktur der Soja-LOX-1 wurde ein entsprechender 18 Å langer Kanal vorgeschlagen (Boyington et al., 1993), der jedoch in der Struktur mit verbesserter 1,4 Å Auflösung nicht bestätigt werden konnte (Minor et al., 1996). Jüngste experimentelle Ergebnisse mit der Soja-LOX-1 (Knapp et al., 2001) und mit modifizierten Substratfettsäuren und Enzymmutanten der Kaninchen-Retikulozyten
15-LOX (Ivanov et al., unveröffentlichte Daten) deuten jedoch auf die Existenz eines Sauerstoffkanals sowohl bei der pflanzlichen Soja-LOX-1 als auch bei der Kaninchen-LOX hin.

Aufgrund des hydrophoben Charakters der Substratbindungstasche liegt es nahe, dass die Fettsäure mit dem hydrophoben Methylende ins Innere der Substratbindungstasche eintaucht, während das hydrophile Carboxylende an der Enzymoberfläche bleibt. Diese Hypothese wurde durch verschiedene experimentelle Ergebnisse für die 12- und 15-LOXn bestätigt. So zeigten Versuche mit Arachidonsäure-Isomeren, in denen die Position der Doppelbindungen variiert wurde, dass der Abstand des doppelallylständigen Methylens vom Methylende der Fettsäure entscheidend für die Reaktivität und Positionsspezifität ist (Kuhn et al., 1990). Durch ortsgerichtete Mutagenese der Aminosäuren Ile418 und Met419 der humanen 15-LOX gegen die entsprechenden Aminosäuren der humanen
12-LOX (Ala418, Val419) (Sloane et al., 1991) bzw. der Schweine 12-LOX (Val418, Val419) (Sloane et al., 1995) konnten 15-LOX-Enzymmutanten mit 12-LOX-Aktivität hergestellt werden. Entsprechende Untersuchungen an 12-LOXn führten zu 15-lipoxygenierenden Enzymspezies (Chen und Funk, 1993;Suzuki et al., 1994). Hieraus wurde gefolgert, dass die Größe und Geometrie der Seitenketten der Aminosäuren 418 und 419 die Position der Arachidonsäureoxygenierung durch 12- bzw. 15-LOXn entscheidend beeinflussen. Da es nicht gelang, die Ratten 12-LOX durch entsprechende Mutationen in eine 15-LOX umzuwandeln (Hada et al., 1994;Watanabe und Haeggstrom, 1993), wurden weitere Positionsdeterminanten vermutet. Durch Konstruktion von Enzymchimären aus 15- und verschiedenen 12-LOXn sowie ortsgerichteter Mutagenese kritischer Aminosäuren in der Kaninchen-Retikulozyten 15-LOX konnten zwei weitere wichtige Aminosäuren für die Positionsspezifität der 15- bzw. 12-Lipoxygenierung ermittelt werden: Phe353 (Borngraber et al., 1996) und Ile593 (Borngraber et al., 1999). Eine Übersicht der Lage der identifizierten Positionsdeterminanten der Kaninchen-Retikulozyten 15-LOX mit der hineinmodellierten Arachidonsäure zeigt Abb. 5. Die primären Positionsdeterminanten sind in violett dargestellt, Aminosäuren mit geringerem Einfluss in grau.

Es ist deutlich zu erkennen, dass die entsprechenden Aminosäuren den Boden der Substratbindungstasche bilden und damit durch ihre Größe die mögliche Tiefe des Eindringens des Substrats in die Tasche beeinflussen. Das an der Enzymoberfläche liegende Arg403, welches möglicherweise mit der Carboxylgruppe des Substrats wechselwirkt, besitzt eine sehr bewegliche Seitenkette und könnte somit ein unterschiedlich tiefes Eintauchen der Fettsäure tolerieren.

	Abb. 5 : Darstellung der Positionsdeterminanten der Kaninchen-Retikulozyten 15-LOX (violett) mit dem katalytisch aktiven Eisen und der hineinmodellierten Arachidonsäure, aus (Borngraber et al., 1999).

Führt man mehrere Mutationen an den entsprechenden kritischen Aminosäuren durch, zeigt sich ein funktionelles Zusammenspiel, d.h. die Verkleinerung der Seitenkette an der einen Position kann durch entsprechende Vergrößerung an einer anderen ausgeglichen werden (Abb. 6). All diesen Positionsdeterminanten gemein ist, dass der Austausch von großen Seitenketten der 15-LOX in kleinere die Spezifität von 15- zu 12-Lipoxygenierung verschob.

	Abb. 6 : Produktverhältnisse der verschiedenen Kaninchen-Retikulozyten 15-LOX-Mutanten (HPLC-Chromatogramme) aus (Borngraber et al., 1999). Die jeweiligen Produkte verdeutlichen ein funktionelles Zusammenspiel der Positionsdeterminanten.

Auch bei der Maus 8S-LOX und der humanen 15-LOX-2 (Epidermis-Typ), die trotz unterschiedlicher Positionsspezifitäten eine hohe Homologie aufweisen, konnten Positionsdeterminanten identifiziert werden. Die Mutation von Tyr603 und His604 des Maus-Enzyms in die entsprechenden Reste der humanen 15-LOX-2 führte zu einer Verschiebung von
8- zu vollständiger 15-Lipoxygenaseaktivität, die umgekehrte Strategie zu einer partiellen Änderung der Positionsspezifität der humanen 15-LOX-2 (Jisaka et al., 2000).

Die Umwandlung einer 15- in eine 12-LOX und umgekehrt ist also relativ leicht und kann bereits durch den Austausch einer Aminosäure erreicht werden. Frühere Versuche, eine
15-LOX in eine 5-LOX umzuwandeln, führten allerdings zu inaktiven Enzymspezies. Kürzlich ist es jedoch gelungen, durch den Austausch von vier Aminosäuren (F359W, A424I, N425M, A603I) die humane 5-LOX über eine 8-lipoxygenierende Spezies in eine 15-LOX umzuwandeln (Schwarz et al., 2001).

Es existieren zurzeit zwei verschiedene Hypothesen, um die Positionsspezifität der
15- bzw. 12-LOXn und der 5-LOX auf Basis der Substratbindung zu erklären (Funk und Loll, 1997).

Volumen-Hypothese:

Die Ergebnisse der Mutageneseversuche, in denen eine 15-LOX durch Verkleinerung von voluminösen Aminosäuren in eine 12-LOX umgewandelt werden konnte, sowie die Versuche mit artifiziellen Fettsäuren und nicht zuletzt die Kristallstrukturen der Sojabohnen- und der Kaninchen-Retikulozyten LOX sind Ausgangspunkt der Volumen-Hypothese. Nach dieser Hypothese wird die Größe der Substratbindungstasche für die unterschiedliche Positionsspezifität verantwortlich gemacht (Browner et al., 1998;Gillmor et al., 1997) (Abb. 8a). Das Substrat wird bei allen Isoformen mit dem Methylende in der Bindungstasche gebunden. Demzufolge besitzen 15-LOXn eine sehr kleine Bindungstasche, das Substrat kann nicht besonders tief eindringen, so dass C-13 der Arachidonsäure an das katalytisch aktive Eisen kommt. Bei 12-LOXn ist der Hohlraum ein wenig größer, das Substrat kann tiefer in die Bindungstasche gelangen und C-10 ist am Eisen lokalisiert. Bei LOXn mit dualer Positionsspezifität befinden sich zwei doppelallylständige Methylene in Reichweite des aktiven Zentrums, so dass Wasserstoffabstraktion von zwei unterschiedlichen C-Atomen erfolgen kann (z. B. C-13 und C-10 bei 12/15-LOXn). Die Tiefe dieser Substratbindungstasche liegt demzufolge zwischen denen der 15- und 12-LOXn.

Auch für die 5-LOXn wird eine solche konservierte Substratorientierung postuliert. Die Bindungstasche wird als noch voluminöser angenommen, wodurch C-7 der Arachidonsäure an das Eisen gelangt. Computermodelle des aktiven Zentrums der 5-LOX ausgehend von der Kaninchen 15-LOX-Struktur ergaben eine 20% größere Bindungstasche, was für eine entsprechende Substratorientierung ausreichen würde (Browner et al., 1998). Zusätzlich wird möglicherweise das Substrat am Eingang der Bindungstasche durch Wechselwirkung der negativ geladenen Carboxylgruppe mit einer positiv geladenen Aminosäure (z. B. Arg 403 bei der Kaninchen-Retikulozyten LOX) fixiert (Gan et al., 1996;Gillmor et al., 1997).

Während diese Theorie für 12- und 15-LOXn weitgehend akzeptiert ist, vermag sie nicht ohne weiteres die beobachtete Stereospezifität bei 5-LOXn zu erklären (Prigge et al., 1996;Prigge et al., 1998). Obwohl 5-LOXn den Sauerstoff in der S-Konfiguration einfügen, erfolgen Wasserstoffabstraktion und auch die Sauerstoffinsertion im Vergleich zu 12S- und 15S-LOXn von der gegenüberliegenden Seite. Demzufolge zeigt die Hydroperoxygruppe des 5S-HPETE in die entgegengesetzte Richtung zu der von 12S- oder 15S-HPETE. Die gleiche Benennung des Isomers (S) ergibt aus der unterschiedlichen Lage der benachbarten Doppelbindung an dem jeweiligen chiralen Zentrum (Prioritätenregeln nach Cahn-Ingold-Prelog) (Abb. 7). Führt man sich die hohe Flexibilität der Arachidonsäure vor Augen, scheint es jedoch möglich, sowohl das pro-S-Wasserstoffatom des C-7 bei 5-LOXn als auch das pro-S-Wasserstoffatom von C-10 bzw. C-13 bei 12- und 15-LOXn am aktiven Zentrum zu positionieren (Browner et al., 1998).

Auch die Radikalverschiebung bei der 5-LOX-Reaktion unterscheidet sich von der der anderen LOX-Isoformen. Während bei 12- und 15-LOXn eine [+2] Verschiebung auftritt, findet man bei der 5-LOX eine [-2] Verschiebung, d.h. das Radikal wandert in Richtung Carboxylende der Fettsäure.

Orientierungs-Hypothese:

Auch die Orientierungs-Hypothese geht für 12- und 15-LOXn von einer Bindung der Fettsäure mit dem Methylende in der Substratbindungstasche aus. Im Gegensatz dazu binden 5-LOXn nach dieser Hypothese das Substrat in inverser Orientierung, d.h. das Carboxylende der Fettsäure gelangt in die Bindungstasche (Prigge et al., 1998)
(Abb. 8b). Diese Orientierung könnte sehr gut die Stereochemie der 5-LOX-Reaktion erklären, da, unter der Voraussetzung, dass das aktive Zentrum analog zu den 12- und 15-LOXn aufgebaut ist, Wasserstoffabstraktion und Oxygenierung von der Seite der Fettsäure stattfänden, die den beobachteten Produkten entspricht. Das Scheitern der Versuche, eine 15-LOX durch Mutagenese in eine 5-LOX umzuwandeln, unterstützten diese Theorie. Das Einführen der geladenen Carboxylgruppe in die hydrophobe Bindungstasche sollte jedoch zu energetischen Problemen führen (Browner et al., 1998).

Es ist davon auszugehen, dass sich die beiden Theorien nicht zwangsläufig gegenseitig ausschließen. So wurde beispielsweise für die Umsetzung von 15S-HPETE mit der Soja-LOX-1 eine 5S-Lipoxygenierung nachgewiesen (Produkt 5S,15S-DiHPETE) (Van Os et al., 1981). Wird die Carboxylgruppe von 15-HETE methyliert, ist 5-Lipoxygenierung sogar die Hauptreaktion mit der Soja-LOX-1 und der Kaninchen 15-LOX (Schwarz et al., 1998). Nach Mutation von Ile418 zu einem kleineren Ala wurde hauptsächlich 8S-Lipoxy-genierung beobachtet (Produkt 8S,15S-DiHPETE). Diese Ergebnisse unterstützen eine inverse Orientierung des 15-HETE-Methylesters bei der 5-Lipoxygenierung durch
15-LOXn. Bei den 5-LOXn mag die Substratorientierung aber wiederum anders sein. So gibt es kinetische und experimentelle Hinweise, dass die 5-Lipoxygenierung, katalysiert durch 15- bzw. 5-LOXn, nach unterschiedlichen Mechanismen abläuft. Substrate mit veresterter Carboxylgruppe, die von der 15-LOX verstärkt an der Position C-5 oxygeniert wurden, werden von der 5-LOX nicht umgesetzt. Des Weiteren konnte die 5-LOX durch Austausch kleiner Aminosäuren gegen die bei der 15-LOX als Positionsdeterminanten identifizierten voluminöseren Reste in eine 15-LOX umgewandelt werden (Schwarz et al., 2001). Die hier zu Grunde liegende Verkleinerung der Bindungstasche würde die Volumen-Hypothese unterstützen.

	Abb. 8 : Modelle der Substratbindung bei verschiedenen LOXn nach a) der Volumen-Hypothese und b) der Substrat-Orientierungs-Hypothese. Nach Wasserstoffabstraktion vom am Eisen lokalisierten doppelallylständigen C-Atom und Verschiebung des Radikals erfolgt Sauerstoffinsertion an den Pfeilen. Nach der Orientierungs-Hypothese wird das Substrat bei 5-LOXn invers, d.h. mit der Carboxylgruppe in der Bindungstasche, gebunden.

1.6  Lipoxygenase-Hemmstoffe

Aufgrund der Beteiligung von tierischen LOXn an zahlreichen pharmakologisch relevanten Prozessen wie Entzündungsreaktion, Karzinogenese und Atherosklerose sind LOX-Inhibitoren von großem Interesse. Zurzeit laufen auch diverse Studien zu 5-LOX/
Cyclooxygenase-Dual-Inhibitoren (Übersichtsartikel (Celotti und Laufer, 2001;Fiorucci et al., 2001)). In einem Maus-Modell wurde gezeigt, dass die antiinflammatorische Wirkung der kombinierten COX und LOX Inhibitoren deutlich höher ist als die der beiden Hemmstoffe allein (Nickerson-Nutter und Medvedeff, 1996). Darüber hinaus scheint ihre Verträglichkeit wesentlich besser zu sein als die anderer nichtsteroidaler entzündungshemmender Medikamente (NSAIDs) (Celotti und Laufer, 2001).

Neben dem therapeutischen Einsatz von LOX-Inhibitoren spielen diese auch eine wissenschaftliche Rolle. So kann der Einsatz LOX-Isoform-spezifischer Inhibitoren in in vivo Versuchen zur weiteren Aufklärung der Funktion von LOXn beitragen, indem Veränderungen nach gezieltem Ausschalten einer spezifischen LOX beobachtet werden.

Eine gezielte Entwicklung potentieller Inhibitoren (rational drug design)wurde jedoch lange Zeit durch fehlende Kristallstrukturen behindert, was sich erst durch die 1997 veröffentlichte Struktur des Kaninchen-Retikulozyten 15-LOX-Inhibitor-Komplexes änderte. Nichtsdestotrotz existiert inzwischen eine Vielzahl von mehr oder weniger spezifischen LOX-Inhibitoren, darunter das Ebselen, auf das hier näher eingegangen werden soll.

1.6.1  Eigenschaften von Ebselen

Ebselen (2-Phenyl-1,2-benzisoselenazol-3(2H)-on) (Abb. 9) ist eine selenoorganische Verbindung. Es besitzt nur geringe Toxizität und entwickelt ein breites Spektrum an pharmakologisch interessanten Wirkungen (Übersichtsartikel (Schewe, 1995)).

	Abb. 9 : Struktur von Ebselen

Ursprünglich wurde Ebselen als antiinflammatorischer Wirkstoff entwickelt (Cotgreave et al., 1989;Cotgreave et al., 1988;Gao und Issekutz, 1993). Es ist in der Lage, viele am Entzündungsprozess beteiligte Enzyme zu hemmen, darunter die NADPH-Oxidase (Cotgreave et al., 1989), die NO-Synthase (Hattori et al., 1994) und die 5-LOX (Schewe et al., 1994). Darüber hinaus hemmt es die Kaninchen-Retikulozyten 15-LOX (Schewe et al., 1994) und besitzt unter anderem antiatherosklerotische (Thomas und Jackson, 1991;Thomas et al., 1993) und zellschützende Eigenschaften (Li et al., 1994;Lin und Girotti, 1994).

Ebselen reduziert effektiv Hydroperoxide, darunter auch die in Biomembranen und Lipoproteinen. In Gegenwart von SH-Reagenzien wie Glutathion ist Ebselen in der Lage, eine katalytische Wirkung analog der PHGPx zu entwickeln (Sies, 1994). Viele der beobachteten Effekte werden auf diese Eigenschaft zurückgeführt, der Hemmmechanismus der meisten Enzyme wurde jedoch bisher nicht näher untersucht.

Für die Hemmung der LOXn wurde eine duale Wirkung des Ebselens vorgeschlagen (Schewe et al., 1994). Zum einen wird der Hydroperoxidtonus der Zellen durch die Glutathion-Peroxidase-Aktivität des Ebselens gesenkt und LOXn benötigen Hydroperoxide zur Aktivierung. Zum anderen erfolgt eine direkte Hemmung durch die Bildung eines LOX-Ebselen-Komplexes. Die genaue Untersuchung der Hemmung der Kaninchen-Retikulozyten 15-LOX durch Ebselen ist Gegenstand dieser Arbeit.

Die Positionsspezifität von LOXn ist keine unveränderbare Enzymeigenschaft, sondern hängt vielmehr von der spezifischen Wechselwirkung zwischen Enzym und Substrat ab. Die Ausrichtung des Substrats im aktiven Zentrum spielt dabei eine entscheidende Rolle und wird sowohl von der Größe kritischer Aminosäureseitenketten, den Positionsdeterminanten, als auch von der Struktur des Substrats beeinflusst. Demzufolge können Änderungen am Enzym ebenso wie Substratmodifizierungen zu einer veränderten Positionsspezifität führen. Im Rahmen dieser Arbeit sollten verschiedene Arachidonsäurederivate mit LOXn unterschiedlicher Positionsspezifität umgesetzt und die Produktzusammensetzung sowie die Reaktionsraten bestimmt werden. Die hierdurch gewonnenen detaillierten Kenntnisse der Enzym-Substratwechselwirkung sollten zur Aufklärung der Orientierung der Substrate im aktiven Zentrum der jeweiligen LOX-Spezies beitragen.

Ebenfalls zu den Untersuchungen am aktiven Zentrum gehörten Versuche mit einem LOX-Inhibitor, dem Ebselen. Diese Substanz gehört zu den stärksten LOX-Inhibitoren und ist zurzeit Gegenstand diverser klinischer Studien. Ziel dieser Arbeiten war es, den Mechanismus der Hemmung der LOX durch Ebselen eingehend zu untersuchen und mögliche Rückschlüsse auf die Anwendbarkeit von Ebselen als LOX-Inhibitor in vivo zu treffen.

Ein weiterer Schwerpunkt dieser Arbeit war die Aufklärung des Mechanismus der Membranbindung der Kaninchen-Retikulozyten 15-LOX. Die Beteiligung am Abbau von Zellorganellen, der wichtigsten bisher bekannten Funktion dieser LOX, setzt die Fähigkeit voraus, an Biomembranen zu binden. In der Literatur wurde bereits die mögliche Funktion der N-terminalen β-Faltblatt-Domäne, insbesondere der Aminosäuren Phe70 und Leu71, für die Membranbindung vorgeschlagen. Diese Thesen sollten experimentell untersucht werden. Durch Expression einer nach Möglichkeit enzymatisch aktiven N-terminal trunkierten LOX-Spezies sollte die Beteiligung der gesamten N-terminalen Domäne an der Membranbindung überprüft werden. Außerdem war die Membranbindungsfähigkeit der LOX nach gezielter Mutagenese der beiden vorgeschlagenen Bindungsdeterminanten Phe70 und Leu71 in geladene Aminosäuren Gegenstand der Untersuchungen. Da es zweifelhaft erscheint, dass die N-terminale Domäne eine alleinige Rolle bei der Membranbindung spielt, sollten mögliche weitere Bindungsdeterminanten identifiziert und eine Enzymmutante exprimiert werden, die weitestgehend nicht mehr in der Lage ist, an Biomembranen zu binden. In in vitro Experimenten sollte dann die verbliebene Enzymaktivität dieser Mutante mit Biomembranen und Fettsäuren als Substrat untersucht werden.